Summary
본 프로토콜은 쥐의 쇄골 하 정맥으로부터 혈액을 수집하는 간단하고 효율적인 방법을 기술한다. 마취 없이 빠르고 시기적절하며 쉽게 식별할 수 있는 샘플링이 가능하며 반복적인 샘플 수집을 통해 고품질 혈액을 얻을 수 있습니다.
Abstract
쥐는 약물 노출을 감지하기 위해 특정 시점에 일정량의 혈액을 수집해야하는 약동학 (PK) 및 독성 동태 학 (TK) 연구에 널리 사용됩니다. 쥐 혈액 샘플링 방법은 혈장의 품질을 결정하고 테스트 결과의 정밀도에 더 영향을 미칩니다. 이 프로토콜에 설명 된 쇄골 하 정맥 혈액 수집 방법은 PK 및 TK 검사의 요구를 충족시키기 위해 동물의 의식 상태에서 반복적으로 혈액 샘플을 수집합니다. 구속 처리 기술과 바늘 절개의 적절한 절차는 채혈 성공률을 보장합니다. 플라즈마의 품질을 보장하면서 동시에 동물 복지를 제공하면서 작동하기 쉽습니다. 그러나이 방법은 숙련 된 작업이 필요하며 부적절한 방법은 동물의 약점, 통증, 절름발이 및 심지어 사망을 유발할 수 있습니다. 현재 방법은 TK를 가진 Sprague Dawley (SD) 쥐에서 4 주간의 경구 독성 연구를 위해 테스트 시설에서 사용되었습니다. 24 시간 이내에 수집 된 혈액의 최대량은 동물의 총 혈액의 20 %를 초과하지 않았습니다. 동물의 체중은 수컷과 암컷의 경우 200g 이상이었습니다. 데이터는 동물의 체중이 매주 꾸준히 증가한 것으로 나타 났으며 반복적 인 샘플 수집 후 임상 관찰은 정상이었습니다.
Introduction
인체 사용 의약품 등록을위한 기술 요구 사항의 조화에 관한 국제 회의 지침1 및 국가 의약품 관리국 (NMPA) 지침2에 따르면, 독성 동태 학 (TK) 연구에서 쥐의 채혈 시점 수는 동적 약물 노출 평가의 요구 사항을 충족해야합니다. 쥐의 대략적인 총 혈액량은 체중 kg 당 55-70 mL / kg입니다3. 수집 시점은 일반적으로 투여 후 30분 이내에 집중적이고 그 이후에는 감소하며,일상적인 검사에서 48시간 이내에 10개 이상의 혈액 샘플을 수집해야 합니다4. 예를 들어, 혈액 샘플은 경구 투여 약물의 TK 연구에서 12 시간 (0 분, 5 분, 10 분, 15 분, 30 분, 45 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 8 시간 및 12 시간)에서 수집됩니다. 연구원은 TK테스트를 위한 고품질 혈장을 얻기 위해 쥐에서 200-250μL의 혈액을 반복적으로 수집해야 합니다5.
쥐의 혈액 수집 부위에는 꼬리 혈관, 역안와 신경총 정맥, 턱밑 정맥, 심장, 복부 대동맥6 등이 포함됩니다. 그 중 쥐의 꼬리 정맥에서 채혈하는 것은 자주 사용되는 방법이며 숙련되고 숙련 된 작업자 7,8이 필요합니다. 후 안와 신경총 정맥에서 혈액을 수집하는 것은 덜 복잡합니다. 그러나 이 방법은 쥐의 시력을 손상시킬 수 있으므로9 권장되지 않으며 심장 및 복부 대동맥의 혈액은 최종 혈액 샘플링10에만 적합합니다. 의식이 있는 쥐의 턱밑 정맥에서 혈액을 수집하는 또 다른 방법은 더 많은 합병증을 유발하는 것으로 나타났으며 혈액샘플 품질이 충분하지 않은 것으로 나타났습니다11. 따라서 연구자들은 샘플링의 어려움을 줄이기 위해 동물을 마취시킬 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 마취는 또한 실험 비용을 증가시키고 더 심각하게는 쥐12의 대사 상태에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 마취없이 쥐의 쇄골 하 정맥에서 혈액을 수집하는 빠르고 간단한 방법을 사용하여 정확한 위치 지정 및 양측 교대 혈액 수집을 가능하게하여시기 적절하고 반복적 인 방식으로 고품질 샘플을 얻을 수 있습니다.
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Protocol
기재된 모든 동물 실험은 광동 루윈 제약 연구소 유한 회사의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었으며, 수컷 및 암컷 Sprague Dawley(SD) 래트, ~6-11주 동안 실험에 사용되었다. 랫트는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 사육되었습니다13.
1. 동물 준비
참고: 이 연구에 사용된 모든 SD 쥐는 깨어 있었고 마취/안락사되지 않았습니다. 동물의 뒤쪽에있는 피부를 움켜 쥐는 구속 처리 기술이 필요합니다.
- 쥐의 목과 앞다리 사이의 쇄골 하 삼각형 포사의 가장 낮은 지점을 찾으십시오. 머리쪽으로 ~ 2-3mm 이동하여 혈액 수집 부위의 바늘 지점에 도달합니다 (그림 1). 전기 면도기를 사용하여 머리카락을 제거하십시오.
알림: 실험 요구 사항에 따라 혈청 또는 혈장이 필요할 수 있습니다. 혈장은이 프로토콜의 예로 간주되며 혈액 수집 작업에 영향을 미치지 않습니다. - 닦고 소독하기 위해 75 % 알코올로 얼룩진 면봉을 준비하고 닦기 위해 마른 면봉을 준비하십시오.
2. 혈액 샘플링
알림: 혈액 수집 및 쥐 억제 기술에 경험이 있어야 하는 최소 2명이 이 단계를 수행해야 합니다.
- 한 손으로 목 뒤쪽의 피부를 잡고 쥐의 머리, 목, 가슴을 똑바로 세우고 주사 부위를 노출시킵니다 (비디오 1). 주사 부위의 앞다리를 곧게 펴서 수평을 유지하십시오.
- 다른 손으로 주사기를 쥐의 머리와 평행하게 유지하고 팁이 복부 방향으로 기울어 지도록 주사기를 바깥쪽으로 5 ° -10 ° 기울입니다.
- 바늘을 전방에 완전히 삽입하십시오. 튜브 내에서 음압을 유지하기 위해 주사기를 뒤로 당깁니다.
- 바늘을 깊은 곳에서 얕은 곳으로 천천히 옮기고 같은 경로를 백업하십시오. 혈액이 주사기 바늘에 들어가면 바늘의 위치를 고정하십시오 (비디오 2).
알림: 그런 다음 혈액은 그림 2A (전면 보기) 및 그림 2B (측면도)와 같이 주사기에 일정한 속도로 채워집니다. - 기관의 동물 관리 및 사용위원회가 정한 기준에 따라 최대 혈액량을 모니터링하십시오. 이것은 동물의 체중과 건강에 달려 있습니다. 다른 요구 사항이 없는 경우 ~3주의 회복이 필요한 24시간 이내에 동물의 총 혈액량의 20% 이상을 제거하지 마십시오14.
- 충분한 혈액 샘플이 수집되면 즉시 주사기를 꺼내 혈액 치료를 준비합니다 (3 단계).
- 출혈을 멈추기 위해 쥐의 주사 부위에 ~1-2분 동안 압력을 가합니다. 수집 부위가 목 아래 부분에 있기 때문에 쇄골 하 정맥의 피부를 꼬집어 출혈을 멈추십시오 (그림 3).
알림: 반복적인 혈액 수집이 필요한 경우 양측 쇄골하 정맥에서 혈액을 교대로 수집할 수 있습니다. - 쥐를 새장으로 돌려 보내고 그 상태를 관찰하십시오.
3. 혈액 샘플 처리
- 주사기에서 바늘을 제거하고 날카로운 도구 용기에 버립니다. 주사기에서 1.5mL 튜브로 혈액을 천천히 옮깁니다. 기포 형성을 피하기 위해 주사기를 벽에 대고 누르십시오.
참고: 압력으로 적혈구가 파열될 수 있으므로 용혈을 방지하기 위해 바늘을 제거하십시오14. - 미세 원심 분리기 튜브를 덮고 부드럽게 튕긴 다음 거꾸로 5 번 이상 뒤집어 혈액과 항응고제를 완전히 혼합하십시오.
- 혈장을 수집 한 후 120 분 이내에 실온에서 ~ 10-15 분 동안 2000 x g 에서 전혈 샘플을 원심 분리합니다.
- 피펫 건( 재료 표 참조)을 사용하여 상부 플라즈마를 빈 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 피펫 헤드를 더 낮은 전혈로 만지지 마십시오. 적혈구로 오염된 혈장을 폐기하거나 다시 원심분리하십시오.
- 샘플을 즉시 사용하거나 -30 ° C에서 보관하십시오.
참고 : 약물의 특성에 따라 보관 시간이 결정됩니다. 쇄골 하 정맥에서 얻은 혈장 표본은 반투명하고 밝은 노란색입니다. 용혈은 혈장을 빨갛게 만들 수 있습니다.
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Representative Results
쇄골하 정맥으로부터의 양호한 혈장 샘플은 반투명 옅은 황색이었다(도 4, 좌측 튜브). 부적절한 채혈 또는 조작으로 인해 용혈이 발생했습니다(그림 4, 오른쪽 튜브).
테스트 시설의 데이터에 따르면 TK가 있는 SD 쥐의 점안액에 대한 4주간의 경구 독성 연구에서 혈액 샘플은 첫 번째 투약일(Day 1)과 마지막 투여일(Day 28) 사이에 9-시점(0h, 0.167h, 0.5h, 1h, 1h, 2h, 2h, 4h, 8h, 12h 및 24h)에 두 번 수집되었습니다. TKB, TKC 및 TKD 쥐의 투여량은 각각 10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg이었고, 투여량은 10 mL/kg이었다. 첫 번째 샘플링의 채혈량은 ~0.2mL, 동물의 나이는 ~6-7주, 수컷 동물의 체중은 ~268-297g, 암컷의 체중은 ~214-239g이었습니다. 마지막 샘플링의 혈액량은 ~0.3mL, 동물의 나이는 ~10-11주, 수컷 동물의 체중은 ~376-462g, 암컷 동물의 체중은 ~254-300g이었습니다. TK 채혈의 두 시간 사이에 28일의 간격이 있었다. 동물의 체중은 매주 꾸준히 증가했으며 임상 관찰은 정상이었습니다. 250g 쥐의 총 혈액량은 약 16mL15이며, 24 시간 이내에 수집 된 혈액의 최대량은 동물의 총 혈액의 20 %를 초과하지 않았습니다. 암컷 동물의 체중 데이터는 표 1에, 수컷 동물의 체중 데이터는 표 2에 나타내었다.
그림 1: 채혈 부위의 바늘 끝 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 혈액 추출 과정. 혈액은 원활하게 얻어졌다. (ᅡ) 정면도. (B) 측면도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 지혈 방법의 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 원심분리 후 시편 모양. 왼쪽 튜브는 자격을 갖춘 플라즈마 이미지를 보여주었습니다. 오른쪽 튜브는 용혈 샘플을 보여주었습니다. 혈장은 분홍색이나 빨간색으로 보였습니다. 색상이 어두울수록 용혈 속도가 높아집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 쇄골 하 정맥의 해부학. 이 정맥은 쇄골 아래에 위치하며 바늘은 쇄골 하 삼각형 포사를 통과하여 0.5cm 이하로 도달 할 수 있습니다. 내부 경정맥, 척추 정맥 및 외부 경정맥을 연결하여 두개정맥을 형성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 암컷 동물의 체중 데이터. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 : 수컷 동물의 체중 데이터. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 쥐 혈액 샘플링 과정의 하향식 보기. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2 : 쥐 혈액 샘플링 과정의 측면도. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
쇄골 하 정맥에서 혈액을 수집하는 데에는 몇 가지 이점이 있습니다. (1) 채혈 부위가 쉽게 해리되고 쥐의 자세가 다르기 때문에 정맥 신경총이 규칙적이지 않기 때문에 설명 된 방법은 쥐의 안정적이고 편안한 자세를 유지하면서 정맥 신경총의 위치를 쉽게 국소화 할 수 있습니다. (2) 수술이 쉽고 기술자의 기술이 빠르게 발전하고 동물에게 고통이 적습니다. (3) 동물을 편안하게 해주는 작동 모드는 불안한 행동을 크게 줄이고 피가 튀는 것을 방지합니다. (4) 고속(20초), 고효율, 저비용, 마취 없는 채혈 방법으로 동물 마취의 위험과 동물 복지 측면에서 구속 시간을 줄입니다.
이 프로토콜에서 쥐는 구속 과정에서 편안하게 유지되고 장시간 접촉을 피하고 취급 할 때 적당히 휴식을 취합니다. 느슨한 취급은 쥐가 빠르게 움직일 수있게하고 동물이나 사람에게 우발적 인 부상을 입힐 수 있습니다. 반대로 쥐에게 저산소증을 일으킬 수 있습니다. 샘플링 부위를 누르는 동안 출혈을 멈추는 것이 중요합니다. 운영자는 어둠 속에서 동물을 부드럽게하기 위해 동물을 팔에 안고 있습니다. 또한 혈액 수집 중에 부압이 너무 높아서는 안됩니다. 그렇지 않으면 혈액 샘플링이 불량하게됩니다. PK 및 TK 연구는 반복적 인 혈액 수집이 필요하기 때문에 혈액량은 동물의 체중과 건강 상태에 따라 조절되어야합니다. 한편, 대체 채혈 장소는 동물 복지에 도움이 될 것입니다. 동물이 작거나 약한 경우, 시험에서 허용하는 조건 하에서 포도당 및 기타 보충제가 적절하게 제공됩니다. 바늘 입구는 매끄럽고 저항이 없어야하며, 수집 할 혈액이 없거나 저항이없는 경우 바늘을 약간 조정 된 방향으로 다시 삽입하거나 측면을 변경해야합니다. 혈액 샘플링 과정에서 삽입에서 두 번 채취 한 혈액을 혼합하지 않아야합니다. 첫 번째 주입을위한 혈액 샘플 양이 충분하지 않으면 두 번째 주입이 필요하고 주사기를 교체해야하며 용혈시 다시 혈액을 수집하기 위해 교체 튜브를 가져옵니다. 한 번에 혈액 수집을 완료하는 것이 좋습니다. 주사기의 혈액은 벽에 부착되어 혈액 수집 튜브에 주입되어 공정 중 기포를 방지합니다. 적시에 혈액을 수집하려면 작업자가 수집 2 분 전에 완전히 준비하고 1 분 전에 주사해야합니다. 동물이 덜 협조적이거나 작동하기 어려울 때는 미리 진정시켜야합니다. 따라서 자격을 갖춘 기술자 그룹이 있어야 합니다.
상완 신경총은 쇄골 하 정맥에 수직이고 뒤에 있으므로 부적절한 수술은 상완 신경총 손상, 앞다리 통증, 절름발이, 움찔 및 기타 부작용을 유발할 수 있습니다16. 이 기술은 기니피그에도 적용될 수 있으며 기니피그 실험에서 혈액 수집 요구를 충족 할 수 있지만이 방법으로 기니피그에서 혈액을 채취하려면 추가 연구가 필요합니다.
쇄골 하 정맥의 해부학은 그림 5에 나와 있습니다. 쇄골 하 정맥은 쇄골 아래에 위치하며 바늘은 쇄골 하 삼각형 포사를 통과하여 0.5cm 이하로 도달 할 수 있습니다. 따라서이 방법은 위험하며 자격을 갖춘 전문가가 필요합니다. 자격이 없는 전문가는 동물의 과잉 행동, 통제의 어려움, 혈액 순환 불량, 동물의 약점 또는 연속 채혈 후 사망을 초래할 것입니다. 잘못된 수술은 또한 가슴이나 동맥을 손상시킵니다. 결과적으로 성공적인 실험을 위해서는 자격을 갖춘 전문가를 참여시키는 것이 중요합니다.
결론적으로,이 프로토콜은 PK 및 TK 연구에 대한 기술 지원을 제공하는 쥐의 쇄골 하 정맥에서 혈액을 수집하는 대체 방법을 제시합니다.
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Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song 및 Wei Yang은 광동 Lewwin 제약 연구소 유한 회사에 재정적 인 관심을 가지고 있지만이 작업을 지원하지 않았습니다. 다른 저자들은 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 광동성 약물 비임상 평가 및 연구 핵심 연구소(No.2018B030323024)와 광둥성 핵심 연구 개발 계획의 핵심 프로그램 "신약 창출"(No.2019B02020202001), 광저우 기초 및 응용 재단 연구 프로젝트(No.202002030249 및 No.202002030156)의 자금 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
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