Summary
Здесь мы описываем метод визуализации in vivo с использованием оптической когерентной томографии для облегчения диагностики и количественного измерения ретинопатии у мышей.
Abstract
Оптическая когерентная томография (ОКТ) предлагает неинвазивный метод диагностики ретинопатии. Машина OCT может захватывать перекрестные изображения сетчатки, по которым можно рассчитать толщину сетчатки. Хотя ОКТ широко используется в клинической практике, его применение в фундаментальных исследованиях не так распространено, особенно у мелких животных, таких как мыши. Из-за небольшого размера их глазных яблок сложно проводить исследования глазного дна у мышей. Поэтому для размещения ОКТ-визуализации на мелких животных требуется специализированная система визуализации сетчатки. В этой статье демонстрируется специфическая для мелких животных система для процедур обследования OCT и подробный метод анализа изображений. Представлены результаты ОКТ-исследования сетчатки нокаутирующих мышей липопротеиновых рецепторов очень низкой плотности (Vldlr) и мышей C57BL/6J. Изображения OCT мышей C57BL/6J показали слои сетчатки, в то время как изображения нокаутированных мышей Vldlr показали субретинальную неоваскуляризацию и истончение сетчатки. Таким образом, исследование OCT может облегчить неинвазивное обнаружение и измерение ретинопатии на мышиных моделях.
Introduction
Оптическая когерентная томография (ОКТ) - это метод визуализации, который может обеспечить in vivo высокое разрешение и перекрестную визуализацию для тканей 1,2,3,4,5,6,7,8, особенно для неинвазивного исследования в сетчатке 9,10,11,12 . Он также может быть использован для количественной оценки некоторых важных биомаркеров, таких как толщина сетчатки и толщина слоя нервных волокон сетчатки. Принцип ОКТ заключается в оптической когерентной рефлектометрии, которая получает кросссекционную тканевую информацию из когерентности света, отраженного от образца, и преобразует ее в графическую или цифровую форму через компьютерную систему7. OCT широко используется в офтальмологических клиниках в качестве важного инструмента для диагностики, последующего наблюдения и лечения пациентов с заболеваниями сетчатки. Это также может дать представление о патогенезе заболеваний сетчатки.
В дополнение к клиническим применениям, OCT также использовался в исследованиях на животных. Хотя патология является золотым стандартом морфологической характеристики, ОКТ имеет преимущество неинвазивной визуализации in vivo и продольного наблюдения. Кроме того, было показано, что ОКТ хорошо коррелирует с гистопатологией в моделях ретинопатии животных 11,13,14,15,16,17,18,19,20. Мышь является наиболее часто используемым животным в биомедицинских исследованиях. Тем не менее, его небольшие глазные яблоки представляют собой техническую проблему для проведения ВИЗУАЛИЗАЦИИ OCT у мышей.
По сравнению с OCT, впервые использованным для визуализации сетчатки у мышей21,22, OCT у мелких животных в настоящее время оптимизирован в отношении аппаратных и программных систем. Например, OCT в сочетании с трекером значительно снижает отношение сигнал/шум; Обновления программной системы OCT позволяют автоматически обнаруживать больше слоев сетчатки; а встроенный DLP-излучатель помогает уменьшить артефакты движения.
Рецептор липопротеинов очень низкой плотности (Vldlr) представляет собой трансмембранный белок в эндотелиальных клетках. Экспрессируется на эндотелиальных клетках сосудов сетчатки, пигментных эпителиальных клетках сетчатки и вокруг наружной ограничивающей мембраны23,24. Субретинальная неоваскуляризация является фенотипом нокаутирующих мышей Vldlr 23. Поэтому нокаутирующие мыши Vldlr используются для исследования патогенеза и потенциальной терапии субретинальной неоваскуляризации. Эта статья демонстрирует применение OCT-визуализации для обнаружения поражений сетчатки у нокаутированных мышей Vldlr, в надежде предоставить некоторый технический справочник для исследований ретинопатии на моделях мелких животных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Операции были выполнены в соответствии с Заявлением об использовании животных в офтальмологических и зрительных исследованиях от Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии. Экспериментальный проект был одобрен институциональным Комитетом по этике животных (Medical Ethics Committee of JSIEC, EC 20171213(4)-P01). В этом исследовании использовались двухмесячные мыши C57BL/6J и нокаутирующие мыши Vldlr . В каждой группе было 7 мышей, все из которых были самками и весили от 20 г до 24 г.
1. Экспериментальные условия
- Отнесите мышей к двум группам: экспериментальной группе, состоящей из нокаутированных мышей Vldlr , и контрольной группе, состоящей из мышей C57BL/6J.
- Кормите мышей пищей и водой условно.
- Выращивают мышей в лаборатории животных в стабильных условиях комнатной температуры (22 °C), влажности (50-60%), светло-темного цикла (12 ч-12 ч) и интенсивности света в помещении (350-400 люкс).
- Подготовьте экспериментальное оборудование: оптическую когерентную томографию с конфокальным сканирующим лазерным офтальмоскопом (цСЛО) для мелких животных (рисунок 1А).
- Подготовьте все материалы, необходимые для эксперимента (рисунок 1B) и взвесьте мышей (рисунок 1C).
2. Информационные записи
- Запишите информацию: группу, код, дату рождения, возраст, пол, вес и дозировку анестетика.
3. Запуск и тестирование прибора
- Включите компьютер и запустите программное обеспечение.
- Нажмите кнопку Тестовая программа , чтобы завершить тестовую программу.
- Включите термостат и разогрейте его до температуры 37 °C.
- Запустите процедуру модуля центр развертывания Office после тестирования программы.
- Создайте новую тему и заполните информацию о мыши.
- Разогрейте электрическое одеяло и накройте его хирургическими полотенцами.
4. Анестезия
- Используйте лиофилизированный анестетиковый порошок, содержащий тилетамин и золазепам, для приготовления анестезирующей смеси.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте рекомендациям местного комитета по этике животных по выбору, дозировке и способу введения анестезии. Обезболить животное анестетиком, который обеспечит неподвижность и потерю болевого восприятия не менее чем на 1 час, после чего животное быстро восстанавливается. Дозировка должна основываться на продолжительности эксперимента, весе животного и других факторах. - Обезболить животное с помощью приготовленной анестезирующей смеси. Следите за тем, чтобы животное согревалось в течение всей процедуры до выздоровления.
5. Применение мидриатических капель
- Добейтесь ручного удержания мыши за шиворот, заставьте глазное яблоко слегка выступать и поверните головку мыши одним глазом вверх.
- Нанесите мидриатические капли для расширения зрачков (рисунок 2А).
- Проверьте наличие расширения зрачка через 10 мин.
6. Размещение мыши
- Поместите мышь на электрическую платформу для одеяла.
- Обложите оба глаза медицинским геалуронатовым гелем натрия (рисунок 2B).
- Прикрутите двойную сферическую линзу 60 D (предустановленную линзу) на устройстве cSLO (рисунок 1A-5, 6).
- Поместите контактную линзу 100 D на роговицу мыши с вогнутой стороной, касающейся геля гиалуроната натрия на поверхности роговицы (рисунок 2C, D и рисунок 3A-II).
- Поместите мышь на маленькую платформу для животных с постоянной температурой и держите глаз на расстоянии 1-2 мм от объектива устройства cSLO (рисунок 3A).
- Отрегулируйте угол наклона контактной линзы щипцами, чтобы удержать зрачок в центре линзы.
- Тонкая настройка головы, чтобы сделать лицо глаза прямым впереди.
7. Конфокальный сканирующий лазерный офтальмоскоп (cSLO)
- Нажмите кнопку OCT , выберите модуль мыши и запустите программу cSLO (рисунок 4B).
- Выберите ИК-режим (источник света: красный свет) и отрегулируйте параметр (диапазон: 2047, рисунок 4D).
- Выберите глаз для осмотра (правый глаз: рисунок 4C-1; левый глаз: рисунок 4C-2).
- Управляйте рычагом и медленно перемещайте предустановленную линзу к контактной линзе.
- Отрегулируйте значение диоптрий до тех пор, пока изображение заднего полюса не станет четким (рисунок 4E).
- Внесите дополнительные коррективы, чтобы выровнять изображение заднего полюса сетчатки, центрируя его на головке зрительного нерва.
8. Оптическая когерентная томография (ОКТ)
- Запустите программу OCT (рисунок 4G).
- Щелкайте индикатор выполнения вверх и вниз, пока не появится изображение центра развертывания Office (рисунок 4H).
- Настройка параметров: Диапазон Min (Рисунок 4I) = 0-20, Диапазон Макс (Рисунок 4J) = 40-60.
- Отрегулируйте заданное расстояние объектива и направление позиционирования до получения идеального изображения OCT.
- Выберите положение сканирования, переместив стандартную линию в cSLO (рисунок 4M).
- Начните сканирование с головки зрительного нерва.
- Собирайте изображения в одинаковом порядке для каждого глаза: горизонтальная линия: головка зрительного нерва → верхняя → нижняя; вертикальная линия: головка зрительного нерва → носовой → височной.
- Собирайте изображения с четырех направлений.
- Щелкните Среднее значение, чтобы наложить сигналы изображения cSLO и OCT (рисунок 4F и рисунок 4O).
- Нажмите кнопку снимка , чтобы получить изображение SLO-OCT (рисунок 4P).
- Сохраните и экспортируйте все изображения (рисунок 4Q, R).
9. Окончание эксперимента (после ОКТ-экспертизы)
- Положите мышь на электрическое одеяло, чтобы держать ее в тепле, пока она не проснется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь должна находиться под наблюдением до тех пор, пока она не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя. Послеоперационное воздействие яркого света должно быть сведено к минимуму. - Снимите контактную линзу 100 D.
- Нанесите левофлоксациновый гель для глаз для защиты роговицы.
- Поместите мышь обратно в клетку после того, как она проснется.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что исследуемая мышь не возвращена компании других мышей до полного выздоровления. - Выключите программное обеспечение и выключите компьютер.
- Очистите контактную линзу 100 D водой; высушить хрусталик.
- Очищайте и дезинфицируйте окружающую среду.
10. Анализ изображений
- Сравните изображения OCT нокаутирующих мышей Vldlr с изображениями мышей C57BL/6J.
- Соблюдайте несколько положений: вертикальное и горизонтальное сканирование, проходящее через зрительный сосочек; верхнее, нижнее, носовое и височное сканирование; и сканирование аномальных мест отражения.
- Наблюдайте толщину, форму, слоистость и аномальные отражающие поражения сетчатки на каждом изображении, а также границу раздела стекловидного тела сетчатки и стекловидного тела.
- Запишите местоположение, характеристики и количество поражений.
11. Коррекция стратификации сетчатки
- Щелкните Проверка нагрузки на интерфейсе центра развертывания Office (рисунок 5A).
- Вызовите изображения центра развертывания Office мыши из всплывающего окна.
- Выбор изображений: сканирование изображений OCT через оптический сосочек, горизонтально или вертикально.
- Дважды щелкните изображение в медиаконтейнере , чтобы отобразить его на экране (рисунок 5C).
- Нажмите « Обнаружение слоев», чтобы завершить автоматическое наслоение сетчатки (рисунок 5D).
- Выделите разделительные линии по обеим сторонам слоя, подготовленного к анализу (рисунок 6D-10).
- Выберите отдельную разделительную линию (рисунок 6B-6) и нажмите «Редактировать слой» (рисунок 6A-1), чтобы активировать линию при появлении красного круга (рисунок 6B-7).
- Отрегулируйте расстояние (рисунок 6А-4, например, 50) и диапазон пределов (рисунок 6А-5, например, 50).
- Измените разделительную линию, переместив красный круг (сравните зеленую разделительную линию на рисунках 6B и 6C; На рисунке 6C показан измененный результат).
12. Толщина ламинирования сетчатки
- Нажмите кнопку Измерить маркер (рисунок 6D-9).
- Выберите разделительную линию анализируемого слоя (например, во внешнем ядерном слое выберите4-ю и5-ю разделительную линию в списке), чтобы отобразить границу слоя на изображении OCT (рисунок 6D-10).
- Выберите Соединиться со слоем (рисунок 6D-11) и оставайтесь на связи на ходу (рисунок 6D-12).
- Выберите область для отображения результатов (выбранный столбец окрашен, рисунок 6D-13).
- Щелкните позицию для анализа на изображении центра развертывания Office, чтобы линия измерения отображалась (перпендикулярная горизонтальной оси и соответствующая цвету результирующей области) (рисунок 6D-14).
- Нажмите на следующий столбец для следующего измерения и отобразите предыдущие данные (рисунок 6E-15).
- Считайте значение Vert (толщина измеряемого положения) в строке Length in μm (ткань) (рисунок 6E, красный прямоугольник).
- Щелкните Удалить маркер (рисунок 6E-16) и Новый маркер (рисунок 6E-17) для повторного тестирования, чтобы результаты охватывали исходные данные (если необходимо повторное измерение).
- Нажмите Print Scr на клавиатуре, чтобы сохранить скриншоты, или нажмите Save Examination (Сохранить экзамен), чтобы сохранить напрямую (рисунок 5H).
- Введите данные в электронную таблицу или статистическое программное обеспечение для статистического анализа.
13. Измерение полной толщины сетчатки
- Выберите линию 1 (ILM, внутренняя ограничивающая мембрана, рисунок 7B) и строку 7 (OS-RPE, OS: внешние сегменты фоторецептора; РПЭ: пигментный эпителиальный слой сетчатки, рисунок 7С) в списке в правом верхнем углу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полная толщина сетчатки означает толщину слоя нейрепителия сетчатки, который является сетчаткой между ILM и OS-RPE на OCT). - Измерьте толщину сетчатки с обеих сторон зрительного сосочка через определенный интервал.
- Например: от внешнего вида структуры сетчатки на краю зрительного сосочки измерьте 4 значения с расстоянием 200 мкм от горизонтальной линейки (рисунок 7G, H).
- Запишите все измеренные значения в электронную таблицу.
- Используйте несколько t-тестов (по одному на строку) для сравнения измеренных значений каждой соответствующей позиции в обеих группах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Благодаря сканированию с высоким разрешением OCT можно наблюдать слои сетчатки мыши, а также идентифицировать аномальные отражения и их точное местоположение. В этом исследовании сравнивались изображения OCT сетчатки нокаутированных мышей Vldlr и мышей C57BL/6J. Изображения OCT всех мышей C57BL/6J показали различные слои сетчатки с различной отражательной способностью, и демаркация была четкой (рисунок 8D). Напротив, все нокаутирующие мыши Vldlr показали аномальные, гиперрефлексивные поражения на изображениях OCT (рисунок 8B).
Неполная отслойка стекловидного тела (PVD) у нокаутирующих мышей Vldlr
Результаты OCT показали некоторые средние отражающие полосы на поверхностях сетчатки нокаутирующих мышей Vldlr (рисунок 8B, красные стрелки). Эти средние отражающие полосы прилипали к сосуду сетчатки (рисунок 8B, зеленая стрелка), что соответствует изображению cSLO (рисунок 8A, зеленая стрелка). Эти особенности согласуются с ОКТ характеристиками неполной отслойки стекловидного тела.
Субретинальная неоваскуляризация у нокаутирующих мышей Vldlr
Результаты показали, что субретинальная неоваскуляризация имела два режима развития у нокаутирующих мышей Vldlr .
С вовлечением внешнего ядерного слоя
Гиперрефлексивное поражение, с треугольной формой снизу вниз на изображении OCT, появилось на субретинальном пространстве и распространилось на внешний ядерный слой. Поражение не пробивало наружный плексиформный слой (рисунок 8В, белая стрелка).
Появление ОКТ этого типа субретинальной неоваскуляризации соответствовало патологическим выводам, показанным на рисунке 9А. Патологический участок показал, что неоваскуляризация (рисунок 9А, толстая зеленая стрелка) прорвалась через RPE, внутренние/внешние сегменты фоторецептора (IS/OS) и внешнюю ограничивающую мембрану (ELM). Он вторгся во внешний ядерный слой (ONL), но не прорвался через внешний плексиформный слой (OPL).
Без вовлечения внешнего ядерного слоя
Полоса гиперрефлексивного поражения появилась на изображении OCT, которое располагалось в субретинальном пространстве (рисунок 8B, желтая стрелка). На изображении cSLO показано соответствующее местоположение (рисунок 8A, желтая стрелка). Дополнительные сканирования сетчатки вокруг этого места (рисунок 8A, желтая стрелка) показали те же результаты.
В соответствии с поражением (рисунок 10А, толстая синяя стрелка) в патологическом участке, эта субретинальная неоваскуляризация не прорвалась через ELM (рисунок 10A, тонкая желтая стрелка), а частично включала фоторецептор IS/OS.
Результаты по толщине сетчатки
Толщина сетчатки правого глаза всех мышей была получена с помощью функции автоматического стратификации и измерения толщины OCT. Толщина сетчатки нокаутированных мышей Vldlr (200,94 ± 14,64 мкм) была значительно ниже, чем у мышей C57BL/6J (217,46 ± 10,21 мкм, P < 0,001, t-тест, 7 правых глаз/группа). Сравнение толщины сетчатки в четырех направлениях (височном, носовом, верхнем и нижнем) заднего полярного между двумя группами показано на рисунке 11.
Рисунок 1: Подготовка экспериментальных материалов и животных. (А) Оборудование: 1. cSLO/OCT устройство для визуализации сетчатки мелких животных, 2. компьютер и монитор, 3. Малая платформа для животных с постоянной температурой, 4. термостат, 5. предустановленная линза, 6. установка предустановленной линзы. (B) Лекарства и мелкие предметы: I. povidone-йод, II. микрошприц, III. раствор смеси анестетиков, в/в. таймер, V. мидриатические глазные капли, VI. щипцы, VII. медицинский гиалуронат натрия гель, VIII. медицинский ватный тампон, IX. антибиотическая глазная мазь, X. 100 D контактные линзы (две). (C) Измерение веса на цифровых весах. Сокращения: cSLO = конфокальный сканирующий лазерный офтальмоскоп; ОКТ = оптическая когерентная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Подготовка к ОКТ-исследованию мышей. (А) Нанесение глазных капель мидриазом, (В) покрытие гиалуроната натрия на роговицу, (С, D) размещение контактной линзы 100 D, с вогнутой поверхностью, контактирующей с роговицей. Аббревиатура: OCT = оптическая когерентная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Процедуры обследования OCT. (A) Положение мыши, I. Предустановленная линза, II. контактные линзы, III. Маленькая, постояннотемпературная платформа для животных. B) Эксплуатация машины cSLO/OCT, IV. рычаг управления, V. рычаг наклона, VI. Устройство cSLO. Сокращения: cSLO = конфокальный сканирующий лазерный офтальмоскоп; ОКТ = оптическая когерентная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Процесс визуализации OCT. А. Режим измерения , B. Start Laser ИК-лазера, C. выбор глаз (C-1-OD; C-2-OS), D. диапазон ИК-лазера, E. диоптрия, F. наложение изображения cSLO, G. OCT сканирующая кнопка запуска/остановки H. ссылка на изображение OCT, I. Диапазон Min: 0-20, J. Диапазон Max: 50-60, K. интенсивность сигнала изображения, L. направление сканирования (например, вертикальное сканирование), M. положение сканирования, выбранное путем перемещения зеленой контрольной линии (например, вертикальное сканирование через зрительный сосочек), N. отображение изображения OCT в режиме реального времени, O. наложение изображения OCT, P. Shot: получение изображения, Q. SLO-OCT изображения, которые были получены, R. Save Examination: сохранение результата обследования. Шкала стержней = 200 мкм. Сокращения: cSLO = конфокальный сканирующий лазерный офтальмоскоп; ОКТ = оптическая когерентная томография; ИК = инфракрасный; OD = правый глаз; ОС = левый глаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Интерфейс автоматического расслоения сетчатки в системе OCT. A. Кнопка проверки нагрузки , B. Медиаконтейнер, показывающий все изображения OCT, C. Изображение OCT выбирается для анализа, кнопка D. Layer Detection для автоматического наслоения сетчатки, E. список разделительных линий, F. автоматическое расслоение на сетчатке, кнопка G. Edit Layer для послойной коррекции, H. Save Examination для сохранения результатов. Шкала стержней = 200 мкм. Аббревиатура: OCT = оптическая когерентная томография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Послойная коррекция (A-C) и измерение толщины (D-E). (A) Интерфейс активации многоуровневого редактирования: 1. Кнопка Edit Layer , 2. список разделительных линий (например, выбор всех строк), 3. активированные разделительные линии, 4. Регулировка интервала , 5. Регулировка предельного диапазона . (B) Активация разделительной линии (например, линии 3 в А), 6. линия 3, линия между внутренним плексиформным слоем и внутренним ядерным слоем, 7. пример ошибки наслоения. (C) Изменение ошибки наслоения, 8. красный кружок для модификации. D) Пример измерения толщины пластинчатки сетчатки, 9. Кнопка маркера измерения , 10. разделительные линии внешнего ядерного слоя, 11. Соединитесь со слоем (измерение соединится со слоем по разделительным линиям), 12. Оставайтесь на связи на ходу (положение измерения — это место, где остается ручной щелчок), 13. расположение результирующего дисплея, 14. измерительная линия (перпендикулярно горизонтальной оси). E) Получение результатов измерений, 15. результаты измерений (красный прямоугольник: значение Vert - результат толщины), 16. Кнопка "Удалить маркер" для удаления записи измерений, 17. Новая кнопка Marker для повторного измерения (новый результат перезапишет исходную запись). Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Измерение полной толщины сетчатки. A. Кнопка «Измерить маркер», B. линия 1 (ILM) и C. Линия 7 (OS-RPE) для отображения границ полной толщины сетчатки, D. Соединение с выделением слоя, E. Оставайтесь подключенными на move выделении, F. линейка (вертикальные и горизонтальные полосы линейки, оба 200 мкм в длину), G. линии измерения на сетчатке (4 линии с 200 мкм горизонтальной длины линейки в качестве интервала с каждой стороны зрительный сосочек), H. результаты измерений (результаты дифференцируются разными цветами и соответствуют цвету линий измерения на сетчатке), I. Извлечение данных из значения Vert в строке Length in μm (ткань). Шкала стержней = 200 мкм. Сокращения: ILM = внутренняя ограничивающая мембрана; OS-RPE = фоторецепторный наружный сегмент пигментного эпителия сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Сравнение изображений cSLO и OCT мышей Vldlr и C57BL/6J. Изображения cSLO (A) и OCT (B) нокаутирующих мышей Vldlr по сравнению с изображениями cSLO (C) и OCT (D) мышей C57BL/6J. Характеристики ОКТ у нокаутирующих мышей Vldlr (B): 1) Средняя отражающая линия (B, красные стрелки) на внутренней поверхности сетчатки с адгезией к сосуду сетчатки (B, зеленая стрелка). 2) Гиперрефлексивные поражения, расположенные в субретинальном пространстве, с (В, белая стрелка) или без (В, желтая стрелка) вовлечением внешнего ядерного слоя. Стрелки на изображении cSLO (A) представляют расположение соответствующих цветных стрелок на изображении OCT (B). Шкала стержней = 200 мкм. Сокращения: cSLO = конфокальный сканирующий лазерный офтальмоскоп; ОКТ = оптическая когерентная томография; Vldlr = рецептор липопротеинов очень низкой плотности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Режим 1: парафиновые срезы сетчатки с окрашиванием гематоксилин-эозина в нокауте Vldlr и мыши C57BL/6J. (A) Пример субретинальной неоваскуляризации, вторгающейся во внешний ядерный слой (толстая зеленая стрелка), расположенный в средней части сетчатки нокаутирующей мыши Vldlr . (B) Нормальный контроль, средняя часть сетчатки мыши C57BL/6J. Шкала баров = 50 мкм. Сокращения: Vldlr = рецептор липопротеинов очень низкой плотности; ILM = внутренняя ограничивающая мембрана; NFL = слой нервных волокон сетчатки; GCL = ганглиозный клеточный слой сетчатки; IPL = внутренний плексиформный слой; INL = внутренний ядерный слой; OPL = наружный плексиформный слой; ONL = внешний ядерный слой; ELM = внешняя ограничивающая мембрана; IS = внутренний сегмент фоторецептора; ОС = внешний сегмент фоторецептора; RPE = слой пигментного эпителия сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Режим 2: парафиновые срезы сетчатки с окрашиванием гематоксилин-эозина у нокаута Vldlr и мыши C57BL/6J. (A) Пример субретинальной неоваскуляризации без участия внешнего ядерного слоя (толстая синяя стрелка) и с неповрежденным ELM (тонкая желтая стрелка), расположенным на средней периферии сетчатки у нокаутирующей мыши Vldlr . (B) Нормальный контроль, средняя периферическая сетчатка мыши C57BL/6J. Шкала стержней = 50 мкм. Сокращения: VLDR = рецептор липопротеинов очень низкой плотности; ILM = внутренняя ограничивающая мембрана; NFL = слой нервных волокон сетчатки; GCL = ганглиозный клеточный слой сетчатки; IPL = внутренний плексиформный слой; INL = внутренний ядерный слой; OPL = наружный плексиформный слой; ONL = внешний ядерный слой; ELM = внешняя ограничивающая мембрана; IS = внутренний сегмент фоторецептора; ОС = внешний сегмент фоторецептора; RPE = слой пигментного эпителия сетчатки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11: Сравнение толщины сетчатки между мышами C57BL/6J и нокаутирующими мышами Vldlr (все данные из правого глаза). (A) Толщина сетчатки (мкм) через сосочек зрительного нерва методом горизонтального сканирования OCT. (B) Толщина сетчатки (мкм) через сосочек зрительного нерва методом вертикального сканирования ОКТ. Горизонтальная координата представляет собой измерительные позиции с интервалом 200 мкм.*: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P < 0,001. Сокращения: T = temporal; P = зрительный сосочек; N = носовой; S = Улучшенный; I = Низший; ОКТ = оптическая когерентная томография; VLDR = рецептор липопротеинов очень низкой плотности; OD = правый глаз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании OCT-визуализация с использованием системы визуализации сетчатки мелких животных была применена для оценки изменений сетчатки у нокаутирующих мышей Vldlr , которые демонстрируют неполную заднюю отслойку стекловидного тела, субретинальную неоваскуляризацию и истончение толщины сетчатки. OCT - это неинвазивный метод визуализации для изучения состояния сетчатки in vivo. Большинство устройств OCT предназначены для обследования человеческого глаза. Размер аппаратного оборудования, настройка фокусного расстояния, настройка параметров системы и требования к позиционированию испытуемого основаны на человеческом глазу. Модификации объектива и настроек системы необходимы для исследования мелких животных с помощью специфического для человека оборудования OCT. В данной статье представлены процедуры ОКТ-обследования мелких животных.
Фокусное расстояние различно при сканировании изображений разных мелких животных с разными размерами глазных яблок. Эта разница в фокусном расстоянии имеет решающее значение и должна быть устранена для получения четких и точных изображений глазного дна. Одним из эффективных методов является замена объектива линзами различной кривизны. Из-за небольшого глазного яблока мышь нуждается в контактной линзе 100 D перед роговицей в дополнение к двухсферической предустановленной линзе 60 D оборудования OCT.
Центр развертывания Office может выполнять только линейное сканирование, которое охватывает только ограниченную область сетчатки. Поэтому важно стандартизировать протокол сканирования ОКТ для качественного и количественного сравнения результатов ОКТ в разных группах. Здесь были выполнены три горизонтальных сканирования и три вертикальных сканирования. Эта машина обеспечивает изображение cSLO в режиме реального времени для мониторинга местоположения сканирования OCT, чтобы положение сканирования можно было точно и удобно регулировать. Дополнительные сканирования могут быть добавлены при обнаружении аномального отражения.
Параметры получения изображения необходимо тщательно корректировать. Здесь рекомендуется, чтобы диапазон Min был равен 0-20, а диапазон Max был 50-60 (рисунок 4I, J). При перенастройке параметров сигнальный контраст изображения будет повышен, а отраженный сигнал сетчатки с низким отражением станет ниже или даже черным, а некоторая морфологическая информация будет потеряна.
Ниже приведены некоторые советы, чтобы избежать ухудшения качества изображения: 1. Поместите контактную линзу перед глазами сразу после анестезии, чтобы избежать катаракты; 2. Убедитесь, что предустановленная линза и контактные линзы чистые; 3. Избегайте попадания волос между роговицей и контактными линзами; 4. Убедитесь, что параметры доплера, контрастности и яркости в центре развертывания Office установлены соответствующим образом.
Изображения OCT могут быть использованы для качественного обнаружения поражений и количественного измерения таких показателей, как толщина сетчатки. Здесь предлагается метод измерения толщины сетчатки в нескольких местах, и среднее значение может быть рассчитано как средняя толщина сетчатки. Это достигается за счет автоматической функции стратификации системы OCT. Поэтому толщина ламината сетчатки также может быть измерена. Метод измерения прост и точен (рисунок 6 и рисунок 7). Результаты показали, что толщина сетчатки была ниже у нокаутированных мышей Vldlr , чем у мышей C57BL/6J, что согласуется с литературой25. Разница в толщине сетчатки между двумя группами может быть четко показана графиком, полученным в результате измерений в нескольких местах (рисунок 11). Аналогичный анализ ретинопатии и методы измерения толщины сетчатки также были зарегистрированы на мышиной модели26 с болезнью Штаргардта. Однако стоит отметить, что гиперрефлексивные полосы на границе раздела стекловидного тела сетчатки не относятся к ткани сетчатки и должны удаляться во время стратификации. Кроме того, если субретинальные поражения вторгаются в сетчатку, измерение толщины должно включать захваченную часть.
Эта система визуализации сетчатки мелких животных имеет некоторые ограничения. Например, хотя он может обеспечить четкие изображения заднего полюса в пределах 35 °, получение изображения периферической сетчатки по-прежнему является сложной задачей. Кроме того, cSLO формирует изображение в оттенке серого, которое не так хорошо, как цветное изображение глазного дна для обнаружения поражений глазного дна (пигментация, кровотечение, экссудация). Следовательно, необходимы дальнейшие улучшения. Таким образом, исследование OCT машиной cSLO может облегчить неинвазивное обнаружение и измерение ретинопатии на мышиных моделях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов.
Acknowledgments
Источник проекта: Фонд естественных наук провинции Гуандун (2018A0303130306). Авторы хотели бы поблагодарить Лабораторию офтальмологических исследований, Объединенный международный глазной центр Шаньтоу Университета Шаньтоу и Китайский университет Гонконга за финансирование и материалы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-Dpt contact lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Double aspheric 60-Dpt glass lens | Volk Optical,Inc, Mentor, OH | Accessory belonging to the RETImap | |
| Electric heating blanket | POPOCOLA | CW-DRT-01 | 50 x 35 cm |
| Injection syringe (1 mL) | Kaile | 0.45 x 16RWLB | |
| Levofloxacin Hydrochloride Eye Gel | EBE PHARMACEUTICAL Co.LTD | 5 g: 0.015 g | |
| Medical sodium hyaluronate gel | Alcon | 16H01E | |
| Microliter syringes | Shanghai high pigeon industry and trade co., LTD | Q31/0113000236C001-2017 | 50 µL |
| Povidone iodine solution | Guangdong medihealth pharmaceutical Co.,LTD | 100 mL | |
| RETImap | ROLAND CONSULT | 19-99_50-2.1_1.2E | cSLO/ERG/VEP/FA/OCT/GFP |
| Small animal ear studs | OSMO POCKET OT110 | INS1005-1S | |
| Tropicamide Phenylephrine Eye Drops | Santen Pharmaceutical Co.,LTD | 5 mg/mL | |
| Xylazin | Sigma | X1251-5G | 5 g |
| Zoletil 50 | Virbac.S.A | 7FRPA | Tiletamine 125 mg + Zolazepam 125 mg |
References
- Frombach, J., et al. Serine protease-mediated cutaneous inflammation: characterization of an ex vivo skin model for the assessment of dexamethasone-loaded core multishell-nanocarriers. Pharmaceutics. 12 (9), 862 (2020).
- Osiac, E., Săftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract. Journal of Gastroenterology. 17 (1), 15-20 (2011).
- Xiong, Y. Q., et al. Diagnostic accuracy of optical coherence tomography for bladder cancer: A systematic review and meta-analysis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 27, 298-304 (2019).
- Andrews, P. M., et al. Optical coherence tomography of the aging kidney. & Clinical Transplantation. 14 (6), 617-622 (2016).
- Terashima, M., Kaneda, H., Suzuki, T. The role of optical coherence tomography in coronary intervention. The Korean Journal of Internal Medicine. 27 (1), 1-12 (2012).
- Avital, Y., Madar, A., Arnon, S., Koifman, E. Identification of coronary calcifications in optical coherence tomography imaging using deep learning. Scientific Reports. 11 (1), 11269 (2021).
- Huang, D., et al.
- Tsai, T. H., et al. Optical coherence tomography in gastroenterology: a review and future outlook. Journal of Biomedical Optics. 22 (12), 1-17 (2017).
- Chen, J., et al. Relationship between optical intensity on optical coherence tomography and retinal ischemia in branch retinal vein occlusion. Scientific Reports. 8 (1), 9626 (2018).
- Chen, X., et al. Quantitative analysis of retinal layer optical intensities on three-dimensional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 54 (10), 6846-6851 (2013).
- Cruz-Herranz, A., et al. Monitoring retinal changes with optical coherence tomography predicts neuronal loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 203 (2019).
- Podoleanu, A. G.
- Augustin, M., et al. Optical coherence tomography findings in the retinas of SOD1 knockout mice. Translational Vision Science & Technology. 9 (4), 15 (2020).
- Berger, A., et al. Spectral-domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology. PLoS One. 9 (5), 96494 (2014).
- Burns, M. E., et al. New developments in murine imaging for assessing photoreceptor degeneration in vivo. Advances in Experimental Medicine & Biology. 854, 269-275 (2016).
- Jagodzinska, J., et al. Optical coherence tomography: imaging mouse retinal ganglion cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: Jove. (127), e55865 (2017).
- Kocaoglu, O. P., et al. Simultaneous fundus imaging and optical coherence tomography of the mouse retina. Investigative Opthalmology & Visual Science. 48 (3), 1283-1289 (2007).
- Tode, J., et al. Thermal stimulation of the retina reduces Bruch's membrane thickness in age related macular degeneration mouse models. Translational Vision Science & Technology. 7 (3), 2 (2018).
- Wang, R., Jiang, C., Ma, J., Young, M. J. Monitoring morphological changes in the retina of rhodopsin-/- mice with spectral domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3967-3972 (2012).
- Xie, Y., et al. A spectral-domain optical coherence tomographic analysis of Rdh5-/- mice retina. PLoS ONE. 15 (4), 0231220 (2020).
- Li, Q., et al. Noninvasive imaging by optical coherence tomography to monitor retinal degeneration in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 42 (12), 2981-2989 (2001).
- Horio, N., et al. Progressive change of optical coherence tomography scans in retinal degeneration slow mice. Archives of Ophthalmology. 119 (9), 1329-1332 (2001).
- Hu, W., et al. Expression of VLDLR in the retina and evolution of subretinal neovascularization in the knockout mouse model's retinal angiomatous proliferation. Investigative Opthalmology & Visual Science. 49 (1), 407-415 (2008).
- Wyne, K. Expression of the VLDL receptor in endothelial cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (3), 407-415 (1996).
- Augustin, M., et al. In vivo characterization of spontaneous retinal neovascularization in the mouse eye by multifunctional optical coherence tomography. Investigative Opthalmology & Visual Science. 59 (5), 2054-2068 (2018).
- Fang, Y., et al. Fundus autofluorescence, spectral-domain optical coherence tomography, and histology correlations in a Stargardt disease mouse model. The FASEB Journal. 34 (3), 3693-3714 (2020).
