Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Aksonal Taşımacılığın In Vivo Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi

Published: December 23, 2021 doi: 10.3791/63471
Automatic Translation
1,2, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Department of Neuromuscular Diseases, UCL Queen Square Institute of Neurology, University College London, 2UCL Queen Square Motor Neuron Disease Centre, University College London, 3UK Dementia Research Institute, University College London

Summary

Transgenik floresan fareler kullanılarak, canlı hayvanlarda bozulmamış siyatik sinirin motor ve duyusal aksonları içinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için ayrıntılı protokoller tanımlanmıştır.

Abstract

Aksonal taşımacılık, çeşitli organellerin ve yüklerin çift yönlü kaçakçılığını sağlayarak nöronal homeostazı korur. Aksonal taşımadaki bozulmalar, bireysel nöronlar ve ağları için yıkıcı sonuçlara sahiptir ve çok sayıda nörolojik bozukluğa katkıda bulunur. Bu koşulların birçoğu hem hücre özerk hem de otonom olmayan mekanizmaları içerdiğinden ve genellikle nöronal alt tipler arasında bir patoloji spektrumu gösterdiğinden, nöronal alt kümeleri doğru bir şekilde tanımlamak ve analiz etmek için yöntemler zorunludur.

Bu yazıda, anestezi uygulanan farelerin siyatik sinirlerinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için protokoller detaylandırılmıştır. 1) Kolinerjik motor nöronlar içinde floresan proteinleri seçici olarak eksprese eden fareleri kullanarak motoru in vivo, in situ ve ex vivo duyusal nöronlardan ayırt etmek; ve 2) sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını ayrı ayrı veya eşzamanlı olarak değerlendirir. Bu tamamlayıcı intravital yaklaşımlar, sağlık ve hastalıkta aksonal transportu kantitatif olarak izlemek için farklı periferik sinir aksonlarındaki farklı yüklerin eşzamanlı görüntülenmesini kolaylaştırır.

Introduction

Periferik sinir sistemi (PNS), merkezi sinir sistemini (CNS) distal hedeflerine bağlar ve motor kontrolünü uygulamak için efferent sinyallerin rölesine ve duyusal geri bildirim sağlamak için afferent sinyallerin iletilmesine izin verir. Fare genetiğindeki çok sayıda gelişmeyi kullanarak, bilim adamları PNS 1,2,3'ü etkileyen birçok hastalığı / sendromu araştırmak için farklı fare modelleri geliştirdiler. Çoğu nörodejeneratif patoloji, hücre otonom ve otonom olmayan katkıları4,5 ile multifaktöriyel olduğundan, hücre / nörona özgü patolojilerin çözülmesi, hastalık mekanizmalarına çok önemli, yeni bilgiler sağlayabilir.

Bu amaçla, bakteriyel yapay kromozom (BAC)-transgenik farelerin 6 gelişimi, nöronların hedeflenen alt kümelerinde floresanproteinlerin seçici endojen ekspresyonunu sağlamıştır. Örneğin, kolinerjik7 veya glisinerjik nöronlar8'de yeşil floresan proteini (GFP) veya parvalbümin pozitif nöronlarda9'da bir varyant kırmızı floresan proteini (tdTomato) eksprese eden BAC-transgenik fareler mevcuttur. Alternatif olarak, floresan proteinlerin seçici nöronal ekspresyonu, Cre-loxP teknolojisi10 ile elde edilebilir. Örneğin, nöronların alt kümelerinde Cre-rekombinaz eksprese eden fare suşları (örneğin, kolin asetiltransferaz (ChAT)-Cre), loxP bölgeleri11 tarafından kuşatılmış bir transkripsiyonel baskılayıcının kontrolü altında (örneğin, tdDomates veya GFP) kurucu bir lokustan (örneğin, tdDomates veya GFP) floresan proteini (örneğin, tdDomates veya GFP) eksprese eden farelerle yetiştirilebilir (örneğin, tdDomates'i yalnızca kolinerjik nöronlarda eksprese eden fareler üretmek). Gerçekten de, Cre-loxP rekombinasyonunu kullanarak, inen kortikospinal sistemin aksonlarında sarı floresan proteini eksprese eden transgenik fareler üretilmiştir12.

Ek olarak, ORANGE gibi CRISPR / Cas9 gen düzenlemedeki son gelişmeler, nano ölçekli çözünürlük13'te elde edilebilen ekspresyon ile çoklu endojen nöronal proteinlerin floresan etiketlemesini mümkün kılmaktadır. Dahası, Cre-eksprese eden fare suşları ile kombinasyon halinde, ORANGE-CAKE bireysel nöronlarda birden fazla endojen proteini etiketlemek için kullanılabilir13. Alternatif olarak, viral aracılı nöronal izleme, nöronal alt kümelerin etiketlenmesine de izin verir ve viral serotiplerin ve / veya hücreye özgü promotörlerin hedeflenen kombinasyonları ile elde edilebilir14,15,16,17.

Nöronal etiketleme yöntemlerine ek olarak, fare çizgileri, camgöbeği floresan proteinini (Mito.CFP)18 ifade eden mitokondri veya GFP'yi (LC3.GFP)19 ifade eden otofagozomlar gibi belirli organelleri hedef alan muhabir proteinlerini ifade etmek için de tasarlanmıştır. Dahası, fare çizgileri özellikle nöronlardaki kalsiyum dinamiklerini değerlendirmek için tasarlanmıştır (örneğin, Thy1.GCaMP)20,21. Toplamda, bu tür modellerin ilerlemesiyle, yeni deneysel uygulamalar, bilim adamlarının CNS ve PNS hakkında daha kesin biyolojik ve patolojik sorular sormalarını sağlar.

Periferik motor sinirlerin ana rolü, hareketi ortaya çıkarmak için elektrik sinyallerini iskelet kasına iletmektir. Ek olarak, ve daha uzun zaman ölçeklerinde meydana gelen, çeşitli organeller (örneğin, mitokondri, endolizozomlar, sinyal endozomları) şeklinde nörokimyasal ve fizyolojik mesajlar, nöronal homeostazın korunmasına yardımcı olmak için sitoiskelet ağını tek veya çift yönlü bir şekilde geçer22,23,24. Aksonal transporttaki bozulmaların nöronal sağlık için feci sonuçları vardır ve birçok nörogelişimsel ve nörodejeneratif hastalıkla bağlantılıdır25. Moleküler düzeyde, aksonal taşımadaki bozulmalar, sinaptik sinyalleşmeyi ve plastisiteyi, gen transkripsiyonunu ve akson26,27 boyunca lokal translasyonu düzenleyen fizyolojik olayları bozabilir. Bu olayları kültürlenmiş hücrelerde / nöronlarda incelemek için çok sayıda araç olsa da28,29, aksonal taşıma dinamiklerini ve aksonal bağlantılı biyolojik olayları in vivo olarak değerlendirmek, fizyolojik ve patolojik süreçlere ilişkin temel içgörüleri doğrulamak için gereklidir30.

Yıllar geçtikçe, Schiavo Laboratuvarı aksonal taşıma hakkında çeşitli sorular sormak için protokolleri optimize etmiştir31,32,33,34,35,36. Bu deneyler, tetanoz nörotoksininin (HCT) floresan olarak etiketlenmiş atoksik bir parçasının, nidogenler ve polisialoglio sidleri37 ile etkileşimler yoluyla iskelet kasındaki akson terminallerine içselleştirildiğinin keşfinden genişlemiştir. İçselleştirildikten sonra, HCT, motor ve duyusal nöronların hücre gövdelerine yönelik Rab7-pozitif, nörotrofin içeren sinyal endozomlarında retrograd olarak taşınır 38,39,40,41. Buna paralel olarak, görüntüleme teknolojisindeki ilerlemeler, canlı, anestezi uygulanan farelerde periferik sinir demetlerinin ve bireysel aksonların gerçek zamanlı analizini sağlamıştır30. Patolojide in vivo aksonal transport dinamiklerini değerlendirmeye yönelik ilk girişim, SOD1G93A fare amiyotrofik lateral skleroz (ALS) modelinde sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin taşınmasında presemptomatik bozukluklar ortaya koymuştur35. Daha da önemlisi, motor nöron kaybının, Kennedy hastalığı42'nin bir fare modelinde ve ALS43'ün heterozigot mutant FUS modelinde aksonal taşıma pertürbasyonlarının yokluğunda ortaya çıkabileceği bulgusu göz önüne alındığında, bu kusurların nörodejenerasyonun ikincil sonuçlarını temsil etmesi muhtemel değildir. Bu tür aksonal transport açıkları, ALS farelerinde spesifik kinazların inhibitörleri33 veya büyüme faktörü reseptörleri34 kullanılarak düzeltilebilir. Dahası, nöronların spesifik bir histon deasetilaz blokeri ile tedavi edilmesi, mitokondriyal transportu in vivo36 değiştirir. Son zamanlarda, aksonal transportun BDNF'ye bağımlı modülasyonunun, ALS fareleri44'te farklı motor nöron alt tiplerinde düzensiz olduğunu bildiriyoruz.

Aksonal taşıma dinamiklerini değerlendirmek için sürekli genişleyen bir araç seti kullanan bu video protokolü, farklı biyolojik ve patolojik senaryolar hakkında daha fazla bilgi sahibi olmayı sağlayacak çeşitli uygulamaları özetlemektedir. İlk olarak, kolinerjik nöronlarda (yani motor nöronlarda) floresan proteinlerini seçici olarak eksprese eden transgenik fareler, hem in vivo hem de ex vivo motor ve duyusal aksonlar arasında ayrım yapmak için kullanılır. Floresan olarak etiketlenmiş HCT daha sonra farklı periferik nöronlardaki aksonal taşıma dinamiklerini ayırt etmek için üç transgenik çizgideki sinyal endozomlarına yüklenir. Bir sonraki deneysel protokol, ChAT.tdDomates farelerini Mito-CFP fareleri ile yetiştirerek özellikle motor nöronlarda mitokondriyal taşımayı değerlendirmek için çok katlı bir floresan yaklaşımını detaylandırmaktadır. Son olarak, aynı akson içindeki mitokondri ve sinyal endozomlarının in vivo olarak nasıl eşzamanlı olarak görüntüleneceğine dair talimatlar verilmiştir.

Protocol

Tüm fare kullanımı ve deneyleri, Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası'na (1986) uygun olarak gerçekleştirildi ve University College London - Queen Square Institute of Neurology Ethics Committee tarafından onaylandı.

1. Hayvanlar

  1. Tüm hayvanları ayrı ayrı havalandırılan kafeslerde sıcaklık ve nem kontrollü bir ortamda barındırın ve yiyecek ve suya ad libitum erişimi ile 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde tutun.
  2. Aşağıdaki transgenik suşların hem erkek hem de dişi farelerini kullanın: 1) ChAT.eGFP fareleri olarak adlandırılan heterozigot Tg (Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd fareleri; 2) HB9 olarak adlandırılan heterozigot B6.Cg-Tg (Hlxb9-GFP) 1Tmj / J. GFP fareleri; ve 3) heterozigot B6.Cg-Tg (Thy1-CFP / COX8A) S2Lich / J, Mito.CFP fareleri olarak adlandırılır.
  3. ChAT.Cre fareleri olarak adlandırılan homozigot B6;129S6-Chat tm2(cre)Lowl/J'yi homozigot B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdDomates)Hze/J ile geçerek ChAT.tdDomates fareleri oluşturun.
  4. Heterozigot ChAT.tdDomates farelerini heterozigot Mito.CFP fareleri ile geçerek ChAT.tdDomates farelerini oluşturun.

2. Floresan HC T'nin kas içi enjeksiyonları

  1. Ameliyat öncesi hazırlık
    1. Express H CT (HCT441, kalıntılar 875-1315), 45'e göre bir glutatyon-S-transferaz füzyon proteini olarak bakterilerde gelişmiş bir sistein bakımından zengin etikete kaynaşmıştır. AlexaFlour555 C2 maleimide31 ile HCT etiketini kullanın, buz gibi diyaliz tamponunda (10 mM HEPES-NaOH, 100 mM NaCl, pH 7.4) çevirin, sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın. İn vivo deneyler yapmadan önce, birincil nöronlarda başarılı alım ve taşıma için ilk test HCT in vitro.
    2. Floresan H C T'yi (örneğin, HCT-555), 0,2 mL'lik bir tüp içinde steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2,5 ila 10 μg / μL arasında değişen nihai ve deneysel olarak tutarlı bir konsantrasyona seyreltin. Bu adımda, gerekirse HCT çözeltisine daha fazla bileşik / faktör ekleyin (örneğin, beyin kaynaklı nörotrofik faktör).
      NOT: Son hacim, ilgilenilen kasların boyutuna uygun olmalıdır. Örneğin, tibialis anterior (TA) kası için 3-4 μL'lik bir enjeksiyon hacmi ve daha küçük soleus kası için ~ 1 μL'lik bir enjeksiyon hacmi hazırlayın. HCT'nin çalışma konsantrasyonunu, son hacimden bağımsız olarak 2,5 ila 10 μg / μL arasında tutun.
    3. HCT çözeltisini bir pipet veya girdap kullanarak karıştırın ve sıvıyı toplamak ve büyük kabarcıkları çıkarmak için bir masaüstü santrifüjü kullanarak düşük hızda kısa bir süre aşağı doğru döndürün. HC T'yiışıktan ve buz üzerinde taşımadan koruyun.
    4. Daha küçük kaslara (örneğin, soleus) optimal kas içi enjeksiyonlar veya intrasiyatik sinir enjeksiyonları için çekilmiş bir cam mikropipet kullanın. Ameliyattan önce derecelendirilmiş cam mikropipetleri ( 46'ya göre) çekin.
      NOT: Pipetlemeyi etkinleştirmek ve mikropipetin arkasından yukarı ve dışarı akışı kısıtlamak için, diseksiyon mikroskobu altında ince forseps kullanarak keskin uçtan küçük bir parçayı dikkatlice ayırın. Kırık ucu uygun çöp kutusuna atmaya özen gösterin.
    5. Kullanmadan önce tüm cerrahi aletleri sterilize edin ve temizleyin.
  2. Cerrahi-kas içi enjeksiyonlar
    1. 37°C'ye ayarlanmış bir ısı paspası üzerine steril bir cerrahi örtü yerleştirerek ameliyata hazırlanın. Çalışma mikroskobunu konumlandırın ve odaklayın. Ameliyatın başlaması için, cerrahi örtünün üzerine önceden sterilize edilmiş cerrahi aletleri, cerrahi bandı, steril pamuklu çubukları, suda %70 (v/v) etanol, steril salin, dikişleri ve bir Hamilton iğnesi veya çekilmiş cam mikropipetleri açın.
    2. Anestezik makinenin cerrahi prosedür süresince yeterli oksijen ve izoflurana sahip olduğundan emin olun. Anestezi akışını indüksiyon odasına yönlendirin ve anestezi makinesini açın.
      1. Başlamak için, 1-2 L / dak ve% 5 izofluran oksijen akış hızı kullanın. Anesteziyi başlatmak için fareyi indüksiyon odasına yerleştirin. Sağ refleks olmadığında, anesteziyi% 2-3 izoflurana düşürün, anestezi akışını ağızlığa yönlendirin ve fareyi cerrahi alanın ayrı bir alanında bulunan ağızlığa aktarın.
    3. Enjekte edilecek kasları kaplayan kürk bölgesini tıraş etmeden önce hem kornea hem de pedal çekilme reflekslerinin bulunmadığından emin olun. Tamamlandığında, cerrahi bandın yapışkan tarafını kullanarak fareden mümkün olduğunca fazla tıraş edilmiş kürkü çıkarın ve ameliyat öncesi ağırlığını kaydetmek için fareyi tartım terazilerine yerleştirin.
    4. Göz yağlayıcısını pamuklu çubukla dikkatlice uygulayın ve fareyi ve ağızlığı cerrahi bölgeye aktarın.
      NOT: Cerrahi bölgeye de aktarılan tıraşlı kürk miktarını sınırlamaya çalışın. Farenin kaymasını önlemek için kafayı ağızlığa sabitlemek için cerrahi bant kullanın. Ayrı bir pamuklu çubuk kullanarak, kürk kontaminasyonunu sterilize etmek ve azaltmak için tıraş edilen bölgeye etanol uygulayın.
    5. Vücudu enjekte edilecek kaslara göre konumlandırın. Örneğin, TA için, fareyi sırtına yerleştirin ve arka bacağını orta hattan ~ 10 ° 'de uzatın. Alternatif olarak, soleus enjeksiyonları için, hayvanı yan tarafına yerleştirin ve arka bacağını orta hattan ~ 45 ° C'de uzatın. Arka bacak doğru pozisyonda olduğunda, ameliyat sırasında istenmeyen hareketleri önlemek için ayak boyunca cerrahi bant kullanın.
      NOT: TA, gastroknemius ve soleus kasları için enjeksiyon prosedürleri daha önce ayrıntılı olarakaçıklanmıştır 32.
    6. Bir kesi yapmadan önce, pedal çekilme refleksini test ederek anestezinin yeterli olduğunu onaylayın. Anesteziyi sürekli izleyin ve solunum ve yoksunluk refleksinin düzenli olarak değerlendirilmesi ile cerrahi prosedür boyunca koruyun.
    7. Bu noktada, çalışan HCT çözeltisini Hamilton şırıngasına veya çekilmiş cam mikropipete çekin.
    8. Motor uç plaka bölgeleri46,47,48 ile uyuşan alan (lar) daki ilgili kas (lar) üzerinde küçük bir kesi yapın. Kas üzerindeki dış fasyayı delin ve HCT'yi 32'ye göre yavaşça enjekte edin. Yavaşça geri çekmeden önce şırınga/mikropipeti 5-10 sn pozisyonda bırakın.
    9. Kesileri 1-2 dikişle kapatın ve fareyi izole bir kurtarma kafesine aktarın. Ameliyat sonrası fareyi ev kafesine geri döndürmeden önce en az 30 dakika izleyin. Fare başarıyla iyileştiğinde ve cerrahi sonrası izleme tamamlandığında, kafesi normal muhafaza koşullarına geri döndürün.

3. In vivo aksonal taşıma

  1. Siyatik sinirin açığa çıkarılması
    1. Mikroskop çevre odasını görüntülemeden en az 1 saat önce 37 °C'ye ayarlayın.
    2. Cerrahi alanın etrafındaki cerrahi örtü, aletler, bant, steril pamuklu çubuklar,% 70 etanol ve steril salini düzenleyerek siyatik siniri açığa çıkarmaya hazırlanın. Anestezik makinenin fare başına 2 saate kadar yeterli oksijen ve izofluran deposuna sahip olduğundan emin olun. Parafilm veya görünmez banttan açılı bir uçla dar bir dikdörtgen (örneğin, daha büyük fareler için ~ 1 cm genişlikte) keserek bir kama oluşturun ve görüntüleme işlemine yardımcı olmak için açıkta kalan siyatik sinirin altına yerleştirin. İndüksiyon odasını bir ısı paspasının üzerine yerleştirin ve vücut sıcaklığına ayarlayın.
      NOT: HCT'nin alınması ve enjeksiyon bölgesinden siyatik sinire retrograd olarak taşınması için dört saat yeterli bir süredir; Bu nedenle, bu süreden sonra tek bir fare yeniden anestezi için hazırlanabilir.
    3. Anestezi akışını indüksiyon odasına yönlendirin, anestezi makinesini 1-2 L / dak ve% 3-4 izofluran oksijen akış hızına sahip açın ve anesteziyi başlatmak için fareyi indüksiyon odasına yerleştirin.
      NOT: İn vivo aksonal taşıma deneyi bir terminal prosedürü olduğundan, gözlerin yağlanmasına gerek yoktur.
    4. Sağ refleks olmadığında, anesteziyi% 2-3 izoflurana düşürün, anestezi akışını ağızlığa yönlendirin ve fareyi ağızlığa aktarın. Kafayı ağızlığa sabitlemek için cerrahi bant kullanın, hedeflenen arka bacağı orta hattan ~ 45 ° 'de uzatın ve bu pozisyonu korumak için ayağın üzerinde cerrahi bant kullanın.
      NOT: Azaltılmış anestezi, görüntüleme işlemi sırasında solunum artefaktlarının etkisini sınırlayabileceğinden bu noktada avantajlıdır.
    5. Kornea ve pedal çekilme reflekslerinin bulunmadığından emin olun ve daha sonra siyatik sinir32'nin üzerindeki cildi kesmek için makas kullanın (yani, merkezi omurilikten orta-alt arka bacaklığa kadar uzanan geniş bir alan). Üstteki biseps femoris kasının yanı sıra siyatik sinirin yakınında bulunan diğer kas ve bağ dokusunu çıkarın. Siyatik sinire ve çevresindeki kan damarlarına, özellikle de lateral gastroknemius başının patella / proksimal yönünün lateral yönünün yakınında bulunanlara zarar vermekten kaçının.
    6. Sağlam siyatik sinir yeterince maruz kaldığında, kurumayı önlemek için siyatik sinirin etrafındaki alana önceden ısıtılmış steril salin uygulayın. Derinlerde yatan bağ dokusunu bozmak için kavisli forseps kullanın ve önceden hazırlanmış parafilm 'kama'yı sinirin altına yerleştirin. Tamamlandığında, maruz kalan bölgeye tuzlu suyla ıslatılmış pamuk yünü yerleştirin ve fareyi,O2'de izofluran ile doldurulması gereken ısı paspasının (37 ° C'ye ayarlanmış) üzerine yerleştirilmiş indüksiyon odasına getirin.
  2. In vivo aksonal görüntüleme
    1. Özelleştirilmiş mikroskop aşamasına 22 x 64 mm'lik bir kapak camı yerleştirin ve konumunu bantla sabitleyin. Daldırma yağını seçip hedefe uygulayın ve ardından mikroskop aşamasını ters çevrilmiş mikroskopa bağlayın. Yağ ve kapak camı arasında temas kurulana kadar yağa batırılmış hedefi yavaşça kaldırın.
      NOT: Siyatik sinirde in vivo transportu görüntülemek için 40x, 1.3 sayısal açıklık (NA) DIC Plan-Apochromat veya 63x, 1.4 NA DIC Plan-Apochromat yağ daldırma hedefleri kullanılabilir.
    2. Anestezik ağızlığı mikroskop aşamasına taşıyın ve anestezinin bozulmasını önlemek için anestezi hortumlarını bantla sabitleyin. Pamuk yününü siyatik sinirden çıkarın ve fareyi indüksiyon odasından ağızlığa aktarın, açıkta kalan sinir kapak camına bakacak şekilde. Farenin başının ağızlığa sabitlendiğinden emin olmak ve en düşük, etkili anestezi seviyesini korumak için cerrahi bant kullanın. Fareyi kuyruğundan yavaşça kaldırın ve kurumayı kısıtlamak ve görüntülemeye yardımcı olmak için maruz kalan siyatik sinirin yakınındaki kapak kaymasına steril salin ekleyin.
      NOT: Alanın vücut sıcaklığında kalmasını sağlamak için çevre odasının tüm kapılarını kapatın.
    3. Oküler kullanarak, siyatik siniri bulun, optimal odak noktasını belirleyin ve hareketli aksonal organeller içeren bir ilgi alanı seçin.
      NOT: Bu işlemin ayrıntılı bir açıklaması daha önce açıklanmıştır32.
    4. Edinme düğmesini (veya eşdeğerini) tıklatarak bilgisayar yazılımına geçin ve bir ilgi alanı seçin. Toplam >80x büyütme elde etmek için dijital yakınlaştırma kullanın ve aksonları yatay olarak görselleştirmek için seçilen alanı döndürün (örneğin, sağdan sola hareketli retrograd kargo ve soldan sağa hareketli anterograd kargo).
      NOT: Yönlülük parametreleri kullanıcıya bağımlıdır, ancak denemeler boyunca tutarlı kalmalıdır.
    5. Lazer yoğunluğu (% 0,2 - 1), iğne deliği açıklığı (1 AU - maksimum), kazanç (Master) (700 - 1000), dijital ofset (-50 - 0) ve dijital kazanç (1,0 - 4,0) gibi parametreleri ayarlayarak sinyal yoğunluğunu optimize edin. Fototoksisitenin potansiyel etkisini azaltmak için, lazer yoğunluğunu mümkün olan yerlerde% 1'≤ ve maksimum lazer yoğunluğunu% 2 oranında tutun. Optimum sinyal algılama için lazer yoğunluğunu ayarlamadan önce diğer tüm parametreleri değiştirin.
    6. Bölgeler kutusunu (veya eşdeğerini) tıklayın, ilgilenilen dikdörtgen bir bölge seçin, ardından Edinme Modu'nda (veya eşdeğeri) kare boyutunu en az 1024 x 1024 piksel olarak ayarlayın ve 100-1.000 karelik hızlandırılmış alımı başlatın.
      NOT: İstenilen kare alma hızı kullanıcıya bağlıdır (örneğin, taşıma 0,1 ila 6 sn arasındaki kare hızlarıyla değerlendirilebilir) ve ilgilenilen bölge, tarama hızı süresi, edinme ortalaması ve lazer yönlülüğü gibi yazılım parametreleriyle ayarlanabilir. Örneğin, daha yavaş bir kare hızı elde etmek için, ilgilenilen bölgenin yüksekliğini/genişliğini artırın, daha yavaş tarama hızları elde edin, edinme ortalamasını artırın ve daha hızlı bir kare hızı için tek lazer yönlülüğü kullanın veya bunun tersi de geçerlidir . Farklı frekanslarda görüntüleme tutarsızlıklara neden olabileceğinden, kare alma hızı karşılaştırılabilir veri kümeleri arasında tutarlı kalmalıdır. Sinyal endozomları gibi hızlı yükler, daha yavaş bir hız (örneğin 2.5-6 s) kullanılarak analiz edilebilen mitokondri gibi daha yavaş organellere kıyasla daha hızlı bir kare hızı (örneğin 0.1-3 s) gerektirir.
    7. Fare başına en az üç aksondan en az 10 hareketli kargo yakalamayı hedefleyin.
      NOT: İki örneklemli, iki taraflı güç hesaplamalarına dayanarak (standart gücü 0,8 (1-β) ve tip I hata oranı %5 (α)), 6-8 örneklem büyüklükleri vahşi tip ve hastalık modelleri arasındaki aksonal taşıma farklılıklarını tanımlamak için yeterlidir35,43.
    8. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, anestezi altındayken fareyi hemen ötenazi yapın (örneğin, servikal çıkık). Kaslar ve siyatik sinirler gibi post mortem dokular da daha fazla analiz için toplanabilir.

Representative Results

Bu makale, kemirgen modellerinde in vivo aksonal taşıma araç setini genişleten çok yönlü bir protokolü detaylandırmaktadır. Şekil 1 , motor nöron aksonlarının transgenik fareler kullanılarak hem duyusal nöron aksonlarından hem de Schwann hücrelerinden ayırt edilebileceğini göstermektedir. Şekil 1A , canlı, anestezi uygulanmış ChAT.eGFP faresinden kolinerjik motor aksonlardaki eGFP ekspresyonunu göstermektedir. Şekil 1B , ChAT.tdDomates faresinden yeni eksize edilmiş bir sinirde (yani, ek doku işleme olmadan) tdDomates ekspresyonunu elde etmek için alternatif bir yöntem kullanır. Bu nedenle, ChAT.eGFP, ChAT.tdDomates veya Hb9.GFP gibi transgenik suşların kullanılması, in vivo motor aksona özgü etiketlemeyi mümkün kılar.

Alternatif olarak, aksonlar iskelet kaslarına izleyiciler / belirteçler (örneğin, HCT31,32 veya eGFP 15'i kodlayan virüsler) enjekte edilerek de tanımlanabilir. Şekil 2, HCT-555-pozitif sinyal endozomları (beyaz oklar), TA kasına ~ 4 saat sonrası prob enjeksiyonu içeren sekiz sağlam ChAT.eGFP-pozitif aksonu gösteren böyle bir uygulamayı vurgulamaktadır. Bu deneysel tasarımı kullanarak, ağırlıklı olarak hızlı yorulabilen44 olan TA-innerve edici α-motor nöronları tanımlayabiliriz. Daha az sağlam eGFP ekspresyonuna sahip beş ChAT.eGFP aksonu (Şekil 2A, turuncu yıldızlar) kısmen odak dışıydı ve siyatik sinir içinde biraz daha derine yerleştirilmesi muhtemeldi.

Ayrıca, eGFP-negatif duyusal aksonlarda (sarı oklar) HCT-555-pozitif sinyal endozomlarını tanımladık. Bu nedenle, bu deneysel paradigmayı kullanarak, motordaki sinyal endozomlarının aksonal taşınımını in vivo olarak duyusal nöronlara karşı özel olarak değerlendirebilir ve karşılaştırabilirsiniz. Gerçekten de, bu transgenik muhabir suşunu kullanarak, ChAT.eGFP-pozitif motor aksonlarındaki sinyal endozomlarının taşınmasının, akson genişlikleri43 kullanılarak güvenilir bir şekilde ayırt edilebilen ChAT.eGFP-negatif duyusal aksonlardan daha hızlı olduğunu keşfettik.

Daha önce ChAT.eGFP fareyi in vivo 43 kullanarak motor nöron aksonlarını tanımlamıştık. Şimdi HB9'u bildiriyoruz. GFP fareleri, in vivo motor nöron akson tanımlaması elde etmek için de kullanılabilir. Gerçekten de, Şekil 3, HB9'un bir dizi hızlandırılmış görüntüsünü sunmaktadır. Retrograd hareketli HCT-555-pozitif sinyal endozomları içeren GFP aksonları. ChAT güdümlü ifadenin aksine, GFP'nin HB9'da daha dakik/granüler bir desene sahip olduğunu unutmayın. GFP aksonları; bunun nedeni belirsizdir.

Mitokondriyal hedefli boya, tetrametilrodamin, etil ester, perklorat (TMRE)32,36'nın intrasiyatik sinir enjeksiyonları yoluyla siyatik sinirlerde in vivo mitokondriyal dinamiklerin nasıl izleneceğini daha önce açıklamıştık. Motor ve duyusal mitokondrileri güvenilir bir şekilde ayırt etmek için, Thy1 promotörü18 altında CFP'yi ifade eden Mito.CFP faresi, belirli nöronal tiplerde floresan muhabir genini ifade eden transgenik farelerle çaprazlanabilir. Gerçekten de, Mito.CFP farelerini ChAT.tdDomates fareleriyle (ChAT.tdDomates olarak adlandırılır::Mito.CFP olarak adlandırılır) yetiştirerek, Şekil 4'te gösterildiği gibi mitokondrileri özellikle motor aksonlara görselleştirebiliriz. Bu canlı multipleks örnekte, dördü CFP pozitif mitokondri içeren beş ChAT.tdDomates aksonu görselleştirilebilir. Ayrıca, Ranvier'in düğümü (panel iii'deki beyaz ok) da tanımlanabilir. Ayrıca, Ranvier'in düğümleri ChAT.eGFP, HB9'da açıkça tespit edilebilir. GFP ve Mito.CFP fareleri (gösterilmemiştir). Bu çift transgenik suşlar, motor nörona özgü mitokondriyal içeriği ve aksonal taşıma dinamiklerini izlemek için canlı, anestezi uygulanmış farelerin hızlandırılmış intravital görüntülenmesini sağlar.

Son olarak, sinyal veren endozomlar ve mitokondri, Mito.CFP farelerinin kaslarına HCT enjekte edilerek in vivo olarak aynı aksonlar içinde eşzamanlı olarak görselleştirilebilir (Şekil 5). HCT-555'in intramüsküler enjeksiyonları, görüntülemeden önce bir Mito.CFP faresinde ~ 4 saat önce TA kasında gerçekleştirildi. Hem mitokondri (i panelleri) hem de sinyal endozomları (ii paneller) aynı anda kaslara özgü aksonlar (yani, TA'yı innerve eden aksonlar) olarak görselleştirildi. Gerçekten de, anterograd (sarı üçgenler) ve retrograd (yeşil üçgenler ve daireler) hareketli organellerin yanı sıra durmuş organeller (turuncu üçgenler ve daireler) gözlenebilir. Bu deneysel paradigmayı kullanarak, aksonal mitokondri ile sinyal veren endozomlar arasındaki karmaşık fonksiyonel etkileşimler in vivo olarak değerlendirilebilir. Genel olarak, sinyal veren endozomların ve / veya mitokondrilerin, özellikle de in vivo kolinerjik motor nöronların aksonal taşınımını değerlendirmek için birkaç farklı deneysel yaklaşım gösteriyoruz.

Figure 1
Resim 1: Siyatik sinir motor aksonları . (A) Bir ChAT.eGFP faresinden in vivo olarak elde edilen eGFP-pozitif motor aksonların temsili tek düzlemli görüntüsü. (B) ChAT.tdDomates faresinden eksize edilmiş bir siyatik sinir içindeki tdDomates pozitif motor aksonlarının temsili tek düzlemli görüntüsü. Akson kalibredeki farklılıklar fare yaşı ve boyutundaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Ölçek çubukları = 50 μm. Kısaltmalar: eGFP = geliştirilmiş yeşil floresan proteini; ChAT = kolin asetiltransferaz. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Canlı siyatik sinir motorunda ve ChAT.eGFP faresinin duyusal nöronlarında sinyal veren endozomların in vivo aksonal taşınması. (A-C) EGPP (A) eksprese eden ve H C T-555-pozitif sinyal endozomları (B) içeren kolinerjik aksonların temsili görüntüleri ve birleşme (C). Beyaz oklar, H C T-555-pozitif sinyal endozomları içeren bir eGFP-pozitif motor aksonunu vurgular, camgöbeği okları H C T-555-pozitif sinyal endozomlarından yoksun bir motor aksonunu tanımlar ve sarı oklar, HCT-555-pozitif sinyal endozomlarını taşıyan bir eGFP-negatif duyusal aksonu vurgular. Turuncu yıldız işaretleri, daha zayıf eGFP ekspresyonuna sahip motor aksonları tanımlar. Ölçek çubuğu = 25 μm. Kısaltmalar: eGFP = geliştirilmiş yeşil floresan proteini; ChAT = kolin asetiltransferaz; HCT-555 = tetanoz toksini bağlayıcı alan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: HB9'un canlı motor nöronlarında sinyal veren endozomların in vivo aksonal taşınımını temsil eden hızlandırılmış görüntü serisi. GFP fare. (A-D) Her 3 saniyede bir çekilen, yeşil floresan proteini (i) eksprese eden ve HCT-555-pozitif sinyal endozomları (ii) ve birleşme (iii) içeren motor nöron aksonlarını gösteren hızlandırılmış görüntüler. Aynı renkteki her daire, farklı çerçeveler boyunca aynı hareketli endozomu tanımlar. Retrograd hareket sağdan sola doğrudur. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; HCT-555 = tetanoz toksini bağlayıcı alan. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Bir ChAT.tdTomato'nun canlı siyatik sinir motor nöronlarında mitokondrinin in vivo aksonal taşınması:: Mito.CFP: fare. (A-C) CFP-pozitif mitokondri (B) ve birleşme (C) içeren tdTomato-pozitif motor aksonlarının (A) temsili görüntüleri. I-iii iç görüntüleri her panelden daha yüksek bir büyütme içerir. Beyaz ok, Ranvier'in şüpheli bir düğümünü temsil eder. Ölçek çubukları = 25 (A-C) ve 10 μm (i-iii). Kısaltmalar: ChAT = kolin asetiltransferaz; CFP = camgöbeği floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Mito.CFP farenin canlı siyatik sinir motor nöronlarında mitokondrinin eşzamanlı in vivo aksonal taşınımını ve sinyal endozomlarını temsil eden hızlandırılmış görüntü serisi. (A-C) Her 3 saniyede bir çekilen ve aynı siyatik sinir aksonu (iii) içinde hem mitokondri (i) hem de sinyal endozomlarının (ii) aksonal taşınımını gösteren hızlandırılmış görüntüler. Sarı üçgenler anterograd olarak hareket eden kargoları, yeşil daireler / üçgenler geriye doğru hareket eden kargoları tanımlar ve turuncu daireler / üçgenler sabit yükleri tanımlar. Anterograd hareket soldan sağa, retrograd hareket ise ters yöndedir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: HCT-555 = tetanoz toksini bağlama alanı; CFP = camgöbeği floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Bu protokol, fare siyatik sinirinin sağlam aksonlarında sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için adımları detaylandırır. Gerçekten de, kullanıcıların 1) motor nöronlarda seçici olarak ifade edilen floresan muhabir proteinlerini eksprese eden fareleri kullanarak motoru in vivo , in situ ve ex vivo duyusal nöronlardan ayırt etmelerini sağlayan deneysel bir kurulum sağlanmıştır; 2) üç farklı transgenik fare kullanarak özellikle motor nöron aksonlarında sinyal veren endozomların in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek; 3) Mitokondrinin özellikle motor nöron aksonlarında in vivo aksonal taşınımını araştırmak; ve 4) aynı akson içindeki sinyal veren endozomların ve mitokondrilerin in vivo taşıma dinamiklerini eşzamanlı olarak değerlendirir. Bu yaklaşım, bazal koşullarda aksonal transportu araştırmak için geniş bir potansiyele sahiptir ve periferik motor ve duyusal sinirleri etkileyen farklı hastalıklarda patolojik pertürbasyonları değerlendirmek için kullanılabilir.

Önceki deneysel paradigmaları temel olarak kullanarak31,32, burada transgenik muhabir fareleri kullanarak motor ve duyusal nöronlarda meydana gelen aksonal taşımayı ayırt etmenin ayrıntılı yeni, sağlam yollarına sahibiz. Mito.CFP fareyi kullanarak, bu yaklaşım TMRE36'nın intrasiyatik sinir enjeksiyonlarından kaçınarak in vivo mitokondriyal transportu değerlendirmek için daha da geliştirilmiştir. Bu, probun intrasinir enjeksiyonunun neden olduğu aksonal taşımadaki olası nöral hasarı ve pertürbasyonları ortadan kaldırır. Ayrıca, bu protokol, farklı fizyolojik özelliklere sahip kasları innerve eden motor aksonlardaki çoklu organellerin aksonal taşınmasının görselleştirilmesine izin verir (örneğin, hızlı seğirme yorulmaya dirençli kaslara karşı hızlı seğirme yorulmaya dirençli kaslar). Bu nedenle, sinyal endozomu ve / veya mitokondriyal aksonal taşıma dinamikleri, α-motor nöronların farklı alt kümelerinde değerlendirilebilir44. Ayrıca, bu organellerin patolojik ortamlarda aksonal taşınması, farklı nörodejeneratif hastalıkların fare modelleri ile melezleme yoluyla da değerlendirilebilir 1,2,3.

Aksonal taşıma araç seti sürekli olarak28,29 genişlemektedir ve kültürlü fare ventral boynuz eksplantları 49 veya eksize edilmiş fare sinir-kas preparatları 50 kullanılarak taşıma dinamiklerini değerlendirmek için ex vivo protokoller geliştirilmiştir. Ayrıca, indüklenmiş insan pluripotent kök hücresi (hiPSC) kaynaklı kortikal 51 nöronlarda veya hiPSC türevi spinal motornöronlarda 52'de aksonal transportu değerlendirmek için protokollerin geliştirilmesi, hastalığa neden olan mutasyonlara sahip insan nöronlarının araştırılmasını sağlamıştır. Fare dokusu ve insan hücrelerindeki bu tür son teknoloji protokoller, nöronal fonksiyon hakkında kritik bilgiler sağlayabilir, nörodejeneratif hastalık modellerinde yeni pathomechanistic keşfi kolaylaştırabilir ve terapötik molekülleri ve stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Bu tekniklerin başarılı bir şekilde uygulanması için birkaç kritik adımın izlenmesi gerekmektedir ve protokol bölümünde bazı önemli notlar verilmiştir. İntravital görüntüleme için başlıca gereksinimler, özelleştirilmiş sahne ekine sahip ters çevrilmiş konfokal mikroskop ve anestezi ve optimum sıcaklığı korumak için ekipmandır. Gerçekten de, 1) anestezi indüksiyonu, 2) diseksiyon / doku işleme (yani, siyatik sinirin açığa çıkarılması) ve 3) intravital görüntüleme sırasında anestezinin sürdürülmesi (daha önce 31,32'de ayrıntılı olarak açıklandığı gibi) için özel bir mobil anestezik sisteme ihtiyaç vardır. Özellikle daha yüksek büyütme hedefleri (örneğin, 40x veya 63x) kullanıldığında, anestezi derinliği görüntü kalitesini etkileyebilir, çünkü daha derin anestezi, odakta sık sık kaymalara neden olan büyük 'gazlı' nefeslere neden olur. Bu tür büyük hareketler şüphesiz görüntüleme sonrası taşıma analizlerini (örneğin, Fiji eklentileri TrackMate53 veya KymoAnalyzer54 kullanarak kargoların izlenmesi) etkileyecektir, çünkü solunum hareketleri hızlandırılmış videolarda otomatik izleme için uygun olmayan veya daha fazla zaman alıcı değerlendirme gerektirebilecek eserler üretir. Ayrıca, siyatik sinir içindeki titreşen arterlerin neden olduğu, ancak farklı bir görüntüleme bölgesi seçilerek çözülebilen görüntüleme artefaktlarını da gözlemledik. Mikroskop, sıcaklık ve pH'ın aksonal taşımayı etkilediği için sabit vücut sıcaklığını koruyabilen bir çevre odası ile donatılmalıdır55. Ayrıca, ameliyat sonrası analjeziklerin uygulanmasından kaçınılmalıdır, çünkü bunlar taşıma dinamiklerini değiştirebilir56. Deneysel tasarım uzunlamasına ise ve tekrarlanan görüntüleme gerektiriyorsa (örneğin, 57), diseksiyon protokollerinin minimal invaziv olacak şekilde uygun şekilde ayarlanması gerekir ve ek etik / lisans onayı gerektirebilir.

Bazı deneysel hususların akılda tutulması gerekir. İlk olarak, burada ayrıntılı olarak açıklanan protokollerin çoğu, mitokondri veya motor nöron aksonlarında floresan muhabir proteinlerine sahip transgenik farelerin kullanımını içerir. Bu fare çizgilerinin her biri hemi-/heterozigot olarak yetiştirilmeli ve görüntülenmelidir. Bununla birlikte, istisnalar, homozigot olarak ayrı ayrı korunabilen ChAT.Cre ve Rosa26.tdDomates fare çizgileridir ve elde edilen hemizigot yavruları, Cre-loxP rekombinasyonundan sonra kolinerjik nöronlarda tdDomates ekspresyonunu sağlar. Transgenik hemi / heterozigot fareleri (örneğin, Mito.CFP) diğer transgenik hemi / heterozigot farelerle (örneğin, ChAT.eGFP) melezleştirirken, istenen sayıda çift mutant doyunun elde edilmesi zaman alıcı olabileceğinden, üreme stratejisini dikkatlice düşünmek gerekir. Dahası, F1 nesil ChAT.Cre ve Rosa26.tdDomates farelerini (yani, ChAT.tdDomates) ek transgenik suşlarla (örneğin, Mito.CFP) yetiştirirken, istenen üçlü transgenleri taşıyan daha az fare beklenmelidir. Ek olarak, yakın dalga boyu özelliklerine sahip iki muhabirli fareleri yetiştirirken potansiyel florofor örtüşmesi de göz önünde bulundurulmalıdır (örneğin, Mito-CFP-uyarma: 435 nm, emisyon: 485 nm, ChAT.eGFP-uyarma: 488 nm, emisyon: 510 nm ile yetiştirilmiş), ancak spektral karıştırma58 ile bu sorunun üstesinden gelmek mümkün olabilir.

Bu tekniğin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Bu çalışmada ve önceki protokollerimiz31,32'de, farklı organelleri in vivo olarak etiketlemek ve izlemek için genetik olarak kodlanmış birkaç belirtecin ve farklı boyama yöntemlerinin nasıl kullanılabileceğini gösterdik. Bununla birlikte, tüm problar bu deneysel yaklaşım için uygun değildir. Kolera toksini beta alt biriminin (CTB)-488 (görüntülemeden 0.5-1.5 μg/μL ~4 saat önce), in vivo retrograd izleyici deneylerinde motor nöron hücre cisimciklerini etiketlemek için rutin olarak kullanılan bir probun TA veya soleus kasına enjeksiyonları değerlendirdik. Bununla birlikte, tek başına enjekte edildiğinde veya HCT-555 ile birlikte enjekte edildiğinde, CTB-488 etiketlemesi, başarılı retrograd motor nöron takibi için kullanılanlara benzer konsantrasyonlar kullanılmasına rağmen zayıftı. Bu nedenle, CTB'nin nöronal kültürlerde sinyal veren endozomların mükemmel bir in vitro belirteci olmasınarağmen, H CT'nin in siyatik sinir aksonlarında in vivo sinyal endozomlarını tanımlamak için altın standart prob olmaya devam ettiği sonucuna varıyoruz.

Farklı yollar kullanarak, LysoTracker yeşil DND-26 gibi lizozomları etiketlemek için rutin olarak kullanılan probları ve Cathepsin D62 için BODIPY-FL-pepstatin A ve Cathepsin B için Magic Red gibi aktif lizozomal hidrolazların belirteçlerini test ettik, ancak başarılı olamadık. BODIPY-FL-pepstatin A'nın intramüsküler olarak verilmesini (görüntülemeden önce TA ~ 4 saat içinde 2.5 μg) ve görüntülemeden 30-60 dakika önce 2 μL LysoTracker (10 μM), BODIPY-FL-pepstatin A (10 μM) veya Magic Red (1/10) intrasiyatik sinir enjeksiyonunu denedik. Siniri vurgulayan bu problara rağmen, açıkça etiketlenmiş organeller bulamadık. Sondalar aksonların etrafında birikti, muhtemelen Schwann hücreleri tarafından tutuldu. Bu nedenle, lizozomların başarısız bir şekilde etiketlenmesi, nöronlara eksik prob verilmesinden kaynaklanabilir, ancak daha uygun konsantrasyonların varlığı göz ardı edilemez. TMRE etiketlemesinin benzer koşullar altında (yani, intrasiyatik sinir enjeksiyonları) çalıştığı göz önüne alındığında, etiketleme yoğunluğu boyaya bağımlı olabilir ve her belirteç için bağımsız olarak test edilmelidir. Bununla birlikte, lizozomları bu problarla in vivo olarak hedeflemenin yukarıda belirtilen konsantrasyonlarda mümkün olmadığı sonucuna varıyoruz.

Anestezi yöntemleri farklı fizyolojik okumaları değiştirebilir (örneğin, koklea fonksiyonu63 ve kortikal elektrofizyoloji64); Bununla birlikte, anestezinin siyatik sinirde in vivo aksonal transportu etkileyip etkilemediği şu anda bilinmemektedir. İzofluran kaynaklı anestezi altında azalmış nöromüsküler aktivite göz önüne alındığında, taşıma kinetiğinin uyanık duruma kıyasla farklılık göstermesi mümkündür. Bununla birlikte, bunu doğrudan araştıran tek in vivo çalışma, talamokortikal projeksiyonlarda yoğun çekirdek veziküllerinin taşınmasının anestezi uygulanan ve uyanık fareler arasında farklılık göstermediğini ortaya koymuştur65. Ayrıca, vahşi tip ve hastalık modeli fareler arasındaki taşımacılıktaki ayrımlar anestezi altında tespit edilebildiği için35,43, izofluran maruziyetinin endozom veya mitokondriyal kaçakçılığı işaret etmede uygunlukların tanımlanmasını engellemediği açıktır.

Bu protokolün aşağıda açıklanan diğer potansiyel uygulamaları vardır. Bu protokolde özetlenen transgenik farelerin (örneğin, Mito.CFP, ChAT.eGFP) nörodejeneratif hastalık fare modelleri 1,2,3 ile ıslahı, nöron alt tipine ve / veya kargoya özgü araştırmaları mümkün kılacaktır. Dahası, yakın zamanda geliştirilen fare Cre hatları66, farklı duyusal akson popülasyonlarında floresan muhabir proteinlerinin görselleştirilmesine de izin verecektir. Örneğin, Rosa26.tdDomates fareleri bir nöropeptit Y reseptörü -2-eksprese edici (Npy2r) ile çaprazlanabilir. Miyelinli A-fiber nosiseptörlerde tdDomates floresansını etkinleştirmek için Cre fare67. Ayrıca, zamansal kontrol, indüklenebilir Cre sistemleri (örneğin, tamoksifen)68 kullanılarak da sağlanabilir. Başka bir potansiyel uygulama, Schwann hücrelerinde floresan muhabir proteinlerini eksprese eden transgenik farelerin mevcudiyetine dayanmaktadır. Gerçekten de, S100-GFP69 ve PLP-GFP70 fareleri, Schwann hücrelerinin in vivo ve / veya in situ görüntülemesini sağlar ve periferik sinir rejenerasyonu sırasında Schwann hücre göçünde yer alan araştırmaların ön saflarında yer almıştır.

Bu uygulamalara ek olarak ve Mito.CFP fareyi tamamlayan, floresan proteinleri mitokondri ve otofagozomlar gibi farklı organellerde eksprese eden birkaç transgenik fare çizgisinin mevcudiyetidir. Örneğin, in vivo mitokondriyal taşımayı araştırmak, mito::mKate2 fare71 veya fotodönüştürülebilir mitoDendra fare57 ile mümkün olabilir. Ayrıca, mitofaji analizleri için pH'a duyarlı mito-Keima fare72 ve mito-QC fare73 kullanılarak in vivo mitophagotom taşınması mümkün olabilir. Ayrıca, karşılaştığımız lizozomal etiketleme zorlukları, LAMP1-GFP'yi eksprese eden fareler kullanılarak, LAMP1'in lizozomlardan farklı endositik organellerde de mevcut olduğu uyarısı ile aşılabilir74.

Özetle, çeşitli transgenik farelerden spesifik periferik sinir aksonlarındaki çeşitli organellerin in vivo aksonal taşınımını değerlendirmek için yeni yollar sağladık. Farklı organellerin eşzamanlı görüntülenmesi, aksonal etkileşimlerin ve mitokondri ve endozomlar75,76 gibi organellerin ortak kaçakçılığının son bulguları göz önüne alındığında, özellikle önemli olacaktır. Sunulan yöntemlerin, aksonların in vivo bazal fizyolojisinin daha iyi anlaşılması ve periferik sinirlerin nörodejenerasyonunu yönlendiren önemli patomekanizmaların çözülmesi için yararlı olacağına inanıyoruz.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

ChAT-eGFP, ChAT.Cre ve Rosa26.tdDomates farelerini paylaştığı için Robert M. Brownstone'a (Queen Square Institute of Neurology, University College London) ve HB9'u paylaştığı için Pietro Fratta'ya (Queen Square Institute of Neurology, University College London) teşekkür ederiz. GFP fare. Elena R. Rhymes, Charlotte J.P. Kremers ve Qiuhan Lang'a (Queen Square Institute of Neurology, University College London) el yazmasının eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Motor Nöron Hastalıkları Derneği (İngiltere) (Tosolini / Ekim 20/973-799) (APT), Wellcome Trust Kıdemli Araştırmacı Ödülleri (107116 / Z / 15 / Z ve 223022 / Z / 21 / Z) (GS), İngiltere Demans Araştırma Enstitüsü Vakfı ödülü (GS) tarafından Junior Non-Clinical Fellowship tarafından desteklenmiştir; ve Tıbbi Araştırma Konseyi Kariyer Geliştirme Ödülü (MR / S006990/1) (JNS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tube
70% (v/v) ethanol in distilled water
AlexaFlour555 C2 maleimide ThermoFisher Scientific A-20346 Can also use AlexaFlour-488 or -647 Maleimide
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J Jackson Laboratory 7909 Rosa26.tdTomato mice
B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J mice Jackson Laboratory 5029 HB9.GFP mice
B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J mice Jackson Laboratory 7967 Mito.CFP mice
B6;129S6-Chattm2(cre)Lowl/J mice Jackson Laboratory 6410 ChAT.Cre mice
Computer with microscope control and image acquisition software Zeiss Zen
Cotton swab
Desktop centrifuge
Dissecting microscope
Eye lubricant
Fine curved forceps Dumont
Fine straight forceps Dumont
Glass coverslip (22 x 64 mm, thickness no. 1)
Graduated, glass micropipette with microliter markings and plunger Drummond Scientific 5-000-1001-X10
Hair clippers
Hamilton microliter syringe (701 N, volume 10 μL, needle size 26 s G, bevel tip, needle L 51 mm) Merck 20779
HcT-441 N/A N/A See Restani et al., 2012 for more details
Heating pad
Immersion oil for fluorescent imaging at 37 °C
Inverted confocal microscope with environmental chamber Zeiss LSM 780 Most inverted confocals should be adaptable
Isoflurane
Isoflurane vaporizer/anesthesia machine with induction cham-ber and mask stabilizer
Magic tape invisible tape
Micropipette puller
Parafilm Parafilm
Phosphate-buffered saline (PBS): 137 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.8 mM KH2PO4–HCl, pH 7.4
Recombinant human brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 BDNF that can be co-injected with HcT-555
Saline
Scalpel blade Dumont
Small spring scissors Dumont
Surgery/operating microscope
Surgical drape
Surgical suture
Surgical tape
Tg(Chat-EGFP) GH293Gsat/Mmucd mice MMRRC 000296-UCD ChAT.eGFP
Vortex mixer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Webster, R. G. Animal models of the neuromuscular junction, vitally informative for understanding function and the molecular mechanisms of congenital myasthenic syndromes. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1326 (2018).
  2. Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Disease Models & Mechanisms. 4 (4), 457-467 (2011).
  3. De Giorgio, F., Maduro, C., Fisher, E. M. C., Acevedo-Arozena, A. Transgenic and physiological mouse models give insights into different aspects of amyotrophic lateral sclerosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037424 (2019).
  4. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. The Journal of Cell Biology. 187 (6), 761-772 (2009).
  5. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic lateral sclerosis. The New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  6. Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  7. Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiological Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
  8. Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. 482 (2), 123-141 (2005).
  9. Kaiser, T., Ting, J. T., Monteiro, P., Feng, G. Transgenic labeling of parvalbumin-expressing neurons with tdTomato. Neuroscience. 321, 236-245 (2016).
  10. Zheng, B., Sage, M., Sheppeard, E. A., Jurecic, V., Bradley, A. Engineering mouse chromosomes with Cre-loxP: range, efficiency, and somatic applications. Molecular and Cellular Biology. 20 (2), 648-655 (2000).
  11. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  12. Bareyre, F. M., Kerschensteiner, M., Misgeld, T., Sanes, J. R. Transgenic labeling of the corticospinal tract for monitoring axonal responses to spinal cord injury. Nature Medicine. 11 (12), 1355-1360 (2005).
  13. Willems, J., et al. A CRISPR/Cas9-based genome editing toolbox for epitope tagging of endogenous proteins in neurons. PLoS Biology. 18 (4), 3000665 (2020).
  14. Huh, Y., Oh, M. S., Leblanc, P., Kim, K. -S. Gene transfer in the nervous system and implications for transsynaptic neuronal tracing. Expert Opinion on Biological Therapy. 10 (5), 763-772 (2010).
  15. Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting motor end plates for delivery of adenoviruses: an approach to maximize uptake and transduction of spinal cord motor neurons. Scientific Reports. 6, 33058 (2016).
  16. Andrews, M. R. Gene therapy in the CNS-one size does not fit all. Gene Therapy. 28 (7-8), 393-395 (2021).
  17. Kügler, S. Tissue-specific promoters in the CNS. Methods in Molecular Biology. 1382, 81-91 (2016).
  18. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  19. Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular Biology of the Cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
  20. Dana, H., et al. Thy1-GCaMP6 transgenic mice for neuronal population imaging in vivo. PLoS One. 9 (9), 108697 (2014).
  21. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  22. Maday, S., Twelvetrees, A. E., Moughamian, A. J., Holzbaur, E. L. F. Axonal transport: cargo-specific mechanisms of motility and regulation. Neuron. 84 (2), 292-309 (2014).
  23. Terenzio, M., Schiavo, G., Fainzilber, M. Compartmentalized signaling in neurons: from cell biology to neuroscience. Neuron. 96 (3), 667-679 (2017).
  24. Abouward, R., Schiavo, G. Walking the line: mechanisms underlying directional mRNA transport and localisation in neurons and beyond. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (6), 2665-2681 (2021).
  25. Sleigh, J. N., Rossor, A. M., Fellows, A. D., Tosolini, A. P., Schiavo, G. Axonal transport and neurological disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (12), 691-703 (2019).
  26. Bronfman, F. C., Moya-Alvarado, G. BDNF/TrkB signaling endosomes mediate long-distance dendritic growth by activating CREB/PI3K-mTOR-dependent translation in neuronal cell bodies. BioRxiv. , (2020).
  27. Nagano, S., Araki, T. Axonal Transport and Local Translation of mRNA in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 697973 (2021).
  28. Boecker, C. A., Olenick, M. A., Gallagher, E. R., Ward, M. E., Holzbaur, E. L. F. ToolBox: Live Imaging of intracellular organelle transport in induced pluripotent stem cell-derived neurons. Traffic. 21 (1), 138-155 (2020).
  29. Surana, S., et al. The evolution of the axonal transport toolkit. Traffic. 21 (1), 13-33 (2020).
  30. Sleigh, J. N., Vagnoni, A., Twelvetrees, A. E., Schiavo, G. Methodological advances in imaging intravital axonal transport. F1000Research. 6, 200 (2017).
  31. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  32. Sleigh, J. N., Tosolini, A. P., Schiavo, G. In vivo imaging of anterograde and retrograde axonal transport in rodent peripheral nerves. Methods in Molecular Biology. 2143, 271-292 (2020).
  33. Gibbs, K. L., et al. Inhibiting p38 MAPK alpha rescues axonal retrograde transport defects in a mouse model of ALS. Cell Death & Disease. 9 (6), 596 (2018).
  34. Fellows, A. D., Rhymes, E. R., Gibbs, K. L., Greensmith, L., Schiavo, G. IGF1R regulates retrograde axonal transport of signalling endosomes in motor neurons. EMBO Reports. 21 (3), 49129 (2020).
  35. Bilsland, L. G., Sahai, E., Kelly, G., Golding, M., Greensmith, L., Schiavo, G. Deficits in axonal transport precede ALS symptoms in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (47), 20523-20528 (2010).
  36. Kalinski, A. L., et al. Deacetylation of Miro1 by HDAC6 blocks mitochondrial transport and mediates axon growth inhibition. The Journal of Cell Biology. 218 (6), 1871-1890 (2019).
  37. Bercsenyi, K., et al. Tetanus toxin entry. Nidogens are therapeutic targets for the prevention of tetanus. Science. 346 (6213), 1118-1123 (2014).
  38. Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52 (2), 293-305 (2006).
  39. Debaisieux, S., Encheva, V., Chakravarty, P., Snijders, A. P., Schiavo, G. Analysis of signaling endosome composition and dynamics using SILAC in embryonic stem cell-derived neurons. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 542-557 (2016).
  40. Surana, S., et al. The travel diaries of tetanus and botulinum neurotoxins. Toxicon. 147, 58-67 (2018).
  41. Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Lazo, O. M. The many disguises of the signalling endosome. FEBS Letters. 592 (21), 3615-3632 (2018).
  42. Malik, B., et al. Absence of disturbed axonal transport in spinal and bulbar muscular atrophy. Human Molecular Genetics. 20 (9), 1776-1786 (2011).
  43. Sleigh, J. N., et al. Mice carrying ALS mutant TDP-43, but not mutant FUS, display in vivo defects in axonal transport of signaling endosomes. Cell Reports. 30 (11), 3655-3662 (2020).
  44. Tosolini, A. P., Sleigh, J. N., Surana, S., Rhymes, E. R., Cahalan, S. D., Schiavo, G. modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. BioRxiv. , (2021).
  45. Restani, L., et al. Botulinum neurotoxins A and E undergo retrograde axonal transport in primary motor neurons. PLoS Pathogens. 8 (12), 1003087 (2012).
  46. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52846 (2015).
  47. Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons. Frontiers in Neurology. 4, 58 (2013).
  48. Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport. Neuroscience. 274, 318-330 (2014).
  49. Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal transport of organelles in motor neuron cultures using microfluidic chambers system. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60993 (2020).
  50. Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and analysis of neurofilament transport in excised mouse tibial nerve. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61264 (2020).
  51. Mou, Y., Mukte, S., Chai, E., Dein, J., Li, X. -J. Analyzing mitochondrial transport and morphology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons in hereditary spastic paraplegia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (156), e60548 (2020).
  52. Stoklund Dittlau, K., et al. Generation of human motor units with functional neuromuscular junctions in microfluidic devices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (175), e62959 (2021).
  53. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  54. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  55. Bohnert, S., Schiavo, G. Tetanus toxin is transported in a novel neuronal compartment characterized by a specialized pH regulation. The Journal of Biological Chemistry. 280 (51), 42336-42344 (2005).
  56. Kanai, A., et al. Low-concentration lidocaine rapidly inhibits axonal transport in cultured mouse dorsal root ganglion neurons. Anesthesiology. 95 (3), 675-680 (2001).
  57. Bolea, I., Gan, W. -B., Manfedi, G., Magrané, J. Imaging of mitochondrial dynamics in motor and sensory axons of living mice. Methods in Enzymology. , 97-110 (2014).
  58. Cohen, S., Valm, A. M., Lippincott-Schwartz, J. Multispectral live-cell imaging. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 46 (2018).
  59. Blum, J. A., et al. Single-cell transcriptomic analysis of the adult mouse spinal cord reveals molecular diversity of autonomic and skeletal motor neurons. Nature Neuroscience. 24 (4), 572-583 (2021).
  60. Xu, J., et al. An approach to maximize retrograde transport based on the spatial distribution of motor endplates in mouse hindlimb muscles. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 707982 (2021).
  61. Wang, T., et al. Flux of signalling endosomes undergoing axonal retrograde transport is encoded by presynaptic activity and TrkB. Nature Communications. 7, 12976 (2016).
  62. Chen, C. S., Chen, W. N., Zhou, M., Arttamangkul, S., Haugland, R. P. Probing the cathepsin D using a BODIPY FL-pepstatin A: applications in fluorescence polarization and microscopy. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 42 (3), 137-151 (2000).
  63. Cederholm, J. M. E., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hearing Research. 292 (1-2), 71-79 (2012).
  64. Michelson, N. J., Kozai, T. D. Y. Isoflurane and ketamine differentially influence spontaneous and evoked laminar electrophysiology in mouse V1. Journal of Neurophysiology. 120 (5), 2232-2245 (2018).
  65. Knabbe, J., Nassal, J. P., Verhage, M., Kuner, T. Secretory vesicle trafficking in awake and anaesthetized mice: differential speeds in axons versus synapses. The Journal of Physiology. 596 (16), 3759-3773 (2018).
  66. Gong, S., et al. Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs. The Journal of Neuroscience. 27 (37), 9817-9823 (2007).
  67. Arcourt, A., et al. Touch receptor-derived sensory information alleviates acute pain signaling and fine-tunes nociceptive reflex coordination. Neuron. 93 (1), 179-193 (2017).
  68. Valny, M., Honsa, P., Kirdajova, D., Kamenik, Z., Anderova, M. Tamoxifen in the mouse brain: implications for fate-mapping studies using the tamoxifen-inducible Cre-loxP system. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 243 (2016).
  69. Hayashi, A., et al. A double-transgenic mouse used to track migrating Schwann cells and regenerating axons following engraftment of injured nerves. Experimental Neurology. 207 (1), 128-138 (2007).
  70. Chen, B., Chen, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. -P. Analysis of schwann cell migration and axon regeneration following nerve injury in the sciatic nerve bridge. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 308 (2019).
  71. Barrasso, A. P., Tong, X., Poché, R. A. The mito::mKate2 mouse: A far-red fluorescent reporter mouse line for tracking mitochondrial dynamics in vivo. Genesis. 56 (2), (2018).
  72. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  73. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. The Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
  74. Cheng, X. -T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. The Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  75. Cioni, J. -M., Lin, J. Q., et al. Late Endosomes Act as mRNA Translation Platforms and Sustain Mitochondria in Axons. Cell. 176 (12), 56 (2019).
  76. Liao, Y. -C., Fernandopulle, M. S., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179 (1), (2019).

Tags

Nörobilim Sayı 178
Aksonal Taşımacılığın <em>In Vivo</em> Görüntülemesi için Araç Kitinin Genişletilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tosolini, A. P., Villarroel-Campos,… More

Tosolini, A. P., Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport. J. Vis. Exp. (178), e63471, doi:10.3791/63471 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter