Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Uitbreiding van de toolkit voor in vivo beeldvorming van axonaal transport

Published: December 23, 2021 doi: 10.3791/63471
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology, University College London, 2UCL Queen Square Motor Neuron Disease Centre, University College London, 3UK Dementia Research Institute, University College London

Summary

Met behulp van transgene fluorescerende muizen worden gedetailleerde protocollen beschreven om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in motorische en sensorische axonen van de intacte heupzenuw bij levende dieren te beoordelen.

Abstract

Axonaal transport handhaaft neuronale homeostase door de bidirectionele handel van diverse organellen en ladingen mogelijk te maken. Verstoringen in axonaal transport hebben verwoestende gevolgen voor individuele neuronen en hun netwerken en dragen bij aan een overvloed aan neurologische aandoeningen. Omdat veel van deze aandoeningen zowel celautonomische als niet-autonome mechanismen omvatten en vaak een spectrum van pathologie vertonen over neuronale subtypen, zijn methoden om neuronale subsets nauwkeurig te identificeren en te analyseren noodzakelijk.

Dit artikel beschrijft protocollen om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in heupzenuwen van verdoofde muizen te beoordelen. Stapsgewijze instructies worden gegeven om 1) motorische van sensorische neuronen in vivo, in situ en ex vivo te onderscheiden door muizen te gebruiken die selectief fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in cholinerge motorneuronen; en 2) afzonderlijk of gelijktijdig in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën beoordelen. Deze complementaire intravitale benaderingen vergemakkelijken de gelijktijdige beeldvorming van verschillende ladingen in verschillende perifere zenuwaxonen om axonen kwantitatief het axonale transport in gezondheid en ziekte te monitoren.

Introduction

Het perifere zenuwstelsel (PNS) verbindt het centrale zenuwstelsel (CZS) met zijn distale doelen, waardoor het relais van efferente signalen motorische controle kan uitoefenen en afferente signalen om sensorische feedback te geven. Met behulp van de vele ontwikkelingen in de muisgenetica hebben wetenschappers verschillende muismodellen ontwikkeld om veel ziekten / syndromen te onderzoeken die de PNS 1,2,3 treffen. Aangezien de meeste neurodegeneratieve pathologieën multifactorieel zijn met celautonomische en niet-autonome bijdragen 4,5, kan het ontwarren van cel- / neuronspecifieke pathologieën cruciale, nieuwe inzichten in ziektemechanismen bieden.

Hiertoe heeft de ontwikkeling van bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) -transgene muizen6 selectieve endogene expressie van fluorescerende eiwitten in gerichte subsets van neuronen mogelijk gemaakt. Er zijn bijvoorbeeld BAC-transgene muizen beschikbaar, die groen fluorescerend eiwit (GFP) tot expressie brengen in cholinerge7 of glycinerge neuronen8, of een variant rood fluorescerend eiwit (tdTomato) in parvalbumine-positieve neuronen9. Als alternatief kan selectieve neuronale expressie van fluorescerende eiwitten worden bereikt via Cre-loxP-technologie 10. Muisstammen die Cre-recombinase tot expressie brengen in subsets van neuronen (bijv. Choline-acetyltransferase (ChAT)-Cre) kunnen bijvoorbeeld worden gefokt met muizen die een fluorescerend eiwit (bijv. tdTomato of GFP) tot expressie brengen uit een constitutieve locus (bijv. Gt (ROSA) 26Sor) onder controle van een transcriptionele repressor geflankeerd door loxP-sites11 (bijvoorbeeld het genereren van muizen die tdTomato alleen in cholinerge neuronen tot expressie brengen). Inderdaad, met behulp van Cre-loxP-recombinatie zijn transgene muizen gegenereerd die geel fluorescerend eiwit tot expressie brengen in axonen van het dalende corticospinale kanaal12.

Bovendien maken recente ontwikkelingen in CRISPR/Cas9-genbewerking, zoals ORANGE, de fluorescerende tagging van meerdere endogene neuronale eiwitten mogelijk, met expressie haalbaar bij nanoschaalresolutie13. Bovendien kan ORANGE-CAKE, in combinatie met Cre-expressing muizenstammen, worden gebruikt om meerdere endogene eiwitten in individuele neuronen te labelen13. Als alternatief maakt viraal-gemedieerde neuronale tracering ook de etikettering van neuronale subsets mogelijk en kan worden bereikt met gerichte combinaties van virale serotypen en / of celspecifieke promotors 14,15,16,17.

Naast de neuronale etiketteringsmethoden zijn muislijnen ook ontworpen om reportereiwitten tot expressie te brengen die gericht zijn op specifieke organellen, zoals mitochondriën die cyaan fluorescerend eiwit tot expressie brengen (Mito.CFP)18 of autofagosomen die GFP (LC3.GFP)19 tot expressie brengen. Bovendien zijn muislijnen ontworpen om de calciumdynamica specifiek in neuronen te beoordelen (bijv. Thy1.GCaMP)20,21. Al met al, met de vooruitgang van dergelijke modellen, stellen nieuwe experimentele toepassingen wetenschappers in staat om preciezere biologische en pathologische vragen te stellen over het CZS en PNS.

De belangrijkste rol van perifere motorische zenuwen is het verzenden van elektrische signalen naar de skeletspieren om beweging uit te lokken. Bovendien, en optredend over langere tijdschalen, doorkruisen neurochemische en fysiologische berichten in de vorm van diverse organellen (bijv. Mitochondriën, endolysosomen, signaal-endosomen) het cytoskeletale netwerk op een uni- of bidirectionele manier om neuronale homeostase te helpen handhaven 22,23,24. Stoornissen in axonaal transport hebben desastreuze gevolgen voor de neuronale gezondheid en zijn gekoppeld aan veel neurologische en neurodegeneratieve ziekten25. Op moleculair niveau kunnen stoornissen in axonaal transport fysiologische gebeurtenissen verstoren die synaptische signalering en plasticiteit, gentranscriptie en lokale translatie in het axon reguleren26,27. Hoewel er een veelheid aan hulpmiddelen is om deze gebeurtenissen in gekweekte cellen/neuronen te bestuderen28,29, is het beoordelen van axonale transportdynamiek en axonaal gekoppelde biologische gebeurtenissen in vivo vereist om belangrijke inzichten in fysiologische en pathologische processen te bevestigen30.

In de loop der jaren heeft het Schiavo Laboratorium protocollen geoptimaliseerd om diverse vragen te stellen over axonaal transport 31,32,33,34,35,36. Deze experimenten zijn uitgebreid van de ontdekking dat een fluorescerend gelabeld atoxisch fragment van tetanus neurotoxine (HCT) wordt geïnternaliseerd in axonterminals in skeletspieren door interacties met nidogenen en polysialogangliosiden37. Eenmaal geïnternaliseerd, wordt HCT retrograde getransporteerd in Rab7-positieve, neurotrofine-bevattende signaal-endosomen die bestemd zijn voor de cellichamen van motorische en sensorische neuronen 38,39,40,41. Tegelijkertijd heeft de vooruitgang in beeldvormingstechnologie de real-time analyse van perifere zenuwbundels en individuele axonen in levende, verdoofde muizen30 mogelijk gemaakt. De eerste poging tot het beoordelen van in vivo axonale transportdynamiek in de pathologie onthulde presymptomatische stoornissen in het transport van signaal-endosomen en mitochondriën in het SOD1G93A-muismodel van amyotrofische laterale sclerose (ALS)35. Belangrijk is dat het onwaarschijnlijk is dat deze defecten eenvoudigweg secundaire gevolgen van neurodegeneratie vertegenwoordigen, gezien de bevinding dat verlies van motorneuronen kan optreden in afwezigheid van axonale transportverstoringen in een muismodel van kennedy's ziekte42 en een heterozygoot mutant FUS-model van ALS43. Dergelijke axonale transporttekorten kunnen bij ALS-muizen worden verholpen met behulp van remmers van specifieke kinasen33 of groeifactorreceptoren34. Bovendien verandert de behandeling van neuronen met een specifieke histondeacetylaseblokker mitochondriaal transport in vivo36. Onlangs rapporteren we dat de BDNF-afhankelijke modulatie van axonaal transport ontregeld is in verschillende subtypen van motorneuronen bij ALS-muizen44.

Door gebruik te maken van een steeds groter wordende toolkit voor het beoordelen van axonale transportdynamiek 28,29, schetst dit videoprotocol verschillende toepassingen die verdere inzichten in verschillende biologische en pathologische scenario's mogelijk maken. Ten eerste worden transgene muizen die selectief fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in cholinerge neuronen (d.w.z. motorneuronen) gebruikt om onderscheid te maken tussen motorische en sensorische axonen, zowel in vivo als ex vivo. Fluorescerend gelabeld HCT wordt vervolgens geladen in signaal-endosomen in drie transgene lijnen om axonale transportdynamiek in verschillende perifere neuronen te differentiëren. Het volgende experimentele protocol beschrijft een multiplex fluorescentiebenadering om mitochondriaal transport specifiek in motorneuronen te beoordelen door ChAT.tdTomato-muizen te fokken met Mito-CFP-muizen. Ten slotte worden instructies gegeven over hoe mitochondriën en signaal-endosomen binnen hetzelfde axon in vivo gelijktijdig in beeld kunnen worden gebracht.

Protocol

Alle muisbehandeling en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Animals (Scientific Procedures) Act (1986) en werden goedgekeurd door de University College London - Queen Square Institute of Neurology Ethics Committee.

1. Dieren

  1. Huisvest alle dieren in individueel geventileerde kooien in een temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde omgeving en onderhoud ze op een licht / donker-cyclus van 12 uur met ad libitum toegang tot voedsel en water.
  2. Gebruik zowel mannelijke als vrouwelijke muizen van de volgende transgene stammen: 1) heterozygote Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd muizen, aangeduid als ChAT.eGFP muizen; 2) heterozygoot B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J, aangeduid als HB9. GFP-muizen; en 3) heterozygote B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J, aangeduid als Mito.CFP muizen.
  3. Genereer ChAT.tdTomato-muizen door homozygote B6;129S6-Chat tm2(cre)Lowl/J, aangeduid als ChAT.Cre-muizen, te kruisen met homozygote B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J, aangeduid als Rosa26.tdTomato-muizen.
  4. Genereer ChAT.tdTomato::Mito.CFP-muizen door heterozygote ChAT.tdTomato-muizen te kruisen met heterozygote Mito.CFP-muizen.

2. Intramusculaire injecties van fluorescerende HCT

  1. Pre-operatieve voorbereiding
    1. Express HCT (HCT441, residuen 875-1315) gefuseerd tot een verbeterde cysteïne-rijke tag in bacteriën als een glutathion-S-transferase fusie-eiwit volgens 45. Label HCT met AlexaFlour555 C2 maleimide31, dialyseer het in ijskoude dialysebuffer (10 mM HEPES-NaOH, 100 mM NaCl, pH 7,4), vries het in vloeibare stikstof in en bewaar het bij -80 °C. Voordat u in vivo experimenten uitvoert, test u eerst HCT in vitro voor succesvolle opname en transport in primaire neuronen.
    2. Verdun fluorescerend HCT (bijv. HCT-555) tot een uiteindelijke en experimenteel consistente concentratie variërend van 2,5 tot 10 μg/μL in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) in een buis van 0,2 ml. Voeg bij deze stap indien nodig meer verbindingen/factoren toe aan de HCT-oplossing (bijv. Van de hersenen afgeleide neurotrofe factor).
      OPMERKING: Het uiteindelijke volume moet geschikt zijn voor de grootte van de spier (en) van belang. Bereid bijvoorbeeld een injectievolume van 3-4 μL voor de tibialis anterieure (TA) spier en ~ 1 μL voor de kleinere soleusspier. Houd de werkconcentratie van HCT tussen 2,5 en 10 μg/μL, ongeacht het uiteindelijke volume.
    3. Meng de HCT-oplossing met behulp van een pipet of vortex en draai kort op lage snelheid met behulp van een desktopcentrifuge om de vloeistof te verzamelen en grote bellen te verwijderen. Bescherm de HCT tegen licht en transport op ijs.
    4. Gebruik een micropipette van getrokken glas voor optimale intramusculaire injecties in kleinere spieren (bijv. Soleus) of voor intrasciatische zenuwinjecties. Trek gegradeerde glazen micropipettes (volgens 46) vóór de operatie.
      OPMERKING: Om pipetteren mogelijk te maken en de stroom op en neer de achterkant van de micropipette te beperken, breekt u voorzichtig een klein stukje van de scherpe punt af met behulp van een fijne tang onder een ontleedmicroscoop. Zorg ervoor dat u het kapotte uiteinde in de juiste bak gooit.
    5. Steriliseer en reinig alle chirurgische hulpmiddelen voor gebruik.
  2. Chirurgie-intramusculaire injecties
    1. Bereid de operatie voor door een steriel chirurgisch gordijn vast te zetten op een warmtemat op 37°C. Plaats en focus de operatiemicroscoop. Om de operatie te beginnen, pakt u de voorgesteriliseerde chirurgische hulpmiddelen, chirurgische tape, steriele wattenstaafjes, 70% (v / v) ethanol in water, steriele zoutoplossing, hechtingen en een Hamilton-naald of getrokken glazen micropipettes uit op de chirurgische drapeer.
    2. Zorg ervoor dat de verdovingsmachine voldoende zuurstof en isofluraan heeft voor de duur van de chirurgische ingreep. Leid de stroom van anesthesie naar de inductiekamer en schakel de verdovingsmachine in.
      1. Gebruik om te beginnen een zuurstofdebiet van 1-2 l/min en 5% isofluraan. Plaats de muis in de inductiekamer om de anesthesie te starten. Wanneer de rechtzettingsreflex afwezig is, vermindert u de anesthesie tot 2-3% isofluraan, richt u de stroom van anesthesie naar het mondstuk en brengt u de muis over naar het mondstuk in een apart gebied van de chirurgische ruimte.
    3. Zorg ervoor dat zowel de cornea- als de pedaalonttrekkingsreflexen afwezig zijn voordat u het gebied van de vacht scheert dat de te injecteren spier (en) bedekt. Verwijder na voltooiing zoveel mogelijk geschoren vacht van de muis met behulp van de kleverige kant van chirurgische tape en plaats de muis op weegschalen om het pre-chirurgische gewicht te registreren.
    4. Breng voorzichtig oogsmeermiddel aan met een wattenstaafje en breng de muis en het mondstuk over naar het operatiegebied.
      OPMERKING: Probeer de hoeveelheid geschoren vacht te beperken die ook naar het operatiegebied wordt overgebracht. Gebruik chirurgische tape om het hoofd aan het mondstuk te bevestigen om te voorkomen dat de muis uitglijdt. Breng met behulp van een apart wattenstaafje ethanol aan op het geschoren gebied om bontbesmetting te steriliseren en te verminderen.
    5. Positioneer het lichaam volgens de te injecteren spier. Plaats bijvoorbeeld voor de TA de muis op zijn rug en strek de achterste op ~ 10 ° van de middellijn. Als alternatief, voor soleusinjecties, plaats het dier op zijn kant en verleng de achterste op ~ 45 ° van de middellijn. Wanneer de achterste in de juiste positie is, gebruikt u chirurgische tape over de voet om ongewenste bewegingen tijdens de operatie te voorkomen.
      OPMERKING: De injectieprocedures voor TA, gastrocnemius en soleusspieren zijn eerder gedetailleerd32.
    6. Voordat u een incisie maakt, bevestigt u dat de anesthesie voldoende is door de pedaalonttrekkingsreflex te testen. Controleer de anesthesie voortdurend en onderhoud deze gedurende de chirurgische procedure met regelmatige beoordeling van de ademhaling en de ontwenningsreflex.
    7. Trek op dit punt de werkende HCT-oplossing in de Hamilton-spuit of de micropipette van getrokken glas.
    8. Maak een kleine incisie over de spier(en) van belang in het gebied (en) dat overeenkomt (en) met de motorische eindplaatgebieden 46,47,48. Doorboort de externe fascia op de spier en injecteer langzaam de HCT volgens 32. Laat de spuit/micropipette 5-10 s op zijn plaats voordat u zich langzaam terugtrekt.
    9. Sluit de incisies met 1-2 hechtingen en breng de muis over naar een geïsoleerde herstelkooi. Controleer de muis na de operatie gedurende minimaal 30 minuten, voordat u deze terugbrengt naar de thuiskooi. Wanneer de muis met succes is hersteld en de postoperatieve monitoring is voltooid, brengt u de kooi terug naar normale huisvestingsomstandigheden.

3. In vivo axonaal transport

  1. Blootstelling van de heupzenuw
    1. Stel de microscoopomgevingskamer ten minste 1 uur vóór de beeldvorming in op 37 °C.
    2. Bereid je voor om de heupzenuw bloot te leggen door het chirurgische gordijn, gereedschappen, tape, steriele wattenstaafjes, 70% ethanol en steriele zoutoplossing rond het chirurgische gebied te plaatsen. Zorg ervoor dat de verdovingsmachine voldoende zuurstof en isofluraan heeft voor maximaal 2 uur per muis. Maak een wig uit parafilm of onzichtbare tape door deze in een smalle rechthoek te snijden (bijv. ~ 1 cm breedte voor grotere muizen) met een schuine punt en plaats deze onder de blootgestelde heupzenuw om het beeldvormingsproces te ondersteunen. Plaats de inductiekamer op een warmtemat en stel deze in op lichaamstemperatuur.
      OPMERKING: Vier uur is ruim de tijd voor HCT om te zijn opgenomen en retrograde te worden getransporteerd van de injectieplaats naar de heupzenuw; vandaar dat een enkele muis na deze tijd kan worden klaargemaakt voor heranesthesie.
    3. Leid de stroom van anesthesie naar de inductiekamer, schakel de anesthesiemachine in met een zuurstofdebiet van 1-2 L / min en 3-4% isofluraan en plaats de muis in de inductiekamer om anesthesie te starten.
      OPMERKING: Aangezien het in vivo axonale transportexperiment een terminale procedure is, is het niet nodig om de ogen te smeren.
    4. Wanneer de rechtzettingsreflex afwezig is, vermindert u de anesthesie tot 2-3% isofluraan, stuurt u de stroom van anesthesie naar het mondstuk en brengt u de muis over naar het mondstuk. Gebruik chirurgische tape om het hoofd aan het mondstuk te bevestigen, verleng de beoogde achterklep op ~ 45 ° van de middellijn en gebruik chirurgische tape over de voet om deze positie te behouden.
      OPMERKING: Verminderde anesthesie is op dit moment voordelig omdat het de impact van ademhalingsartefacten tijdens het beeldvormingsproces kan beperken.
    5. Zorg ervoor dat cornea- en pedaalonttrekkingsreflexen afwezig zijn en gebruik vervolgens een schaar om de huid weg te snijden die boven de heupzenuw ligt32 (d.w.z. een groot gebied dat zich uitstrekt van het centrale ruggenmerg tot het midden van de onderste achtervel). Verwijder de bovenliggende biceps femoris spier, evenals alle andere spieren en bindweefsel dat zich in de buurt van de heupzenuw bevindt. Vermijd beschadiging van de heupzenuw en de omliggende bloedvaten, vooral die in de buurt van het laterale aspect van het patella / proximale aspect van de laterale gastrocnemiuskop.
    6. Wanneer de intacte heupzenuw voldoende is blootgesteld, brengt u voorgewarmde steriele zoutoplossing aan op het gebied rond de heupzenuw om uitdroging te voorkomen. Gebruik een gebogen tang om het diepliggende bindweefsel te verstoren en plaats de vooraf voorbereide parafilm 'wig' onder de zenuw. Wanneer u klaar bent, plaatst u in zoutoplossing gedrenkte watten op het blootgestelde gebied en beweegt u de muis in de inductiekamer bovenop de warmtemat (ingesteld op 37 °C), die nog steeds moet worden gevuld met isofluraan in O2.
  2. In vivo axonale beeldvorming
    1. Plaats een afdekglas van 22 x 64 mm op het aangepaste microscooppodium en beveilig de positie met tape. Selecteer en breng dompelolie aan op het objectief en sluit vervolgens het microscoopstadium aan op de omgekeerde microscoop. Til het in olie ondergedompelde objectief langzaam op totdat er contact wordt gemaakt tussen de olie en het dekglas.
      OPMERKING: Ofwel de 40x, 1.3 numeriek diafragma (NA) DIC Plan-Apochromat of 63x, 1.4 NA DIC Plan-Apochromat olie-immersie doelstellingen kunnen worden gebruikt om in vivo transport in de heupzenuw in beeld te brengen.
    2. Verplaats het verdovingsmondstuk naar de microscoopfase en bevestig de anesthesieslangen met tape om verstoring van de anesthesie te voorkomen. Verwijder de watten van de heupzenuw en breng de muis over van de inductiekamer naar het mondstuk, met de blootgestelde zenuw naar het afdekglas gericht. Gebruik chirurgische tape om ervoor te zorgen dat het hoofd van de muis aan het mondstuk is bevestigd en het laagste, effectieve niveau van anesthesie te handhaven. Til de muis voorzichtig bij zijn staart op en voeg steriele zoutoplossing toe aan de deklip in de buurt van de blootgestelde heupzenuw om uitdroging te beperken en beeldvorming te bevorderen.
      OPMERKING: Sluit alle deuren van de omgevingskamer om ervoor te zorgen dat het gebied op lichaamstemperatuur blijft.
    3. Lokaliseer met behulp van de oculairen de heupzenuw, bepaal het optimale brandpunt en selecteer een interessegebied met beweeglijke axonale organellen.
      OPMERKING: Een gedetailleerde uitleg van dit proces is eerder beschreven32.
    4. Schakel over naar de computersoftware door op de knop Acquisitie (of een equivalent daarvan) te klikken en selecteer een interessegebied. Gebruik een digitale zoom om in totaal >80x vergroting te verkrijgen en draai het geselecteerde gebied om de axonen horizontaal te visualiseren (bijvoorbeeld van rechts naar links bewegende retrograde lading en van links naar rechts bewegende anterograde lading).
      OPMERKING: De directionaliteitsparameters zijn afhankelijk van de gebruiker, maar moeten consistent blijven tijdens experimenten.
    5. Optimaliseer de signaalintensiteit door parameters aan te passen zoals laserintensiteit (0,2 - 1%), pinhole diafragma (1 AU - max), versterking (Master) (700 - 1000), digitale offset (-50 - 0) en digitale versterking (1,0 - 4,0). Om de potentiële invloed van fototoxiciteit te verminderen, moet u de laserintensiteit waar mogelijk op ≤ 1% houden, met een maximale laserintensiteit van 2%. Wijzig alle andere parameters voordat u de laserintensiteit aanpast voor optimale signaaldetectie.
    6. Klik op het vak Regio's (of gelijkwaardig), selecteer een rechthoekig gebied van belang en stel vervolgens in de acquisitiemodus (of gelijkwaardig) de framegrootte in op minimaal 1024 x 1024 pixels en begin met time-lapse-acquisitie van 100-1.000 frames.
      OPMERKING: De gewenste frameacquisitiesnelheid is afhankelijk van de gebruiker (transport kan bijvoorbeeld worden beoordeeld met framesnelheden tussen 0,1 en 6 s) en kan worden aangepast met softwareparameters, zoals interessegebied, scansnelheidstijd, acquisitiemiddeling en laserdirectionaliteit. Om bijvoorbeeld een lagere framesnelheid te verkrijgen, verhoogt u de hoogte/breedte van het betreffende gebied, verkrijgt u langzamere scansnelheden, verhoogt u het acquisitiemiddeling en gebruikt u één laserdirectionaliteit, en vice versa voor een snellere framesnelheid. De frameacquisitiesnelheid moet consistent blijven in vergelijkbare datasets, omdat beeldvorming op verschillende frequenties inconsistenties kan veroorzaken. Snelle ladingen zoals signaal-endosomen vereisen een snellere framesnelheid (bijv. 0,1-3 s) in vergelijking met langzamere organellen zoals mitochondriën die kunnen worden geanalyseerd met behulp van een langzamere snelheid (bijv. 2,5-6 s).
    7. Streef ernaar om minimaal 10 beweeglijke ladingen te vangen van minimaal drie axonen per muis.
      OPMERKING: Op basis van tweezijdige, tweezijdige vermogensberekeningen (met een standaardvermogen van 0,8 (1−β) en een type I-foutenpercentage van 5% (α)) zijn steekproefgroottes van 6-8 voldoende om axonale transportverschillen tussen wildtype- en ziektemodellente identificeren 35,43.
    8. Zodra de beeldvorming is voltooid, euthanaseert u de muis onmiddellijk terwijl u onder narcose bent (bijv. Cervicale dislocatie). Post mortem weefsel, zoals spieren en heupzenuwen, kan ook worden geoogst voor verdere analyse.

Representative Results

Dit artikel beschrijft een veelzijdig protocol dat de in vivo axonale transporttoolkit in knaagdiermodellen uitbreidt. Figuur 1 toont aan dat motorneuronen axonen kunnen worden onderscheiden van zowel sensorische neuron axonen als Schwann-cellen door gebruik te maken van transgene muizen. Figuur 1A toont eGFP-expressie in cholinerge motoraxonen van een levende, verdoofde ChAT.eGFP-muis. Figuur 1B gebruikt een alternatieve methode om tdTomato-expressie te bereiken in een vers weggesneden zenuw (d.w.z. geen extra weefselverwerking) van een ChAT.tdTomato-muis. Daarom maakt het gebruik van transgene stammen zoals ChAT.eGFP, ChAT.tdTomato of Hb9.GFP motor axon-specifieke etikettering in vivo mogelijk.

Als alternatief kunnen axonen ook worden geïdentificeerd door tracers/markers (bijv. HCT31,32 of virussen die coderen voor eGFP15) in skeletspieren te injecteren. Figuur 2 belicht een dergelijke toepassing, met acht robuust tot expressie brengende ChAT.eGFP-positieve axonen die HCT-555-positieve signaal-endosomen (witte pijlen) bevatten, ~ 4 uur na sonde-injectie in de TA-spier. Met behulp van dit experimentele ontwerp konden we TA-innervating identificeren α-motorneuronen, die overwegend snel-dikmakend zijn44. Nog eens vijf ChAT.eGFP-axonen met minder robuuste eGFP-expressie (figuur 2A, oranje sterretjes) waren gedeeltelijk onscherp en bevonden zich waarschijnlijk iets dieper in de heupzenuw.

Bovendien identificeerden we HCT-555-positieve signaal-endosomen in eGFP-negatieve sensorische axonen (gele pijlen). Als zodanig kan men met behulp van dit experimentele paradigma specifiek het axonale transport van signaal-endosomen in motorische versus sensorische neuronen in vivo beoordelen en vergelijken. Inderdaad, met behulp van deze transgene reporterstam ontdekten we dat het transport van signaal-endosomen in ChAT.eGFP-positieve motoraxonen sneller is dan in ChAT.eGFP-negatieve sensorische axonen, die betrouwbaar kunnen worden gedifferentieerd met behulp van axonbreedtes43.

We hebben eerder motorneuronenaxonen geïdentificeerd met behulp van de ChAT.eGFP-muis in vivo43. We melden nu dat HB9. GFP-muizen kunnen ook worden gebruikt om in vivo motorneuron-axonidentificatie te bereiken. Figuur 3 geeft inderdaad een reeks time-lapse beelden van HB9. GFP-axonen met retrograde bewegende HCT-555-positieve signaal-endosomen. Merk op dat, in tegenstelling tot ChAT-gestuurde expressie, GFP een meer punctate / granulair patroon heeft in HB9. GFP-axonen; de reden hiervoor is onduidelijk.

We hebben eerder beschreven hoe in vivo mitochondriale dynamiek in heupzenuwen kan worden gevolgd via intrasciatische zenuwinjecties van de mitochondriaal gerichte kleurstof, tetramethylrhodamine, ethylester, perchloraat (TMRE)32,36. Om op betrouwbare wijze motorische versus sensorische mitochondriën te onderscheiden, kan de Mito.CFP-muis, die CFP tot expressie brengt onder de Thy1-promotor 18, worden gekruist met transgene muizen die een fluorescerend reportergen tot expressie brengen in specifieke neuronale typen. Inderdaad, door Mito.CFP-muizen te fokken met ChAT.tdTomato-muizen (aangeduid als ChAT.tdTomato::Mito.CFP), konden we mitochondriën specifiek visualiseren in motorische axonen, zoals weergegeven in figuur 4. In dit live multiplex voorbeeld konden vijf ChAT.tdTomato axonen worden gevisualiseerd, waarvan er vier CFP-positieve mitochondriën bevatten. Bovendien kon ook het knooppunt van Ranvier (witte pijl in paneel iii) worden geïdentificeerd. Bovendien zijn de knooppunten van Ranvier duidelijk detecteerbaar in ChAT.eGFP, HB9. GFP- en Mito.CFP-muizen (niet weergegeven). Deze dubbel-transgene stammen maken time-lapse intravitale beeldvorming van levende, verdoofde muizen mogelijk om motorneuronspecifieke mitochondriale inhoud en axonale transportdynamiek te controleren.

Ten slotte kunnen signaal-endosomen en mitochondriën gelijktijdig worden gevisualiseerd binnen dezelfde axonen in vivo door HCT in de spieren van Mito.CFP-muizen te injecteren (figuur 5). Intramusculaire injecties van HCT-555 werden uitgevoerd in TA-spier in een Mito.CFP-muis ~ 4 uur voorafgaand aan beeldvorming. Zowel mitochondriën (i-panelen) als signaal-endosomen (ii-panelen) werden tegelijkertijd gevisualiseerd in spierspecifieke axonen (d.w.z. axonen die de TA innerveren). Inderdaad, anterogradely (gele driehoeken) en retrograde (groene driehoeken en cirkels) bewegende organellen evenals vastgelopen organellen (oranje driehoeken en cirkels) kunnen worden waargenomen. Met behulp van dit experimentele paradigma kan men de complexe functionele interacties tussen axonale mitochondriën en signaal-endosomen in vivo beoordelen. Over het algemeen demonstreren we verschillende experimentele benaderingen om axonaal transport van signaal-endosomen en / of mitochondriën te beoordelen, met name in cholinerge motorneuronen in vivo.

Figure 1
Figuur 1: Ischiaszenuwmotorische axonen. (A) Representatief enkelvlaksbeeld van eGFP-positieve motoraxonen verkregen in vivo van een ChAT.eGFP-muis. (B) Representatief enkelvlaksbeeld van tdTomato-positieve motoraxonen in een weggesneden heupzenuw van een ChAT.tdTomato-muis. Verschillen in axonkaliber zijn het gevolg van verschillen in muisleeftijd en -grootte. Schaalstaven = 50 μm. Afkortingen: eGFP = enhanced green fluorescent protein; ChAT = choline acetyltransferase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: In vivo axonaal transport van signaal-endosomen in levende heupzenuwmotor en sensorische neuronen van een ChAT.eGFP-muis. (A-C) Representatieve beelden van cholinerge axonen die eGFP (A) tot expressie brengen en HCT-555-positieve signaalsosomen (B) en de samenvoeging (C) bevatten. De witte pijlen markeren een eGFP-positief motoraxon met HCT-555-positieve signaleringseindosomen, de cyaanpijlen identificeren een motoraxon zonder HCT-555-positieve signaleringseinden en de gele pijlen markeren een eGFP-negatief sensorisch axon dat HCT-555-positieve signaleringseinden transporteert. Oranje sterretjes identificeren motorische axonen met een zwakkere eGFP-expressie. Schaalbalk = 25 μm. Afkortingen: eGFP = enhanced green fluorescent protein; ChAT = choline acetyltransferase; HCT-555 = tetanus toxine-bindend domein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Time-lapse beeldreeksen die in vivo axonaal transport van signaal-endosomen in levende motorneuronen van een HB9 vertegenwoordigen. GFP-muis. (A-D) Time-lapse-opnamen die om de 3 s worden gemaakt met motorneuronen die groen fluorescerend eiwit (i) tot expressie brengen en HCT-555-positieve signaal-endosomen bevatten (ii) en de samenvoeging (iii). Elke cirkel van dezelfde kleur identificeert hetzelfde bewegende endosoom over verschillende frames. Retrograde beweging is van rechts naar links. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; HCT-555 = tetanus toxine-bindend domein. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: In vivo axonaal transport van mitochondriën in levende heupzenuwmotorneuronen van een ChAT.tdTomato:: Mito.CFP: muis. (A-C) Representatieve beelden van tdTomato-positieve motoraxonen (A), die CFP-positieve mitochondriën (B) bevatten, en de samenvoeging (C). De inzetafbeeldingen i-iii bevatten een hogere vergroting van elk paneel. De witte pijl stelt een vermoedelijk knooppunt van Ranvier voor. Schaalstaven = 25 (A-C) en 10 μm (i-iii). Afkortingen: ChAT = choline acetyltransferase; CFP = cyaan fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Time-lapse beeldreeksen die gelijktijdig in vivo axonaal transport van mitochondriën en signalerende endosomen in levende heupzenuwmotorneuronen van een Mito.CFP-muis vertegenwoordigen. (A-C) Time-lapse beelden genomen om de 3 s met axonaal transport van zowel mitochondriën (i) als signalerende endosomen (ii) binnen hetzelfde heupzenuw axon (iii). De gele driehoeken identificeren anterogradely bewegende ladingen, de groene cirkels / driehoeken identificeren retrograde bewegende ladingen en de oranje cirkels / driehoeken identificeren stationaire ladingen. Anterograde beweging is van links naar rechts, terwijl retrograde beweging in de tegenovergestelde richting is. Schaalbalk = 10 μm. Afkortingen: HCT-555 = tetanus toxine-bindend domein; CFP = cyaan fluorescerend eiwit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit protocol beschrijft stappen om in vivo axonaal transport van signaal-endosomen en mitochondriën in intacte axonen van de heupzenuw van de muis te beoordelen. Er is inderdaad een experimentele opstelling die gebruikers in staat stelt om 1) motorische van sensorische neuronen in vivo, in situ en ex vivo te onderscheiden door muizen te gebruiken die fluorescerende reportereiwitten tot expressie brengen die selectief tot expressie komen in motorneuronen; 2) beoordelen in vivo axonaal transport van signaal-endosomen specifiek in motorneuronen axonen met behulp van drie verschillende transgene muizen; 3) onderzoek in vivo axonaal transport van mitochondriën specifiek in motorneuronen axonen; en 4) gelijktijdig de in vivo transportdynamiek van signalerende endosomen en mitochondriën binnen hetzelfde axon beoordelen. Deze aanpak heeft een enorm potentieel voor het onderzoeken van axonaal transport in basale omstandigheden en kan worden gebruikt om pathologische verstoringen te beoordelen bij verschillende ziekten die perifere motorische en sensorische zenuwen aantasten.

Met behulp van eerdere experimentele paradigma's als basis31,32, hebben we hier gedetailleerde nieuwe, robuuste manieren om axonaal transport te onderscheiden dat plaatsvindt in motorische versus sensorische neuronen met behulp van transgene reportermuizen. Met behulp van de Mito.CFP-muis is deze aanpak verder ontwikkeld om in vivo mitochondriaal transport te beoordelen door intrasciatische zenuwinjecties van TMRE36 te vermijden. Dit omzeilt mogelijke neurale schade en verstoringen in axonaal transport veroorzaakt door de intranerve injectie van de sonde. Bovendien maakt dit protocol de visualisatie mogelijk van axonaal transport van meerdere organellen in motorische axonen die spieren innerveren met verschillende fysiologische eigenschappen (bijv. Fast-twitch dikbare spieren versus slow-twitch vermoeidheidsbestendige spieren). Als zodanig kan signaal-endosom en /of mitochondriale axonale transportdynamiek worden beoordeeld in verschillende subsets van α-motorneuronen44. Bovendien kan het axonale transport van die organellen in pathologische omgevingen ook worden beoordeeld door kruising met muismodellen van verschillende neurodegeneratieve ziekten 1,2,3.

De axonale transporttoolkit breidt zich voortdurend uit28,29 en er zijn ex vivo protocollen ontwikkeld om de transportdynamiek te beoordelen met behulp van gekweekte muis ventrale hoorn explants49 of weggesneden muiszenuw-spierpreparaten50. Bovendien heeft de ontwikkeling van protocollen voor het beoordelen van axonaal transport in geïnduceerde menselijke pluripotente stamcel (hiPSC) -afgeleide corticale51 neuronen of hiPSC-afgeleide spinale motorneuronen52 onderzoek mogelijk gemaakt van menselijke neuronen met ziekteveroorzakende mutaties. Dergelijke geavanceerde protocollen in muizenweefsel en menselijke cellen kunnen kritische inzichten bieden in de neuronale functie, nieuwe pathomechanistische ontdekkingen in neurodegeneratieve ziektemodellen vergemakkelijken en worden gebruikt om therapeutische moleculen en strategieën te testen.

Verschillende kritieke stappen moeten worden gevolgd voor de succesvolle implementatie van deze technieken, en enkele belangrijke opmerkingen zijn verstrekt in de protocolsectie. De belangrijkste vereisten voor intravitale beeldvorming zijn de omgekeerde confocale microscoop met aangepaste podiuminzet en de apparatuur om anesthesie en optimale temperatuur te behouden. Inderdaad, een gespecialiseerd mobiel anestheticumsysteem is nodig voor 1) inductie van anesthesie, 2) dissectie / weefselverwerking (d.w.z. het blootstellen van de heupzenuw) en 3) het handhaven van anesthesie tijdens intravitale beeldvorming (zoals eerder beschreven in 31,32). Vooral bij het gebruik van hogere vergrotingsdoelstellingen (bijv. 40x of 63x), kan de diepte van de anesthesie de beeldkwaliteit beïnvloeden, omdat diepere anesthesie grote 'gaspy' ademhalingen induceert die resulteren in frequente verschuivingen in focus. Dergelijke grote bewegingen zullen ongetwijfeld van invloed zijn op transportanalyses na beeldvorming (bijvoorbeeld het volgen van ladingen met behulp van de Fiji-plug-ins TrackMate53 of KymoAnalyzer54), omdat de ademhalingsbewegingen artefacten produceren in time-lapse-video's die ze ongeschikt kunnen maken voor geautomatiseerde tracking of meer tijdrovende beoordeling vereisen. Bovendien hebben we ook beeldartefacten waargenomen die worden veroorzaakt door pulserende slagaders in de heupzenuw, die alleen kunnen worden opgelost door een ander beeldvormingsgebied te kiezen. De microscoop moet zijn uitgerust met een omgevingskamer die in staat is een constante lichaamstemperatuur te handhaven, aangezien temperatuur en pH axonaal transport beïnvloeden55. Bovendien moet de toepassing van pijnstillers na de operatie worden vermeden, omdat deze de transportdynamiek kunnen veranderen56. Als het experimentele ontwerp longitudinaal is en herhaalde beeldvorming vereist (bijv.,57), moeten de dissectieprotocollen op de juiste manier worden aangepast om minimaal invasief te zijn en kunnen aanvullende ethische / licentiegoedkeuring vereisen.

Bepaalde experimentele overwegingen moeten in gedachten worden gehouden. Ten eerste omvatten de meeste protocollen die hierin worden beschreven het gebruik van transgene muizen die fluorescerende reportereiwitten bezitten in mitochondriën of motorneuronen. Elk van deze muislijnen moet worden gefokt en afgebeeld als hemi-/heterozygoot. De uitzonderingen zijn echter de ChAT.Cre- en Rosa26.tdTomato-muislijnen die afzonderlijk kunnen worden gehandhaafd als homozygoten, waarbij de resulterende hemizygote-nakomelingen tdTomato-expressie in cholinerge neuronen mogelijk maken na Cre-loxP-recombinatie . Bij het kruisen van transgene hemi-/heterozygote muizen (bijv. Mito.CFP) met andere transgene hemi-/heterozygote muizen (bijv. ChAT.eGFP), moet men de fokstrategie zorgvuldig overwegen, omdat het verkrijgen van de gewenste aantallen dubbel-mutante nakomelingen tijdrovend kan zijn. Bovendien, bij het fokken van de F1-generatie van ChAT.Cre- en Rosa26.tdTomato-muizen (d.w.z. ChAT.tdTomato) met extra transgene stammen (bijv. Mito.CFP), moet men nog minder muizen verwachten die de gewenste drievoudige transgenen dragen. Bovendien moet men ook rekening houden met de potentiële fluorofooroverlapping bij het fokken van twee-reportermuizen met nabijgelegen golflengte-eigenschappen (bijv. Mito-CFP-excitatie: 435 nm, emissie: 485 nm, gefokt met ChAT.eGFP-excitatie: 488 nm, emissie: 510 nm), hoewel het mogelijk kan zijn om dit probleem te overwinnen met spectrale ontmenging58.

Deze techniek heeft enkele beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden. In dit werk en onze eerdere protocollen 31,32 hebben we laten zien hoe verschillende genetisch gecodeerde markers en verschillende kleuringsmethoden kunnen worden gebruikt om verschillende organellen in vivo te labelen en te volgen. Niet alle sondes zijn echter geschikt voor deze experimentele aanpak. We beoordeelden injecties in TA of soleus spier van cholera toxine beta subunit (CTB)-488 (0,5-1,5 μg / μL ~ 4 uur vóór beeldvorming), een sonde die routinematig wordt gebruikt om motorneuroncellichamen te labelen in in vivo retrograde tracerexperimenten59,60. Wanneer echter alleen geïnjecteerd of gelijktijdig geïnjecteerd met HCT-555, was de CTB-488-etikettering slecht ondanks het gebruik van concentraties die vergelijkbaar waren met die welke werden gebruikt voor succesvolle retrograde motorneurontracering. We concluderen dus dat, ondanks dat CTB een uitstekende in vitro marker is van signaal-endosomen in neuronale culturen61, HCT de gouden standaard sonde blijft om signalerende endosomen in vivo in heupzenuwaxonen te identificeren.

Met behulp van verschillende routes hebben we ook sondes getest die routinematig worden gebruikt voor het labelen van lysosomen, zoals LysoTracker groen DND-26, en markers van actieve lysosomale hydrolasen, zoals BODIPY-FL-pepstatine A voor Cathepsin D62 en Magic Red voor Cathepsin B, maar zonder succes. We probeerden intramusculaire toediening van BODIPY-FL-pepstatine A (2,5 μg in de TA ~ 4 uur vóór beeldvorming), evenals intrasciatische zenuwinjectie van 2 μL LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatine A (10 μM) of Magic Red (1/10) 30-60 min vóór beeldvorming. Ondanks deze sondes die de zenuw benadrukten, konden we geen duidelijk gelabelde organellen vinden. De sondes verzamelden zich rond axonen, waarschijnlijk vastgehouden door Schwann-cellen. Vandaar dat de mislukte etikettering van lysosomen te wijten kan zijn aan een gebrekkige sondeafgifte in neuronen, hoewel het bestaan van meer geschikte concentraties niet kan worden uitgesloten. Aangezien TMRE-etikettering onder vergelijkbare omstandigheden werkt (d.w.z. intrasciatische zenuwinjecties), kan de etiketteringsintensiteit kleurstofafhankelijk zijn en moet deze voor elke marker onafhankelijk worden getest. We concluderen echter dat het richten van lysosomen in vivo met deze sondes niet haalbaar is bij de hierboven vermelde concentraties.

Methoden van anesthesie kunnen verschillende fysiologische uitlezingen veranderen (bijv. Cochlea-functie63 en corticale elektrofysiologie64); of anesthesie in vivo axonaal transport in de heupzenuw beïnvloedt, is momenteel echter onbekend. Gezien de verminderde neuromusculaire activiteit onder isofluraan-geïnduceerde anesthesie, is het mogelijk dat transportkinetiek verschilt in vergelijking met de waaktoestand. De enige in vivo studie die dit direct heeft onderzocht, toonde echter aan dat het transport van dichte kernblaasjes in thalamocorticale projecties niet verschilt tussen verdoofde en wakkere muizen65. Bovendien, omdat het onderscheid in transport tussen wildtype en ziektemodelmuizen detecteerbaar is onder anesthesie35,43, is het duidelijk dat blootstelling aan isofluraan de identificatie van perturbances bij het signaleren van endosom of mitochondriale handel niet verhindert.

Dit protocol heeft andere potentiële toepassingen, die hieronder zijn beschreven. Het fokken van de transgene muizen die in dit protocol worden beschreven (bijv. Mito.CFP, ChAT.eGFP) met neurodegeneratieve ziektemuismodellen 1,2,3 zal neuron subtype- en / of ladingspecifiek onderzoek mogelijk maken. Bovendien zouden recent ontwikkelde muis Cre-lijnen66 ook de visualisatie van fluorescerende reportereiwitten in verschillende sensorische axonpopulaties mogelijk maken. Rosa26.tdTomato muizen kunnen bijvoorbeeld worden gekruist met een neuropeptide Y receptor-2-expressing (Npy2r). Cre muis om tdTomato fluorescentie in myeliniseerde A-vezel nociceptoren in te schakelen67. Bovendien kan temporele controle ook worden bereikt door gebruik te maken van induceerbare Cre-systemen (bijv. tamoxifen)68. Een andere mogelijke toepassing is gebaseerd op de beschikbaarheid van transgene muizen die fluorescerende reportereiwitten tot expressie brengen in Schwann-cellen. S100-GFP69- en PLP-GFP70-muizen maken inderdaad in vivo en/of in situ beeldvorming van Schwann-cellen mogelijk en hebben een voortrekkersrol gespeeld in het onderzoek dat betrokken is bij schwann-celmigratie tijdens perifere zenuwregeneratie.

Naast deze toepassingen en als aanvulling op de Mito.CFP-muis is de beschikbaarheid van verschillende transgene muislijnen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen in verschillende organellen, zoals mitochondriën en autofagosomen. Het onderzoeken van in vivo mitochondriaal transport zou bijvoorbeeld mogelijk kunnen zijn met de mito::mKate2 muis71 of de fotoconverteerbare mitoDendra muis57. Bovendien kan in vivo mitohagosonotransport mogelijk zijn met behulp van de pH-gevoelige mito-Keima muis72 en de mito-QC muis73 voor mitofagie analyses. Bovendien kunnen de lysosomale etiketteringsproblemen die we tegenkwamen worden overwonnen door muizen te gebruiken die LAMP1-GFP tot expressie brengen, met de kanttekening dat LAMP1 ook aanwezig is in endocytaire organellen die verschillen van lysosomen74.

Samenvattend hebben we nieuwe manieren geboden om in vivo axonaal transport van verschillende organellen in specifieke perifere zenuwaxonen van diverse transgene muizen te beoordelen. De gelijktijdige beeldvorming van verschillende organellen zal bijzonder belangrijk zijn, gezien recente bevindingen van axonale interacties en co-handel van organellen zoals mitochondriën en endosomen 75,76. Wij geloven dat de gepresenteerde methoden nuttig zullen zijn voor het verbeteren van het begrip van de basale fysiologie van axonen in vivo en het ontwarren van belangrijke pathomechanismen die neurodegeneratie van perifere zenuwen aansturen.

Disclosures

De auteurs hebben geen belangenconflicten.

Acknowledgments

We willen Robert M. Brownstone (Queen Square Institute of Neurology, University College London) bedanken voor het delen van de ChAT-eGFP, ChAT.Cre en Rosa26.tdTomato muizen, en Pietro Fratta (Queen Square Institute of Neurology, University College London) voor het delen van de HB9. GFP-muis. We willen Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers en Qiuhan Lang (Queen Square Institute of Neurology, University College London) bedanken voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Junior Non-Clinical Fellowship van de Motor Neuron Disease Association (UK) (Tosolini/Oct20/973-799) (APT), de Wellcome Trust Senior Investigator Awards (107116/Z/15/Z en 223022/Z/21/Z) (GS), een UK Dementia Research Institute Foundation award (GS); en een Medical Research Council Career Development Award (MR/S006990/1) (JNS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tube
70% (v/v) ethanol in distilled water
AlexaFlour555 C2 maleimide ThermoFisher Scientific A-20346 Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J Jackson Laboratory 7909 Rosa26.tdTomato mice
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice Jackson Laboratory 5029 HB9.GFP mice
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice Jackson Laboratory 7967 Mito.CFP mice
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice Jackson Laboratory 6410 ChAT.Cre mice
Computer with microscope control and image acquisition software Zeiss Zen
Cotton swab
Desktop centrifuge
Dissecting microscope
Eye lubricant
Fine curved forceps Dumont
Fine straight forceps Dumont
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1)
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger Drummond Scientific 5-000-1001-X10
Hair clippers
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) Merck 20779
HcT-441 N/A N/A See Restani et al., 2012 for more details
Heating pad
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C
Inverted confocal microscope with environmental chamber Zeiss LSM 780 Most inverted confocals should be adaptable
Isoflurane
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer
Magic tape invisible tape
Micropipette puller
Parafilm Parafilm
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 BDNF that can be co-injected with HcT-555
Saline
Scalpel blade Dumont
Small spring scissors Dumont
Surgery/operating microscope
Surgical drape
Surgical suture
Surgical tape
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice MMRRC 000296-UCD ChAT.eGFP
Vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  2. Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models & Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
  3. De Giorgio, F., Maduro, C., Fisher, E. M. C., Acevedo-Arozena, A. Transgenic and physiological mouse models give insights into different aspects of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037424 (2019).
  4. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. The Journal of Cell Biology. 187 (6), 761-772 (2009).
  5. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  6. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  7. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiological Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
  8. Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 482 (2), 123-141 (2005).
  9. Kaiser, T., Ting, J. T., Monteiro, P., Feng, G. Transgenic labeling of parvalbumin-expressing neurons with tdTomato. Neuroscience. 321, 236-245 (2016).
  10. Zheng, B., Sage, M., Sheppeard, E. A., Jurecic, V., Bradley, A. Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Molecular and Cellular Biology. 20 (2), 648-655 (2000).
  11. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  12. Bareyre, F. M., Kerschensteiner, M., Misgeld, T., Sanes, J. R. Transgenic labeling of the corticospinal tract for monitoring axonal responses to spinal cord injury. Nature Medicine. 11 (12), 1355-1360 (2005).
  13. Willems, J., et al. A CRISPR/Cas9-based genome editing toolbox for epitope tagging of endogenous proteins in neurons. PLoS Biology. 18 (4), 3000665 (2020).
  14. Huh, Y., Oh, M. S., Leblanc, P., Kim, K. -S. Gene transfer in the nervous system and implications for transsynaptic neuronal tracing. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (5), 763-772 (2010).
  15. Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: an approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Scientific Reports. 6, 33058 (2016).
  16. Andrews, M. R. Gene therapy in the CNS-one size does not fit all. Gene Therapy. 28 (7-8), 393-395 (2021).
  17. Kügler, S. Tissue-specific promoters in the CNS. Methods in Molecular Biology. 1382, 81-91 (2016).
  18. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  19. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  20. Dana, H., et al. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo. PLoS One. 9 (9), 108697 (2014).
  21. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  22. Maday, S., Twelvetrees, A. E., Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. F. Axonal transport: cargo-specific mechanisms of motility and regulation. Neuron. 84 (2), 292-309 (2014).
  23. Terenzio, M., Schiavo, G., Fainzilber, M. Compartmentalized signaling in neurons: from cell biology to neuroscience. Neuron. 96 (3), 667-679 (2017).
  24. Abouward, R., Schiavo, G. Walking the line: mechanisms underlying directional mRNA transport and localisation in neurons and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2665-2681 (2021).
  25. Sleigh, J. N., Rossor, A. M., Fellows, A. D., Tosolini, A. P., Schiavo, G. Axonal transport and neurological disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 691-703 (2019).
  26. Bronfman, F. C., Moya-Alvarado, G. BDNF/TrkB signaling endosomes mediate long-distance dendritic growth by activating CREB/PI3K-mTOR-dependent translation in neuronal cell bodies. BioRxiv. , (2020).
  27. Nagano, S., Araki, T. Axonal Transport and Local Translation of mRNA in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 697973 (2021).
  28. Boecker, C. A., Olenick, M. A., Gallagher, E. R., Ward, M. E., Holzbaur, E. L. F. ToolBox: Live Imaging of intracellular organelle transport in induced pluripotent stem cell-derived neurons. Traffic. 21 (1), 138-155 (2020).
  29. Surana, S., et al. The evolution of the axonal transport toolkit. Traffic. 21 (1), 13-33 (2020).
  30. Sleigh, J. N., Vagnoni, A., Twelvetrees, A. E., Schiavo, G. Methodological advances in imaging intravital axonal transport. F1000Research. 6, 200 (2017).
  31. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  32. Sleigh, J. N., Tosolini, A. P., Schiavo, G. In vivo imaging of anterograde and retrograde axonal transport in rodent peripheral nerves. Methods in Molecular Biology. 2143, 271-292 (2020).
  33. Gibbs, K. L., et al. Inhibiting p38 MAPK alpha rescues axonal retrograde transport defects in a mouse model of ALS. Cell Death & Disease. 9 (6), 596 (2018).
  34. Fellows, A. D., Rhymes, E. R., Gibbs, K. L., Greensmith, L., Schiavo, G. IGF1R regulates retrograde axonal transport of signalling endosomes in motor neurons. EMBO Reports. 21 (3), 49129 (2020).
  35. Bilsland, L. G., Sahai, E., Kelly, G., Golding, M., Greensmith, L., Schiavo, G. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (47), 20523-20528 (2010).
  36. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. The Journal of Cell Biology. 218 (6), 1871-1890 (2019).
  37. Bercsenyi, K., et al. Tetanus toxin entry. Nidogens are therapeutic targets for the prevention of tetanus. Science. 346 (6213), 1118-1123 (2014).
  38. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293-305 (2006).
  39. Debaisieux, S., Encheva, V., Chakravarty, P., Snijders, A. P., Schiavo, G. Analysis of signaling endosome composition and dynamics using SILAC in embryonic stem cell-derived neurons. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 542-557 (2016).
  40. Surana, S., et al. The travel diaries of tetanus and botulinum neurotoxins. Toxicon. 147, 58-67 (2018).
  41. Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Lazo, O. M. The many disguises of the signalling endosome. FEBS Letters. 592 (21), 3615-3632 (2018).
  42. Malik, B., et al. Absence of disturbed axonal transport in spinal and bulbar muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 20 (9), 1776-1786 (2011).
  43. Sleigh, J. N., et al. Mice carrying ALS mutant TDP-43, but not mutant FUS, display in vivo defects in axonal transport of signaling endosomes. Cell Reports. 30 (11), 3655-3662 (2020).
  44. Tosolini, A. P., Sleigh, J. N., Surana, S., Rhymes, E. R., Cahalan, S. D., Schiavo, G. modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. BioRxiv. , (2021).
  45. Restani, L., et al. Botulinum neurotoxins A and E undergo retrograde axonal transport in primary motor neurons. PLoS Pathogens. 8 (12), 1003087 (2012).
  46. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52846 (2015).
  47. Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Frontiers in Neurology. 4, 58 (2013).
  48. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
  49. Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60993 (2020).
  50. Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61264 (2020).
  51. Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein, J., Li, X. -J. Analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60548 (2020).
  52. Stoklund Dittlau, K., et al. Generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), e62959 (2021).
  53. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  54. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  55. Bohnert, S., Schiavo, G. Tetanus toxin is transported in a novel neuronal compartment characterized by a specialized pH regulation. The Journal of Biological Chemistry. 280 (51), 42336-42344 (2005).
  56. Kanai, A., et al. Low-concentration lidocaine rapidly inhibits axonal transport in cultured mouse dorsal root ganglion neurons. Anesthesiology. 95 (3), 675-680 (2001).
  57. Bolea, I., Gan, W. -B., Manfedi, G., Magrané, J. Imaging of mitochondrial dynamics in motor and sensory axons of living mice. Methods in Enzymology. , 97-110 (2014).
  58. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Multispectral live-cell imaging. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 46 (2018).
  59. Blum, J. A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the adult mouse spinal cord reveals molecular diversity of autonomic and skeletal motor neurons. Nature Neuroscience. 24 (4), 572-583 (2021).
  60. Xu, J., et al. An approach to maximize retrograde transport based on the spatial distribution of motor endplates in mouse hindlimb muscles. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 707982 (2021).
  61. Wang, T., et al. Flux of signalling endosomes undergoing axonal retrograde transport is encoded by presynaptic activity and TrkB. Nature Communications. 7, 12976 (2016).
  62. Chen, C. S., Chen, W. N., Zhou, M., Arttamangkul, S., Haugland, R. P. Probing the cathepsin D using a BODIPY FL-pepstatin A: applications in fluorescence polarization and microscopy. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 42 (3), 137-151 (2000).
  63. Cederholm, J. M. E., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hearing Research. 292 (1-2), 71-79 (2012).
  64. Michelson, N. J., Kozai, T. D. Y. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
  65. Knabbe, J., Nassal, J. P., Verhage, M., Kuner, T. Secretory vesicle trafficking in awake and anaesthetized mice: differential speeds in axons versus synapses. The Journal of Physiology. 596 (16), 3759-3773 (2018).
  66. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  67. Arcourt, A., et al. Touch receptor-derived sensory information alleviates acute pain signaling and fine-tunes nociceptive reflex coordination. Neuron. 93 (1), 179-193 (2017).
  68. Valny, M., Honsa, P., Kirdajova, D., Kamenik, Z., Anderova, M. Tamoxifen in the mouse brain: implications for fate-mapping studies using the tamoxifen-inducible Cre-loxP system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 243 (2016).
  69. Hayashi, A., et al. A double-transgenic mouse used to track migrating Schwann cells and regenerating axons following engraftment of injured nerves. Experimental Neurology. 207 (1), 128-138 (2007).
  70. Chen, B., Chen, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. -P. Analysis of schwann cell migration and axon regeneration following nerve injury in the sciatic nerve bridge. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 308 (2019).
  71. Barrasso, A. P., Tong, X., Poché, R. A. The mito::mKate2 mouse: A far-red fluorescent reporter mouse line for tracking mitochondrial dynamics in vivo. Genesis. 56 (2), (2018).
  72. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  73. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. The Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  74. Cheng, X. -T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. The Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  75. Cioni, J. -M., Lin, J. Q., et al. Late Endosomes Act as mRNA Translation Platforms and Sustain Mitochondria in Axons. Cell. 176 (12), 56 (2019).
  76. Liao, Y. -C., Fernandopulle, M. S., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179 (1), (2019).

Tags

Neurowetenschappen Nummer 178
Uitbreiding van de toolkit voor <em>in vivo</em> beeldvorming van axonaal transport
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tosolini, A. P., Villarroel-Campos,… More

Tosolini, A. P., Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport. J. Vis. Exp. (178), e63471, doi:10.3791/63471 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter