Summary
Denne protokollen presenterer en ny kirurgisk teknikk for nyretransplantasjon med fokus på en modifisert arteriell anastomosestrategi. En vaskulær suturteknikk inkludert en enkel og sikrere anastomosemetode for urinblære presenteres også. Disse modifikasjonene forkorter operasjonstiden og forbedrer suksessraten for musens nyretransplantasjonsprosedyre.
Abstract
Nyretransplantasjon hos mus er en komplisert og utfordrende kirurgiprosedyre. Det er svært få publikasjoner som demonstrerer de viktigste trinnene i denne operasjonen. Derfor introduserer denne artikkelen teknikken og påpeker de kirurgiske forbeholdene knyttet til denne operasjonen. I tillegg er viktige modifikasjoner i forhold til den konvensjonelle prosedyren demonstrert. For det første blir en flekk av bukaorta kuttet og forberedt slik at de proksimale bifurkasjonene i nyrearterien, inkludert ureteral arterien, blir transektert sammen med donor nyre en blokk. Dette reduserer risikoen for en urinrørnekrose og unngår utviklingen av en urinveis okklusjon. For det andre er det demonstrert en ny metode for vaskulær anastomose som gjør at operatøren fleksibelt kan øke eller redusere størrelsen på anastomose etter at nyretransplantasjonsreperfusjon allerede er igangsatt. Dette unngår utvikling av fartøyets striktur og intraabdominal blødning. For det tredje vises en teknikk som muliggjør anastomose av den delikate donorureteren og mottakerblæren som ikke forårsaker traumer. Ved å ta i bruk denne protokollen kan operasjonstiden forkortes og skaden på mottakerens blære reduseres, og dermed øke driftssuksessraten for mottakermusene betydelig.
Introduction
Siden Sakowitz et al. utviklet musemodeller for nyretransplantasjon i 1973 for første gang1, har det vist seg som et viktig eksperimentelt verktøy for å studere mekanismene for transplantasjons iskemisk skade og alloimmun avvisning, samt for å utvikle nye behandlinger med sikte på å forlenge allograft overlevelse og muligens for å oppnå immunologisk toleranse. Imidlertid har den kirurgiske teknikken vist seg å være kompleks og svært krevende, noen ganger har komplikasjoner som vaskulære anastomotiske striktur som fører til prerenal ikke-immunologisk nyretransplantasjonssvikt2, postrenal svikt forårsaket av iskemi og etterfølgende nekrose av den transplanterte urinblæren, strikturene av anastomose av den transplanterte urinlederen og / eller mottakerens urinblære som fører til en forstyrrelse av urinutløpet. Alle disse er grunner til at nyretransplantasjon hos mus ikke er videreutviklet og derfor ikke er mye brukt. Etablering av en effektiv og langsiktig stabil muse nyretransplantasjonsmodell uten vaskulære og urinveiskomplikasjoner har fortsatt uerstattelig betydning for mange studier i transplantasjonsfeltet med fokus på nyreimmunnmedierte, men også smittsomme sykdommer3. I tillegg, sammenlignet med andre organtransplantasjoner i murinmodeller som lunge-, hjerte- og tarmtransplantasjon 4,5, gir musen nyretransplantasjonsmodellen en sjanse til å studere langsiktig overlevelse selv i innstillingen av store histokompatibilitetsantigenforskjeller 3,6. Det har også vist seg at i samme setting av donormottakerstammekombinasjoner er forskjellige organtransplantasjoner som hjerte eller nyre preget av forskjellig dynamikk og utbrudd av allograft avvisning3. Videre, fra det nephrologiske synspunktet, er det en mer egnet modell for å studere parenchymale medierte immunregulatoriske mekanismer i sammenheng med akutte og kroniske avvisningshendelser enn enkle hudtransplantasjonsforsøk.
På grunnlag av tidligere rapporter om den kirurgiske teknikken for nyretransplantasjon hos mus 3,7,8,9, demonstrerer vi her følgende pålitelige forbedringer som har blitt brukt i løpet av de siste 10 årene i vår gruppe 10,11,12: For det første er ureteral arterien trygt bevart når nyrearterien blir resected en bloc sammen med den respektive delen av abdominal aorta. For det andre, en ny, enkel og rask teknikk av en knuteløs vaskulær anastomose der den endelige masken av anastomose ikke er bundet med slutten av det øvre slipset som den tradisjonelle tilnærmingen, men forblir fri. Denne teknikken gjør det mulig å øke eller redusere størrelsen på anastomose etter nyrereperfusjon for å unngå karstraff og intraabdominal blødning. For det tredje ble 21 G og 30 G sprøytenåler brukt som et hjelpepunkteringsguideverktøy for å implantere donorureteren i mottakerens blærevegg og redusere skaden på mottakerens blære og lette dannelsen av strengfri anastomose.
I denne rapporten sammenlignet vi også den tradisjonelle, mye brukte teknikken med den modifiserte som er etablert i vårt laboratorium og fant ingen signifikant forskjell i graden av nyrerørformet atrofi og nyretransplantasjon interstitiell vevsfibrose. I tidligere studier sammenlignet vi i tillegg resultatene av denne nye teknikken med den konvensjonelle metoden når det gjelder lokal blødning, trombose, tid for å utføre fartøyets anastomose og overlevelsesrate. Vi fant forbedringer som betydelige reduksjoner av lokale trombosehendelser (1,1 % versus 6,6 %), redusert tid for anastomoseprosedyren og en svært reproduserbar nyretransplanttisk transplantat langtidsoverlevelse (95 % versus 84 % med den klassiske tilnærmingen)10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført i henhold til retningslinjene fra Europaparlamentets direktiv 2010/63/EU om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål (Animalsk etikkkort: Niedersachsens mat- og narkotikadepartement, #33.9-42502-04-11/0492). Utfør prosedyrer ved hjelp av sterile kirurgiske instrumenter og forbruksvarer (autoklavert) og prøv å holde operasjonsområdet så sterilt som mulig.
MERK: C57BL/6J mannlige mus fungerte som donorer og mottakere (syngeneisk transplantasjonsmodell) mens Balb/c mus fungerte som nyre allograftmottakere (modell for å studere akutt allograft avvisningsmodell9). Mus var i alderen 8-12 uker, veide ~ 25-30 g ved transplantasjon og ble plassert under standardforhold. Data rapportert i dette manuskriptet ble generert av fire kirurger som hadde erfaring med muskirurgi.
1. Forberedende trinn
- For kirurgi, bruk et sett med mikroskopiske instrumenter, inkludert en mikrosaks, mikro-tang, en nåleholder, mikro hemostatiske klemmer og en elektrokirurgisk penn. Utfør suturer med 7/0er, 10/0er eller 4/0er nylonmonofilament.
- For anestesi, plasser musen i esken for innånding av isofluran (2%) i ca 40-60 s for å indusere bevisstløshet.
- Når musen er bedøvet, vei musen.
- I henhold til musens vekt, bruk en intraperitoneal injeksjon av ketamin (100 mg / kg) + xylazin (10 mg / kg) + acepromazin (2 mg / kg) for å bedøve musen13. Bekreft at musen er bedøvet ved å observere mangel på respons på en tåklemme.
- Når anestesi har trer i kraft, klipp bukpelsen. Fest deretter musen på operasjonsbordet ved å immobilisere lemmer løst med et sterilt maskeringstape.
- Desinfiser musens underliv etter å ha plassert musen på operasjonsbordet. Utfør desinfeksjon ved hjelp av vekslende skrubb av povidonjodid (iodofor) og alkohol, tre ganger (bruk konsentrisk mønster, start skrubb midt i magen og beveg deg utover), og dekk deretter musen riktig ved hjelp av et fenestert kirurgisk håndkle.
- Påfør øyesalve og opprettholde sterilitet gjennom hele prosedyren.
MERK: Antibiotika anbefales ikke gjennom hele prosedyren, da disse stoffene kan påvirke immunologiske responser.
2. Donor operasjon prosedyre
- Bruk saks til å kutte huden og utføre et kryss abdominal snitt på ca 3-4 cm. Klipp musklene i bukveggen. Dekk og forsiktig flytte bort viscera med en saltvann imbibed gasbind.
- Bruk en bomullspinne til forsiktig å fjerne tarmene, magen og milten mot høyre side (fra musens synspunkt), dekk og forsiktig flytt bort viscera med en saltvanns imbibed gasbind.
- Bruk mikro tang for å eksponere venstre nyre, aorta og dårligere vena cava (IVC).
- Bruk en elektrokirurgisk blyant for å cauterize venstre lumbal årer, inkludert deres underliggende grener og andre små fartøy sammen med venstre binyrefartøy, forsiktig.
- Bruk mikrosaks og tang for å dissekere venstre urinlederen og forsiktig mobilisere den fra det omkringliggende vevet. Rengjør kutt den nær urinblæren. Mobiliser aortaområdet mellom venstre og høyre nyrearteri ca. 2 mm i lengde.
- Bruk mikro tang for å skille den infrarenale dårligere vena cava (IVC) og aorta, og bruk deretter buede tang til å passere under aorta for å plassere et løst slips på 7-0 silke sutur rundt dette fartøyet.
- Kryss klemme området av aorta under høyre nyrearterie og dårligere vena cava (IVC) ved hjelp av to 5 mm mikrovaskulære klemmer.
- Transekt venstre nyreåre fra vena cava.
- Bruk en sprøyte til å skylle aorta med 1 ml heparin saltløsning (60 U/ml).
- Bruk mikro tang for å stramme ligaturen som brukes i trinn 2.5. Klipp deretter aorta under ligaturen så vel som under den proksimale klemmen. Med dette må de proksimale bifurkasjonene i nyrearterien (vær oppmerksom på at arterieåpningen må kuttes pent, ellers vil det påvirke anastomose) og ureteral arterien er inkludert og transektert en blokk. Forbered forsiktig, slik at den delikate urinrørsarterien er helt bevart.
- Bruk elektrokirurgisk blyant og tang for å frigjøre venstre nyre og tilhørende kar helt ved forsiktig cauterizing alle fartøy rundt vev. Fjern nyrene og oppbevar den i saltoppløsning ved 4 °C.
- Euthanize bedøv den bedøvede donormusen ved halshugging.
3. Operasjonsprosedyre for mottaker
- Utfør de første kirurgiske trinnene (inkludert anestesi og sterilisering, se trinn 1.1 til 1.7) som beskrevet for donormusen.
- Bruk saks til å åpne magen via et median snitt (ca. 2,5 cm i lengde), og dekk deretter bukorganene med en våt gasbind ved hjelp av saltløsning.
- Ta forsiktig vare på den infrarenale aorta og dårligere vena cava (IVC) og sørg for at hver stor kargren er cauterized. Bruk den elektriske cautery samt å dissekere venstre urinlederen forsiktig i en posisjon proksimal til nyrebekken. Fjern deretter venstre nyre.
- Bruk mikro tang og bomull knopper for å eksponere abdominal aorta og dårligere vena cava og løsne dem fra det omkringliggende fettvevet (ca. over 4 mm i lengde).
- Bruk to mikrovaskulære klemmer og plasser dem proksimalt og distalt på både den dårligere vena cava og abdominal aorta samtidig.
- Bruk en mikronålholder til å lede en 10/0 monofilament (laget av syntetisk fiber med en jevn overflate) suturnål, som er plassert gjennom aortaveggen på en proksimal til distal måte.
- Oppnå en elliptisk arteriotomi på ca. 1 mm med en skånsom oppadgående trekkraft av suturen, mens du skjærer rett under nålens nedre overflate med fin, buet saks.
- Bruk mikrosaks til å kutte den dårligere vena cava (IVC) langsgående med tilstrekkelig lengde på ca. 1,5 mm. Plasser dette snittet litt under den aortaiske motparten.
- Utfør donor og mottaker aorta anastomose på en ende-til-side måte. Plasser donor nyre på høyre side av mottakerens dårligere vena cava justere mansjetten av donorens abdominal aorta med anastomose av mottakerens abdominal aorta.
- Bruk en mikronålholder og to separate 10-0 suturer for å sy de proksimale og distale endene av anastomose.
- Etter binding, la de to lange suturene, inkludert nålen, være på plass. Sy venstre side av anastomosens aortale vegg kontinuerlig med to jevnt fordelte masker i en distal-proksimal retning.
- Etter den siste masken, før suturen gjennom en delvis tykkelse på karveggen over det øvre oppholdssugebåndet.
- Bruk mikro tang til samtidig å utøve forsiktig trekkraft til den korte enden av nedre sutur slips.
MERK: I denne nye knuteløse teknikken er den siste masken ikke bundet til den korte enden av det øvre slipset. - Bruk mikro tang for å snu den transplanterte nyre til sin normale posisjon. Sy nå kontinuerlig høyre vegg av aortal anastomose ved hjelp av tre masker på en proksimal til distal måte.
MERK: Sammenlignet med den konvensjonelle kirurgisketeknikken 7,8 slås den siste suturen sammen med det distale slipset i nærheten. Ikke bind den til enden av den nedre suturen, kutt den for å etterlate en fri lengde på 2-3 mm i stedet. - Utfør venøs anastomose ved hjelp av samme suturing prosedyre som tidligere beskrevet med forskjellen at fire til fem masker er nødvendig for hver side av anastomose. Den endelige masken er igjen som en fri ende av lignende lengde som ligner den aortale anastomose beskrevet ovenfor.
- Etter å ha fullført begge anastomosene, bruk en tørr vattpinne for å utøve forsiktig trykk mot det suturerte området i ca 10-20 s.
- Bruk en klipsapplikator tang for å fjerne begge klemmene, først den nedre deretter den øvre. Skyll bukhulen med 0,9% natriumklorid ved en temperatur på 38,0 °C.
- Vær oppmerksom på reperfusjonen av den transplanterte nyren.
4. Ureteral implantasjon
- Bruk en mikronålholder til å trenge gjennom mottakerens urinblære med en 10/0 sutur (rett nål) og sett den inn i en 21 G nållumen for veiledning (se Supplerende figur 1a).
- Før nå 21 G nålen til å sy et hull på stedet for forrige nålpåføring (Tilleggsfigur 1b).
- Trekk ut 21 G nålen (tilleggsfigur 1c).
- Bruk en mikronålholder og 10/0 sutur til å sy (ingen slips) den trimmede urinlederenden og perforere blæren med denne 10/0-suturen igjen ved inngangsstedet (Tilleggsfigur 1d).
- Bruk en mikronålholder til å slepe 10/0-filamentet og urinlederen inn i urinblæren gjennom det konstruerte hullet (Tilleggs figur 1e).
- Bruk en mikronålholder og en annen 10/0 sutur for å anastomose donorens urindempeter til mottakerens urinblære. Her kobler du urinlederens ytre membran til den ytre membranen på blæreveggen, og utfører periodiske suturer med 3 til 4 masker. Til slutt trekker du ut trekkraftsugingen (supplerende figur 1f).
- Bruk tang for å plassere tarmene tilbake i bukhulen. Utfør tolags suturer (først magemusklene etterfulgt av huden) for å lukke magesårene ved hjelp av en 4/0 filament.
- Plasser de transplanterte musene i et oksygen- og temperaturkontrollert kammer for å gjenopprette etter operasjonen.
- For postoperativ analgesi, gi Metamizol direkte 200 mg/kg per os etter bruk.
Fire og 16 timer etter operasjonen gi Metamizol 200 mg/kg per os pluss Carprofen (5mg/kg) s.c. I den videre oppfølgingen, bruk Carprofen (5 mg/kg) s.c. på de transplanterte musene hver 24. Hvis det er tegn på utilstrekkelig analgesi buprenorfin 0,05 mg/kg er i tillegg gitt hver 8 h s.c.
5. Kontralateral nephrektomi og offer av mottakermusen
MERK: Utfør kontralateral nephrektomi av mottakermusen 5 dager etter transplantasjon.
- Utfør den kontralaterale nephrektomien til den transplanterte musen 5 dager etter transplantasjon under anestesi. Ligate og kutte mottakerens autologe høyre nyrearterier og årer, fjern riktig nyre og lukk bukhulen. Den postoperative omsorgen og analgesien er den samme som beskrevet tidligere (se trinn 4.7).
- Hev og registrer musens tilstand. Gi den transplanterte musen postoperativ analgesi, mat og vannforsyning.
- Fire uker etter transplantasjon, ofre halvparten av de transplanterte musene og utfør H&E-farging for nyretransplantasjonene.
- 12 uker etter transplantasjon, ofre de resterende musene og utfør Masson Gold farging av disse nyretransplantasjonene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fire uker etter transplantasjon viste både den modifiserte teknikken og den konvensjonelle teknikken moderate tegn på nyrerøratrofi14,15 sammenlignet med den innfødte mottakeren kontralaterale nyrer (figur 1). Graden av nyre tubules atrofi viste ingen signifikant forskjell mellom de to forskjellige teknikkene. Masson Goldners trichrome farging14,15 av nyrene 12 uker etter transplantasjon viste jevnt åpenbare tegn på interstitiell vev fibrose sammenlignet med normale ikke-transplanterte nyrer (figur 2).
Vi har tidligere undersøkt utfallet av denne nye knuteløse teknikken (n = 175) og sammenlignet den med den klassiske tilnærmingen (n = 122) når det gjelder tekniske aspekter ved prosedyren og intraoperative og postoperative komplikasjoner (se også tabell 1)10. Den modifiserte teknikken som er vist her var forbundet med en lavere forekomst av intragraft arterielle eller venøse trombotiske hendelser (figur 3b, 1,1% versus 6,6%). Tiden for å utføre anastomose var betydelig mindre (figur 3a), og en svært reproduserbar nyretransplantasjon langsiktig overlevelse ble oppnådd (95% versus 84%, p < 0,001, figur 3c) som bestemt av mottakerens overlevelse 12 uker etter transplantasjon. I tillegg påvirker anvendelsen av denne modifiserte transplantasjonsprosedyren ikke nyre allograftfunksjonen som vurderes av serumkreatinin i observasjonsperioden på 12 uker10.
| Konvensjonell | Ny knuteløs teknikk | |
| (n=122) | (n=175) | |
| Operasjonstider | ||
| Tid for arteriell anastomose (min) | 9.2 ± 0,09 | 7,5 ± 0,06** |
| Tid for venøs anastomose (min) | 9.1 ± 0,10 | 7,5 ± 0,05** |
| Komplikasjonsrater | ||
| Trombose | 8 (6.6%) | 2 (1,1 %)* |
| Lokal blødning | 4 (3.3%) | 1 (0.6%) |
| Suksessrate | 103 (84.4%) | 167(95.4%)** |
| Rong, S., Lewis AG., Kunter U., et al. En knuteløs teknikk for nyretransplantasjon i musen. J-transplantasjon. Epub2012:127215,(2012). | ||
Tabell 1: Sammenligning av denne nye teknikken (n = 175) med den konvensjonelle teknikken (n = 122) når det gjelder tekniske aspekter ved prosedyren og intraoperative og postoperative komplikasjoner10. Tall representerer operasjonstidene i minutter for hver prosedyre (gjennomsnitt ± SD).
Figur 1: Representative histologiske resultater som vurderer rørformet atrofi. HE Farging av nyretransplantasjoner 4 uker etter transplantasjon (40x): (a) normal ikke-transplantert nyre, (b) konvensjonell teknikk og (c) modifisert teknikk for en nyretransplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative histologiske resultater som vurderer interstitiell fibrose. Masson Goldners trichrome farging 12 uker etter transplantasjon (40x) av (a) normal ikke-transplantert nyre, (b) konvensjonell teknikk, og (c) modifisert teknikk for en syngeneisk nyretransplantasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av driftstider for karanastomoser, komplikasjoners frekvens og suksessrater mellom den modifiserte og konvensjonelle teknikken10 Barografiene i (a) skildrer operasjonstiden som trengs for å utføre karets anastomose; bargraphs i (b) skildrer intragraft trombose hendelser og lokale blødningsproblemer; mens bargraphs i (c) demonstrerer en høyere suksessrate for den nye knuteløse teknikken i henhold til overlevelse større enn 12 uker posttransplant etter ytterligere utvisning av den innfødte kontralaterale nyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Oversikt over den anatomiske strukturen (øvre paneler a og b) og reseksjonslinjer i aorta- og nyrearterien for både den konvensjonelle (c) og den modifiserte teknikken (d). (A) Abdominal aorta, (B) Nyrearterie, (C) Ureteral arterie, (D) Nyre, (E) Ureter. Venøse fartøyene (V. cava, inkludert Vv. renales) er avbildet som stiplede linjer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksemplarisk demonstrasjon av en knuteløs søm av arteriefartøyet anastomose som viser (A) abdominal aorta, (B) nyrearterien, og (C) den knuteløse sømteknikken der den siste masken av anastomose ikke er bundet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Anastomose av donorureteren med mottakerens urinblære. (a) Tre gjennom mottakerens urinblære med en 10/0 monofilament og sett den inn i en 21 G nål lumen, (b) Før 21 G nålen til å utføre et hull som er plassert ved forrige nålperforering, (c) trekk ut 21 G nålen, (d) sy den trimmede urinlederenden med 10/0-suturen og perforer blæren med 10/0-suturen igjen på inngangsstedet, (e) deretter, slepe 10/0 suturen og urinlederen inn i urinblæren gjennom det konstruerte hullet, (f) og anastomose donorens urinrører til mottakerens blære med en annen 10/0 sutur. Til slutt trekker du ut trekkraft suturen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens hudtransplantasjonsmodellen hos mus er enkel og enkel å utføre for å studere alloimmune avvisningshendelser, har de kirurgiske teknikkene for å undersøke mer spesifikt de alloimmune-relaterte inflammatoriske endringene etter hjerte16 og nyretransplantasjon10 vist seg å være komplekse og svært krevende. Fra transplantasjonsnefrologens synspunkt har etableringen av en effektiv og langsiktig stabil nyretransplantasjonsmodell fortsatt en uerstattelig betydning for mange funksjonelle og immunologiske studier. I tillegg, sammenlignet med andre organtransplantasjoner, kan musens nyretransplantasjonsmodell oppnå en langvarig overlevelse selv med visse forskjeller i store histokompatibilitetsantigener som innebærer muligheten for å studere immunreguleringsmekanismer i den langsiktige utviklingen av både avvisning eller identifisering av forutsetningsfaktorer for å etablere alloimmun toleranse3.
Som beskrevet tidligere er nyretransplantasjon hos mus en utfordrende prosedyre, og suksessraten til selv erfarne kirurger varierer mye mellom 40 og 95% 10,17,18,19,20. Med hensyn til rapportene fra ulike forskningsteam rundt om i verden om denne kirurgiske teknikken, har vi gjort følgende modifikasjoner i forhold til den klassiske tilnærmingen som fører til flere forbedringer.
For det første blir en flekk av abdominal aorta kuttet og forberedt slik at de proksimale bifurkasjonene i nyrearterien og ureteralarterien blir transektert, inkludert donor nyre en blokk. Denne manøveren bevarer ikke bare fullstendig og beholder blodtilførselen og funksjonen til donorens urinlederen ved å unngå en skade på periureteralvevet og dermed forhindre postoperativ hydronefrose, men det forhindrer også postoperative strikturene i nyrearterien (figur 4). Derfor unngås nyretransplantasjons iskemi formidlet av en strenghet i nyrearterien eller forårsaket av en hydronefrose formidlet av en streng og iskemisk transplantasjonsureter, som representerer to av de viktigste aspektene for å oppnå langsiktig transplantasjonsoverlevelse i denne modellen. Imidlertid er det anatomiske varianter for avkom av urinrørsarterien. For eksempel, i noen mus stammer urinarterien fra hovedstammen til buka aorta i stedet fra nyrearterien, og posisjonen til dette avkomet er for det meste ca. 0,2 til 0,5 mm distal fra nyrearteriens avkom (avbildet i figur 4). Fra vår erfaring vil vi estimere forekomsten av ureteral arterien som stammer direkte fra aorta i ca 20% av C57BL / 6J mannlige mus (upublisert observasjon), og mer sjelden i andre stammer av mus som BALBc. I noen av de rapporterte tradisjonelle kirurgiske metodene ble dette viktige næringsrike fartøyet noen ganger forsømt å beskytte, da det ble ignorert og direkte ligatert eller elektrokautert.
Spesielt i disse situasjonene med anatomiske varianter når avkom av musens ureterale arterie stammer fra hovedstammen til bukaorta under avkom av nyrearterien, er denne metoden for en bloc-transeksjon og rekonstruksjon av aortaanastomose enda mer egnet. Erfarne kirurger kan til og med bestemme når de skal bruke den tradisjonelle eller modifiserte en bloc anastomose.
For det andre, anvendelsen av en ny, enkel og rask teknikk av en knuteløs vaskulær anastomose der den endelige masken av anastomose ikke er bundet med slutten av det øvre slipset som den tradisjonelle tilnærmingen, men forblir fri, tilbyr i stedet en verdifull fordel (se figur 5). Denne teknikken gjør det fortsatt mulig å øke eller redusere størrelsen på anastomose etter at nyretransplantasjonsreperfusjon allerede er initiert. Dette unngår utvikling av fartøyets striktur og intraabdominal blødning. I tillegg kan de frie haler av forankringsmaskene i begge ender trekkes i motsatte retninger for å fleksibelt justere og utvide anastomose for å unngå stenose i arteriene eller venene. Sømteknikken forbedrer derfor kirurgifeiltoleransen og er vennlig for nybegynnere20.
For det tredje, for å atraumatisk utføre anastomose av donorureteren og mottakerblæren, ble 21 G og 30 G sprøytenåler brukt som hjelpepunkteringsføringsverktøy. Hos mus er urinlederen ganske tynn og veldig delikat for å utføre en ende-til-ende anastomose. Vanligvis blir donorureteren direkte trukket inn i blæren ved hjelp av tang for å lede urinlederen etter å ha perforert blæren med en sprøytenål. Vi har forbedret denne metoden ytterligere ved å bruke en tynnere diameter 30 G sprøytenål som en veiledning for 21 G sprøytenålen (Seldinger-prosedyren). Med denne atraumatiske teknikken trenger ikke 21 G sprøytenålen inn i hele blæren, noe som reduserer blærens skade og vanskeligheten med urinimplantasjonen17 (Supplerende figur 1).
Et kritisk trinn i protokollen er konfigurasjonen av arteriell åpning. I begge tilfeller (donor og mottaker) må disse kuttes pent, ellers vil det påvirke kvaliteten på anastomose. Videre, i denne nye knuteløse teknikken, er den siste masken ikke bundet til den knutede tråden. Etter anastomose bør kirurgen i utgangspunktet holde den anastomotiske stomien liten. Deretter trekker du trådens ender i øvre og nedre ender etter reperfusjon for å forstørre den. Et annet kritisk skritt som man må være klar over er plasseringen av snittet av donor nyrearterie som urinrør arterien må identifiseres for å være beskyttet.
En stor begrensning i denne teknikken er foruten de beskrevne forbedringene - at operatøren fortsatt trenger å oppfylle høye krav da fartøyveggene er små og svært ømme. Uten intens og utholdende praksis vil suksessraten for operasjonen være lav.
Oppsummert viser denne rapporten anvendelsen av en teknisk modifikasjon av nyretransplantasjonsprosedyren hos mus. Kirurgiprosedyren som presenteres her har vist seg som en verdifull og pålitelig metode som fungerte som en viktig del av flere forskningspublikasjoner i løpet av de siste 10 årene 3,19,20. Sammenlignet med den klassiske og allment etablerte operasjonsmodellen, gir metoden som er demonstrert her flere viktige forbedringer som fører til mindre komplikasjonsrater og en lengre transplantasjonsoverlevelsesrate i nyretransplantasjonsinnstillingen3. Det er viktig å nevne at begge teknikkene (modifiserte og konvensjonelle) deler de samme ytterligere komplikasjonene som påvirker mottakerens dødelighet som død ved visceral skade, lekkasje av urin, hydronefrose, infeksjoner, etc., som ikke var forskjellig. Oppsummert forbedrer denne nye kirurgiske teknikken den totale suksessraten og langsiktig graftoverlevelse, noe som gjør den til et pålitelig verktøy for å studere alloimmun respons etter nyretransplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Tiantian Bai team for hjelp med voice over, Miss Mian Pao for hennes hjelp i medisinsk illustrasjon. Dette arbeidet ble delvis støttet av Den tyske forskningsstiftelsen (DFG) for å fremme internasjonalt samarbeid (HO2581/4-1 til AH) og National Science Foundation of China (NSFC; #81760291 til FJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30G-needles | Braun | 456300 | - |
| acepromazine | CP Pharma | Tranquisol P | - |
| Bepanthen eye ointment | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | - |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | - |
| Box for insulation and oxygen supply device | RUSKINN | INVIV | - |
| C57BL/6J mice | Charles River. Germany | no catalog number | - |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | - |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | - |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | - |
| Curved forceps | WPI | 14114-G | - |
| Cutasept skin disinfection | VWR | BODL980365 | - |
| Dehydrator | DIAPATH | Donatello | - |
| electrosurgical pen | Bovie | CHANGE-A-TIP | - |
| Embedding machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-P5 | - |
| Ethanol | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 100092683 | - |
| Frozen platform | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | - |
| gauze pads, cotton swabs | Lohmann-Rauscher | 13353 | - |
| Glass slide | Servicebio | G6004 | - |
| HE dye solution set | Servicebio | G1003 | - |
| Heating mat | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | - |
| hemostatic sponge | CuraSpon | J1276A | - |
| heparine-solution | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | - |
| ice box | PETZ | No Catalog Number available | - |
| Imaging system | Nikon | Nikon DS-U3 | - |
| Inhalation anesthesia device | GROPPLER | BKGM 0616 | - |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | - |
| ketamine | Zoetis | no catalog numer | - |
| Masson dye solution set | Servicebio | G1006 | - |
| metamizole | WDT | no catalog numer | - |
| Micro scissors | FST | 15000-00,15000-10 | - |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Angled / 16 mm | FST | 18055-06 | - |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | - |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | - |
| Neutral gum | SCRC | 10004160 | - |
| Oven | Tianjin Laibo Rui Instrument Equipment Co., Ltd | GFL-230 | - |
| Pathology slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | - |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | - |
| scissors | Peha Instruments | 991083/4 | - |
| Slides | Servicebio | - | |
| small Petri dish | Sarstedt | 8,33,900 | - |
| straight forceps | WPI | 14113-G | - |
| surgical tape | BSN | 4120 | - |
| Suture Tying Forceps - 10 cm | FST | 18025-10 | - |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | - |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | - |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | - |
| Syringe (0,3 mL) | BD | 324826 | - |
| Syringe (1 mL) | BD | 320801 | - |
| Tissue spreader | Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd | KD-P | - |
| Upright optical microscope | Nikon | Nikon Eclipse E100 | - |
| xylazine | Bayer | Rompun | - |
| Xylene | Sinopharm Group Chemical Reagent Co. LtD | 10023418 | - |
References
- Skoskiewicz, M., Chase, C., Winn, H. J., Russell, P. S. Kidney transplants between mice of graded immunogenetic diversity. Transplantation Proceedings. 5 (1), 721-725 (1973).
- Jiang, K., et al. Noninvasive assessment of renal fibrosis with magnetization transfer MR imaging: Validation and evaluation in murine renal artery stenosis. Radiology. 283 (1), 77-86 (2017).
- Tse, G. H., et al. Mouse kidney transplantation: Models of allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (92), e52163 (2014).
- Okazaki, M., et al. et al.Costimulatory blockade-mediated lung allograft acceptance is abrogated by overexpression of Bcl-2 in the recipient. Transplantation Proceedings. 41 (1), 385-387 (2009).
- Chuck, N. C., et al. et al.Ultra-short echo-time magnetic resonance imaging distinguishes ischemia/reperfusion injury from acute rejection in a mouse lung transplantation model. Transplant International. 29 (1), 108-118 (2016).
- Zhang, Z., et al. Pattern of liver, kidney, heart, and intestine allograft rejection in different mouse strain combinations. Transplantation. 62 (9), 1267-1272 (1996).
- Wang, J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A.
- Plenter, R., Jain, S., Ruller, C. M., Nydam, T. L., Jani, A. H.
- Plenter, R. J., Jain, S., Nydam, T. L., Jani, A. H. Revised arterial anastomosis for improving murine kidney transplant outcomes. Journal of Investigative Surgery. 28 (4), 208-214 (2015).
- Rong, S., Lewis, A. G., Kunter, U., Haller, H., Gueler, F. A knotless technique for kidney transplantation in the mouse. Journal of Transplantation. , 127215 (2012).
- Kreimann, K., et al. Ischemia reperfusion injury triggers CXCL13 release and B-cell recruitment after allogenic kidney transplantation. Frontiers in Immunology. 11, 1204 (2020).
- Schmidbauer, M., et al. Diffusion-Weighted imaging and mapping of T1 and T2 relaxation time for evaluation of chronic renal allograft rejection in a translational mouse model. Journal of Clinical Medicine. 10 (19), 4318 (2021).
- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Haas, M. Chronic allograft nephropathy or interstitial fibrosis and tubular atrophy: what is in a name. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (3), 245-250 (2014).
- Dang, Z., MacKinnon, A., Marson, L. P., Sethi, T. Tubular atrophy and interstitial fibrosis after renal transplantation is dependent on galectin-3. Transplantation. 93 (5), 477-484 (2012).
- Yin, D., et al. Blood circuit reconstruction in an abdominal mouse heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (172), e62007 (2021).
- Zhang, Z., et al. Improved techniques for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 16 (2), 103-109 (1995).
- Mannon, R. B., et al. Chronic rejection of mouse kidney allografts. Kidney International. 55 (5), 1935-1944 (1999).
- Coffman, T., et al. Improved renal function in mouse kidney allografts lacking MHC class I antigens. Journal of Immunology. 151 (1), 425-435 (1993).
- Martins, P. N. Learning curve, surgical results and operative complications for kidney transplantation in mice. Microsurgery. 26 (8), 590-593 (2006).
