Summary
El presente protocolo describe un método simple y eficiente para recolectar sangre de la vena subclavia en ratas. Permite un muestreo rápido, oportuno y fácilmente identificable sin anestesia y obtiene sangre de alta calidad a través de la recolección repetitiva de muestras.
Abstract
Las ratas se utilizan ampliamente en estudios farmacocinéticos (PK) y toxicocinéticos (TK) que necesitan recolectar una cierta cantidad de sangre en puntos de tiempo específicos para detectar la exposición al medicamento. El método de muestreo de sangre de rata determina la calidad del plasma y afecta aún más la precisión de los resultados de la prueba. El método de recolección de sangre de la vena subclavia descrito en este protocolo recoge muestras de sangre repetidamente en el estado consciente de los animales para satisfacer las necesidades de las pruebas farmacocinéticas y tradicionales. Las habilidades de manejo de la restricción y el procedimiento apropiado de incisión con aguja aseguran la tasa de éxito de la recolección de sangre. Es fácil de operar al tiempo que garantiza la calidad del plasma y, al mismo tiempo, atiende al bienestar animal. Sin embargo, este método requiere una operación experta, y una inadecuada puede causar debilidad animal, dolor, cojera e incluso mortalidad. El método actual se ha utilizado en el centro de pruebas para un estudio de toxicidad oral de 4 semanas en ratas Sprague Dawley (SD) con CC.TT. La cantidad máxima de sangre recolectada dentro de las 24 h no excedió el 20% de la sangre total del animal. El peso corporal de los animales era de más de 200 g para machos y hembras. Los datos mostraron que el peso corporal de los animales aumentó constantemente cada semana, y la observación clínica fue normal después de la recolección repetitiva de muestras.
Introduction
De acuerdo con las directrices 1 de la Conferencia Internacional sobre la Armonización de los Requisitos Técnicos para el Registro de Productos Farmacéuticos de Uso Humano (ICH) ylas directrices 2 de la Administración Nacional de Productos Médicos (NMPA), el número de puntos de tiempo de extracción de sangre de ratas en el estudio toxicocinético (CC.TT.) debe cumplir los requisitos de la evaluación dinámica de la exposición al fármaco. El volumen sanguíneo total aproximado de una rata es de 55-70 mL/kg de peso corporal3. Los puntos de tiempo de recolección son generalmente intensivos dentro de los 30 minutos después de la dosificación y disminuyen después de eso, y se deben recolectar más de diez muestras de sangre dentro de las 48 h en las pruebas de rutina4. Por ejemplo, las muestras de sangre se recogen en 12 puntos de tiempo (0 min, 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 8 h y 12 h) en el estudio de conocimientos tradicionales de fármacos administrados por vía oral. Los investigadores deben recolectar repetidamente 200-250 μL de sangre en ratas para obtener plasma de alta calidad para la prueba de conocimientos tradicionales5.
Los sitios de recolección de sangre en ratas incluyen vasos sanguíneos de la cola, vena del plexo retroorbital, vena submandibular, corazón, aorta abdominal6, etc. Entre ellos, la recolección de sangre de la vena caudal de ratas es un método de uso frecuente, que requiere operadores experimentados y capacitados 7,8. Recolectar sangre de la vena del plexo retroorbitario es menos complicado; Sin embargo, este método no se recomienda ya que puede dañar la vista de las ratas9, y la sangre del corazón y la aorta abdominal sólo es apropiada para el muestreo final de sangre10. Otro método de recolección de sangre de la vena submandibular en una rata consciente ha demostrado resultar en más complicaciones y reveló una calidad insuficiente de la muestra de sangre11. Por lo tanto, los investigadores pueden anestesiar al animal para reducir la dificultad del muestreo. Aún así, la anestesia también aumenta el costo del experimento y, lo que es más grave, afectará el estado metabólico de las ratas12. El presente protocolo utiliza un método rápido y sencillo de recolección de sangre en las venas subclavias de ratas sin anestesia, lo que permite un posicionamiento preciso y una recolección de sangre alterna bilateral para obtener muestras de alta calidad de manera oportuna y repetida.
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Protocol
Todos los experimentos con animales descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. Se utilizaron ratas Sprague Dawley (SD) machos y hembras, ~ 6-11 semanas para los experimentos. Las ratas fueron criadas siguiendo las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio13.
1. Preparación de animales
NOTA: Todas las ratas SD utilizadas en este estudio estaban despiertas y no fueron anestesiadas/sacrificadas. Se necesita la habilidad de manejar la restricción agarrando la piel en la espalda del animal.
- Encuentra el punto más bajo de la fosa triangular subclavia entre el cuello y la extremidad anterior en una rata. Mueva ~2-3 mm hacia la cabeza y alcance la punta de aguja en el sitio de recolección de sangre (Figura 1). Retire el vello con una afeitadora eléctrica.
NOTA: Dependiendo de las necesidades experimentales, se puede requerir suero o plasma. El plasma se toma como ejemplo en este protocolo, y no afectará la operación de recolección de sangre. - Prepare hisopos de algodón teñidos con alcohol al 75% para limpiar y desinfectar e hisopos de algodón secos para limpiar.
2. Muestreo de sangre
NOTA: Al menos 2 personas, ambas con experiencia en la recolección de sangre y técnicas de restricción de ratas, deben llevar a cabo estos pasos.
- Agarre la piel de la parte posterior del cuello con una mano para mantener la cabeza, el cuello y el pecho de la rata erguidos y exponga el sitio de inyección (Video 1). Enderezar la extremidad anterior en el lado del sitio de inyección para mantener su nivel.
- Mantenga la jeringa paralela a la cabeza de la rata con la otra mano e incline la jeringa hacia afuera 5°-10° para que la punta esté inclinada hacia la dirección ventral.
- Inserte la aguja completamente en la cavidad anterior. Retraiga la jeringa para mantener la presión negativa dentro del tubo.
- Mueva lentamente la aguja de profunda a poco profunda y retroceda por el mismo camino. Cuando la sangre haya entrado en la aguja de la jeringa, fije la posición de la aguja (Video 2).
NOTA: La sangre se llenará a una velocidad constante en la jeringa, como se muestra en la Figura 2A (vista frontal) y la Figura 2B (vista lateral). - Controlar la cantidad máxima de sangre de acuerdo con las normas establecidas por el comité de cuidado y uso de animales de la institución. Esto depende del peso y la salud del animal. En ausencia de otros requisitos, no retire más del 20% del volumen total de sangre del animal dentro de las 24 h, lo que requiere ~ 3 semanas de recuperación14.
- Cuando se obtenga suficiente muestra de sangre, retire inmediatamente la jeringa y prepárese para el tratamiento de sangre (paso 3).
- Presurice el sitio de inyección de la rata durante ~ 1-2 minutos para detener el sangrado. Dado que el sitio de recolección está en la parte inferior del cuello, pellizque la piel de la vena subclavia para detener el sangrado presionándola (Figura 3).
NOTA: La sangre se puede recolectar alternativamente de la vena subclavia bilateral cuando se necesita una recolección repetida de sangre. - Devuelva la rata a la jaula y observe su condición.
3. Procesamiento de la muestra de sangre
- Retire la aguja de la jeringa y deséchela en el recipiente afilado para herramientas. Transfiera lentamente la sangre de la jeringa a un tubo de 1,5 ml. Presione la jeringa contra la pared para evitar la formación de burbujas, si las hay.
NOTA: Como la presión puede causar la ruptura de los glóbulos rojos, retire la aguja para prevenir la hemólisis14. - Cubra el tubo de microcentrífuga, muévalo suavemente y gírelo boca abajo al menos cinco veces para mezclar bien la sangre con el anticoagulante.
- Centrifugar la muestra de sangre entera a 2000 x g durante ~10-15 min a temperatura ambiente dentro de los 120 min después de recoger el plasma.
- Utilice una pistola de pipetas (consulte la Tabla de materiales) para transferir el plasma superior a un tubo de microcentrífuga en blanco. No toque la cabeza de la pipeta con la parte inferior de la sangre entera. Deseche o vuelva a centrifugar el plasma contaminado con los glóbulos rojos.
- Utilizar las muestras inmediatamente o almacenarlas a -30 °C.
NOTA: Las características del medicamento determinan el tiempo de almacenamiento. Las muestras de plasma obtenidas de la vena subclavia son translúcidas y de color amarillo claro. La hemólisis puede tornar el plasma rojo.
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Representative Results
Las buenas muestras de plasma de la vena subclavia fueron de color amarillo pálido translúcido (Figura 4, el tubo izquierdo). La recolección o manipulación inadecuada de sangre resultó en hemólisis (Figura 4, el tubo derecho).
Los datos de la instalación de prueba mostraron que en un estudio de toxicidad oral de 4 semanas de un colirio en ratas SD con TK, se recolectaron muestras de sangre dos veces en 9 puntos de tiempo (0 h, 0.167 h, 0.5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h y 24 h) entre el primer (Día 1) y el último día de dosificación (Día 28). La dosis para las ratas TKB, TKC y TKD fue de 10 mg / kg, 30 mg / kg y 100 mg / kg, respectivamente, y el volumen de dosis fue de 10 ml / kg. El volumen de recolección de sangre de la primera muestra fue de ~ 0.2 ml, la edad del animal fue de ~ 6-7 semanas, el peso corporal del animal macho fue de ~ 268-297 g y el de la hembra fue de ~ 214-239 g. El volumen de sangre de la última muestra fue de ~ 0.3 ml, la edad del animal fue de ~ 10-11 semanas, el peso corporal del animal macho fue de ~ 376-462 g y el del animal hembra fue de ~ 254-300 g. Hubo un intervalo de 28 días entre los dos momentos de la recolección de sangre de CC.TT. El peso corporal de los animales aumentó constantemente cada semana, y la observación clínica fue normal. La cantidad total de sangre de una rata de 250 g es de aproximadamente 16 ml15, y la cantidad máxima de sangre recolectada dentro de las 24 h no excedió el 20% de la sangre total del animal. Los datos de peso corporal de las hembras se muestran en la Tabla 1, y los de los machos se muestran en la Tabla 2.
Figura 1: Representación de la punta de aguja del sitio de recolección de sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Proceso de extracción de sangre. La sangre se obtuvo sin problemas. (A) Vista frontal. (B) Vista lateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representación del método hemostático. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Aspecto de la muestra después de la centrifugación. El tubo izquierdo mostró una imagen de plasma calificada. El tubo derecho mostró una muestra de hemólisis. El plasma se veía rosado o rojo. Cuanto más oscuro es el color, mayor es la tasa de hemólisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Anatomía de la vena subclavia. Esta vena se encuentra debajo de la clavícula, y la aguja puede alcanzarla simplemente pasando a través de la fosa triangular subclavia no más de 0,5 cm. Se une a la vena yugular interna, la vena vertebral y la vena yugular externa para formar la vena craneal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Datos de peso corporal de las hembras. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla 2: Datos de peso corporal de animales machos. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Video 1: Vista de arriba hacia abajo del proceso de muestreo de sangre de rata. Haga clic aquí para descargar este video.
Video 2: Vista lateral del proceso de muestreo de sangre de rata. Haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Hay ciertos beneficios de recolectar sangre de las venas subclavias. (1) Como el sitio de la recolección de sangre se disocia fácilmente, y el plexo venoso no es regular debido a las diferentes posturas de las ratas, el método descrito puede localizar fácilmente la posición del plexo venoso mientras mantiene las posturas estables y cómodas de las ratas. (2) La operación es fácil y favorable para el rápido desarrollo de las habilidades de los técnicos y menos dolor para los animales. (3) Un modo de funcionamiento para que el animal se sienta cómodo reduce significativamente los comportamientos inquietos y evita las salpicaduras de sangre. (4) Es un método de extracción de sangre con alta velocidad (20 s), alta eficiencia, bajo costo y sin anestesia, lo que reduce el riesgo de anestesia animal y el tiempo de restricción en términos de bienestar animal.
En este protocolo, las ratas se mantienen cómodas en el proceso de sujeción, relajándose moderadamente al manipular y evitando un toque prolongado. El manejo suelto permite que las ratas se muevan rápidamente y puede causar lesiones accidentales a animales o personas; Por el contrario, puede causar hipoxia en ratas. Es esencial detener el sangrado mientras se presiona en el sitio de muestreo. Los operadores sostienen al animal en sus brazos para suavizarlo en la oscuridad. Además, la presión negativa no debe ser demasiado alta durante la extracción de sangre; de lo contrario, conducirá a un muestreo de sangre deficiente. Dado que los estudios farmacocinéticos y tradicionales requieren la extracción repetida de sangre, el volumen de sangre debe controlarse de acuerdo con el peso de los animales y las diferentes condiciones de salud; Mientras tanto, un sitio alternativo de recolección de sangre beneficiará el bienestar animal. Si los animales son pequeños o débiles, se les suministrará glucosa y otros suplementos de forma adecuada en las condiciones permitidas por la prueba. La entrada de la aguja debe ser lisa y libre de resistencia, y cuando no hay sangre para recolectar, o no hay resistencia, la aguja debe volver a insertarse en una dirección ligeramente ajustada o cambiar de lado. En el proceso de muestreo de sangre, es necesario evitar mezclar sangre extraída dos veces desde la inserción. Cuando el volumen de la muestra de sangre para la primera inyección es insuficiente, se requiere la segunda inyección, es necesario reemplazar la jeringa y se toma el tubo de reemplazo para la sangre extraída nuevamente en caso de hemólisis. Se recomienda terminar de recolectar sangre de inmediato. La sangre en la jeringa se adhiere a la pared y se inyecta en el tubo de recolección de sangre para evitar burbujas durante el proceso. Para recolectar sangre a tiempo, el operador debe estar completamente preparado 2 minutos antes de la recolección e inyectar 1 minuto antes de eso. Cuando el animal es menos cooperativo o difícil de operar, debe ser calmado con anticipación. Por lo tanto, es necesario que haya un grupo de técnicos calificados.
El plexo braquial es perpendicular a y detrás de la vena subclavia, por lo que una operación inadecuada puede provocar lesión del plexo braquial, dolor en las extremidades anteriores, cojera, estremecimiento y otros síntomas adversos16. Esta técnica también se puede aplicar a conejillos de indias y satisfacer las necesidades de recolección de sangre en experimentos con conejillos de indias, pero se necesita más investigación para extraer sangre de conejillos de indias mediante este método.
La anatomía de una vena subclavia se muestra en la Figura 5. La vena subclavia se encuentra debajo de la clavícula, y la aguja puede alcanzarla simplemente pasando a través de la fosa triangular subclavia no mayor de 0,5 cm. Por lo tanto, el método es arriesgado y requiere un profesional calificado. Un profesional no calificado resultará en hiperactividad animal, dificultad para controlar, mala circulación sanguínea, debilidad animal o incluso mortalidad después de una recolección de sangre en serie. La cirugía incorrecta también dañará el tórax o la arteria. Como resultado, es crucial involucrar a un profesional calificado para lograr un experimento exitoso.
En conclusión, este protocolo presenta un método alternativo para recolectar sangre de la vena subclavia de ratas, que proporciona apoyo técnico para estudios farmacocinéticos y de CC.TT.
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Disclosures
Limei Wang, Jianmin Guo, Xiaoman Zhong, Yali Sheng, Qiwen Lai, Hui Song y Wei Yang tienen un interés financiero en Guangdong Lewwin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd, que, sin embargo, no apoyó este trabajo. Los otros autores declaran que no hay intereses en conflicto.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por el Laboratorio Provincial Clave de Evaluación e Investigación No Clínica de Medicamentos de Guangdong (No.2018B030323024) y el Programa Clave "Creación de Nuevos Medicamentos" del Plan de Investigación y Desarrollo Clave de Guangdong (No.2019B020202001), Proyecto de Investigación de la Fundación Fundamental y de Aplicación de Guangzhou (No.202002030249 y No.202002030156).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
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