Summary
Denne protokollen beskriver en enkel og effektiv metode for å samle blod fra vena subclavia hos rotter. Det muliggjør rask, rettidig og lett identifiserbar prøvetaking uten anestesi og oppnår blod av høy kvalitet gjennom repeterende prøveinnsamling.
Abstract
Rotter er mye brukt i farmakokinetikk (PK) og toksikokinetiske (TK) studier som trenger å samle en viss mengde blod på bestemte tidspunkter for å oppdage legemiddeleksponering. Prøvetakingsmetoden for rotteblod bestemmer plasmakvaliteten og påvirker presisjonen av testresultatene ytterligere. Den subklaviske veneblodinnsamlingsmetoden beskrevet i denne protokollen samler blodprøver gjentatte ganger i bevisst tilstand hos dyr for å møte behovene til PK- og TK-tester. Ferdighetene til fastholdelseshåndtering og passende prosedyre for nålsnitt sikrer suksessraten for blodinnsamling. Det er enkelt å betjene samtidig som det sikrer kvaliteten på plasma og samtidig ivaretar dyrevelferden. Imidlertid krever denne metoden dyktig drift, og en feil kan forårsake svakhet hos dyr, smerte, lameness og til og med dødelighet. Den nåværende metoden har blitt brukt i testanlegget for en 4-ukers oral toksisitetsstudie i Sprague Dawley (SD) rotter med TK. Maksimal mengde blod samlet innen 24 timer oversteg ikke 20% av dyrets totale blod. Dyrenes kroppsvekt var mer enn 200 g for menn og kvinner. Dataene viste at dyrenes kroppsvekt økte jevnt hver uke, og den kliniske observasjonen var normal etter repeterende prøvetaking.
Introduction
I henhold til International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guidelines1 og National Medical Products Administration (NMPA) guidelines2, må antall blodinnsamlingstidspunkter for rotter i den toksikokinetiske (TK) studien oppfylle kravene i den dynamiske legemiddeleksponeringsvurderingen. Det omtrentlige totale blodvolumet til en rotte er 55-70 ml / kg kroppsvekt3. Innsamlingstidspunktene er generelt intensive innen 30 minutter etter dosering og reduseres etter det, og mer enn ti blodprøver må samles inn innen 48 timer i rutinemessig testing4. For eksempel samles blodprøver ved 12-tidspunkter (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 t, 2 t, 3 timer, 4 timer, 8 timer og 12 timer) i TK-studie av oralt administrerte legemidler. Forskere må gjentatte ganger samle 200-250 μL blod hos rotter for å oppnå høyverdig plasma for TK-testingen5.
Blodinnsamlingsstedene hos rotter inkluderer haleblodkar, retro-orbital plexusvene, submandibulær vene, hjerte, abdominal aorta6 og så videre. Blant dem er blodinnsamling fra rottens kaudale vene en ofte brukt metode, som krever erfarne og dyktige operatører 7,8. Å samle blod fra retro-orbital plexusvenen er mindre komplisert; Denne metoden anbefales imidlertid ikke, da den kan skade rottenes syn9, og blod fra hjertet og abdominalaorta er kun egnet for endelig blodprøvetaking10. En annen metode for å samle blod fra submandibulær vene i en bevisst rotte har vist seg å resultere i flere komplikasjoner og avslørt utilstrekkelig blodprøvekvalitet11. Derfor kan forskere bedøve dyret for å redusere vanskeligheten med prøvetaking. Likevel øker anestesien også kostnaden for forsøket, og mer alvorlig, det vil påvirke metabolsk tilstand av rotter12. Den nåværende protokollen bruker en rask og grei metode for å samle blod i de subklaviske venene hos rotter uten anestesi, noe som muliggjør nøyaktig posisjonering og bilateral vekslende blodinnsamling for å oppnå prøver av høy kvalitet på en rettidig og gjentatt måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beskrevne dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Mannlige og kvinnelige Sprague Dawley (SD) rotter, ~ 6-11 uker ble brukt til forsøkene. Rottene ble oppdrettet etter retningslinjene for stell og bruk av forsøksdyr13.
1. Dyr forberedelse
MERK: Alle SD-rottene som ble brukt i denne studien var våkne og ble ikke bedøvet/avlivet. Ferdigheten med selvbeherskelseshåndtering ved å gripe huden på baksiden av dyret er nødvendig.
- Finn det laveste punktet på den subklaviske trekantede fossa mellom halsen og forbenet hos en rotte. Beveg ~2-3 mm mot hodet og nå nålepunktet på blodinnsamlingsstedet (figur 1). Fjern håret med en barbermaskin.
MERK: Avhengig av eksperimentelle behov, kan serum eller plasma være nødvendig. Plasma er tatt som et eksempel i denne protokollen, og det vil ikke påvirke driften av blodinnsamling. - Forbered bomullspinner farget med 75% alkohol for tørking og desinfisering og tørk bomullspinner for tørking.
2. Prøvetaking av blod
MERK: Minst 2 personer, som begge må ha erfaring med blodinnsamling og rottesikringsteknikker, bør utføre disse trinnene.
- Ta tak i huden på baksiden av nakken med én hånd for å holde rottens hode, nakke og bryst oppreist og blottlegge injeksjonsstedet (video 1). Rett forbenet på siden av injeksjonsstedet for å opprettholde nivået.
- Hold sprøyten parallelt med rottens hode med den andre hånden og vipp sprøyten utover 5°-10° slik at spissen vippes mot ventral retning.
- Stikk nålen helt inn i fremre hulrom. Trekk sprøyten tilbake for å opprettholde undertrykket i slangen.
- Beveg nålen sakte fra dyp til grunn og opp igjen i samme bane. Når blod har kommet inn i kanylen, fikseres kanylens posisjon (Video 2).
MERK: Blodet vil da fylles med konstant hastighet i sprøyten, som vist i figur 2A (sett forfra) og figur 2B (sett fra siden). - Overvåk maksimal blodmengde i samsvar med standarder fastsatt av institusjonens dyrepleie- og brukskomité. Dette avhenger av dyrets vekt og helse. I fravær av andre krav, ikke fjern mer enn 20% av dyrets totale blodvolum innen 24 timer, noe som krever ~ 3 uker med rekreasjon14.
- Når tilstrekkelig blodprøve er samlet, trekkes sprøyten umiddelbart ut og klargjøres for blodbehandling (trinn 3).
- Trykk på rottens injeksjonssted i ~ 1-2 min for å stoppe blødningen. Siden oppsamlingsstedet er i nedre del av halsen, knip huden på vena subclavia for å stoppe blødningen ved å trykke på den (figur 3).
MERK: Blod kan samles vekselvis fra den bilaterale subklaviske venen når gjentatt blodinnsamling er nødvendig. - Sett rotta tilbake til buret og følg tilstanden.
3. Behandling av blodprøven
- Fjern kanylen fra sprøyten og kast den i den skarpe verktøybeholderen. Overfør blodet sakte fra sprøyten til et 1,5 ml rør. Trykk sprøyten mot veggen for å unngå eventuelle bobleformasjoner.
MERK: Siden trykk kan føre til at røde blodlegemer brister, fjern nålen for å forhindre hemolyse14. - Dekk mikrosentrifugerøret, knips det forsiktig og skru det opp ned minst fem ganger for å blande blodet grundig med antikoagulanten.
- Sentrifuger hele blodprøven ved 2000 x g i ~ 10-15 min ved romtemperatur innen 120 minutter etter innsamling av plasma.
- Bruk en pipettepistol (se materialfortegnelsen) til å overføre det øvre plasmaet til et tomt mikrosentrifugerør. Ikke berør pipettehodet med det nedre helblodet. Kast eller sentrifuge plasmaet forurenset med de røde blodcellene.
- Bruk prøvene umiddelbart eller oppbevar dem ved -30 °C.
MERK: Egenskapene til stoffet bestemmer lagringstiden. Plasmaprøvene tatt fra vena subclavia er gjennomsiktige og lysegule. Hemolyse kan gjøre plasmaet rødt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gode plasmaprøver fra vena subclavia var gjennomskinnelig svakt gule (figur 4, venstre tube). Feil blodansamling eller manipulasjon resulterte i hemolyse (figur 4, høyre rør).
Dataene fra testanlegget viste at i en 4-ukers oral toksisitetsstudie av øyedråper hos SD-rotter med TK, ble blodprøver samlet to ganger ved 9-tidspunkter (0 timer, 0,167 timer, 0,5 timer, 1 time, 2 timer, 4 timer, 8 timer, 12 timer og 24 timer) mellom den første (dag 1) og den siste doseringsdagen (dag 28). Doseringen for TKB-, TKC- og TKD-rottene var henholdsvis 10 mg/kg, 30 mg/kg og 100 mg/kg, og doseringsvolumet var 10 ml/kg. Blodinnsamlingsvolumet til den første prøvetakingen var ~ 0,2 ml, dyrets alder var ~ 6-7 uker, kroppsvekten til hanndyret var ~ 268-297 g, og kvinnens kroppsvekt var ~ 214-239 g. Blodvolumet til den siste prøvetakingen var ~ 0,3 ml, dyrets alder var ~ 10-11 uker, kroppsvekten til hanndyret var ~ 376-462 g, og kroppsvekten til det kvinnelige dyret var ~ 254-300 g. Det var et intervall på 28 dager mellom de to tidspunktene for TK-blodinnsamling. Dyrenes kroppsvekt økte jevnt hver uke, og den kliniske observasjonen var normal. Den totale mengden blod av en 250 g rotte er ca. 16 ml15, og den maksimale mengden blod samlet innen 24 timer oversteg ikke 20% av dyrets totale blod. Kroppsvektdata for hunndyr er vist i tabell 1, og kroppsvektdata for hanndyr er vist i tabell 2.
Figur 1: Avbildning av nålepunktet på blodinnsamlingsstedet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Blodekstraksjonsprosess. Blodet ble oppnådd jevnt. (A) Sett forfra. (B) Sett fra siden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representasjon av hemostatisk metode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Prøvens utseende etter sentrifugering. Venstre rør viste et kvalifisert plasmabilde. Høyre rør viste hemolyseprøve. Plasmaet så rosa eller rødt ut. Jo mørkere farge, jo høyere hemolysehastighet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Vena subclavias anatomi. Denne venen ligger under kragebenet, og nålen kan nå den bare passert gjennom den subklaviske trekantede fossa ikke mer enn 0,5 cm. Den forbinder den indre jugularvenen, vertebrale venen og den ytre jugularvenen for å danne den kraniale vena-venen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Kroppsvektdata for hunndyr. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: Kroppsvektdata for hanndyr. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Video 1: Ovenfra-og-ned-visning av blodprøveprosessen hos rotter. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Sidevisning av blodprøveprosessen fra rotter. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er visse fordeler med å samle blod fra de subklaviske venene. (1) Siden stedet for blodsamlingen lett dissosieres, og den venøse plexus ikke er vanlig på grunn av rotternes forskjellige stillinger, kan den beskrevne metoden lett lokalisere posisjonen til venøs plexus samtidig som rotternes stabile og komfortable stillinger opprettholdes. (2) Operasjonen er enkel og gunstig for den raske utviklingen av teknikernes ferdigheter og mindre smerte for dyr. (3) En driftsmodus for å gjøre dyret komfortabelt reduserer rastløs atferd betydelig og forhindrer blodsprut. (4) Det er en blodtegningsmetode med høy hastighet (20 s), høy effektivitet, lav pris og uten anestesi, noe som reduserer risikoen for dyrebedøvelse og tilbakeholdstiden når det gjelder dyrevelferd.
I denne protokollen holdes rottene komfortable i tilbakeholdelsesprosessen, slapper av moderat ved håndtering og unngår langvarig berøring. Løs håndtering gjør at rotter kan bevege seg raskt og kan forårsake utilsiktet skade på dyr eller mennesker; Tvert imot kan det forårsake hypoksi hos rotter. Det er viktig å stoppe blødningen mens du trykker på prøvetakingsstedet. Operatørene holder dyret i armene for å glatte dem ut i mørket. I tillegg må undertrykket ikke være for høyt under blodoppsamlingen; Ellers vil det føre til dårlig blodprøvetaking. Siden PK- og TK-studiene krever gjentatt blodinnsamling, må blodvolumet kontrolleres i henhold til forskjellige dyrevekter og helsemessige forhold; I mellomtiden vil et alternativt blodinnsamlingssted være til nytte for dyrevelferden. Dersom dyrene er små eller svake, forsynes de med glukose og andre tilskudd på egnet måte på de vilkår som er tillatt i henhold til testen. Nåleinntaket må være glatt og motstandsfritt, og når det ikke er blod å samle opp, eller det ikke er motstand, skal nålen settes inn igjen i en litt justert retning eller skifte sider. I blodprøveprosessen er det nødvendig å unngå å blande blod tatt to ganger fra innsetting. Når blodprøvevolumet for den første injeksjonen er utilstrekkelig, er den andre injeksjonen nødvendig, sprøyten må byttes ut, og erstatningsrøret tas for blodet samlet igjen i tilfelle hemolyse. Det anbefales å fullføre innsamling av blod på en gang. Blodet i sprøyten er festet til veggen og injisert i blodoppsamlingsrøret for å unngå bobler under prosessen. For å samle blod i tide, må operatøren være fullt forberedt 2 minutter før samlingen og injisere 1 min før det. Når dyret er mindre samarbeidsvillig eller utfordrende å operere, må det beroliges på forhånd. Derfor må det være en gruppe kvalifiserte teknikere.
Plexus brachialis er vinkelrett på og bak vena subclavia, så feil bruk kan føre til plexusskade i brachialis, smerter i forbenene, halthet, flinching og andre negative symptomer16. Denne teknikken kan også brukes på marsvin og møte blodinnsamlingsbehov i marsvinforsøk, men videre forskning er nødvendig for å trekke blod fra marsvin ved denne metoden.
Anatomien til en vena subclavia er vist i figur 5. Den subklaviske venen ligger under kragebenet, og nålen kan nå den bare passerer gjennom den subklaviske trekantede fossa ikke større enn 0,5 cm. Metoden er derfor risikabel og krever en kvalifisert fagperson. En ukvalifisert profesjonell vil resultere i hyperaktivitet hos dyr, vanskeligheter med å kontrollere, dårlig blodsirkulasjon, svakhet hos dyr eller til og med dødelighet etter en seriell blodinnsamling. Feil kirurgi vil også skade brystet eller arterien. Som et resultat er det avgjørende å involvere en kvalifisert profesjonell for å oppnå et vellykket eksperiment.
Avslutningsvis presenterer denne protokollen en alternativ metode for å samle blod fra den subklaviske venen hos rotter, som gir teknisk støtte til PK- og TK-studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song og Wei Yang har en økonomisk interesse i Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd, som imidlertid ikke støttet dette arbeidet. De øvrige forfatterne oppgir ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Guangdong Provincial Key Laboratory of Drug Non-clinical Evaluation and Research (No.2018B030323024) og Key Program "New Drug Creation" av Guangdong Key Research and Development Plan (No.2019B02020202001), Guangzhou Fundamental and Application Foundation Research Project (No.202002030249 og No.202002030156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. The China Food and Drug Administration (CFDA). , Springer International Publishing. (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , Cambridge, MA. (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , National Academies Press. Washington DC. (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
