Summary
Hier wordt een methode beschreven om plantenweefsels transparant te maken met behoud van de stabiliteit van fluorescerende eiwitten. Deze techniek vergemakkelijkt diepe beeldvorming van geklaarde plantenweefsels zonder fysieke doorsnede.
Abstract
Het is een uitdaging om de interne structuur van meerlagige en ondoorzichtige plantenspecimens direct te observeren, zonder dissectie, onder een microscoop. Bovendien belemmert autofluorescentie toegeschreven aan chlorofyl de observatie van fluorescerende eiwitten in planten. Al lange tijd worden verschillende opruimreagentia gebruikt om planten transparant te maken. Conventionele clearingreagentia verminderen echter fluorescerende signalen; daarom was het niet mogelijk om de cellulaire en intracellulaire structuren met fluorescerende eiwitten te observeren. Er zijn reagentia ontwikkeld die plantenweefsels kunnen verwijderen door chlorofyl te verwijderen met behoud van fluorescerende eiwitstabiliteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor het optisch opruimen van plantenweefsels met behulp van clearingreagentia, ClearSee (CS) of ClearSeeAlpha (CSA). De bereiding van geklaarde plantenweefsels omvat drie stappen: fixatie, wassen en opruimen. Fixatie is een cruciale stap in het behoud van de cellulaire structuren en intracellulaire stabiliteit van fluorescerende eiwitten. De incubatietijd voor het opruimen is afhankelijk van het weefseltype en de soort. In Arabidopsis thaliana was de tijd die nodig was voor het opruimen met CS 4 dagen voor bladeren en wortels, 7 dagen voor zaailingen en 1 maand voor stampers. CS had ook een relatief korte tijd van 4 dagen nodig om de gametofytische bladeren van Physcomitrium patens transparant te maken. Daarentegen produceerden stampers in tabak en torenia bruin pigment als gevolg van oxidatie tijdens CS-behandeling. CSA verminderde het bruine pigment door oxidatie te voorkomen en kon tabak en torenia stampers transparant maken, hoewel het relatief lang duurde (1 of 2 maanden). CS en CSA waren ook compatibel met kleuring met chemische kleurstoffen, zoals DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) en Hoechst 33342 voor DNA en Calcofluor White, SR2200 en Direct Red 23 voor de celwand. Deze methode kan nuttig zijn voor beeldvorming van de hele plant om intacte morfologie, ontwikkelingsprocessen, plant-microbe interacties en nematodeninfecties te onthullen.
Introduction
Visualisatie van cellulaire structuren en lokalisatie van eiwitten in levende organismen is belangrijk voor het verduidelijken van hun functies in vivo. Omdat het levende lichaam echter niet transparant is, is het een uitdaging om de interne structuur van levende organismen zonder dissectie te observeren. Vooral in het geval van plantenweefsels, die meerlagig zijn met cellen van verschillende vormen, is de indexmismatch veroorzaakt door hun structuur en de aanwezigheid van lichtabsorberende pigmenten problematisch. Plantenbladeren hebben bijvoorbeeld een complexe structuur waarmee ze het licht dat hun lichaam binnenkomt efficiënt kunnen gebruiken voor fotosynthese1, terwijl de structuur ook refractieve indexmismatch veroorzaakt, waardoor ze moeilijk waarneembaar zijn. Bladeren hebben echter veel lichtabsorberende pigmenten, zoals chlorofyl, die sterke rode fluorescentie afgeven en bruinachtige pigmenten worden geproduceerd door oxidatie2,3. Deze pigmenten belemmeren ook de waarnemingen van fluorescentiemicroscopie in planten. Daarom worden voor het observeren van de interne structuur van planten ontkleuring en fixatie door alcohol en clearing met behulp van chloraalhydraat al lange tijd gebruikt om de brekingsindexmismatch en autofluorescentie te elimineren4,5. Deze conventionele methoden worden al vele jaren gebruikt, maar ze hebben het nadeel dat ze tegelijkertijd de fluorescentie van fluorescerende eiwitten elimineren6,7. Dit is problematisch omdat fluorescerende eiwitten onmisbaar zijn geworden in de huidige fluorescerende beeldvorming.
Daarom zijn ClearSee (CS) en ClearSeeAlpha (CSA) ontwikkeld als optische clearingreagentia voor plantenweefsels. Beide reagentia verminderen chlorofylautofluorescentie met behoud van de stabiliteit van fluorescerende eiwitten7,8. CSA is vooral nuttig wanneer bruine pigmenten worden geproduceerd als gevolg van weefseloxidatie. Met behulp van deze reinigingsreagentia is het mogelijk om de cellulaire structuur en eiwitlokalisatie in het plantenlichaam te observeren zonder fysieke sectie.
Protocol
1. Voorbereiding van clearingoplossingen
- Om CS-oplossing te bereiden, lost u 10% (w / v) xylitol, 15% (w / v) natriumdeoxycholaat en 25% (w / v) ureum op in gedestilleerd water op een magneetroerder.
OPMERKING: Natriumdeoxycholaatpoeder moet in een tochtkamer worden gewogen omdat het gemakkelijk in de lucht drijft. CS kan meer dan 1 jaar bij kamertemperatuur in het donker worden bewaard. - Voeg voor de bereiding van de CSA-oplossing natriumsulfiet (eindconcentratie van 50 mM) toe aan de hierboven verkregen CS-oplossing.
OPMERKING: Voeg vlak voor gebruik natriumsulfiet toe aan de CS-oplossing, omdat het reductiemiddel gemakkelijk kan worden gedeactiveerd.
2. Bereiding van de fixatieve oplossing
- Breng 40 ml gesteriliseerd water over in een conische buis en voeg 2 g paraformaldehyde toe. Voeg 200 μL van 2 N NaOH toe om de pH van de oplossing te verhogen. Na het sluiten en afdichten van de buis met parafilm, incuberen bij 60 °C met af en toe inversies totdat alles is opgelost.
- Voeg na het afkoelen van de oplossing tot kamertemperatuur 5 ml 10x fosfaatbuffered saline (PBS) toe om de pH op 7,4 te brengen. Voeg gesteriliseerd water toe om het volume op 50 ml te brengen.
OPMERKING: Een vers bereide fixatieve oplossing heeft de voorkeur. De oplossing kan ook enkele maanden bij -30 °C worden bewaard.
3. Fixatie van monsters
- Dompel plantenmonsters onder in de fixatieve oplossing in een microbuis (figuur 1A) en zorg ervoor dat het volume van de fixatieve oplossing meer dan vijf keer het monstervolume bedraagt.
- Sluit het microbuisje af met een parafilm en maak gaten met een naald. Laat de buis niet open vanwege het risico van morsen van het monster tijdens vacuümdecompressie.
- Plaats de microbuis in een exsiccator en pas langzaam de mate van vacuüm (~ 690 mmHg) aan, zodat er geleidelijk bellen uit de monsters verschijnen (figuur 1B-C). Schakel de vacuümpomp uit na het evacueren van de exsiccator. Laat de microbuis 30 minuten ongestoord bij kamertemperatuur.
- Ontlucht de exsiccator zorgvuldig om te voorkomen dat de monsters worden verstoord. Schakel de vacuümpomp weer in en schakel deze uit na het evacueren van de exsiccator. Laat de microbuis 30 minuten ongestoord bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Er moet voor worden gezorgd dat schade aan de monsters wordt voorkomen tijdens het ontluchten van de exsiccator. De penetratie van de fixatieve oplossing in de monsters wordt versterkt door twee vacuümbehandelingen. Verdere vacuümbehandeling helpt om de fixatieve oplossing in dikkere monsters te penetreren. - Open de exsiccator voorzichtig zonder de fixerende oplossing in de microbuis te stoten. Verwijder met behulp van een micropipette de fixatieve oplossing en voeg 1x PBS toe. Vervang na 1 minuut bewaren de oude PBS door nieuwe 1x PBS (Figuur 1D).
4. Opruimen
- Voeg na het verwijderen van PBS vijf keer het monstervolume van de clearingoplossing toe.
- Sluit het microbuisje af met parafilm en maak gaten met een naald. Plaats de monsters in de exsiccator, evacueer zoals in stap 3.3 en schakel de vacuümpomp uit. Laat de microbuis 60 minuten ongestoord bij kamertemperatuur.
- Open de exsiccator voorzichtig. Sluit het microbuisje met parafilm en bewaar het bij kamertemperatuur in het donker om fotobleaching van fluorescerende eiwitten te voorkomen. Keer de microbuis om de 1-2 dagen om om het opruimproces te versnellen.
- Wanneer de clearingoplossing groen wordt, vervangt u deze door nieuwe clearingoplossingen totdat de oplossing kleurloos blijft (figuur 1E-H).
Figuur 1: Procedure voor CS-behandeling. (A) Arabidopsis-zaailing in 4% PFA (Paraformaldehyde) oplossing. (B) Het monster wordt in een exsiccator geplaatst. (C) De zaailing wordt onder vacuüm gefixeerd. (D) De zaailing wordt na vacuümbehandeling in de PFA-oplossing gedrenkt. (E) Resulterende 3-daagse clearing oplossing-behandelde zaailing. Let op de groene kleur van de clearingoplossing. (F) De clearingoplossing wordt 3 dagen na de behandeling vervangen. (G) Resulterende 5-daagse clearing oplossing-behandelde zaailing. (H) De clearingoplossing wordt 5 dagen na de behandeling vervangen. Maatstaven: 1 cm (A,C-H) en 5 cm (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Chemische kleurstofkleuring
- Voeg aan de microbuis Hoechst 33342 (eindconcentratie van 10 μg/ml) toe voor nucleaire kleuring of Calcofluor White (eindconcentratie van 1 mg/ml) voor celwandkleuring en wacht 1 uur. Na het verwijderen van de kleurstofoplossing, was het monster gedurende 1 uur met een verse opruimoplossing.
OPMERKING: 's Nachts kleuren en wassen kan de penetratie van fluorescerende kleurstof in weefsels verbeteren en achtergrondfluorescentie verminderen. Verschillende fluorescerende kleurstoffen zijn compatibel met de CS-oplossing, zoals Basic Fuchsin9 (lignine), Auramine O9 (lignine, suberine en cutine), Nile Red9 (suberine), Direct Yellow 969, Direct Red 239 en SR220010,11 (celwanden).
6. Observatie
- Knip siliconen rubberen vel met een scheermesje om een frame voor de afstandhouder voor te bereiden (figuur 2A).
OPMERKING: Pas de dikte van de siliconen rubberen plaat aan op basis van de dikte van het monster. Omdat monsters die met een clearingoplossing zijn behandeld zacht zijn, zullen ze worden beschadigd als ze rechtstreeks met het afdekglas worden bedekt. - Plaats het siliconen frame op afdekglas (bijv. 25 x 60 mm) (figuur 2B). Plaats de behandelde monsters in het frame en voeg ~100 μL clearingoplossing toe om eventuele bubbels in het frame te verwijderen. Dek af met een ander afdekglas (18 x 18 mm of 24 x 24 mm) om verdamping van de clearingoplossing te voorkomen (figuur 2C).
- Bekijk de monsters onder een fluorescerende microscoop. Breng na observatie de monsters terug naar de opruimoplossing die in een microbuis is genomen en bewaar ze bij kamertemperatuur in het donker.
Figuur 2: Monstervoorbereiding voor microscopische observatie. (A) Snijd een 0,2 mm dikke siliconenplaat in een frame. (B) Plaats het siliconen plaatframe op het afdekglas. C) Plaats het monster dat is behandeld met een clearingoplossing (gemarkeerd met een gestippelde rand) in het frame en bedek het met een afdekglas. Schaalbalken: 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Representative Results
CS kan bladeren van verschillende soorten verwijderen (figuur 3A-H). Het is moeilijk voor de CS-oplossing om een rijstblad binnen te dringen omdat het bladoppervlak bedekt is met cuticulaire was in deze plant. Na het extraheren van de cuticulaire was door gedurende 10 s in chloroform te dopen, kon CS de rijstbladeren verwijderen (figuur 3H). CS kon echter niet doordringen in Chamaecyparis obtusa bladeren die minder doorlaatbaar zijn voor CS (figuur 3I,J). Bij chrysantenbladeren werd bruine pigmentatie geïnduceerd door polyfenoloxidatie waargenomen in de met CS behandelde bladeren (figuur 3K,L). Evenzo vertoonden tabak en torenia stampers bruine pigmentatie tijdens de CS-behandeling (figuur 3M,O). Omdat de natriumsulfietcomponent in CSA polyfenoloxidatie voorkomt vanwege het reducerende effect, kan CSA tabak en torenia stampers verwijderen zonder enige bruine pigmentatie (figuur 3N, P).
Figuur 4B laat zien dat CS-behandeling de lichtgroene kleur van het Arabidopsis H2B-mClover-blad (helder veld) verminderde en de fluorescentie-intensiteit van H2B-mClover verbeterde in vergelijking met PBS-incubatie (figuur 4A). Naast bloeiende planten is CS ook toepasbaar op mosplanten (figuur 4C); na 4 dagen CS-behandeling werd de fluorescentie van H2B-mRFP duidelijk gedetecteerd voor de gehele gametofore met verminderde chlorofylautofluorescentie. Figuren 4D,E tonen 3D reconstructiebeelden van de H2B-mClover stamper in Nicotiana benthamiana die met CSA is opgeruimd. De monsterdiepte was 440 μm. Zoals het dieptegecodeerde projectiebeeld met maximale intensiteit laat zien, maakt CSA diepe beeldvorming van uitdagende weefsels mogelijk, zoals tabakspistei.
CS en CSA waren ook compatibel met fluorescerende kleurstofkleuring. Figuur 5 laat zien dat CS tegelijkertijd kan worden gebruikt om het fluorescerende eiwit (H2B-mClover) en organische fluorescerende kleurstofkleuring (Calcofluor White) te observeren. Na 3D-reconstructie van de z-stack beelden kon elke sectie worden waargenomen.
Figuur 3: Optische reiniging van bladeren en stampers met behulp van clearingoplossingen. (A-L) Vaste bladeren van verschillende soorten werden geïncubeerd in PBS (A, C, E, G, I, K) of CS (B, D, F, H, J, L) gedurende 8 dagen en CS (M, O) of CSA (N, P) gedurende 2 dagen. (A,B,O,P) Torenia fournieri, (C,D) Nicotiana tabacum, (E,F) Cucumis sativus, (G,H) Oryza sativa, (I,J) Chamaecyparis obtusa, (K,L) Chrysanthemum morifolium, (M,N) Nicotiana benthamiana. Schaalbalken: 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Fluorescentiebeeldvorming van weefsels behandeld met clearingoplossingen. (A,B) UBQ10pro::H2B-mClover-bladeren van Arabidopsis thaliana werden gedurende 3 dagen behandeld met PBS (A) of CS (B). (C) H2B-mRFP bladgametoforen van Physcomitrium patens werden gedurende 4 dagen behandeld met CS. De kernen werden gelabeld met H2B-mRFP (groen). De CS-behandeling verminderde chlorofylautofluorescentie (magenta). Het H2B-mRFP-signaal in het apicale gebied werd duidelijk waargenomen voor zowel samengevoegde beelden van H2B-mRFP als autofluorescentie of helder veld. (D,E) Het UBQ10pro::H2B-mClover stigma van Nicotiana benthamiana werd behandeld in CSA gedurende 1 maand. Maximale-intensiteitsprojectie (D) en dieptegecodeerde maximale-intensiteitsprojectie (E) werden gegenereerd uit 88 z-stack-beelden met intervallen van 5 μm. Schaalbalken: 100 μm. De beelden werden gemaakt met behulp van wide-field (A,B), confocale (C) en twee-foton excitatie (D,E) microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Fluorescerende kleurstofkleuring is compatibel met CS. (A) met CS behandelde bladeren waargenomen door twee-foton excitatiemicroscopie met 950 nm excitatie. Celwand is gekleurd met Calcofluor White (cyaan). Kernen zijn gelabeld met UBQ10pro::H2B-mClover (geel). De yz (B) en xz (C) afbeeldingen zijn doorsneden op de positie die wordt aangegeven door de witte stippellijnen in (A). Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Transparantie van natriumdeoxycholaat. (A) Kleuren van verschillende 15% natriumdeoxycholaten (vermeld in de tabel met materialen). (B) Fluorescentiespectrum van elk 15% natriumdeoxycholaat met 380 nm excitatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Deze methode bestaat uit fixeren, wassen en reinigen. Fixatie is een cruciale stap in dit protocol. Als het fluorescerende eiwit niet wordt waargenomen na PFA-fixatie, zal het niet worden waargenomen na behandeling met clearingoplossing. De penetratie van PFA-oplossing in weefsels is van cruciaal belang, maar behandeling met een hoog vacuüm wordt niet aanbevolen omdat het de celstructuur kan vernietigen. Vacuümomstandigheden en fixatieperioden moeten worden geoptimaliseerd voor elk type weefsel en soort. Het wordt aanbevolen om fluorescerende eiwitten te controleren, zelfs na fixatie. Hoewel monsters meestal gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur werden gefixeerd, kunnen ze gedurende langere tijd ('s nachts of langer) op 4 °C worden gefixeerd.
Zoals weergegeven in figuur 6A, hadden sommige natriumdeoxycholaten een lichtgele kleur wanneer ze werden opgelost. Dergelijke natriumdeoxycholaatoplossingen vertoonden sterke autofluorescentie in het gebied van 400-600 nm na excitatie bij 380 nm (figuur 6B). Deze autofluorescentie voorkomt optische clearing en fluorescentie beeldvorming. Gebruikers moeten de kleur van natriumdeoxycholaatoplossing controleren, omdat de kwaliteit van het reagens kan verschillen als gevolg van zuiverheid, partij-tot-partij variatie of andere redenen.
De hier gebruikte clearingoplossingen hebben hoge concentraties natriumdeoxycholaat, die de membraanstructuur kunnen vernietigen. De plasmamembraanmarker (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) werd zelfs na cs-behandeling7 waargenomen. Het kan echter beter zijn om de concentratie natriumdeoxycholaat te verlagen, afhankelijk van de structuur en het weefsel van belang. Inderdaad, beelden met verbeterde helderheid werden verkregen voor Arabidopsis-stampers met gemodificeerd CS, waarbij de concentratie natriumdeoxycholaat met de helft wordt verminderd; verlaagde concentraties natriumdeoxycholaat vereisten echter langere behandelingstijden (bijv. 1 maand voor Arabidopsis-stampers ).
CS kan rode autofluorescentie (>610 nm) verminderen om chlorofyl in behandelde monsters te verwijderen. Autofluorescentie met een bereik van 500-600 nm (geel tot oranje) bleef echter zelfs in met CS behandelde monsters7. Deze autofluorescentie wordt verondersteld te zijn afgeleid van de celwand en andere cellulaire componenten, zoals lignine12,13. Daarom is het moeilijk om weefsels, zoals stengels met ontwikkelde secundaire wanden, volledig transparant te maken door CS-behandeling.
Verschillende reinigingsreagentia naast de hier gebruikte zijn ontwikkeld om fluorescerende eiwitten in planten te observeren met behulp van fluorescerende microscopie14,15,16,17. In vergelijking met deze methoden verwijderen CS en CSA chlorofyl en verminderen ze autofluorescentie, waardoor de plantenweefsels transparanter worden. Onlangs ontwikkelden Sakamoto et al. een verbeterde methode, iTOMEI, voor fixatie, reinigingsmiddelreiniging en montage om de brekingsindexmismatch aan te passen18. Bij Arabidopsis-zaailingen wiste iTOMEI het weefsel binnen 26 uur.
CS is toepasbaar op een breed scala aan plantensoorten, zoals Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avocado21, gerst22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Eucalyptus25, maize26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, soybean33, strawberry34, wheat35 en Wolffiella hyalina36. Voor dikkere weefsels kan CS ook de vibratome-secties transparant maken37,38. Deze methode maakte studies van de cellulaire structuur en genexpressiepatronen in planten mogelijk37,38. Bovendien werden nematodeninfecties20,39, schimmelinfecties en symbiose19,40,41 ook diep in de met CS behandelde weefsels waargenomen. Deze methode is dus nuttig voor beeldvorming van het hele weefsel van micro- tot macroschalen en kan helpen om nieuwe interacties tussen verschillende cellen, weefsels, organen en organismen te ontdekken.
Disclosures
ClearSee wordt gecommercialiseerd (Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation, Japan). Nagoya University heeft een patent (JP6601842) op het clearing reagens ClearSee. D. Kurihara is de uitvinder van het octrooi. De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 to T.H.), Grant-in-Aid for Scientific Research (B, JP17H03697 to D.K.), Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (JP18K19331 to D.K.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP20H05358 for D.K.)) en het Japan Science and Technology Agency (PRESTO program (JPMJPR15QC to Y.M., JPMJPR18K4 naar D.K.)). De auteurs zijn het Live Imaging Center van het Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM) van nagoya university dankbaar voor het ondersteunen van de microscopische studies en Editage (www.editage.com) voor Engelstalige bewerking.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
| ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
| Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
| Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
| Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
| Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
| Needle | TERUMO | NN-2238S | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
| Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
| Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
| Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
| Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
| Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
| Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
| Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
| Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
| Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
References
- Vogelmann, T. C.
- Krause, G. H., Weis, E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 42 (1), 313-349 (1991).
- Pourcel, L., Routaboul, J., Cheynier, V., Lepiniec, L., Debeaujon, I. Flavonoid oxidation in plants: from biochemical properties to physiological functions. Trends in Plant Science. 12 (1), 29-36 (2007).
- Lersten, N. R. An annotated bibliography of botanical clearing methods. Iowa State Journal of Science. 41 (4), 481-486 (1967).
- Villani, T. S., Koroch, A. R., Simon, J. E. An improved clearing and mounting solution to replace chloral hydrate in microscopic applications. Applications in Plant Sciences. 1 (5), 1300016 (2013).
- Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. -U. Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains. PLoS ONE. 7 (3), 33916 (2012).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Higashiyama, T. ClearSeeAlpha: advanced optical clearing for whole-plant imaging. Plant and Cell Physiology. 62 (8), 1302-1310 (2021).
- Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
- Tofanelli, R., Vijayan, A., Scholz, S., Schneitz, K. Protocol for rapid clearing and staining of fixed Arabidopsis ovules for improved imaging by confocal laser scanning microscopy. Plant Methods. 15 (1), 120 (2019).
- Vijayan, A., et al. A digital 3D reference atlas reveals cellular growth patterns shaping the Arabidopsis ovule. eLife. 10, 1-38 (2021).
- Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., George Barisas, B., Seidel, T. Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells. Frontiers in Plant Science. 4, 1-20 (2013).
- Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues. Protoplasma. 252, 1231-1240 (2015).
- Littlejohn, G. R., Gouveia, J. D., Edner, C., Smirnoff, N., Love, J. Perfluorodecalin enhances in vivo confocal microscopy resolution of Arabidopsis thaliana mesophyll. New Phytologist. 186 (4), 1018-1025 (2010).
- Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy. Plant Physiology. 166 (4), 1684-1687 (2014).
- Hasegawa, J., et al. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant and Cell Physiology. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A versatile optical clearing protocol for deep tissue imaging of fluorescent proteins in Arabidopsis thaliana. PLOS ONE. 11 (8), 0161107 (2016).
- Sakamoto, Y., et al. Improved clearing method contributes to deep imaging of plant organs. Research Square. , (2021).
- Tanaka, E., Ono, Y. Whole-leaf fluorescence imaging to visualize in planta fungal structures of Victory onion leaf rust fungus, Uromyces japonicus, and its taxonomic evaluation. Mycoscience. 59 (2), 137-146 (2018).
- Ohtsu, M., et al. Spatiotemporal deep imaging of syncytium induced by the soybean cyst nematode Heterodera glycines. Protoplasma. 254, 2107-2115 (2017).
- Duman, Z., et al. Short de-etiolation increases the rooting of VC801 Avocado rootstock. Plants. 9 (11), 1481 (2020).
- Ho, W. W. H., et al. Integrative multi-omics analyses of barley rootzones under salinity stress reveal two distinctive salt tolerance mechanisms. Plant Communications. 1 (3), 100031 (2020).
- Arsovski, A. A., et al. BrphyB is critical for rapid recovery to darkness in mature Brassica rapa leaves. bioRxiv. , (2020).
- Doll, Y., Koga, H., Tsukaya, H. The diversity of stomatal development regulation in Callitriche is related to the intrageneric diversity in lifestyles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (14), (2021).
- Eliyahu, A., et al. Vegetative propagation of elite Eucalyptus clones as food source for honeybees (Apis mellifera); adventitious roots versus callus formation. Israel Journal of Plant Sciences. 67 (1-2), 83-97 (2020).
- Kelliher, T., et al. MATRILINEAL, a sperm-specific phospholipase, triggers maize haploid induction. Nature. 542, 105-109 (2017).
- Aki, S. S., et al. Cytokinin signaling is essential for organ formation in Marchantia polymorpha. Plant and Cell Physiology. 60 (8), 1842-1854 (2019).
- Kinoshita, A., Koga, H., Tsukaya, H. Expression profiles of ANGUSTIFOLIA3 and SHOOT MERISTEMLESS, key genes for meristematic activity in a one-leaf plant Monophyllaea glabra, revealed by whole-mount in situ hybridization. Frontiers in Plant Science. 11, 1-11 (2020).
- Okazawa, A., et al. Localization of planteose hydrolysis during seed germination of Orobanche minor. bioRxiv. , 448768 (2021).
- Chen, M., et al. VAPYRIN attenuates defence by repressing PR gene induction and localized lignin accumulation during arbuscular mycorrhizal symbiosis of Petunia hybrida. New Phytologist. 229 (6), 3481-3496 (2021).
- Chu, T. T. H., et al. Sub-cellular markers highlight intracellular dynamics of membrane proteins in response to abiotic treatments in rice. Rice. 11, 23 (2018).
- Alaguero-Cordovilla, A., et al. An auxin-mediated regulatory framework for wound-induced adventitious root formation in tomato shoot explants. Plant, Cell & Environment. 44 (5), 1642-1662 (2021).
- Okuda, A., Matsusaki, M., Masuda, T., Urade, R. Identification and characterization of GmPDIL7, a soybean ER membrane-bound protein disulfide isomerase family protein. The FEBS Journal. 284 (3), 414-428 (2017).
- Kim, D. -R., et al. A mutualistic interaction between Streptomyces bacteria, strawberry plants and pollinating bees. Nature Communications. 10 (1), 4802 (2019).
- Wu, J., Mock, H. -P., Giehl, R. F. H., Pitann, B., Mühling, K. H. Silicon decreases cadmium concentrations by modulating root endodermal suberin development in wheat plants. Journal of Hazardous Materials. 364, 581-590 (2019).
- Isoda, M., Oyama, T. Use of a duckweed species, Wolffiella hyalina, for whole-plant observation of physiological behavior at the single-cell level. Plant Biotechnology. 35 (4), 387-391 (2018).
- Ben-Targem, M., Ripper, D., Bayer, M., Ragni, L. Auxin and gibberellin signaling cross-talk promotes hypocotyl xylem expansion and cambium homeostasis. Journal of Experimental Botany. 72 (10), 3647-3660 (2021).
- Shwartz, I., et al. The VIL gene CRAWLING ELEPHANT controls maturation and differentiation in tomato via polycomb silencing. bioRxiv. , (2021).
- Levin, K. A., Tucker, M. R., Strock, C. F., Lynch, J. P., Mather, D. E. Three-dimensional imaging reveals that positions of cyst nematode feeding sites relative to xylem vessels differ between susceptible and resistant wheat. Plant Cell Reports. 40 (2), 393-403 (2021).
- Nouri, E., et al. Phosphate suppression of arbuscular mycorrhizal symbiosis involves gibberellic acid signaling. Plant and Cell Physiology. 62 (6), 959-970 (2021).
- Evangelisti, E., et al. Artificial intelligence enables the identification and quantification of arbuscular mycorrhizal fungi in plant roots. bioRxiv. , 434067 (2021).
