Summary
トランスジェニック蛍光マウスを用いて、生きた動物における無傷の坐骨神経の運動軸索および感覚軸索内のシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの インビボ 軸索輸送を評価するための詳細なプロトコールが記載されている。
Abstract
軸索輸送は、多様な細胞小器官および貨物の双方向輸送を可能にすることによって、ニューロン恒常性を維持する。軸索輸送の中断は、個々のニューロンとそのネットワークに壊滅的な結果をもたらし、多数の神経学的障害に寄与する。これらの状態の多くは、細胞自律機構と非自律機構の両方を含み、しばしばニューロンサブタイプにわたって病理のスペクトルを表示するため、ニューロンサブセットを正確に同定および分析する方法が不可欠である。
この論文は、麻酔をかけられたマウスの坐骨神経におけるシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの in vivo 軸索輸送を評価するためのプロトコルを詳述する。段階的な指示は、1)コリン作動性運動ニューロン内で蛍光タンパク質を選択的に発現するマウスを用いて 、インビボ、インサイチュ、 および エキソビボ で運動を感覚ニューロンと区別するために提供される。2)シグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの インビボ 軸索輸送を別々にまたは同時に評価する。これらの補完的な生体内アプローチは、異なる末梢神経軸索における異なる貨物の同時イメージングを容易にし、健康および疾患における軸索輸送を定量的に監視する。
Introduction
末梢神経系(PNS)は、中枢神経系(CNS)をその遠位標的に接続し、遠心性信号のリレーが運動制御を発揮し、求心性信号が感覚フィードバックを提供することを可能にする。マウス遺伝学の多数の進歩を使用して、科学者はPNS 1,2,3を苦しめる多くの疾患/症候群を調査するために異なるマウスモデルを開発しました。ほとんどの神経変性病理は、細胞自律的および非自律的な寄与を伴う多因子性であるため4,5、細胞/ニューロン特異的病理のもつれを解くことは、疾患メカニズムに関する決定的で新しい洞察を提供することができる。
この目的のために、細菌人工染色体(BAC)-トランスジェニックマウス6の開発は、ニューロンの標的サブセットにおける蛍光タンパク質の選択的内因性発現を可能にした。例えば、コリン作動性ニューロン7またはグリシン作動性ニューロン8において緑色蛍光タンパク質(GFP)を、またはパルブアルブミン陽性ニューロン9において変異赤色蛍光タンパク質(tdTomato)を発現するBACトランスジェニックマウスが利用可能である。あるいは、蛍光タンパク質の選択的ニューロン発現は、Cre−loxP技術10を介して達成することができる。例えば、ニューロンのサブセットにおいてCre−リコンビナーゼを発現するマウス株(例えば、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)−Cre)は、loxP部位11に挟まれた転写リプレッサー(例えば、コリン作動性ニューロンにおいてのみtdTomatoを発現するマウスを生成する)の制御下で、構成的遺伝子座(例えば、Gt(ROSA)26Sor)から蛍光タンパク質(例えば、tdTomatoまたはGFP)を発現するマウスと交配することができる。実際、Cre−loxP組換えを用いて、下行皮質脊髄路の軸索において黄色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスが作製されている12。
さらに、ORANGEなどのCRISPR/Cas9遺伝子編集の最近の進歩により、複数の内因性ニューロンタンパク質の蛍光タグ付けが可能になり、ナノスケールの分解能で発現を達成できます13。さらに、Cre発現マウス株と組み合わせて、ORANGE-CAKEを使用して、個々のニューロン13における複数の内因性タンパク質をタグ付けすることができる。あるいは、ウイルス媒介性ニューロン追跡はまた、ニューロンサブセットの標識を可能にし、ウイルス血清型および/または細胞特異的プロモーターの標的化組み合わせを用いて達成することができる14、15、16、17。
ニューロン標識法に加えて、シアン蛍光タンパク質(Mito.CFP)18 を発現するミトコンドリアまたはGFP(LC3.GFP)19を発現するオートファゴソームなどの特定の細胞小器官を標的とするレポータータンパク質を発現するようにマウス系統も操作されている19。さらに、マウス系統は、ニューロンにおけるカルシウム動態を特異的に評価するように設計されている(例えば、 Thy1.GCaMP)20、21。全体として、このようなモデルの進歩により、新しい実験的応用により、科学者はCNSおよびPNSについてより正確な生物学的および病理学的質問をすることができます。
末梢運動神経の主な役割は、骨格筋に電気信号を伝達して運動を誘発することです。加えて、より長い時間スケールにわたって生じる、多様な細胞小器官の形態の神経化学的および生理学的メッセージ(例えば、ミトコンドリア、エンドリソソーム、シグナル伝達エンドソーム)は、一方向または双方向の様式で細胞骨格ネットワークを横断し、ニューロン恒常性を維持するのを助ける22、23、24。軸索輸送の障害は、ニューロンの健康に悲惨な結果をもたらし、多くの神経発達および神経変性疾患に関連している25。分子レベルでは、軸索輸送の障害は、シナプスシグナル伝達および可塑性、遺伝子転写、および軸索全体にわたる局所翻訳を調節する生理学的事象を混乱させる可能性がある26,27。培養細胞/ニューロンにおけるこれらの事象を研究するためのツールは数多く存在するが28,29、生体内での軸索輸送ダイナミクスおよび軸索関連生物学的事象を評価することは、生理学的および病理学的プロセスに関する重要な洞察を確認するために必要である30。
長年にわたり、Schiavo研究所は、軸索輸送に関する多様な質問をするためにプロトコルを最適化してきました31,32,33,34,35,36。これらの実験は、破傷風神経毒(HCT)の蛍光標識された無毒性断片が、ニドゲンおよびポリシアロガングリオシドとの相互作用を介して骨格筋の軸索末端に内在化されるという発見から拡大した37。一旦インターナライズされると、HCは、運動ニューロンおよび感覚ニューロンの細胞体に向けられたRab7陽性、ニューロトロフィン含有シグナル伝達エンドソームにおいて逆行的に輸送される38、39、40、41。並行して、画像化技術の進歩により、生きた麻酔をかけたマウス30における末梢神経束および個々の軸索のリアルタイム分析が可能となった。病理学におけるin vivo軸索輸送動態を評価するための最初の進出は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)のSOD1G93Aマウスモデルにおけるシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの輸送における未症候性障害を明らかにした35。重要なことに、ケネディ病42のマウスモデルおよびALS43のヘテロ接合型変異FUSモデルにおいて、運動ニューロン喪失が軸索輸送摂動の非存在下で起こり得るという知見を考えると、これらの欠陥が単に神経変性の二次的結果を表す可能性は低い。このような軸索輸送欠損は、特異的キナーゼ33または成長因子受容体34の阻害剤を用いてALSマウスにおいて改善することができる。さらに、特定のヒストンデアセチラーゼブロッカーでニューロンを処理すると、インビボでのミトコンドリア輸送が変化する36。ごく最近、我々は、軸索輸送のBDNF依存性調節が、ALSマウス44の別個の運動ニューロンサブタイプにおいて調節不全であることを報告している。
軸索輸送ダイナミクス28,29を評価するための絶え間なく拡大するツールキットを使用することにより、このビデオプロトコルは、異なる生物学的および病理学的シナリオへのさらなる洞察を可能にするいくつかのアプリケーションを概説する。第1に、コリン作動性ニューロン(すなわち、運動ニューロン)において蛍光タンパク質を選択的に発現するトランスジェニックマウスは、インビボおよびエキソビボの両方で運動軸索および感覚軸索を区別するために使用される。蛍光標識されたHCは、次いで、3つのトランスジェニックラインのシグナル伝達エンドソームにロードされ、別個の末梢ニューロンにおける軸索輸送ダイナミクスを分化させる。次の実験プロトコルは、ChAT.tdTomatoマウスをMito-CFPマウスと育種することによって、運動ニューロンにおけるミトコンドリア輸送を特異的に評価するための多重蛍光アプローチを詳述する。最後に、インビボで同じ軸索内のミトコンドリアとシグナル伝達エンドソームを同時に画像化する方法に関する指示が提供される。
Protocol
すべてのマウスの取り扱いおよび実験は、動物(科学的手順)法(1986年)に従って行われ、ユニバーシティカレッジロンドン - クイーンスクエア神経学倫理委員会によって承認された。
1. 動物
- すべての動物を温度と湿度が制御された環境で個別に換気されたケージに収容し、食物と水に自由にアクセスできる12時間の明暗サイクルでそれらを維持し ます 。
- 以下のトランスジェニック株の雄および雌マウスの両方を使用する:1)ヘテロ接合型Tg(Chat-EGFP)GH293Gsat/Mmcucdマウス(ChAT.eGFPマウスと呼ばれる);2)ヘテロ接合型 B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J、HB9と呼ばれる。GFPマウス;3)ヘテロ接合型 B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J、Mito.CFPマウスと称される。
- ChAT.Creマウスと呼ばれるホモ接合型B6;129S6-Chat tm2(cre)Lowl/Jと、Rosa26.tdTomatoマウスと呼ばれるホモ接合型 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/Jを交配することにより、ChAT.tdTomatoマウスを生成する。
- ヘテロ接合型ChAT.tdTomatoマウスとヘテロ接合型Mito.CFPマウスを交配することにより、ChAT.tdTomato::Mito.CFPマウスを生成する。
2. 蛍光HCの筋肉内注射
- 手術前準備
- 細菌中の改良型システインリッチタグに融合したHCT(HC T441、残基875〜1315)をグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質として45に従って発現させる。AlexaFlour555C2マレイミド31でHC Tにラベルを付け、氷冷透析バッファー(10 mM HEPES-NaOH、100 mM NaCl、pH 7.4)で透析し、液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。 インビボ実験を行う前に、まず、初代ニューロンにおける取り込みおよび輸送の成功についてインビトロでHCTを試験する。
- 蛍光HCT(例えば、HCT-555)を、0.2mLチューブ中の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で、2.5〜10μg/μLの範囲の最終的かつ実験的に一貫した濃度に希釈する。このステップでは、必要に応じて、より多くの化合物/因子をHT溶液に追加します(例えば、脳由来神経栄養因子)。
注:最終的なボリュームは、目的の筋肉のサイズに適切でなければなりません。例えば、前脛骨(TA)筋に3〜4μL、より小さなヒラメ筋に〜1μLの注射量を用意する。H C Tの作動濃度は、最終容量に関係なく2.5〜10μg/μLの範囲に保ちます。 - ピペットまたはボルテックスを使用してHCT溶液を混合し、卓上遠心分離機を使用して低速で短時間スピンダウンして液体を収集し、大きな気泡を除去する。HCTを光や氷上での輸送から保護します。
- 小さな筋肉(ヒラメなど)への最適な筋肉内注射または坐骨神経内注射には、プルドガラスマイクロピペットを使用してください。手術前にグレーディングされたガラスマイクロピペット( 46による)を引っ張る。
メモ:ピペッティングを有効にし、マイクロピペットの背面の上下の流しを制限するには、解剖顕微鏡下で細かい鉗子を使用して、鋭利な先端から小さなピースを慎重に取り外します。壊れた端は適切なビンに捨てるように注意してください。 - 使用前にすべての手術器具を滅菌して清掃してください。
- 手術 - 筋肉内注射
- 37°Cに設定したヒートマットに滅菌手術用ドレープを固定して手術の準備をします。 操作顕微鏡の位置と焦点を合わせます。手術を開始するには、滅菌済みの手術器具、サージカルテープ、滅菌綿棒、水中の70%(v/v)エタノール、滅菌生理食塩水、縫合糸、およびハミルトン針またはプルドガラスマイクロピペットを外科用ドレープに開梱します。
- 麻酔機械が外科的処置の期間中十分な酸素およびイソフルランを有することを確認する。麻酔の流れを誘導室に向け、麻酔装置の電源を入れます。
- まず、1-2 L/minの酸素流量と5%のイソフルランを使用してください。マウスを誘導チャンバーに入れ、麻酔を開始する。右反射がない場合は、麻酔を2〜3%のイソフルランに減らし、麻酔の流れをマウスピースに向け、マウスを手術空間の別の領域に位置するマウスピースに移す。
- 注射する筋肉を覆う毛皮の領域を剃る前に、角膜反射とペダル離脱反射の両方が存在しないことを確認してください。完了したら、サージカルテープの粘着性のある側を使用してマウスからできるだけ多くの剃毛毛皮を取り除き、マウスを体重計の上に置き、手術前の体重を記録します。
- 綿棒を使用して眼滑剤を慎重に塗布し、マウスとマウスピースを手術領域に移します。
注:手術領域にも移される剃毛された毛皮の量を制限するようにしてください。サージカルテープを使用してヘッドをマウスピースに固定し、マウスが滑り落ちるのを防ぎます。別の綿棒を使用して、剃毛した領域にエタノールを塗布し、毛皮の汚染を殺菌し、低減する。 - 注入する筋肉に応じて体を配置します。たとえば、TAの場合、マウスを背中に置き、正中線から約10°で後肢を伸ばします。あるいは、ヒラメ注射のために、動物をその側に置き、正中線から約45°で後肢を伸ばす。後肢が正しい位置にあるときは、手術中の不要な動きを防ぐために、足全体にサージカルテープを使用してください。
注:TA、腓腹筋、およびヒラメ筋の注射手順は、以前に詳述されている32。 - 切開を行う前に、ペダル離脱反射をテストして麻酔が十分であることを確認してください。麻酔を継続的に監視し、呼吸と離脱反射の定期的な評価で外科的処置を通してそれを維持する。
- この時点で、作業中のHCT溶液をハミルトンシリンジまたはプルドガラスマイクロピペットに引き込みます。
- モーターエンドプレート領域46,47,48に対応する領域に、関心のある筋肉に小さな切開を行います。筋肉の外部筋膜を突き刺し、32に従ってHCをゆっくりと注入する。シリンジ/マイクロピペットを5〜10秒間所定の位置に置いてから、ゆっくりと引き出します。
- 切開部を1〜2本の縫合糸で閉じ、マウスを単離された回復ケージに移す。マウスを手術後、少なくとも30分間監視してから、自宅のケージに戻してください。マウスが正常に回復し、手術後のモニタリングが完了したら、ケージを通常の収容状態に戻します。
3. 生体内軸索輸送
- 坐骨神経の露出
- 顕微鏡環境チャンバーを少なくとも1時間前に37°Cに設定してください。
- 手術用ドレープ、工具、テープ、滅菌綿棒、70%エタノール、滅菌生理食塩水を手術領域の周りに配置して、坐骨神経を露出させる準備をします。麻酔機にマウス1匹あたり最大2時間、酸素とイソフルランの十分な貯蔵があることを確認してください。パラフィルムまたは目に見えないテープからくさびを、角度のついた先端を持つ狭い長方形(例えば、より大きなマウスの場合は〜1cmの幅)に切断し、露出した坐骨神経の下に置き、イメージングプロセスを支援します。誘導室をヒートマットの上に置き、体温に設定します。
注:4時間は、HCが取り込まれ、注射部位から坐骨神経に逆行的に輸送されるのに十分な時間である。したがって、この時間後に1匹のマウスが再麻酔の準備をすることができます。 - 麻酔の流れを誘導室に導き、酸素流量1〜2L/minおよび3〜4%イソフルランで麻酔機の電源を入れ、マウスを誘導室に入れて麻酔を開始する。
注: in vivo 軸索輸送実験は終末処置であるため、目を潤滑する必要はありません。 - 右反射がない場合は、麻酔を2〜3%のイソフルランに減らし、麻酔の流れをマウスピースに向け、マウスをマウスピースに移します。サージカルテープを使用してヘッドをマウスピースに固定し、ターゲットの後肢を正中線から約45°で伸ばし、この位置を維持するために足の上にサージカルテープを使用します。
注:麻酔を減らすことは、イメージングプロセス中の呼吸アーチファクトの影響を制限できるため、この時点で有利です。 - 角膜およびペダル離脱反射が存在しないことを確認し、次いで、はさみを使用して、坐骨神経32 (すなわち、中枢脊髄から中下肢後肢まで延びる広い領域)を覆う皮膚を切り取る。上二頭筋大腿骨筋、ならびに坐骨神経の近くにある他の筋肉組織および結合組織を除去する。坐骨神経および周囲の血管、特に側腓腹筋頭の膝蓋骨/近位側面の外側側面の近くに位置する血管を損傷しないでください。
- 無傷の坐骨神経が十分に露出したら、乾燥を防ぐために坐骨神経の周りの領域に予め温められた滅菌生理食塩水を塗布する。湾曲した鉗子を使用して、深く横たわる結合組織を破壊し、事前に準備されたパラフィルム「くさび」を神経の下に置きます。完了したら、露出した領域に生理食塩水を浸したコットンウールを置き、O2中のイソフルランで満たされているはずのヒートマット(37°Cに設定)の上に置かれた誘導チャンバにマウスを移動します。
- In vivo 軸索イメージング
- カスタマイズされた顕微鏡ステージに22 x 64 mmのカバーガラスを置き、テープでその位置を固定します。浸漬油を選択して対物レンズに塗布し、顕微鏡ステージを倒立顕微鏡に接続します。オイルとカバーガラスが接触するまで、オイル浸漬対物をゆっくりと持ち上げます。
注:40倍、1.3開口数(NA)DICプランアポクロマットまたは63倍、1.4NA DICプランアポクロマットオイル浸漬対物レンズのいずれかを使用して、坐骨神経 のインビボ 輸送をイメージングできます。 - 麻酔マウスピースを顕微鏡ステージ上に移動させ、麻酔ホースをテープで固定して麻酔障害を防ぎます。坐骨神経からコットンウールを取り出し、露出した神経をカバーガラスに向けるように、マウスを誘導チャンバーからマウスピースに移します。サージカルテープを使用して、マウスの頭部がマウスピースに固定されていることを確認し、最低レベルの効果的な麻酔を維持します。マウスの尾をそっと持ち上げ、露出した坐骨神経の近くのカバースリップに滅菌生理食塩水を加えて、乾燥を制限し、イメージングを支援します。
メモ:環境チャンバーのすべてのドアを閉じて、エリアが体温のままであることを確認してください。 - 眼を用いて、坐骨神経の位置を特定し、最適な焦点を決定し、運動性軸索小器官を含む関心領域を選択する。
メモ: このプロセスの詳細な説明は、以前に説明されています32. - 「 取得」 ボタン (または同等のもの) をクリックしてコンピューター・ソフトウェアに切り替え、関心のある領域を選択します。デジタルズームを使用して合計>80倍の倍率を取得し、選択した領域を回転させて軸索を水平に視覚化します(例えば、右から左に移動する逆行貨物と左から右に移動する順行貨物)。
注: 方向性パラメーターはユーザーに依存しますが、実験全体で一貫性を保つ必要があります。 - レーザー強度(0.2 - 1%)、ピンホールアパーチャ(1 AU - max)、ゲイン(マスター)(700 - 1000)、デジタルオフセット(-50 - 0)、デジタルゲイン(1.0 - 4.0)などのパラメータを調整して、信号強度を最適化します。光毒性の潜在的な影響を減らすには、レーザー強度を可能な限り≤ 1%に維持し、最大レーザー強度を 2% にします。最適な信号検出のためにレーザー強度を調整する前に、他のすべてのパラメータを変更します。
- 「領域」(または同等の領域) ボックスをクリックし、長方形の関心領域を選択してから、「取得モード」(または同等の領域)でフレームサイズを最小 1024 x 1024 ピクセルに設定し、100 ~ 1,000 フレームのタイムラプス取得を開始します。
メモ:希望するフレーム集録レートはユーザに依存し(たとえば、搬送は0.1~6秒のフレームレートで評価できます)、関心領域、スキャン速度時間、集録平均化、レーザ指向性などのソフトウェアパラメータで調整できます。たとえば、フレームレートを遅くするには、関心領域の高さ/幅を大きくし、スキャン速度を遅くし、集録平均を増やし、単一のレーザー指向性を使用し、その逆も同様でフレームレートを高速化します。フレーム集録レートは、異なる周波数でのイメージングが不整合を引き起こす可能性があるため、比較可能なデータセット間で一貫している必要があります。シグナル伝達エンドソームのような速い貨物は、より遅い速度(例えば2.5-6秒)を用いて分析することができるミトコンドリアのような遅い細胞小器官と比較して、より速いフレームレート(例えば0.1-3秒)を必要とする。 - マウス1匹あたり最低3軸索から最低10個の運動性貨物を捕獲することを目指しています。
注:2サンプルの両面検出力計算(標準検出力0.8(1-β)およびI型エラー率5%(α))に基づくと、サンプルサイズ6~8は、野生型モデルと疾患モデル間の軸索輸送の違いを特定するのに十分です35,43。 - 画像化が完了したら、麻酔下にある間に直ちにマウスを安楽死させる(例えば、子宮頸部脱臼)。筋肉や坐骨神経などの死後組織も、さらなる分析のために採取することができる。
- カスタマイズされた顕微鏡ステージに22 x 64 mmのカバーガラスを置き、テープでその位置を固定します。浸漬油を選択して対物レンズに塗布し、顕微鏡ステージを倒立顕微鏡に接続します。オイルとカバーガラスが接触するまで、オイル浸漬対物をゆっくりと持ち上げます。
Representative Results
この論文では、げっ歯類モデル におけるin vivo 軸索輸送ツールキットを拡張する汎用性の高いプロトコルについて詳述します。 図1 は、トランスジェニックマウスを用いることにより、運動ニューロン軸索が感覚ニューロン軸索およびシュワン細胞の両方から分化され得ることを実証する。 図1Aは 、生きた麻酔付きChAT.eGFPマウスからのコリン作動性運動軸索におけるeGFP発現を描写する。 図1B は、ChAT.tdTomatoマウスから摘出したばかりの神経(すなわち、追加の組織処理なし)においてtdTomato発現を達成するために、代替方法を使用する。したがって、ChAT.eGFP、ChAT.tdTomatoまたはHb9.GFPなどのトランスジェニック株を使用すること で、インビボでの運動軸索特異的標識が可能になります。
あるいは、軸索は、トレーサー/マーカー(例えば、HCT31、32またはeGFP15をコードするウイルス)を骨格筋に注入することによっても同定され得る。図2は、このような用途を強調し、HCT−555陽性シグナル伝達エンドソーム(白矢印)を含む8つの頑健に発現するChAT.eGFP陽性軸索を、TA筋肉へのプローブ注入後〜4時間後に描いている。この実験計画を用いて、TA神経支配性α運動ニューロン(主に高速で嚥下しやすい44)を同定することができた。eGFP発現の堅牢性が低いさらに5つのChAT.eGFP軸索(図2A、オレンジ色のアスタリスク)は部分的に焦点が合っておらず、坐骨神経のわずかに深い位置にある可能性が高い。
また、eGFP陰性感覚軸索におけるHCT-555陽性シグナル伝達エンドソームを同定した(黄色矢印)。したがって、この実験パラダイムを使用して、運動におけるシグナル伝達エンドソームの軸索輸送と生体内の感覚ニューロンを特異的に評価および比較することができる。実際、このトランスジェニックレポーター株を用いて、我々は、ChAT.eGFP陽性運動軸索におけるシグナル伝達エンドソームの輸送が、軸索幅を用いて確実に分化され得るChAT.eGFP陰性感覚軸索よりも速いことを発見した43。
我々は以前、生体内でChAT.eGFPマウスを用いて運動ニューロン軸索を同定した43。我々は今、HB9を報告します。GFPマウスはまた、インビボで運動ニューロン軸索同定を達成するために使用され得る。実際、図3はHB9の一連のタイムラプス画像を示しています。GFP軸索は、逆行的に移動するHC−555陽性シグナル伝達エンドソームを含む。ChAT駆動式とは異なり、GFPはHB9でより点描/粒度のパターンを持つことに注意してください。GFP軸索;その理由は不明です。
我々は以前、ミトコンドリア標的色素、テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩(TMRE)の坐骨神経内注射を介して坐骨神経のインビボミトコンドリアダイナミクスを監視する方法を説明した32,36。運動ミトコンドリアと感覚ミトコンドリアを確実に区別するために、Thy1プロモーター18の下でCFPを発現するMito.CFPマウスを、特定のニューロン型で蛍光レポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスと交配することができる。実際、Mito.CFPマウスをChAT.tdTomatoマウス(ChAT.tdTomato::Mito.CFPと呼ぶ)と育種することで、図4に示すように、運動軸索に特異的にミトコンドリアを可視化することができました。このライブマルチプレックスの例では、5つのChAT.tdTomato軸索を視覚化することができ、そのうちの4つはCFP陽性ミトコンドリアを含む。さらに、ランヴィエのノード(パネルiiiの白い矢印)も識別できた。 さらに、ランヴィエのノードはChAT.eGFP、HB9で明確に検出可能である。GFPおよびMito.CFPマウス(図示せず)。これらのダブルトランスジェニック株は、生きた麻酔をかけられたマウスのタイムラプス生体内イメージングを可能にし、運動ニューロン特異的ミトコンドリア含量および軸索輸送ダイナミクスをモニターする。
最後に、シグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアは、Mito.CFPマウスの筋肉にHCTを注入することによって、インビボで同じ軸索内で同時に視覚化することができる(図5)。HC−555の筋肉内注射は、画像化の〜4時間前にMito.CFPマウスのTA筋肉において実施した。ミトコンドリア(iパネル)およびシグナル伝達エンドソーム(iiパネル)の両方を、筋肉特異的軸索(すなわち、TAを神経支配する軸索)において同時に視覚化した。実際、順行的(黄色の三角形)および逆行的(緑色の三角形および円)移動するオルガネラならびに失速したオルガネラ(オレンジ色の三角形および円)が観察され得る。この実験パラダイムを用いて、インビボでの軸索ミトコンドリアとシグナル伝達エンドソームとの間の複雑な機能的相互作用を評価することができる。全体として、我々は、シグナル伝達エンドソームおよび/またはミトコンドリアの軸索輸送、特にin vivoのコリン作動性運動ニューロンにおける軸索輸送を評価するためのいくつかの異なる実験的アプローチを実証する。
図1:坐骨神経運動軸索(A)ChAT.eGFPマウスからインビボで得られたeGFP陽性運動軸索の代表的な単一平面像。(B)ChAT.tdTomatoマウスから切除した坐骨神経におけるtdTomato陽性運動軸索の代表的な単一平面画像。軸索口径の違いは、マウスの年齢とサイズの違いから生じる。スケールバー = 50 μm。略語:eGFP=増強緑色蛍光タンパク質;ChAT=コリンアセチルトランスフェラーゼ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ChAT.eGFPマウスの生きた坐骨神経運動および感覚ニューロンにおけるシグナル伝達エンドソームのインビボ軸索輸送(A-C)eGFPを発現し、HCT−555陽性シグナル伝達エンドソーム(B)、およびマージ(C)を含むコリン作動性軸索の代表的な画像。白い矢印は、HC−555陽性シグナル伝達エンドソームを含むeGFP陽性運動軸索を強調表示し、シアン矢印は、HC−555陽性シグナル伝達エンドソームを欠く運動軸索を識別し、黄色矢印は、HC−555陽性シグナル伝達エンドソームを輸送するeGFP陽性感覚軸索を強調表示する。オレンジ色のアスタリスクは、より弱いeGFP発現を有する運動軸索を識別する。スケールバー = 25 μm。略語:eGFP=増強緑色蛍光タンパク質;ChAT=コリンアセチルトランスフェラーゼ;HC T-555=破傷風毒素結合ドメイン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HB9の生運動ニューロンにおけるシグナル伝達エンドソームのインビボ軸索輸送を表すタイムラプス画像系列。GFPマウス。(A-D)緑色蛍光タンパク質(i)を発現し、かつHCT−555陽性シグナル伝達エンドソームを含む運動ニューロン軸索(ii)、およびマージ(iii)を描写する3秒ごとに撮影されたタイムラプス画像。同じ色の各円は、異なるフレームにわたって同じ移動エンドソームを識別する。逆行運動は右から左へ。スケールバー = 10 μm。略語:GFP=緑色蛍光タンパク質;HC T-555=破傷風毒素結合ドメイン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ChAT.tdTomatoの生きた坐骨神経運動ニューロンにおけるミトコンドリアのインビボ軸索輸送::Mito.CFP:マウス(A-C)tdTomato陽性運動軸索(A)、CFP陽性ミトコンドリア(B)、およびマージ(C)を含む代表的な画像。はめ込み画像i〜iiiには、各パネルからのより高い倍率が含まれる。白い矢印は、ランヴィエの疑わしいノードを表します。スケールバー = 25 (A-C) および 10 μm (i-iii)略語:ChAT=コリンアセチルトランスフェラーゼ;CFP = シアン蛍光タンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:Mito.CFPマウスの生きた坐骨神経運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよびシグナル伝達エンドソームの同時インビボ軸索輸送を表すタイムラプス画像系列。 (A-C)同じ坐骨神経軸索(iii)内のミトコンドリア(i)およびシグナル伝達エンドソーム(ii)の両方の軸索輸送を描写する3秒ごとに撮影されたタイムラプス画像。黄色の三角形は順方向に移動中の貨物を識別し、緑色の円/三角形は逆行的に移動する貨物を識別し、オレンジ色の円/三角形は静止した貨物を識別します。順行運動は左から右へ、逆行運動は反対方向へ。スケールバー= 10μm. 略語:HCT-555 = 破傷風毒素結合ドメイン;CFP = シアン蛍光タンパク質。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
このプロトコルは、マウス坐骨神経の無傷の軸索におけるシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの インビボ 軸索輸送を評価するためのステップを詳述する。実際、運動ニューロンで選択的に発現する蛍光レポータータンパク質を発現するマウスを用いて、1)インビボ 、インサイチュ、および エキソビボ で運動ニューロンと感覚ニューロンを区別することを可能にする実験セットアップが提供される。2)3つの異なるトランスジェニックマウスを用いて運動ニューロン軸索におけるシグナル伝達エンドソームの インビボ 軸索輸送を特異的に評価する工程;3)運動ニューロン軸索におけるミトコンドリアの in vivo 軸索輸送を特異的に調べる工程;4)同一軸索内のシグナル伝達エンドソームとミトコンドリアの インビボ 輸送動態を同時に評価する。このアプローチは、基礎状態における軸索輸送を調査する大きな可能性を秘めており、末梢運動および感覚神経に影響を及ぼすさまざまな疾患における病理学的摂動を評価するために使用することができる。
以前の実験パラダイムを基礎として使用して31,32、ここでは、トランスジェニックレポーターマウスを用いて運動ニューロンと感覚ニューロンで起こる軸索輸送を区別するための詳細な新規で堅牢な方法がある。Mito.CFPマウスを用いて、このアプローチは、TMRE36の坐骨神経内注射を回避することによってインビボミトコンドリア輸送を評価するためにさらに開発された。これは、プローブの神経内注射によって引き起こされる軸索輸送における可能性のある神経損傷および摂動を回避する。さらに、このプロトコルは、明確な生理学的特性(例えば、速筋疲労性筋肉対遅筋疲労抵抗性筋肉)を有する神経支配筋を神経支配する運動軸索における多重オルガネラの軸索輸送の視覚化を可能にする。そのようにして、シグナル伝達エンドソームおよび/またはミトコンドリア軸索輸送ダイナミクスは、α運動ニューロン44の異なるサブセットにおいて評価され得る。さらに、病理学的環境におけるこれらの細胞小器官の軸索輸送は、異なる神経変性疾患のマウスモデルとの交配を通じて評価することもできる1、2、3。
軸索輸送ツールキットは継続的に拡大しており28、29、培養マウス腹角外植体49または摘出したマウス神経筋調製物50を用いて輸送動態を評価するためにエクスビボプロトコルが開発されている。さらに、誘導ヒト多能性幹細胞(hiPSC)由来皮質51ニューロンまたはhiPSC由来脊髄運動ニューロン52における軸索輸送を評価するプロトコールの開発により、疾患原因となる変異を有するヒトニューロンの調査が可能となった。マウス組織およびヒト細胞におけるこのような最先端のプロトコルは、ニューロン機能に関する重要な洞察を提供し、神経変性疾患モデルにおける新規パトメカニスティック発見を促進し、治療分子および戦略の試験に使用することができる。
これらの手法を正常に実装するには、いくつかの重要な手順に従う必要があり、プロトコルのセクションではいくつかの重要な注意事項が提供されています。生体内イメージングの主な要件は、カスタマイズされたステージインサートを備えた倒立共焦点顕微鏡と、麻酔と最適温度を維持するための装置です。実際、1)麻酔の誘導、2)解剖/組織処理(すなわち、坐骨神経の露出)、および3)生体内イメージング中の麻酔の維持(以前に31,32で詳述されているように)には、特殊な移動麻酔システムが必要である。特に、より高い倍率の対物レンズ(例えば、40倍または63倍)を使用する場合、より深い麻酔は大きな「あえぎ」呼吸を誘発し、焦点の頻繁なシフトをもたらすため、麻酔の深さは画質に影響を与える可能性がある。このような大きな動きは、呼吸の動きがタイムラプスビデオにアーチファクトを生成し、自動追跡に適さないか、より時間のかかる評価を必要とする可能性があるため、イメージング後の輸送分析(フィジープラグインTrackMate53またはKymoAnalyzer54を使用した貨物の追跡など)に間違いなく影響します。さらに、坐骨神経内の動脈の脈動によって引き起こされるイメージングアーチファクトも観察されており、これは異なるイメージング領域を選択することによってのみ解決できます。顕微鏡は、温度およびpHが軸索輸送55に影響を与えるので、一定の体温を維持できる環境チャンバを備えていなければならない。さらに、手術後の鎮痛薬の適用は、輸送ダイナミクス56を変化させる可能性があるため、避けるべきである。実験計画が縦方向であり、繰り返しイメージングを必要とする場合(例えば、57)、解剖プロトコルは低侵襲になるように適切に調整する必要があり、追加の倫理的/ライセンス承認が必要な場合があります。
特定の実験的考慮事項を念頭に置いておく必要があります。第一に、本明細書で詳述されるプロトコールの大部分は、ミトコンドリアまたは運動ニューロン軸索において蛍光レポータータンパク質を有するトランスジェニックマウスの使用を含む。これらのマウスラインのそれぞれは、ヘミ/ヘテロ接合体として飼育され、画像化されるべきである。しかし、例外はChAT.CreおよびRosa26.tdTomatoマウス系統であり、ホモ接合体として別々に維持することができ、得られたヘミ接合体の子孫は、Cre-loxP組換え後のコリン作動性ニューロンにおけるtdTomato発現を可能にする。トランスジェニックヘミ/ヘテロ接合体マウス(例えば、Mito.CFP)を他のトランスジェニックヘミ/ヘテロ接合体マウス(例えば、ChAT.eGFP)と交配する場合、所望の数の二重変異子孫を得るのに時間がかかる可能性があるため、育種戦略を慎重に検討する必要がある。さらに、F1世代のChAT.CreおよびRosa26.tdTomatoマウス(すなわち、ChAT.tdTomato)を追加のトランスジェニック株(例えば、Mito.CFP)で繁殖させる場合、所望のトリプル導入遺伝子を有するマウスはさらに少なくなることが予想される。さらに、近くの波長特性(例えば、水戸-CFP-励起:435nm、発光:485nm、ChAT.eGFP励起:488nm、発光:510nm)を有する2匹のレポーターマウスを飼育する場合の潜在的な蛍光色素重複も考慮しなければならないが、スペクトルアンミキシング58でこの問題を克服することは可能であるかもしれない。
この手法には、考慮すべきいくつかの制限があります。この研究および我々の以前のプロトコール31,32では、いくつかの遺伝的にコードされたマーカーおよび異なる染色方法を使用して、インビボで異なる細胞小器官を標識および追跡する方法を示した。しかし、すべてのプローブがこの実験的アプローチに適しているわけではありません。我々は、in vivo逆行性トレーサー実験で運動ニューロン細胞体を標識するために日常的に使用されるプローブであるコレラ毒素ベータサブユニット(CTB)-488(0.5-1.5μg/μL〜4時間前)のTAまたはヒラメ筋への注射を評価した59,60。しかしながら、単独で注射した場合、またはHCT-555と同時注射した場合、CTB-488標識は、逆行性運動ニューロン追跡の成功に使用された濃度と同様の濃度を使用したにもかかわらず、貧弱であった。したがって、我々は、CTBが神経細胞培養物61におけるシグナル伝達エンドソームの優れたインビトロマーカーであるにもかかわらず、HCは坐骨神経軸索におけるインビボでのシグナル伝達エンドソームを同定するためのゴールドスタンダードプローブであり続けていると結論付ける。
また、異なる経路を用いて、LysoTracker green DND-26などのリソソームの標識に日常的に使用されているプローブや、カテプシンD62 のBODIPY-FL-pepstatin AやCathepsin Bのマジックレッドなどの活性リソソーム加水分解酵素のマーカーもテストしましたが、成功しませんでした。我々は、BODIPY-FL-ペプスタチンA(イメージングの4時間前にTAに2.5μg)の筋肉内送達、ならびに2μLのLysoTracker(10μM)、ボディピー-FL-ペプスタチンA(10μM)またはマジックレッド(1/10)の坐骨神経内注射をイメージングの30〜60分前に試みた。これらのプローブが神経を強調しているにもかかわらず、明確に標識された細胞小器官を見つけることができませんでした。プローブは軸索の周りに蓄積し、おそらくシュワン細胞によって保持されている。したがって、リソソームの標識が失敗したのは、ニューロンへのプローブ送達の欠損によるものかもしれないが、より適切な濃度の存在を排除することはできない。TMRE標識が同様の条件(すなわち、坐骨神経内注射)下で機能することを考えると、標識強度は色素依存的であり得、各マーカーについて独立して試験されなければならない。しかしながら、我々は、これらのプローブ を用いてインビボで リソソームを標的化することは、上記の濃度では実現不可能であると結論付けている。
麻酔の方法は、明確な生理学的読み出し(例えば、蝸牛機能63および皮質電気生理学64)を変化させることができる。しかしながら、麻酔が坐骨神経における生体内軸索輸送に影響を及ぼすかどうかは、現在のところ不明である。イソフルラン誘発麻酔下での神経筋活動の低下を考えると、覚醒状態と比較して輸送動態が異なる可能性がある。しかし、これを直接調査した唯一のin vivo研究は、視床皮質突起における高密度コア小胞の輸送が麻酔付きマウスと覚醒マウスの間で異ならないことを明らかにした65。さらに、野生型マウスと疾患モデルマウスとの間の輸送における区別は麻酔下で検出可能であるので35、43、イソフルラン曝露は、シグナル伝達エンドソームまたはミトコンドリア輸送における摂動の同定を妨げないことは明らかである。
このプロトコルには、以下で説明する他の潜在的なアプリケーションがあります。このプロトコールに概説されているトランスジェニックマウス(例えば、Mito.CFP、ChAT.eGFP)を神経変性疾患マウスモデル1、2、3で育種することは、ニューロンサブタイプおよび/または貨物特異的調査を可能にするであろう。さらに、最近開発されたマウスCreライン66は、異なる感覚軸索集団における蛍光レポータータンパク質の可視化も可能にするであろう。例えば、Rosa26.tdTomatoマウスは、Y受容体-2発現の神経ペプチド(Npy2r)と交配することができる。Creマウスは有髄A線維侵害受容器67においてtdTomato蛍光を可能とする。さらに、時間的制御は、誘導性Cre系(例えば、タモキシフェン)68を使用することによっても達成され得る。別の潜在的な用途は、シュワン細胞において蛍光レポータータンパク質を発現するトランスジェニックマウスの利用可能性に依存している。実際、S100-GFP69およびPLP-GFP70マウスは、シュワン細胞のインビボおよび/またはin situイメージングを可能にし、末梢神経再生中のシュワン細胞遊走に関与する研究の最前線に立ってきた。
これらの用途に加えて、Mito.CFPマウスを補完するものとして、ミトコンドリアやオートファゴソームなどの別個の細胞小器官で蛍光タンパク質を発現するいくつかのトランスジェニックマウス系統の利用可能性がある。例えば、インビボでのミトコンドリア輸送の調査は、mito::mKate2マウス71または光変換可能なmitoDendraマウス57で可能かもしれない。さらに、pH感受性マイトケイママウス72およびマイトQCマウス73をマイトファジー解析に用いると、インビボマイトファゴソーム輸送が可能となり得る。さらに、我々が遭遇したリソソーム標識の困難さは、LAMP1-GFPを発現するマウスを使用することによって克服することができるが、LAMP1はリソソーム74とは異なる内球性細胞小器官にも存在するという警告がある。
要約すると、我々は、多様なトランスジェニックマウスからの特定の末梢神経軸索におけるいくつかの細胞小器官のインビボ軸索輸送を評価するための新規な方法を提供してきた。異なる細胞小器官の同時イメージングは、軸索相互作用およびミトコンドリアおよびエンドソームなどの小器官の共輸送に関する最近の知見を考えると、特に重要である75,76。本発表の手法は、生体内における軸索の基礎生理学の理解を深め、末梢神経の神経変性を駆動する重要な病態機構の解明に役立つと考えています。
Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
ChAT-eGFP、ChAT.Cre、Rosa26.tdTomatoマウスを共有してくれたRobert M. Brownstone(クイーンスクエア神経学研究所、ユニバーシティカレッジロンドン)、HB9を共有してくれたPietro Fratta(ユニバーシティカレッジロンドン、クイーンスクエア神経学研究所)に感謝します。GFPマウス。原稿を批判的に読んでくれたElena R. Rhymes、Charlotte J.P. Kremers、Qiuhan Lang(University College London、Queen Square Institute of Neurology)に感謝します。この研究は、運動ニューロン疾患協会(英国)(Tosolini/Oct20/973-799)(APT)、Wellcome Trust Senior Investigator Awards(107116/Z/15/Zおよび223022/Z/21/Z)(GS)、英国認知症研究所財団賞(GS)のジュニア非臨床フェローシップによって支援されました。医学研究評議会キャリア開発賞(MR/S006990/1)(JNS)を受賞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tube | |||
| 70% (v/v) ethanol in distilled water | |||
| AlexaFlour555 C2 maleimide | ThermoFisher Scientific | A-20346 | Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J | Jackson Laboratory | 7909 | Rosa26.tdTomato mice |
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice | Jackson Laboratory | 5029 | HB9.GFP mice |
| B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice | Jackson Laboratory | 7967 | Mito.CFP mice |
| B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice | Jackson Laboratory | 6410 | ChAT.Cre mice |
| Computer with microscope control and image acquisition software | Zeiss | Zen | |
| Cotton swab | |||
| Desktop centrifuge | |||
| Dissecting microscope | |||
| Eye lubricant | |||
| Fine curved forceps | Dumont | ||
| Fine straight forceps | Dumont | ||
| Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1) | |||
| Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger | Drummond Scientific | 5-000-1001-X10 | |
| Hair clippers | |||
| Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) | Merck | 20779 | |
| HcT-441 | N/A | N/A | See Restani et al., 2012 for more details |
| Heating pad | |||
| Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C | |||
| Inverted confocal microscope with environmental chamber | Zeiss | LSM 780 | Most inverted confocals should be adaptable |
| Isoflurane | |||
| Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer | |||
| Magic tape | invisible tape | ||
| Micropipette puller | |||
| Parafilm | Parafilm | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4 | |||
| Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | BDNF that can be co-injected with HcT-555 |
| Saline | |||
| Scalpel blade | Dumont | ||
| Small spring scissors | Dumont | ||
| Surgery/operating microscope | |||
| Surgical drape | |||
| Surgical suture | |||
| Surgical tape | |||
| Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice | MMRRC | 000296-UCD | ChAT.eGFP |
| Vortex mixer |
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