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Neuroscience

चिकन हैचलिंग में श्रवण Brainstem प्रतिक्रिया का मूल्यांकन

Published: April 1, 2022 doi: 10.3791/63477
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3
1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

Summary

हमने मानक श्रवण ब्रेनस्टेम प्रतिक्रिया (एबीआर) तकनीकों का उपयोग किया है और उन्हें हैचलिंग मुर्गियों पर लागू किया है, जो श्रवण कार्य के लिए एक पूर्वव्यापी एवियन मॉडल है। प्रोटोकॉल पशु तैयारी और एबीआर अधिग्रहण तकनीकों को विस्तार से रेखांकित करता है, उन चरणों के साथ जो अन्य एवियन या कृंतक मॉडल में अनुवाद कर सकते हैं।

Abstract

श्रवण brainstem प्रतिक्रिया (ABR) नैदानिक ऑडियोलॉजी, गैर मानव जानवरों, और मानव अनुसंधान में एक अमूल्य परख है. श्रवण तंत्रिका समकालिकता को मापने और अन्य कशेरुक मॉडल प्रणालियों में सुनवाई संवेदनशीलता का अनुमान लगाने में एबीएस के व्यापक उपयोग के बावजूद, चिकन में एबर रिकॉर्ड करने के तरीकों को लगभग चार दशकों में रिपोर्ट नहीं किया गया है। मुर्गियां एक मजबूत पशु अनुसंधान मॉडल प्रदान करती हैं क्योंकि उनकी श्रवण प्रणाली देर से भ्रूण और शुरुआती हैचलिंग चरणों के दौरान कार्यात्मक परिपक्वता के पास होती है। हमने चिकन हैचलिंग में सबडर्मल सुई इलेक्ट्रोड सरणियों का उपयोग करके एक या दो-चैनल एबीआर रिकॉर्डिंग को प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों का प्रदर्शन किया है। इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग कॉन्फ़िगरेशन (यानी, असेंबल) के बावजूद, एबीआर रिकॉर्डिंग में एक सुपरथ्रेशोल्ड क्लिक उत्तेजना के पहले 6 एमएस के भीतर 3-4 सकारात्मक-जा रहे पीक वेवफॉर्म शामिल थे। पीक-टू-गर्त तरंग आयाम उच्च-तीव्रता के स्तर पर 2-11 μV से लेकर, सकारात्मक चोटियों के साथ अपेक्षित विलंबता-तीव्रता कार्यों को प्रदर्शित करते हैं (यानी, कम तीव्रता के कार्य के रूप में विलंबता में वृद्धि)। मानकीकृत इयरफोन की स्थिति इष्टतम रिकॉर्डिंग के लिए महत्वपूर्ण थी क्योंकि ढीली त्वचा कान नहर को रोक सकती है, और पशु आंदोलन उत्तेजना ट्रांसड्यूसर को हटा सकता है। पीक आयाम छोटे थे, और लेटेंसी लंबे समय तक थे क्योंकि पशु शरीर का तापमान कम हो गया था, जो शारीरिक शरीर के तापमान को बनाए रखने की आवश्यकता का समर्थन करता था। युवा हैचलिंग्स (<3 ज पोस्ट-हैच डे 1) के लिए, थ्रेसहोल्ड को ~ 5 डीबी द्वारा ऊंचा किया गया था, पीक लेटेंसी में ~ 1-2 एमएस की वृद्धि हुई थी, और गर्त आयामों के लिए चोटी को पुराने हैचलिंग की तुलना में ~ 1 μV कम कर दिया गया था। यह एक संभावित प्रवाहकीय-संबंधित मुद्दे (यानी, मध्य कान गुहा में तरल पदार्थ) का सुझाव देता है और युवा हैचलिंग के लिए विचार किया जाना चाहिए। कुल मिलाकर, यहां उल्लिखित एबीआर विधियां चिकन हैचलिंग में इन-विवो श्रवण फ़ंक्शन की सटीक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य रिकॉर्डिंग की अनुमति देती हैं जिन्हें विकास के विभिन्न चरणों में लागू किया जा सकता है। इस तरह के निष्कर्षों को आसानी से सुनवाई हानि, उम्र बढ़ने, या अन्य श्रवण से संबंधित जोड़तोड़ के मानव और स्तनधारी मॉडल की तुलना में किया जाता है।

Introduction

ध्वनि उत्तेजनाओं के लिए उत्पन्न तंत्रिका प्रतिक्रियाओं का अध्ययन आधी सदी1 से अधिक है। श्रवण ब्रेनस्टेम प्रतिक्रिया (एबीआर) एक उत्पन्न क्षमता है जिसका उपयोग दशकों से गैर-मानव जानवरों और मनुष्यों दोनों में श्रवण कार्य के उपाय के रूप में किया गया है। मानव ABR पारंपरिक रूप से रोमन अंकों (I-VII) 2 द्वारा लेबल किए गए पांच से सात तरंग चोटियों के साथ प्रस्तुत करता है। इन चोटियों का विश्लेषण उनकी विलंबता (मिलीसेकंड में घटना का समय) और आयाम (माइक्रोवोल्ट में पीक-टू-गर्त आकार) के आधार पर किया जाता है तंत्रिका प्रतिक्रियाओं का। एबीआर श्रवण तंत्रिका के कार्य और अखंडता के साथ-साथ ब्रेनस्टेम और सुनवाई दहलीज संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। श्रवण प्रणाली में घाटे के परिणामस्वरूप अनुपस्थित, कम, लंबे समय तक, या असामान्य एबीआर लेटेंसी और आयाम होते हैं। उल्लेखनीय रूप से, ये पैरामीटर मनुष्यों और अन्य जानवरों में लगभग समान हैं, जिससे यह कशेरुक मॉडल3 में श्रवण समारोह का एक सुसंगत उद्देश्य परीक्षण है।

ऐसी ही एक मॉडल प्रणाली चिकन है, और यह विभिन्न कारणों से विशेष रूप से उपयोगी है। पक्षियों को altricial या precocial 4 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकताहै। Altricial पक्षियों इंद्रियों अभी भी विकसित हो रही के साथ हैच; उदाहरण के लिए, खलिहान उल्लू चार दिनों के बाद हैच5 तक एक सुसंगत ABR नहीं दिखाते हैं। चिकन की तरह precocious जानवरों के पास परिपक्व इंद्रियों के साथ हैच. सुनवाई की शुरुआत भ्रूण विकास में होती है, जैसे कि हैच (भ्रूण दिवस 21) से पहले के दिनों में, श्रवण प्रणाली कार्यात्मक परिपक्वता 6,7,8 के पास है। Altricial पक्षियों और अधिकांश स्तनधारी मॉडल बाहरी कारकों के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं जो विकास को प्रभावित करते हैं और सुनवाई परिपक्व होने तक पशुपालन की आवश्यकता होती है। चिकन ABRs हैच के रूप में एक ही दिन प्रदर्शन किया जा सकता है, खिला या एक समृद्ध वातावरण की आवश्यकता को छोड़ दिया।

भ्रूण चिकन शरीर विज्ञान और विकास के लिए एक अच्छी तरह से अध्ययन किया गया मॉडल रहा है, विशेष रूप से श्रवण ब्रेनस्टेम में। विशिष्ट संरचनाओं में चिकन कॉकलियर नाभिक शामिल है, जो नाभिक मैग्नोसेलुलरिस (एनएम) और नाभिक एंगुलरिस (एनए) में विभाजित है, और नाभिक लैमिनारिस (एनएल) 6,7 के रूप में जाना जाने वाला औसत दर्जे का बेहतर जैतून का एवियन सहसंबंध है। एबीआर फोरब्रेन और कॉर्टेक्स के स्तर से पहले केंद्रीय श्रवण समारोह पर ध्यान केंद्रित करने के लिए आदर्श है। इन-विवो एबीआर माप और विकास8, फिजियोलॉजी9, टोनोटोपी 10, औरजेनेटिक्स 11,12 के इन-विट्रो न्यूरोनल अध्ययनों के बीच अनुवाद आदर्श अनुसंधान के अवसर प्रदान करता है जो समग्र श्रवण समारोह के अध्ययन का समर्थन करते हैं।

यद्यपि एबीआर का स्तनधारी मॉडल में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, लेकिन एवियन के लिए कम ध्यान केंद्रित किया गया है। पिछले एवियन एबीआर अध्ययनों में बजरीगर 13, कठफोड़वा14, सीगल15, डाइविंग पक्षियों16, ज़ेबरा फिंच17, दैनिक रैप्टर्स18, कैनरी19, उल्लू की तीन प्रजातियां 5,20,21,22 और चिकन 23 के लक्षण वर्णन शामिलहैं। चिकन एबीआर के अंतिम पूरी तरह से लक्षण वर्णन के बाद से लगभग चार दशकों को देखते हुए, पहले उपयोग किए जाने वाले कई उपकरण और तकनीकें बदल गई हैं। अन्य एवियन मॉडल में अध्ययन से अंतर्दृष्टि आधुनिक चिकन एबीआर पद्धति को विकसित करने में मदद कर सकती है, जबकि चिकन एबीआर की तुलना के रूप में भी काम कर सकती है। यह पेपर प्रयोगात्मक सेटअप और डिजाइन को रेखांकित करेगा ताकि हैचलिंग मुर्गियों में एबीआर रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति दी जा सके जिसे विकास के भ्रूण चरणों और अन्य छोटे कृंतक और एवियन मॉडल पर भी लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, चिकन के precocious विकास को देखते हुए, विकासात्मक जोड़तोड़ किसी भी व्यापक पशुपालन के बिना किया जा सकता है। एक विकासशील भ्रूण के लिए जोड़तोड़ का मूल्यांकन केवल कुछ घंटों के बाद किया जा सकता है जब जानवर लगभग परिपक्व सुनवाई क्षमताओं के साथ हैच करता है।

Protocol

यहां वर्णित प्रयोगों को नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड के अनुसार आयोजित किया गया था।

1. चिकन पशुपालन

  1. निषेचित सफेद leghorn चिकन अंडे प्राप्त करें।
    नोट: वैज्ञानिक अनुसंधान में उपयोग की जाने वाली कई चिकन नस्लें हैं, लेकिन यहां दिखाए गए परिणाम सफेद लेगहॉर्न चिकन (गैलस गैलस डोमेस्टिकस) से हैं। जबकि नस्लों के बीच एबीआर परिवर्तनशीलता अज्ञात है, वयस्क अंडे देने वाली मुर्गियों की तुलना मांस-उत्पादक ब्रॉयलर मुर्गियों24,25 से करते समय कुछ अंतर पाए गए हैं।
  2. 38 डिग्री सेल्सियस पर अंडे इनक्यूबेट करें, 50% पर आर्द्रता, वांछित परीक्षण की तारीख से पहले 21 दिनों के लिए।
    नोट: यदि अंडे तुरंत 38 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट नहीं किए जाते हैं, तो उन्हें 14 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, आर्द्रता 40% पर। हालांकि, लंबे अंडे को 14 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है, जितना कम संभावना है कि वे व्यवहार्य हैचलिंग में विकसित होंगे। 7 दिनों के बाद, अंडे की व्यवहार्यता 50% तक कम हो सकती है, यह इस बात पर निर्भर करता है कि अंडे को 14 डिग्री सेल्सियस पर कितने समय तक रखा जाता है। सर्दियों के महीनों में अंडे की व्यवहार्यता भी गिर जाएगी।
  3. समय-समय पर अंडे को दिन में 2-3 बार घुमाएं। अधिकांश इनक्यूबेटरों में इसे स्वचालित रूप से करने के लिए एक तंत्र होता है।
  4. यदि एक स्टायरोफोम इनक्यूबेटर या 6 से अधिक अंडे रखने वाले इनक्यूबेटर का उपयोग कर रहे हैं, तो अंडे को हैच, भ्रूण दिवस 20 (ई 20) से एक दिन पहले एक छोटे से 38 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। अंडे को इनक्यूबेटर में सेट होने के बाद 21 दिनों (E21) को हैच करना चाहिए।
    नोट: हैचिंग प्रक्रिया में, जानवर अंडे से बाहर "पीपिंग" शुरू कर देगा, जिससे एक छोटा सा छेद बन जाएगा जो अंततः पूरे अंडे के चारों ओर जाता है। यदि स्थितियां बहुत सूखी हैं, तो अंडा सूख सकता है, और जानवर हैच करने में असमर्थ होगा। आर्द्रता को लगभग 50% रखा जाना चाहिए, अंडे की हैचिंग व्यवहार्यता 26,27,28,29 पर पिछले अध्ययनों के आधार पर।
  5. जानवर की उम्र निर्धारित करें। यदि हैच को व्यक्तिगत रूप से नहीं देखा जाता है, तो उम्र का एकमात्र संकेत 2-3 घंटे है जो एमनियोटिक द्रव को सूखने के लिए लेता है।
    नोट: हैचलिंग इनक्यूबेटर को 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ दैनिक रूप से अच्छी तरह से साफ किया जाना चाहिए, जो इस बात पर आधारित है कि कितने हैचलिंग संसाधित किए जाते हैं। चिकन हैचलिंग अक्सर इनक्यूबेटर में मल, पंख और एमनियोटिक द्रव छोड़ देते हैं, जो स्थितियों और हवा की गुणवत्ता को दूषित कर सकते हैं।

2. दवा की तैयारी

  1. जानवर को एक बड़ी वजन वाली नाव में रखकर वजन करें। एक सौम्य पर्याप्त प्लेसमेंट के साथ, जानवर को स्थानांतरित नहीं करना चाहिए।
    नोट: द्रव्यमान 30-45 ग्राम से हो सकता है। छोटे जानवर अक्सर जर्दी के भंडार के कारण भारी होते हैं और अभी तक अपशिष्ट को उत्सर्जित नहीं करते हैं। उम्र के 24 घंटे और पी 2 के करीब आने वाले पुराने जानवरों का वजन आमतौर पर कम होता है।
  2. केटामाइन (100 मिलीग्राम / एमएल) और Xylazine (20 मिलीग्राम / एमएल) का एक संवेदनाहारी कॉकटेल तैयार करें जैसे कि खुराक जानवरों के वजन के आधार पर 50 मिलीग्राम / किग्रा केटामाइन और 16.68 मिलीग्राम / किलोग्राम Xylazine है।
    नोट: इस दवा कॉकटेल को केटामाइन (100 मिलीग्राम / एमएल) के 1 एमएल, Xylazine (20 मिलीग्राम / एमएल) के 1.5 मिलीलीटर, और एच 2 ओ के2.5एमएल के साथ बनाया जा सकता है एनेस्थेटिक कॉकटेल इंजेक्शन जानवरों के वजन में 30-45 ग्राम रेंज के आधार पर 0.05-0.1 एमएल से लेकर होगा।

3. दवा इंजेक्शन और पशु तैयारी

  1. जानवर को एक हाथ में पकड़ो, पैरों को नीचे पकड़ना सुनिश्चित करें।
  2. जानवर के स्तन की हड्डी के लिए महसूस करें, कील। कील के दोनों ओर स्तन की मांसपेशी होगी।
  3. त्वचा में 5 मिमी घुसने के लिए 29-जी सुई और सिरिंज का उपयोग करें और स्तन की मांसपेशियों में केटामाइन / Xylazine कॉकटेल इंजेक्ट करें। जानवरों के वजन के आधार पर 0.05-0.1 मिलीलीटर के बीच इंजेक्ट करें।
  4. इंजेक्शन के बाद जानवर को इन्क्यूबेटर में वापस रखें। कुछ मिनटों के लिए पशु शरीर के तापमान को बनाए रखें क्योंकि एनेस्थेटिक प्रभावी होता है।
    1. जानवर के पैर की अंगुली को चुटकी लेने के लिए संदंश का उपयोग करें और जांचें कि गर्दन लंगड़ा है या नहीं। यदि कोई पलटा और लंगड़ा गर्दन नहीं है, तो जानवर बेहोश है।
  5. अपने पंख पंखों का उपयोग करके चिकन के लिंग का निर्धारण करें। यदि पंख सभी समान लंबाई के हैं, तो जानवर नर है। यदि पंख लंबाई में भिन्न होते हैं, तो जानवर मादा30 है।
    नोट: जानवर को सेक्स करने का एक और तरीका वेंटिंग है। पुरुष जननांग ों को क्लोका31 में देखा जा सकता है। यह विधि बहुत कठिन है और सही ढंग से नहीं किए जाने पर जानवर को नुकसान पहुंचा सकती है। पंख पंख विधि का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  6. सिर और गर्दन क्षेत्र के लिए एक कपास टिप applicator के साथ depilatory क्रीम लागू होते हैं, विशेष रूप से पक्षी के लिए कान खोलने के पास।
  7. पंखों को पोंछने के लिए 70% आइसोप्रोपाइल अल्कोहल वाइप्स का उपयोग करें, किसी भी शेष डिपिलेटरी क्रीम, और सिर और गर्दन पर त्वचा।
  8. सबडर्मल इलेक्ट्रोड और रेक्टल जांच को निष्फल करने के लिए 70% आइसोप्रोपाइल अल्कोहल वाइप का उपयोग करें।
  9. जानवर को एक ध्वनि अलगाव और विद्युत रूप से परिरक्षित कक्ष में रखें। सुनिश्चित करें कि पर्यावरण में सबसे अच्छी रिकॉर्डिंग के लिए न्यूनतम विद्युत और ध्वनिक शोर है।
    नोट: यहाँ प्रयोगों को 24 x 24 x 25 इंच को मापने वाले एक कस्टम ध्वनि पृथक बाड़े में किया गया था। कोई भी कक्ष या कमरा जो ध्वनिक शोर को समाप्त करता है, साथ ही साथ वैकल्पिक विद्युत प्रवाह (संयुक्त राज्य अमेरिका में 60 हर्ट्ज) से विद्युत शोर, पर्याप्त है।
  10. पशु शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए हीटिंग पैड या तापमान नियंत्रण प्रणाली का उपयोग करें।
  11. यह सुनिश्चित करने के लिए स्नेहक मलाशय जांच डालें कि जानवर का तापमान 37-41 डिग्री सेल्सियस (98.6-105 डिग्री फारेनहाइट) 32,33 के बीच बनाए रखा जाए।
    नोट:: यदि जांच एक गलत आकार है, तो जानवर तापमान जांच के शीर्ष पर रख सकते हैं।
  12. अवांछित आंदोलन से बचने के लिए जानवर के सिर को जगह में ठीक करें या किसी वस्तु के खिलाफ चोंच को आराम दें। यह मॉडलिंग मिट्टी के साथ किया जा सकता है यदि श्वास बाधित नहीं है।
  13. एनेस्थेटिक कॉकटेल का एक पूरक इंजेक्शन प्रशासित करें जो मूल खुराक का आधा है यदि जानवर परीक्षण के दौरान चेतना हासिल करना शुरू कर देता है।
    नोट: किसी भी शरीर आंदोलन या vocalization एक संकेत है कि एक पूरक खुराक प्रशासित किया जाना चाहिए। छोटी चोंच आंदोलनों साँस लेने का संकेत देते हैं और स्वीकार्य हैं।

4. इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट

  1. निम्नलिखित पदनामों के साथ तीन स्टेनलेस स्टील, सिल्वर क्लोराइड सुई इलेक्ट्रोड का उपयोग करें: संदर्भ इलेक्ट्रोड, सक्रिय इलेक्ट्रोड, और आम जमीन इलेक्ट्रोड।
    नोट:: संदर्भ इलेक्ट्रोड को उलटा या "-" के रूप में भी संदर्भित किया जाता है। सक्रिय इलेक्ट्रोड को noninverting या "+" के रूप में भी जाना जाता है।
  2. प्रत्येक इलेक्ट्रोड उप-डर्मली को सिर में 2-3 मिमी रखें, लेकिन खोपड़ी में प्रवेश करने के लिए पर्याप्त गहरा नहीं है। उन इलेक्ट्रोड का उपयोग करें जो लंबाई में 7 मिमी और व्यास में 0.4 मिमी हैं।
  3. त्वचा से इलेक्ट्रोड को बाहर निकालें, टिप को उजागर करें। यह त्वचा के साथ संपर्क को कम करने और जानवरों में लगातार सम्मिलन गहराई सुनिश्चित करने में मदद करताहै।
    नोट: इलेक्ट्रोड तार में पर्याप्त सुस्ती होनी चाहिए जैसे कि इलेक्ट्रोड रखने के बाद, कोई तनाव नहीं है जो इसे बाहर निकाल देगा या त्वचा को तना हुआ खींच लेगा।
  4. एकल-चैनल रिकॉर्डिंग के लिए, मध्यरेखा पर खोपड़ी के ऊपर सक्रिय इलेक्ट्रोड रखें, जहां तक कान नहर के रूप में कुडल।
    1. कान के पीछे संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें जहां उत्तेजना वितरित की जाएगी, और गर्दन में contralateral कान नहर के पीछे जमीन इलेक्ट्रोड रखें।
      नोट: यदि जानवर की खोपड़ी या कान नहर पर सर्जरी कर रहे हैं, तो जानवर की मध्यरेखा पर गर्दन में संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें। यह और चरण 4.4.1 दोनों को क्षैतिज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग montages माना जाता है।
  5. दो-चैनल रिकॉर्डिंग के लिए, दो नकारात्मक इलेक्ट्रोड और एक संयुक्त सकारात्मक इलेक्ट्रोड का उपयोग करें जिसके लिए एक एडाप्टर केबल की आवश्यकता होती है। जमीन इलेक्ट्रोड subdermally गर्दन में और प्रत्येक कान नहर के पीछे एक संदर्भ इलेक्ट्रोड रखें।
  6. इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा की जाँच करें। सुनिश्चित करें कि समग्र इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा 5.0 kΩ से अधिक नहीं है। इंटरइलेक्ट्रोड प्रतिबाधा को 3.0 kΩ से नीचे बनाए रखें।

5. ABR रिकॉर्डिंग

  1. अधिग्रहण हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर के आधार पर, उपयोग की जाने वाली उत्तेजना आवृत्तियों में सही ध्वनि स्तरों के लिए अंशांकन करना सुनिश्चित करें।
    नोट: अंशांकन तकनीक उपकरणके आधार पर भिन्न होगी (चर्चा देखें)। कुछ कार्यक्रमों के लिए, ध्वनि क्षीणन सॉफ्टवेयर के भीतर संपादित किया जा सकता है। अंशांकन प्रक्रियाओं यहाँ प्रदर्शन एक 1/8 इंच बी एंड के 4138 संघनित्र माइक्रोफोन का उपयोग कर एक बंद युग्मक प्रणाली है कि लड़की कान नहर (~ 5 मिमी) अनुमानित के भीतर आवृत्ति उत्तेजनाओं को रिकॉर्ड करने के लिए शामिल हैं। एक चिकन हैचलिंग अंशांकन तालिका एक पूरक तालिका के रूप में प्रदान की जाती है।
  2. ध्वनि ट्रांसड्यूसर उपकरण को जानवर के सक्रिय कान की ओर ले जाएं। कान नहर में 2 मिमी की उथली गहराई पर ध्वनि ट्रांसड्यूसर रखें।
    नोट: ध्वनि ट्रांसड्यूसर के आधार पर, एक प्लास्टिक speculum संलग्न किया जा सकता है और कान नहर में डाला जा सकता है। speculum प्लेसमेंट महत्वपूर्ण है। यदि ध्वनि को नहर की दीवार द्वारा अवरुद्ध किया गया है या कान नहर को बंद कर दिया गया है, तो ABRs अनुपस्थित होंगे या दहलीज में ~ 40 डीबी शिफ्ट के समान होंगे।
  3. परीक्षण के दौरान जानवर की जांच करें कि क्या परिणाम असामान्य या अनुपस्थित दिखते हैं। यदि वे हैं, तो कान नहर में ध्वनि ट्रांसड्यूसर को पुनर्स्थापित करें।
    नोट: चूंकि त्वचा ढीली है और पशु आंदोलन संभव है, इसलिए रिकॉर्डिंग के दौरान स्पेकुलम प्लेसमेंट शिफ्ट हो सकता है। हालांकि, सही संवेदनाहारी इंजेक्शन और जानवर पूरी तरह से बेहोश होने के साथ, रिकॉर्डिंग 30-45 मिनट के लिए निर्बाध हो सकती है।

6. डेटा अधिग्रहण

  1. ध्वनि उत्तेजनाओं को उत्पन्न करने और रिकॉर्ड / एबीआर रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए पर्याप्त उपकरण / सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट:: ABR अधिग्रहण के लिए कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या कस्टम सिस्टम हैं। इन प्रयोगों के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इंटेलिजेंट हियरिंग सिस्टम (आईएचएस) स्मार्टईपी यूएसबी प्लेटफॉर्म का उपयोग किया गया था। रिकॉर्डिंग पैरामीटर में हेरफेर करने की क्षमता महत्वपूर्ण है; इनमें शामिल हैं, लेकिन उत्तेजना तीव्रता, उत्तेजना लंबाई, उत्तेजना आवृत्ति, उत्तेजना प्रस्तुति दर, उच्च पास और कम पास फ़िल्टर, आर्टिफैक्ट अस्वीकृति, स्वीप की संख्या, नमूना दर, लिफाफा आकार, और उत्तेजना ध्रुवीकरण तक सीमित नहीं हैं।
  2. आर्टिफैक्ट अस्वीकृति (एआर) ऊपरी और निचली सीमाओं को ±25 μV पर सेट करें, जैसे कि स्वीप के दौरान पशु आंदोलन या शोर विश्लेषण से उस स्वीप को बाहर कर देगा। परीक्षण की गई आबादी में, कलाकृतियों के कारण कुल स्वीप के 1% से भी कम को अस्वीकार कर दिया गया था।
  3. एक भव्य औसत प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए कम से कम 1024 स्वीप इकट्ठा करें। यह प्रत्येक 512 स्वीप की दो रिकॉर्डिंग में किया जा सकता है। यह भी सुनिश्चित करता है कि प्रतिक्रिया उत्तेजना-उत्पन्न और दोहराने योग्य है।
  4. लाभ को 100,000 पर सेट करें, कम पास फ़िल्टर को 100 हर्ट्ज पर, और उच्च पास फ़िल्टर को 3000 हर्ट्ज पर सेट करें।
    नोट:: कम और उच्च पास फ़िल्टर सेटिंग्स IHS सिस्टम का उपयोग कर रिकॉर्डिंग के लिए इष्टतम थे। इसलिए, ये पैरामीटर अनुशंसाएँ हैं। BIOSIG सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अन्य एवियन प्रजातियों में ABR रिकॉर्डिंग ने 30 और 3000 हर्ट्ज 5,13,14,16,22 के बीच सिग्नल को फ़िल्टर किया।
  5. प्रति सेकंड 10 और 20 उत्तेजनाओं के बीच उत्तेजना प्रस्तुति दर सेट करें। उच्च प्रस्तुति दर ABR पीक विलंबता, विशेष रूप से बाद की चोटियों13 के लिए स्थानांतरित कर देगा। कम प्रस्तुति दर ABR प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय में वृद्धि होगी।
  6. क्लिक उत्तेजना की समय अवधि को 100 μs पर सेट करें.
    1. यदि एक टोन फट उत्तेजना का उपयोग कर रहे हैं, तो वांछित प्रभाव के आधार पर उत्तेजना की आवृत्ति और अवधि को संपादित करें। टोन फट उत्तेजनाओं के लिए 100-4000 हर्ट्ज की एक सीमा का उपयोग किया गया था, हालांकि वयस्क मुर्गियों में व्यवहार सुनवाई की सीमा 2-9000 हर्ट्ज35 से लेकर होती है।
      नोट: आईएचएस सिस्टम में, एक टोन फट उत्तेजना के उदय और गिरावट के समय को केवल तभी संशोधित किया जा सकता है जब वर्णक्रमीय लिफाफा आकार एक ट्रेपोज़ॉइड हो। हालांकि, कोसाइन स्क्वायर और ब्लैकमैन लिफाफे एक पूर्व निर्धारित वृद्धि और गिरावट का समय प्रदान करते हैं जो आमतौर पर पशु एबीआर प्रयोगों में उपयोग किया जाता है। आईएचएस सिस्टम उचित वृद्धि और गिरावट के समय को सुनिश्चित करने के लिए एक टोन फट के वर्णक्रमीय लिफाफे को प्रदर्शित कर सकता है। एक क्लिक उत्तेजना के उदय और गिरावट के समय को आईएचएस में संपादित नहीं किया जा सकता है।
  7. नमूना दर को सर्वोत्तम रिज़ॉल्यूशन डेटा के लिए स्वीकार्य उच्चतम मान (आमतौर पर 40 kHz) पर सेट करें.
    नोट:: IHS सहित कुछ सिस्टम, नमूना बिंदुओं की एक सीमित संख्या का उपयोग करें और रिकॉर्डिंग विंडो की लंबाई बदल जाएगा। एक 40 kHz (25 μs अवधि) नमूना दर केवल एक 12 एमएस रिकॉर्डिंग विंडो के लिए अनुमति दे सकती है, इसलिए एक टोन फट ABR पर कब्जा करने के लिए, एक 20 kHz नमूना दर (50 μs अवधि) का उपयोग 24 एमएस रिकॉर्डिंग विंडो के लिए अनुमति देने के लिए किया गया था। यदि सीधे क्लिक करें और टोन फट ABRs की तुलना करें, एक ही संकल्प को बनाए रखने के लिए नमूना दर स्थिर रखें।
  8. प्रत्यावर्ती करने के लिए उत्तेजना ध्रुवीकरण सेट करें। यह ABR रिकॉर्डिंग से cochlear माइक्रोफोनिक के विज़ुअलाइज़ेशन को खत्म करने के लिए किया जाता है। कॉकलियर माइक्रोफोनिक की कल्पना करने के लिए, उत्तेजना ध्रुवीयता के लिए दुर्लभता या संक्षेपण का उपयोग करें।
    नोट:: उत्तेजनाओं का चयन करते समय कई सेटिंग्स परिवर्तित किया जा सकता है। प्रदान की गई लाभ और फ़िल्टर सेटिंग्स अन्य उपकरण सेटअप के लिए इष्टतम नहीं हो सकती हैं। अधिकांश ABR मशीनों पर फैक्टरी डिफ़ॉल्ट हैचलिंग चिकन में रिकॉर्डिंग के लिए सेट नहीं हैं।
  9. यदि 512 स्वीप रिकॉर्ड करते हैं, तो 1024 स्वीप औसत बनाने के लिए दो अलग-अलग परीक्षणों को संयोजित करें।
  10. एक क्लिक या टोन फट उत्तेजना के लिए, एक suprathreshold तीव्रता पर एक ABR प्राप्त करें।
  11. कम और कम तीव्रता पर रिकॉर्डिंग जारी रखें जब तक कि उत्पन्न प्रतिक्रिया को अब पहचाना नहीं जा सकता है।
  12. एबीआर थ्रेशोल्ड को सबसे कम उत्तेजना तीव्रता के रूप में परिभाषित करें जो एक पता लगाने योग्य प्रतिक्रिया को प्राप्त करता है। सबसे कम उत्तेजना तीव्रता है कि एक पता लगाने योग्य चोटी elicits को प्राप्त करने के लिए 5 dBSPL के चरणों द्वारा उत्तेजना तीव्रता को कम करें।

7. इच्छामृत्यु और प्रयोग अंत

  1. एक बार जब ABRs का अधिग्रहण कर लिया जाता है, तो इच्छामृत्यु समाधान (Pentobarbital Sodium 390 mg/ mL Phenytoin Sodium 50 mg/mL) की अधिक मात्रा (0.1 mL) तैयार करें।
  2. यह पुष्टि करने के लिए कि कोई पलटा नहीं है, एक पैर की अंगुली की चुटकी का उपयोग करने के बाद, 5 मिमी की गहराई पर 29-जी सुई के साथ स्तन की मांसपेशी में इच्छामृत्यु समाधान इंजेक्ट करें। इंजेक्शन तकनीक एनेस्थेटिक इंजेक्शन के समान है।
    नोट: जानवर कुछ मिनटों के बाद समाप्त हो जाएगा। जब तक कोई आंदोलन का पता नहीं चलता है तब तक जानवर में हेरफेर या विच्छेदन न करें। एक वैकल्पिक इच्छामृत्यु तकनीक विंग के नीचे ब्रैचियल नस में एक अंतःशिरा इंजेक्शन करना है।
  3. जैसे ही जानवर रिफ्लेक्सिव नहीं होता है और सांस लेना और दिल की धड़कन बंद हो जाती है, तेजी से तेज कैंची या कतरनी के साथ विघटित हो जाती है।
  4. हीटिंग पैड, रेक्टल प्रोब और सिल्वर क्लोराइड इलेक्ट्रोड को 70% आइसोप्रोपाइल अल्कोहल वाइप्स के साथ साफ करें।
  5. सुनिश्चित करें कि सभी अधिग्रहित निशान सहेजे गए हैं. आगे के विश्लेषण के लिए, फ़ाइलों को .txt फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें जिन्हें नोटपैड में देखा जा सकता है या स्प्रेडशीट में आयात किया जा सकता है।

Representative Results

हैचलिंग लड़कियों के लिए प्रतिनिधि ABR रिकॉर्डिंग
निम्नलिखित प्रतिनिधि और जनसंख्या परिणाम 43 जानवरों में किए गए एबीआर रिकॉर्डिंग से आते हैं। एक suprathreshold क्लिक उत्तेजना (75 dBSPL) के जवाब में, तीन सकारात्मक जा रही चोटियों को लगातार सभी हैचलिंग में देखा गया था। ये चोटियां उत्तेजना की शुरुआत के बाद 6 एमएस के भीतर हुईं। अक्सर, एक चौथा शिखर भी ~ 6 एमएस पर देखा गया था। जबकि पक्षियों में एबीआर चोटियों की पहचान जानवरों के बीच भिन्न होती है (चर्चा देखें), चोटियों को लेबल किया गया था और रोमन अंक तरंगों I-IV के रूप में पहचाना गया था। लेबल चोटियों के साथ एक प्रतिनिधि ABR तरंग चित्र 1A (शीर्ष ट्रेस) में दिखाया गया है। चित्रा 1B प्रतिनिधि ट्रेस में लेबल तरंगों I और III के लिए विलंबता-तीव्रता फ़ंक्शन दिखाता है। वेव मैं चोटी विलंबता उत्तेजना तीव्रता में प्रत्येक 20 डीबी कमी के लिए ~ 0.3 एमएस से वृद्धि हुई. औसतन, तरंगें I-III क्रमशः 1.50 ms (±0.02 ms), 3.00 ms (±0.06 ms) और 4.13 ms (±0.09 ms) पर 75 dBSPL पर हुई (चित्रा 1C)। वेव I और वेव III हमेशा एक विलक्षण शिखर के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं। कभी-कभी वेव II के लिए, कई छोटी चोटियों को 2.5-3.2 एमएस के बीच देखा गया था। प्रत्येक चोटी में एक संबंधित गर्त था, और वेव I का पीक-टू-गर्त आयाम - सभी चोटियों में से सबसे बड़ा - औसत 7 μV और 75 डीबी एसपीएल पर 11 μV के अधिकतम आयाम से संपर्क किया।

सबसे बड़े आयाम के अलावा, चूजा एबीआर के वेव I ने जानवरों के बीच चोटी विलंबता में कम से कम परिवर्तनशीलता के साथ प्रस्तुत किया। इसलिए, इस चोटी का उपयोग सुनवाई थ्रेशोल्ड संवेदनशीलता का अनुमान लगाने के लिए किया गया था। ABR थ्रेसहोल्ड को सबसे कम उत्तेजना तीव्रता के रूप में परिभाषित किया गया था जो एक पहचानयोग्य और दोहराने योग्य तरंग शिखर को प्राप्त करता था। यह व्यक्तिपरक रूप से प्रयोगकर्ता द्वारा निर्धारित किया गया था और थ्रेशोल्ड समझौते के लिए एक दूसरे प्रयोगकर्ता द्वारा क्रॉस-चेक किया गया था। क्लिक उत्तेजनाओं का उपयोग करते समय चोटियों को बेहतर ढंग से परिभाषित और पहचानना आसान था, लेकिन टोन फटने से परिभाषित और पहचानयोग्य चोटियां भी उत्पन्न हुईं जो उत्तेजना आवृत्ति और इसके मापदंडों (चित्रा 1 डी, एन = 4 चूजों) के आधार पर भिन्न होती हैं। क्लिक-evoked ABR थ्रेशोल्ड 1000 हर्ट्ज के अपवाद के साथ, टोन फट उत्पन्न थ्रेशोल्ड से कम था। क्लिक उत्तेजनाओं के लिए थ्रेशोल्ड 10-30 dBSPL के बीच भिन्न था। क्लिक-उत्तेजित एबर जो पहचानयोग्य चोटियों को नहीं दिखाते थे >30 डीबीएसपीएल अक्सर जानवरों के आंदोलन के कारण कान नहर से स्पेकुलम के विघटित होने का परिणाम था।

शरीर के तापमान में कमी से ABR लेटेंसी बढ़ जाती है
तंत्रिका गतिविधि की गति - जैसा कि एक तरंग आयाम (यानी, विलंबता) की चरम घटना द्वारा मापा जाता है - कम शरीर के तापमान36,37 पर कम होने के लिए जाना जाता है। इस घटना को 75 dBSPL क्लिक उत्तेजना का उपयोग करके हैचलिंग चिकन ABRs में देखा गया था। एक प्रतिनिधि ट्रेस चित्र 2A में दिखाया गया है। जैसा कि शरीर का तापमान 39 डिग्री सेल्सियस से कम हो गया, एबीआर चोटियों की विलंबता बाद में समय में हुई, एक ही उत्तेजना तीव्रता स्तर के बावजूद। चित्रा 2B प्रतिनिधि ट्रेस के लिए कम शरीर के तापमान के एक समारोह के रूप में तरंगों I और III की विलंबता को दर्शाता है। कम शरीर के तापमान और वेव I पीक विलंबता (चित्रा 2C, n = 5 लड़कियों) की घटना के बीच एक मजबूत सहसंबंध (R 2 = 0.89) था। ये परिणाम एबीआर रिकॉर्डिंग के दौरान लगभग सामान्य शरीर के तापमान को बनाए रखने की आवश्यकता को दर्शाते हैं। यदि निकट-सामान्य शरीर के तापमान को बनाए नहीं रखा जाता है, तो विलंबता-तीव्रता कार्य और एबीआर के आयाम माप अत्यधिक परिवर्तनशील और अक्सर गलत होते हैं।

प्रारंभिक हैचलिंग में विलंबता और आयाम अंतर
अनुसंधान से पता चला है कि चूजे के लिए सुनवाई की शुरुआत से संबंधित तंत्रिका गतिविधि देर से भ्रूण की उम्र में परिपक्वता के पास है। हालांकि, बहुत शुरुआती हैचलिंग (<3 ज पोस्ट-हैच) के सबसेट के लिए, हमने 75 डीबी एसपीएल क्लिक उत्तेजना के जवाब में एबीआर तरंगों (एन = 4) की एक चोटी की विलंबता शिफ्ट देखी या संभावित क्षमताओं को पहचाना नहीं जा सकता था (एन = 2 चूजे)। 2 युवा हैचलिंग में, कोई टोन फट एबीआर को प्राप्त नहीं किया जा सकता है, और क्लिक थ्रेसहोल्ड को 50 डीबीएसपीएल द्वारा ऊंचा किया गया था। यह एक प्रवाहकीय मुद्दे के कारण हो सकता है जहां अभी भी जानवर के कान नहर / मध्य कान गुहा, या एक अविकसित तंत्रिका घटक में तरल पदार्थ है। स्तनधारी अध्ययनों ने नवजात शिशुओं में38,39 में 50 डीबी के थ्रेशोल्ड शिफ्ट की सूचना दी है। यहां उपयोग किए जाने वाले प्रतिनिधि जानवर >3 घंटे पुराने थे, जो पंखों को सूखने में लगने वाले समय की लंबाई के साथ भी मेल खाते थे। चित्रा 3A युवा (P1, <3 ज पुराना) और पुराने हैचलिंग (P2) से दर्ज ABRs से पता चलता है। विश्लेषण के लिए, केवल 3 युवा हैचलिंग सभी तीन एबीआर चोटियों के साथ प्रस्तुत किए गए हैं। पीक तरंग लेटेंसी काफी लंबे समय तक चली गई थी, और पुराने हैचलिंग (चित्रा 3 बी-सी, क्रमशः) की तुलना में तरंग आयामों को थोड़ा कम कर दिया गया था।

संदर्भ इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट और दो-चैनल ABR रिकॉर्डिंग
चित्रा 4 में, संदर्भ इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट को 2 अलग-अलग स्थानों के बीच संशोधित किया गया था, लेकिन फिर भी तुलनीय एबीआर रिकॉर्डिंग के परिणामस्वरूप। दो संदर्भ इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट के साथ एक ही जानवर में 75 dBSPL क्लिक निशान के बीच एक तुलना पीक-टू-गर्त तरंग आयामों और चोटी तरंग विलंबता (चित्रा 4 ए) में न्यूनतम अंतर दिखाया गया है। मास्टॉइड प्लेसमेंट स्तनधारी एबीआर प्रयोगों की तरह पद्धतिगत रूप से था जो संदर्भ इलेक्ट्रोड को मास्टोइड या पिन्ना पर रखता है। संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए गर्दन प्लेसमेंट का उपयोग करना फायदेमंद होगा यदि हेरफेर या सर्जरी या तो कान पर की गई थी। दिलचस्प बात यह है कि मास्टॉइड प्लेसमेंट (लाल ट्रेस) के लिए वेव II पीक आयाम गर्दन प्लेसमेंट (ब्लैक ट्रेस) के लिए वेव II पीक के बाद 1 एमएस हुआ। इस समय का अंतर संभवतः इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट के सापेक्ष एबीआर तंत्रिका पीढ़ी की साइट (ओं) को दर्शाता है।

दो-चैनल सेटअप का उपयोग करते हुए, एक सक्रिय रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड (हेड प्लेसमेंट के शीर्ष) और दो संदर्भ इलेक्ट्रोड (मास्टॉइड प्लेसमेंट) का उपयोग बाएं और दाएं दोनों कानों (चित्रा 4 बी) के लिए एबर प्राप्त करने के लिए किया गया था। दो कानों के बीच प्रतिक्रियाएं समान थीं, जिसमें ईयरफोन पोजिशनिंग के कारण चोटी के आयामों में मामूली बदलाव होने की संभावना थी। बाएं और दाएं कान दोनों की विलंबता के बराबर होने के कारण हैचलिंग चिकन में दोनों कानों और ब्रेनस्टेम गोलार्धों के समान रूप से स्वस्थ कार्य का समर्थन किया गया। दो चैनल रिकॉर्डिंग असेंबल binaural ABRs के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन वहाँ उन रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक अतिरिक्त विचार होगा.

Figure 1
चित्रा 1: क्लिक करने के लिए हैचलिंग चूजों की प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग- और टोन-उत्तेजित उत्तेजनाओं को उत्तेजित किया गया है। (ए) विभिन्न उत्तेजना तीव्रता स्तरों के एक समारोह के रूप में एक हैचलिंग चूजे (पी 2) से प्रतिनिधि एबीआर रिकॉर्डिंग। माइक्रोवोल्ट (μV) में तीन से चार सकारात्मक चोटियों को 6 एमएस पोस्ट-स्टिमुलस शुरुआत (समय = 0 एमएस) के भीतर पहचाना जा सकता है। रोमन अंकों का उपयोग करके तरंगों की पहचान की गई थी। पीक-टू-गर्त आयाम कम उत्तेजना तीव्रता के स्तर पर कम हो जाते हैं। (बी) (ए) में दिखाए गए प्रतिनिधि ट्रेस के लिए तरंगों I और III की विलंबता-तीव्रता कार्य। केवल इन चोटियों का विश्लेषण किया गया था, क्योंकि वेव II आमतौर पर तीव्रता <45 dBSPL पर नहीं देखा गया था। (C) क्लिक-evoked ABR पीक waveforms (n = 43 लड़कियों) की विलंबता। त्रुटि पट्टियाँ माध्य (SEM) की मानक त्रुटि को निरूपित करती हैं. (घ) तीन अलग-अलग आवृत्तियों पर चार हैचलिंग चूजों के लिए औसत टोन-उत्तेजित एबीर (काले निशान)। लाल निशान = माध्य (SEM) उत्तेजनाओं की मानक त्रुटि = 75 dBSPL। इस और बाद के आंकड़ों में, त्रुटि सलाखों SEM को निरूपित करते हैं, और दाहिना कान उत्तेजना कान था। ( चित्रा 4 बी के लिए अपवाद जहां दोनों कान उत्तेजित थे)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: ABR रिकॉर्डिंग पर शरीर के तापमान का प्रभाव( A) शरीर के तापमान के एक समारोह के रूप में एक हैचलिंग लड़की (P2) से प्रतिनिधि ABR रिकॉर्डिंग। कम शरीर के तापमान के लिए, पीक तरंग लेटेंसी में वृद्धि हुई, जबकि पीक-टू-गर्त आयाम अपेक्षाकृत अपरिवर्तित रहे। (बी) (ए) में दिखाए गए प्रतिनिधि निशान के लिए तरंगों I और III की विलंबता-तापमान समारोह। (C) 5 चूजों के लिए विलंबता और तापमान परिवर्तन के बीच संबंध को दर्शाने वाले जनसंख्या डेटा (पी < 0.01, आर2 = 0.89)। तरंग II और III के लिए एक समान प्रवृत्ति देखी गई थी (डेटा नहीं दिखाया गया है)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: ABR रिकॉर्डिंग पर आयु से संबंधित अंतर( A) P2 (काला ट्रेस) और P1 (<3 h पोस्ट-हैच, लाल ट्रेस) पर एक प्रतिनिधि हैचलिंग लड़की की प्रतिनिधि ABR रिकॉर्डिंग (ओवरलैप्ड) । (बी) उम्र के एक समारोह के रूप में तरंगों I, II, और III के लिए पीक तरंग विलंबता। तरंगों I-III के लिए लेटेंसी उम्र के बीच काफी भिन्न थे (पी < 0.05, एन = 6 चूजों)। (C) उम्र के एक कार्य के रूप में तरंगों I, II और III के पीक-टू-गर्त तरंग आयाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट और दो-चैनल एबीआर रिकॉर्डिंग: (ए) प्रतिनिधि एबीआर रिकॉर्डिंग (ओवरलैप्ड) एक ही हैचलिंग चूजे (पी 2) से गर्दन (काले ट्रेस) या मास्टोइड (लाल ट्रेस) में रखे गए संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ। सक्रिय इलेक्ट्रोड दोनों इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग montages के लिए खोपड़ी की मध्य रेखा पर रखा गया था। तरंगों I और III की विलंबता, और तरंगों I और III का आयाम दोनों स्थितियों में लगभग समान है। वेव II की विलंबता पहले की है, और गर्दन के ऊतकों में रखे गए इलेक्ट्रोड के लिए आयाम बड़ा है। (बी) दो-चैनल रिकॉर्डिंग जबकि अनुक्रमिक रूप से दाएं और बाएं कानों को उत्तेजित करते हैं। प्रतिनिधि ABR रिकॉर्डिंग (ओवरलैप) एक ही हैचलिंग चिक (P2) से संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ बाएं कान (नीले निशान) और दाएं कान (लाल निशान) के mastoid में रखा तीन अलग अलग तीव्रता स्तरों पर. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका: चिकन हैचलिंग अंशांकन तालिका. इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

पक्षियों के श्रवण ब्रेनस्टेम का अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है, और कई संरचनाएं स्तनधारी श्रवण मार्ग के अनुरूप हैं। श्रवण तंत्रिका दो प्रथम-क्रम केंद्रीय नाभिक, कॉकलियर नाभिक मैग्नोसेलुलरिस (एनएम) और एंगुलरिस (एनए) पर उत्तेजक इनपुट प्रदान करती है। एनएम अपने श्रवण लक्ष्य, नाभिक लैमिनारिस (एनएल) 7 के लिए द्विपक्षीय रूप से एक उत्तेजक प्रक्षेपण भेजता है। नाभिक mesencephalicus lateralis, पार्स dorsalis (MLd)40,41 के लिए NL परियोजनाओं. एनएल भी बेहतर ओलिवरी नाभिक (SON) के लिए परियोजनाएं, जो NM, NA और NL42 को प्रतिक्रिया निषेध प्रदान करता है। यह कम श्रवण brainstem microcircuit अति उत्तम रूप से समारोह यह subserves, ध्वनि स्थानीयकरण, और binaural सुनवाई33 के लिए संरक्षित है. पक्षी के ऊपरी श्रवण ब्रेनस्टेम क्षेत्रों में भी स्तनधारी पार्श्व लेमनिस्कस और मध्यस्तिष्क में अवर कोलिकुलस के अनुरूप नाभिक होते हैं। इन समानताओं को देखते हुए, श्रवण मिडब्रेन तक एवियन एबीआर की संरचना सभी कशेरुकियों में तुलनीय है।

जबकि कई एवियन प्रजातियां उत्तेजना की शुरुआत के बाद 6 एमएस के भीतर तीन सकारात्मक चोटियों को दिखाती हैं, केंद्रीय श्रवण संरचनाओं के साथ एबीआर चोटियों के सहसंबंध में कुछ परिवर्तनशीलता होती है। वेव I को परिधीय बेसिलर पैपिला और श्रवण तंत्रिका से पहली तंत्रिका प्रतिक्रिया माना जा सकता है और व्यक्तियों के बीच थोड़ी परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करता है (चित्रा 1 सी)। बाद की तरंग पहचान कम निश्चित है और प्रजातियों के बीच भिन्न हो सकती है। Kuokkanen et al.17 ने हाल ही में निर्धारित किया है कि खलिहान उल्लू के एबीआर की वेव III एनएल द्वारा उत्पन्न होती है; इस प्रकार, यह तर्क देना उचित है कि वेव II कॉकलियर नाभिक20 के एनएम और एनए से उत्पन्न होता है। हालांकि, उल्लू वेव III को उत्तेजना की शुरुआत के बाद 3 एमएस उत्पन्न सकारात्मक चोटी के रूप में परिभाषित किया गया था। यह वेव II से मेल खाती है जैसा कि हैचलिंग चिकन एबीआर में परिभाषित किया गया है। खलिहान उल्लू ABR में, तरंगों I और II को संयुक्त किया गया था।

जबकि हैचलिंग चिकन आमतौर पर 6 एमएस के भीतर तीन चोटियों के साथ प्रस्तुत किया जाता है, एक चौथा शिखर कभी-कभी मनाया जाता था (उदाहरण के लिए, चित्रा 1 ए देखें)। जनसंख्या डेटा, बड़े नमूने का आकार, और अतिरिक्त प्रयोगात्मक प्रतिमानों को चौथी लहर का समर्थन करने के लिए आवश्यक होगा, और कुछ मामलों में, एक पांच-लहर चिकन एबीआर। सबसे सुसंगत खोज यहां दिखाए गए तीन शिखर प्रतिनिधित्व थे।

चूंकि एबीआर को तंत्रिका समकालिकता के उपाय के रूप में परिभाषित किया गया है, इसलिए श्रवण मार्ग में प्रमुख नाभिक एबीआर में प्रत्येक सकारात्मक-जा रहे शिखर का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। श्रवण तंत्रिका से एनएम / एनए और फिर एनएल को गुजरने वाला संकेत क्रमशः हैचलिंग चिकन एबीआर में तरंगों I, II और III को परिभाषित कर सकता है। इसके अतिरिक्त, चिकन एबीआर की बाद में होने वाली चौथी चोटी एक ऊपरी ब्रेनस्टेम या मिडब्रेन श्रवण संरचना का प्रतिनिधित्व कर सकती है। एवियन ABRs के लक्षण वर्णन को भी precocial और altricial पक्षियों के बीच अंतर पर विचार करना चाहिए। श्रवण प्रतिक्रियाओं की परिपक्वता प्रजातियों के बीच भिन्न होगी और शिकारी व्यवहार और / या मुखर सीखने जैसे अन्य महत्वपूर्ण लक्षणों से भी प्रभावितहोती है। भले ही, वर्णित तरीकों और तकनीकों को आसानी से विभिन्न प्रकार के एवियन और कशेरुक प्रजातियों पर लागू किया जाता है।

जानवरों के शरीर के तापमान को बनाए रखने के महत्व को चित्र 2 में चित्रित किया गया है। जैसे-जैसे आंतरिक शरीर का तापमान कम हुआ, एबीआर प्रतिक्रियाओं की विलंबता एक ही उत्तेजना तीव्रता स्तर के लिए बढ़ी। यह तब अधिक स्पष्ट होता है जब शरीर का तापमान 32 डिग्री सेल्सियस36,37 से नीचे चला जाता है। एबीआर में लगभग 1 एमएस विलंबता वृद्धि चिकन23 में पहले की रिपोर्ट की तुलना में कम है। हालांकि, कातायामा23 ने 12-दिवसीय पुरानी हैचलिंग का उपयोग किया जिसे ठंडा किया गया था और बाद में 4 घंटे की अवधि में गर्म किया गया था। चित्रा 2 में डेटा 20 मिनट की अवधि में शीतलन प्रक्रिया के दौरान दर्ज किया गया था। सबसे अच्छी गुणवत्ता और सबसे सुसंगत रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए, जानवर के शरीर के तापमान को बनाए रखा जाना चाहिए, और सभी रिकॉर्डिंग जानवरों के बीच एक ही शारीरिक तापमान पर की जानी चाहिए।

एबीआर पर उम्र का प्रभाव मामूली है लेकिन विचार करना महत्वपूर्ण है। जबकि एबीआर की तरंगों I और II की केवल विलंबता काफी अलग थी, यह भाग में है क्योंकि चित्र 3 में केवल तीन युवा हैचलिंग का उपयोग किया गया था; अन्य तीन तीन पहचान योग्य एबीआर चोटियों के साथ मौजूद नहीं थे। ABR आयाम और थ्रेशोल्ड शिफ्ट भी स्पष्ट हो सकता है यदि बड़े नमूना आकार का उपयोग कर या आवृत्ति-विशिष्ट ABRs की तुलना। उम्र से संबंधित यह प्रभाव चिकन के मध्य कान में तरल पदार्थ के कारण हो सकता है। इस तरह के प्रवाहकीय परिवर्तन मानव और अन्य स्तनधारी मॉडल38,39 दोनों के लिए एबीआर थ्रेसहोल्ड में उल्लेखनीय वृद्धि का कारण बनते हैं।

दो अलग-अलग रिकॉर्डिंग montages का उपयोग करते हुए, समान प्रतिक्रियाओं को देखा गया (चित्रा 4 ए)। जबकि सबसे आम असेंबल कान प्राप्त करने वाले उत्तेजना के पीछे संदर्भ इलेक्ट्रोड रखता है, गर्दन के ऊतकों में संदर्भ इलेक्ट्रोड होना उपयोगी हो सकता है यदि एबीआर के साथ सर्जिकल हस्तक्षेप होता है। हालांकि, यदि दो-चैनल एबीआर रिकॉर्डिंग का उपयोग किया जाता है, तो संदर्भ इलेक्ट्रोड को अलग-अलग और सममित रूप से रखा जाना चाहिए, जो गर्दन में संदर्भ इलेक्ट्रोड रखने पर मुश्किल है। संदर्भ इलेक्ट्रोड के लिए मास्टॉइड स्थिति को यथासंभव रिकॉर्डिंग के कई पहलुओं को मानकीकृत करने की सिफारिश की जाती है। दो-चैनल एबीआर रिकॉर्डिंग एक प्रभावी उपकरण है जिसके लिए थोड़ी अतिरिक्त तैयारी की आवश्यकता होती है और इसके परिणामस्वरूप कानों के बीच समान प्रतिक्रियाएं होती हैं। मामूली आयाम अंतर इयरफोन की स्थिति के कारण होने की संभावना थी। दो-चैनल रिकॉर्डिंग एक प्रयोगात्मक रूप से हेरफेर किए गए कान या मस्तिष्क गोलार्ध बनाम नियंत्रण के बीच आसान तुलना के लिए अनुमति देती है। इस सेटअप को binaural ABRs के परीक्षण के लिए भी आवश्यक होगा। चिकन ABR का उपयोग कर भविष्य के प्रयोगों रिकॉर्डिंग विन्यास और montages34 पर पिछले साहित्य को संदर्भित कर सकते हैं.

यह पद्धति कई सीमाओं के साथ आती है। जैसा कि चरण 5.1 में उल्लेख किया गया है, खराब स्पेकुलम प्लेसमेंट प्रतिक्रिया में 40 डीबीएसपीएल शिफ्ट का कारण बन सकता है। यह एक हेरफेर या संशोधित जानवर की गलत व्याख्या का कारण बन सकता है। निम्नलिखित सावधानियों की सिफारिश की जाती है: हेरफेर या उत्परिवर्ती मॉडल के ABRs प्राप्त करने से पहले नियंत्रण डेटा का एक बड़ा नमूना प्राप्त करें। रिकॉर्डिंग के बीच 20 से अधिक dBSPL द्वारा उत्तेजना तीव्रता को कम न करें। यदि आयाम या विलंबता अपेक्षा से अधिक शिफ्ट होती है, तो जानवर और स्पेकुलम स्थिति की जांच करें। परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए उस एबीआर उत्तेजना को दोहराएं। यदि स्पेकुलम स्थानांतरित हो गया है, तो पिछले परीक्षणों को फिर से प्राप्त करें। एक और सीमा ABRs का अंशांकन है। ध्वनि दबाव स्तर को रिकॉर्ड करने के लिए उचित अंशांकन के बिना, जानवर को प्रस्तुत तीव्रता अज्ञात है। ध्वनि आउटपुट को मापते समय, प्रयोगात्मक रिकॉर्डिंग के रूप में एक ही स्पेकुलम का उपयोग करें और एक गुहा के अंदर एक छोटा माइक्रोफोन जो जानवर के कान नहर की लंबाई (~ 5 मिमी) का अनुमान लगाता है। प्रयोगों में उपयोग की जाने वाली समान टोन आवृत्तियों को मापें, क्योंकि अंशांकन आवृत्ति विशिष्ट हैं। हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर सिस्टम दोनों के लिए मैनुअल अंशांकन के लिए निर्देशों के साथ आ सकता है। रैखिक चरण और न्यूनतम चरण फ़िल्टर जैसे अतिरिक्त फ़िल्टर भी हैं, जो क्लिक और टोन बर्स्ट ABRs43 में सुधार कर सकते हैं। इन फिल्टरों का उपयोग वर्तमान अध्ययन में नहीं किया गया था। अतिरिक्त विचार, जैसे कि एक टोन फट वर्णक्रमीय लिफाफे के उदय और पतन के समय को आवृत्ति के एक समारोह के रूप में बदलना या क्लिक उत्तेजनाओं के उदय और गिरावट के समय को बदलना या तो जांच नहीं की गई थी। ये अच्छे भविष्य की जांच हैं एक बार विश्वसनीय और सुसंगत ABRs का अधिग्रहण किया जा सकता है।

अन्य एवियन मॉडल के लिए हैचलिंग चिकन की तुलना आशाजनक है। Budgerigars और पूर्वी चीख-उल्लू भी ABR13,22 के पहले 6 एमएस के भीतर तीन सकारात्मक माइक्रोवोल्ट चोटियों को प्रदर्शित करते हैं। कठफोड़वा की विभिन्न प्रजातियों में, तीन चोटियों को भी देखा जाता है, लेकिन उनकी विलंबता समय में बाद में होती है। इसके अतिरिक्त, कठफोड़वा में सबसे अच्छी आवृत्ति संवेदनशीलता की सीमा 1500 और 4000 हर्ट्ज के बीच है, जो 1000 हर्ट्ज पर चिकन की सबसे अच्छी सीमा से कुछ अधिक है। वयस्क चिकन में, सबसे अच्छी संवेदनशीलता 2000 हर्ट्ज35 पर है, इसलिए उच्च आवृत्तियों की बेहतर सुनवाई हो सकती है क्योंकि चिकन हैचलिंग वयस्कों में विकसित होते हैं। यह विकास पक्षी प्रजातियों के बीच भिन्न होगा, जो जानवर4 के अल्ट्रिशियल या पूर्ववर्ती विकास को ध्यान में रखते हुए।

यहां उल्लिखित प्रयोगात्मक तरीके यह निर्धारित करने में मदद कर सकते हैं कि श्रवण प्रतिक्रियाओं और थ्रेसहोल्ड में किन कारकों से नुकसान या परिवर्तन होता है, साथ ही भ्रूण विकास के विभिन्न चरणों में अध्ययन भी होता है। आनुवांशिक हेरफेर, उम्र बढ़ने, और शोर जोखिम सभी जानवरों और अन्य एवियन मॉडल24,25,44,45 में ज्ञात जोड़तोड़ हैं। इन तरीकों को अब चिकन मॉडल तक बढ़ाया जाना चाहिए कि इन-ओवो इलेक्ट्रोपोरेशन जैसी तकनीकें प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देती हैं जो श्रवण ब्रेनस्टेम 12,46 के एक तरफ फोकल और अस्थायी रूप से नियंत्रित होती हैं। यह आनुवंशिक रूप से हेरफेर किए गए कान से दो-चैनल रिकॉर्डिंग प्रतिमान का उपयोग करके contralateral नियंत्रण कान तक ABRs की सीधी तुलना की अनुमति देता है।

कुल मिलाकर, हैचलिंग मुर्गियों का एबीआर एक उपयोगी शोध विधि है, जो मानव और अन्य स्तनधारी मॉडल में सुनवाई समारोह के उपायों के लगभग समान है। यह एक गैर-इनवेसिव, इन-विवो पद्धति भी है। एनेस्थेटिक इंजेक्शन और कुछ मिलीमीटर के सबडर्मल इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट के अलावा, किसी अन्य शारीरिक हेरफेर की आवश्यकता नहीं है। एक हैचलिंग को सैद्धांतिक रूप से दिनों या हफ्तों के विकास के समय के दौरान कई बार परीक्षण किया जा सकता है यदि उचित वातावरण में रखा जाता है। यह प्रोटोकॉल न केवल हैचलिंग चिकन एबीआर के लिए आवश्यक चरणों और रिकॉर्डिंग मापदंडों को बताता है, बल्कि यह एक एवियन एबीआर की विशेषताओं का प्रस्ताव करता है जो श्रवण ब्रेनस्टेम फ़ंक्शन में आगे के परीक्षण को सूचित कर सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह कार्य NIH/NIDCD R01 DC017167 द्वारा समर्थित है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1/8 inch B&K Microphone Brüel & Kjær 4138 Type 4138-A-015 also works
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box Intelligent Hearing Systems M011110
Custom Sound Isolation Chamber GK Soundbooth Inc N/A Custom built
DC Power Supply CSI/Speco PSV-5
ER3 Insert Earphone Intelligent Hearing Systems M015302 Used as sound transducer
Euthasol Virbac 710101 Controlled Substance; euthanasia solution
Insulin Syringe (29 G) Comfort Point 26028
Ketamine Covetrus 11695-0703-1 Controlled Substance
Power Supply Powervar 93051-55R
Rectal Probe YSI 401 (10-09010) Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor
Subdermal needles Rhythmlink RLSND107-1.5
Temperature Monitor YSI 73ATA 7651 Works with any 400 series rectal probe
Xylazine Anased 59399-110-20 Used with ketamine and water for anesthetic

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References

  1. Wever, E. G., Bray, C. W. Action currents in the auditory nerve in response to acoustical stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 16 (5), 344-350 (1930).
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Ordiway, G., McDonnell, M., Mohan, S., Sanchez, J. T. Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings. J. Vis. Exp. (182), e63477, doi:10.3791/63477 (2022).

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