Summary
Le présent protocole décrit une méthode simple et efficace pour prélever du sang dans la veine sous-clavière chez le rat. Il permet un prélèvement rapide, rapide et facilement identifiable sans anesthésie et permet d’obtenir du sang de haute qualité grâce à des prélèvements répétitifs d’échantillons.
Abstract
Les rats sont largement utilisés dans les études pharmacocinétiques (PK) et toxicocinétiques (TK) qui doivent recueillir une certaine quantité de sang à des moments précis pour détecter l’exposition aux médicaments. La méthode d’échantillonnage du sang de rat détermine la qualité du plasma et affecte davantage la précision des résultats des tests. La méthode de prélèvement sanguin dans les veines sous-clavières décrite dans ce protocole prélève des échantillons de sang à plusieurs reprises dans l’état conscient des animaux pour répondre aux besoins des tests pharmacocinétique et TK. Les compétences de manipulation de contention et la procédure appropriée d’incision de l’aiguille assurent le taux de réussite de la collecte de sang. Il est facile à utiliser tout en assurant la qualité du plasma et en même temps en veillant au bien-être animal. Cependant, cette méthode nécessite une opération habile, et une mauvaise méthode peut causer la faiblesse, la douleur, la boiterie et même la mortalité des animaux. La méthode actuelle a été utilisée dans l’installation d’essai pour une étude de toxicité orale de 4 semaines chez des rats Sprague Dawley (SD) avec TK. La quantité maximale de sang prélevée dans les 24 heures ne dépassait pas 20 % du sang total de l’animal. Le poids corporel des animaux était supérieur à 200 g pour les mâles et les femelles. Les données ont montré que le poids corporel des animaux augmentait régulièrement chaque semaine et que l’observation clinique était normale après un prélèvement répétitif d’échantillons.
Introduction
Selon les lignes directrices1 de la Conférence internationale sur l’harmonisation des exigences techniques pour l’enregistrement des produits pharmaceutiques à usage humain (ICH) et les lignes directrices2 de la National Medical Products Administration (NMPA), le nombre de points temporels de prélèvement sanguin des rats dans l’étude toxicocinétique (TK) doit répondre aux exigences de l’évaluation dynamique de l’exposition aux médicaments. Le volume sanguin total approximatif d’un rat est de 55 à 70 mL/kg de poids corporel3. Les points de temps de collecte sont généralement intensifs dans les 30 minutes suivant l’administration et diminuent par la suite, et plus de dix échantillons de sang doivent être prélevés dans les 48 heures dans les tests de routine4. Par exemple, des échantillons de sang sont prélevés à 12 moments (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h et 12 h) dans l’étude des savoirs traditionnels sur les drogues administrées par voie orale. Les chercheurs doivent prélever à plusieurs reprises de 200 à 250 μL de sang chez le rat afin d’obtenir du plasma de haute qualité pour le test TK5.
Les sites de collecte de sang chez les rats comprennent les vaisseaux sanguins de la queue, la veine du plexus rétro-orbitaire, la veine sous-maxillaire, le cœur, l’aorte abdominale6, etc. Parmi eux, la collecte de sang dans la veine caudale des rats est une méthode fréquemment utilisée, qui nécessite des opérateurs expérimentés et qualifiés 7,8. Recueillir du sang dans la veine rétro-orbitaire du plexus est moins compliqué; Cependant, cette méthode n’est pas recommandée car elle peut endommager la vue des rats9, et le sang du cœur et de l’aorte abdominale ne convient que pour le prélèvement sanguin final10. Une autre méthode de prélèvement de sang dans la veine sous-maxillaire chez un rat conscient s’est avérée entraîner plus de complications et a révélé une qualité d’échantillon de sang insuffisante11. Par conséquent, les chercheurs peuvent anesthésier l’animal pour réduire la difficulté d’échantillonnage. Pourtant, l’anesthésie augmente également le coût de l’expérience, et plus sérieusement, elle affectera l’état métabolique des rats12. Le présent protocole utilise une méthode rapide et simple de prélèvement de sang dans les veines sous-clavières de rats sans anesthésie, permettant un positionnement précis et une collecte de sang alternée bilatérale pour obtenir des échantillons de haute qualité en temps opportun et de manière répétée.
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Protocol
Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Des rats Sprague Dawley (SD) mâles et femelles, ~ 6-11 semaines ont été utilisés pour les expériences. Les rats ont été élevés conformément aux directives relatives au soin et à l’utilisation des animaux de laboratoire13.
1. Préparation des animaux
REMARQUE : Tous les rats SD utilisés dans cette étude étaient éveillés et n’étaient pas anesthésiés/euthanasiés. L’habileté de la manipulation de la contention en saisissant la peau sur le dos de l’animal est nécessaire.
- Trouvez le point le plus bas de la fosse triangulaire sous-clavière entre le cou et le membre antérieur chez un rat. Déplacez-vous de ~2-3 mm vers la tête et atteignez le point d’aiguille au site de prélèvement sanguin (Figure 1). Enlevez les poils à l’aide d’un rasoir électrique.
NOTE: Selon les besoins expérimentaux, le sérum ou le plasma peut être nécessaire. Le plasma est pris comme exemple dans ce protocole, et il n’affectera pas le fonctionnement de la collecte de sang. - Préparez des cotons-tiges tachés d’alcool à 75% pour essuyer et désinfecter et des cotons-tiges secs pour essuyer.
2. Prélèvement sanguin
REMARQUE: Au moins 2 personnes, qui doivent toutes deux être expérimentées dans les techniques de prélèvement sanguin et de contention des rats, devraient effectuer ces étapes.
- Saisissez la peau à l’arrière du cou d’une main pour maintenir la tête, le cou et la poitrine du rat à la verticale et exposer le site d’injection (vidéo 1). Redressez le membre antérieur sur le côté du site d’injection pour maintenir son niveau.
- Gardez la seringue parallèle à la tête du rat avec l’autre main et inclinez la seringue vers l’extérieur de 5°-10° de sorte que l’embout soit incliné vers la direction ventrale.
- Insérez complètement l’aiguille dans la cavité antérieure. Retirez la seringue pour maintenir une pression négative à l’intérieur du tube.
- Déplacez lentement l’aiguille de profonde à peu profonde et remontez le même chemin. Lorsque du sang est entré dans l’aiguille de la seringue, fixez la position de l’aiguille (vidéo 2).
REMARQUE : Le sang sera ensuite rempli à un taux constant dans la seringue, comme le montrent la figure 2A (vue de face) et la figure 2B (vue latérale). - Surveiller la quantité maximale de sang conformément aux normes établies par le comité de soin et d’utilisation des animaux de l’établissement. Cela dépend du poids et de la santé de l’animal. En l’absence d’autres exigences, ne pas prélever plus de 20% du volume sanguin total de l’animal dans les 24 heures, ce qui nécessite ~3 semaines de récupération14.
- Lorsque suffisamment d’échantillons de sang sont prélevés, retirez immédiatement la seringue et préparez-vous au traitement sanguin (étape 3).
- Pressuriser le site d’injection du rat pendant ~1-2 min pour arrêter le saignement. Puisque le site de prélèvement se trouve dans la partie inférieure du cou, pincez la peau de la veine sous-clavière pour arrêter le saignement en appuyant dessus (Figure 3).
REMARQUE: Le sang peut être prélevé alternativement dans la veine sous-clavière bilatérale lorsque des prélèvements sanguins répétés sont nécessaires. - Remettez le rat dans la cage et observez son état.
3. Traitement de l’échantillon de sang
- Retirez l’aiguille de la seringue et jetez-la dans le récipient à outils tranchant. Transférer lentement le sang de la seringue vers un tube de 1,5 mL. Pressez la seringue contre le mur pour éviter la formation de bulles, le cas échéant.
REMARQUE: Comme la pression peut provoquer la rupture des globules rouges, retirez l’aiguille pour prévenir l’hémolyse14. - Couvrez le tube de microcentrifugeuse, effleurez-le doucement et retournez-le au moins cinq fois pour bien mélanger le sang avec l’anticoagulant.
- Centrifuger l’échantillon de sang total à 2000 x g pendant ~10-15 min à température ambiante dans les 120 minutes après la collecte du plasma.
- Utilisez un pistolet à pipette (voir le tableau des matériaux) pour transférer le plasma supérieur dans un tube microcentrifuge vierge. Ne touchez pas la tête de la pipette avec le sang total inférieur. Éliminer ou recentrifuger le plasma contaminé par les globules rouges.
- Utilisez les échantillons immédiatement ou conservez-les à -30 °C.
REMARQUE: Les caractéristiques du médicament déterminent la durée de stockage. Les échantillons de plasma obtenus à partir de la veine sous-clavière sont translucides et jaune clair. L’hémolyse peut rendre le plasma rouge.
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Representative Results
Les bons échantillons de plasma de la veine sous-clavière étaient jaune pâle translucides (figure 4, tube gauche). Une mauvaise collecte ou manipulation de sang a entraîné une hémolyse (figure 4, le tube droit).
Les données de l’installation d’essai ont montré que dans une étude de toxicité orale de 4 semaines d’un collyre chez des rats SD atteints de TK, des échantillons de sang ont été prélevés deux fois à 9 moments (0 h, 0,167 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h et 24 h) entre le premier (jour 1) et le dernier jour de dosage (jour 28). La posologie pour les rats TKB, TKC et TKD était de 10 mg/kg, 30 mg/kg et 100 mg/kg, respectivement, et le volume de dosage était de 10 mL/kg. Le volume de prélèvement sanguin du premier échantillonnage était de ~0,2 mL, l’âge de l’animal était de ~6-7 semaines, le poids corporel de l’animal mâle était de ~268-297 g et celui de la femelle était de ~214-239 g. Le volume sanguin du dernier échantillonnage était de ~0,3 mL, l’âge de l’animal était de ~10-11 semaines, le poids corporel de l’animal mâle était de ~376-462 g et celui de l’animal femelle était de ~254-300 g. Il y avait un intervalle de 28 jours entre les deux moments de prélèvement de sang TK. Le poids corporel des animaux augmentait régulièrement chaque semaine et l’observation clinique était normale. La quantité totale de sang d’un rat de 250 g est d’environ 16 mL15, et la quantité maximale de sang prélevée dans les 24 heures ne dépassait pas 20 % du sang total de l’animal. Les données sur le poids corporel des femelles sont présentées dans le tableau 1, et celles des animaux mâles sont présentées dans le tableau 2.
Figure 1 : Représentation du point d’aiguille du site de prélèvement sanguin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Processus d’extraction du sang. Le sang a été obtenu en douceur. (A) Vue de face. (B) Vue latérale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Représentation de la méthode hémostatique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Aspect de l’échantillon après centrifugation. Le tube gauche présentait une image plasma qualifiée. Le tube droit présentait un échantillon d’hémolyse. Le plasma semblait rose ou rouge. Plus la couleur est foncée, plus le taux d’hémolyse est élevé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: L’anatomie de la veine sous-clavière. Cette veine est située sous la clavicule et l’aiguille peut l’atteindre en passant par la fosse triangulaire sous-clavière pas plus de 0,5 cm. Il rejoint la veine jugulaire interne, la veine vertébrale et la veine jugulaire externe pour former la veine crânienne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1: Données sur le poids corporel des femelles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau 2 : Données sur le poids corporel des animaux mâles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Vidéo 1 : Vue de haut en bas du processus de prélèvement sanguin de rat. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2 : Vue latérale du processus de prélèvement sanguin chez le rat. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Il y a certains avantages à recueillir du sang dans les veines sous-clavières. (1) Comme le site de prélèvement sanguin est facilement dissocié et que le plexus veineux n’est pas régulier en raison des différentes postures des rats, la méthode décrite peut facilement localiser la position du plexus veineux tout en maintenant les postures stables et confortables des rats. (2) L’opération est facile et favorable au développement rapide des compétences des techniciens et moins de douleur pour les animaux. (3) Un mode de fonctionnement pour rendre l’animal confortable réduit considérablement les comportements agités et empêche les éclaboussures de sang. (4) Il s’agit d’une méthode de prise de sang à grande vitesse (20 s), à haute efficacité, peu coûteuse et sans anesthésie, qui réduit le risque d’anesthésie animale et le temps de contention en termes de bien-être animal.
Dans ce protocole, les rats sont maintenus à l’aise dans le processus de contention, se relaxant modérément lors de la manipulation et évitant un contact prolongé. La manipulation lâche permet aux rats de se déplacer rapidement et peut causer des blessures accidentelles aux animaux ou aux personnes; Au contraire, il peut provoquer une hypoxie chez le rat. Il est essentiel d’arrêter le saignement tout en appuyant sur le site de prélèvement. Les opérateurs tiennent l’animal dans leurs bras pour les lisser dans l’obscurité. De plus, la pression négative ne doit pas être trop élevée lors de la prise de sang; Sinon, cela entraînera un mauvais prélèvement sanguin. Étant donné que les études pharmacocinétiques et traditionnelles nécessitent des prélèvements sanguins répétés, le volume sanguin doit être contrôlé en fonction du poids et des conditions sanitaires différents des animaux; Pendant ce temps, un autre site de collecte de sang sera bénéfique pour le bien-être des animaux. Si les animaux sont petits ou faibles, ils reçoivent du glucose et d’autres suppléments appropriés dans les conditions autorisées par le test. L’entrée de l’aiguille doit être lisse et exempte de résistance, et lorsqu’il n’y a pas de sang à prélever ou qu’il n’y a pas de résistance, l’aiguille doit être réinsérée dans une direction légèrement ajustée ou changée de côté. Dans le processus de prélèvement sanguin, il est nécessaire d’éviter de mélanger le sang prélevé deux fois lors de l’insertion. Lorsque le volume de l’échantillon de sang pour la première injection est insuffisant, la deuxième injection est nécessaire, la seringue doit être remplacée et le tube de remplacement est prélevé pour le sang prélevé à nouveau en cas d’hémolyse. Il est recommandé de terminer la collecte de sang immédiatement. Le sang dans la seringue est attaché à la paroi et injecté dans le tube de prélèvement sanguin pour éviter les bulles pendant le processus. Pour prélever le sang en temps opportun, l’opérateur doit être parfaitement préparé 2 min avant le prélèvement et injecter 1 min avant. Lorsque l’animal est moins coopératif ou difficile à utiliser, il doit être apaisé à l’avance. Par conséquent, il doit y avoir un groupe de techniciens qualifiés.
Le plexus brachial est perpendiculaire à et derrière la veine sous-clavière, de sorte qu’un mauvais fonctionnement peut entraîner une lésion du plexus brachial, des douleurs aux membres antérieurs, une boiterie, un tressaillement et d’autres symptômes indésirables16. Cette technique peut également être appliquée aux cobayes et répondre aux besoins de collecte de sang dans les expériences sur les cobayes, mais des recherches supplémentaires sont nécessaires pour prélever du sang sur les cobayes par cette méthode.
L’anatomie d’une veine sous-clavière est illustrée à la figure 5. La veine sous-clavière est située sous la clavicule et l’aiguille peut l’atteindre en passant simplement par la fosse triangulaire sous-clavière ne dépassant pas 0,5 cm. La méthode est donc risquée et nécessite un professionnel qualifié. Un professionnel non qualifié entraînera une hyperactivité animale, une difficulté à contrôler, une mauvaise circulation sanguine, une faiblesse animale ou même la mortalité à la suite d’une collecte de sang en série. Une chirurgie incorrecte endommagera également la poitrine ou l’artère. En conséquence, il est crucial d’impliquer un professionnel qualifié pour réaliser une expérience réussie.
En conclusion, ce protocole présente une méthode alternative pour prélever du sang dans la veine sous-clavière des rats, qui fournit un soutien technique pour les études PK et TK.
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Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song et Wei Yang ont un intérêt financier dans Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd, qui, cependant, n’a pas soutenu ce travail. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (No.2018B030323024) et le Key Program « New Drug Creation » du Guangdong Key Research and Development Plan (No.2019B020202001), Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (No.202002030249 et No.202002030156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
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