Summary
Denna artikel beskriver hur man utför in vivo (med hjälp av yt- och nålelektrodmatriser) och ex vivo (med hjälp av en dielektrisk cell) elektrisk impedansmyografi på gnagare gastrocnemius muskel. Det kommer att demonstrera tekniken hos både möss och råttor och detaljera de tillgängliga modifieringarna (dvs. överviktiga djur, valpar).
Abstract
Elektrisk impedansmyografi (EIM) är en bekväm teknik som kan användas i prekliniska och kliniska studier för att bedöma muskelvävnadens hälsa och sjukdom. EIM erhålls genom att applicera en lågintensiv, riktningsfokuserad, elektrisk ström på en muskel av intresse över ett frekvensområde (dvs från 1 kHz till 10 MHz) och registrera de resulterande spänningarna. Från dessa erhålls flera standardimpedanskomponenter, inklusive reaktans, motstånd och fas. Vid ex vivo-mätningar på utskurna muskler kan vävnadens inneboende passiva elektriska egenskaper, nämligen konduktiviteten och den relativa permittiviteten, också beräknas. EIM har använts i stor utsträckning hos djur och människor för att diagnostisera och spåra muskelförändringar i en mängd olika sjukdomar, i samband med enkel disuse atrofi, eller som ett mått på terapeutisk intervention. Kliniskt erbjuder EIM potentialen att spåra sjukdomsprogression över tid och att bedöma effekterna av terapeutiska ingrepp, vilket ger möjlighet att förkorta den kliniska prövningens varaktighet och minska kraven på provstorlek. Eftersom det kan utföras icke-invasivt eller minimalt invasivt i levande djurmodeller såväl som människor, erbjuder EIM potentialen att fungera som ett nytt translationellt verktyg som möjliggör både preklinisk och klinisk utveckling. Den här artikeln innehåller steg-för-steg-instruktioner om hur man utför EIM-mätningar in vivo och ex vivo hos möss och råttor, inklusive metoder för att anpassa teknikerna till specifika förhållanden, till exempel för användning hos ungar eller överviktiga djur.
Introduction
Elektrisk impedansmyografi (EIM) ger en kraftfull metod för att bedöma muskeltillstånd, vilket potentiellt möjliggör diagnos av neuromuskulära störningar, spårning av sjukdomsprogression och bedömning av svar på terapi 1,2,3. Det kan tillämpas analogt på djursjukdomsmodeller och människor, vilket möjliggör relativt sömlös översättning från prekliniska till kliniska studier. EIM-mätningar erhålls enkelt med fyra linjärt placerade elektroder, där de två yttre applicerar en smärtfri, svag elektrisk ström över ett frekvensområde (vanligtvis mellan 1 kHz och cirka 2 MHz) och de två inre som registrerar de resulterande spänningarna1. Från dessa spänningar kan vävnadens impedansegenskaper erhållas, inklusive motståndet (R), ett mått på hur svårt det är för ström att passera genom vävnaden och vävnadens reaktans (X) eller "laddningsbarhet", ett mått relaterat till vävnadens förmåga att lagra laddning (kapacitans). Från reaktansen och motståndet beräknas fasvinkeln (θ) via följande ekvation: 
, vilket ger ett enda summativt impedansmått. Sådana mätningar kan erhållas med användning av vilken multifrekvensbioimpedansanordning som helst. Eftersom myofibrer i huvudsak är långa cylindrar är muskelvävnad också mycket anisotrop, med ström som flyter lättare längs fibrer än över dem 4,5. Således utförs EIM ofta i två riktningar: med matrisen placerad längs fibrerna så att strömmen löper parallellt med dem och över muskeln så att strömmen flyter vinkelrätt mot dem. Vid ex vivo-mätningar, där en känd vävnadsvolym mäts i en impedansmätcell, kan dessutom muskelns inneboende elektriska egenskaper (dvs. konduktiviteten och den relativa permittiviteten) härledas6.
Termen "neuromuskulära störningar" definierar ett brett spektrum av primära och sekundära sjukdomar som leder till strukturell muskelförändring och dysfunktion. Detta inkluderar amyotrofisk lateralskleros och olika former av muskeldystrofi, liksom enklare förändringar relaterade till åldrande (t.ex. sarkopeni), disuse atrofi (t.ex. på grund av långvarigt sängstöd eller mikrogravitation) eller till och med skada7. Medan orsakerna är rikliga och kan härröra från motorneuronen, nerverna, neuromuskulära korsningar eller själva muskeln, kan EIM användas för att upptäcka tidiga förändringar i muskler på grund av många av dessa processer och för att spåra progression eller svar på terapi. Till exempel hos patienter med Duchennes muskeldystrofi (DMD) har EIM visat sig detektera sjukdomsprogression och svar på kortikosteroider8. Nyligen utfört arbete har också visat att EIM är känsligt för varierande disuse-tillstånd, inklusive fraktionerad gravitation9, som skulle upplevas på månen eller Mars, och effekterna av åldrande10,11. Slutligen, genom att tillämpa prediktiva och maskininlärningsalgoritmer på datauppsättningen som erhållits med varje mätning (multifrekvens och riktningsberoende data), blir det möjligt att härleda histologiska aspekter av vävnaden, inklusive myofiberstorlek 12,13, inflammatoriska förändringar och ödem14 och bindväv och fettinnehåll 15,16.
Flera andra icke-invasiva eller minimalt invasiva metoder används också för att utvärdera muskelhälsa hos människor och djur, inklusive nålelektromyografi17 och bildteknik som magnetisk resonanstomografi, datortomografi och ultraljud18,19. EIM visar dock tydliga fördelar jämfört med dessa tekniker. Till exempel registrerar elektromyografi endast de aktiva elektriska egenskaperna hos myofibermembranen och inte de passiva egenskaperna, och kan därför inte ge en sann bedömning av muskelsammansättning eller struktur. I ett visst avseende är avbildningsmetoder närmare besläktade med EIM, eftersom de också ger information om vävnadens struktur och sammansättning. Men i någon mening ger de för mycket data, vilket kräver detaljerad bildsegmentering och expertanalys snarare än att bara ge en kvantitativ utgång. Dessutom, med tanke på deras komplexitet, påverkas bildtekniker också i hög grad av detaljerna i både hårdvaran och programvaran som används, vilket helst kräver användning av identiska system så att datamängder kan jämföras. Däremot innebär det faktum att EIM är mycket enklare att det påverkas mindre av dessa tekniska problem och inte kräver någon form av bildbehandling eller expertanalys.
Följande protokoll visar hur man utför in vivo EIM hos råttor och möss, med hjälp av både icke-invasiva (ytmatris) och minimalt invasiva (subdermala nålmatriser) tekniker, samt ex vivo EIM på nyligen utskurna muskler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee of Beth Israel Deaconess Medical Center under protokollnummer (031-2019; 025-2019). Använd rätt PPE-utrustning för att hantera djur och följ IACUC: s riktlinjer för allt djurarbete.
1. In vivo yta EIM
- Placera djuret i en anestesilåda för att inducera anestesi.
OBS: För råttor användes 1,5%-3,5% isofluran och 2O2L·min-1, och för möss användes 2% isofluran och 1O2L·min-1. - När du är helt bedövad, vilket indikeras av frånvaron av svar efter att ha klämt djurets fot, placera musen på bänken i ett benäget läge och använd näskonen för att upprätthålla anestesi med 1,5% isofluran och ett syreflöde på 1 L · min-1.
- Placera djurets ben som ska analyseras i 45 ° vinkel med höftleden (knä utsträckt) och säkra foten med medicinsk tejp.
- Använd en hårklippare för att trimma pälsen som täcker gastrocnemiusmuskeln.
- Applicera ett tjockt lager hårborttagningskräm över djurets hud och låt det sitta i 1 min. Använd sedan saltlösningsmättad gasbindning för att avlägsna hårborttagningsmedlet. Upprepa denna process upp till tre gånger tills all päls som överlagrar gastrocnemiusmuskeln har tagits bort.
OBS: Placera en gasbinda indränkt i saltlösning över huden när mätningar inte förvärvas för att förhindra uttorkning av huden. - Anslut ytuppsättningen (figur 1) till EIM-enheten och låt elektroderna vila på en bit gasväv som blötläggs i saltlösning.
- Placera ytan direkt på huden över gastrocnemiusmuskeln, orienterad i längdriktningen mot muskelfibrerna.
- Efter att ha kontrollerat lämplig kontakt, vilket indikeras av alla staplar som visas grönt på programvaran som visar stabiliteten hos 50 kHz motstånd, reaktans och fasvärden, förvärva EIM-mätningarna.
OBS: Kurvor bör kontrolleras i realtid för att säkerställa korrekt datainsamling. - Rotera ytuppsättningen med 90 ° och placera den på huden över gastrocnemius för att få de tvärgående mätningarna (kontrollera om det finns gröna staplar som indikerar stabiliteten).
- Upprepa steg 1.7, 1.8 och 1.9 för att få totalt fyra mätningar per muskel: två längsgående och två tvärgående.
OBS: Använd inte ett hårborttagningsmedel mer än en gång (dvs. upp till tre applikationer i samma fall) varannan vecka för att förhindra överdriven hudirritation och skada. Det är viktigt att utföra mätningarna inom cirka 5-10 minuter efter att hårborttagningskrämen har tagits bort eftersom utvecklingen av lokaliserat hudödem inducerat av hårborttagningsmedlet kan påverka de insamlade impedansdata. Djuråtervinning sker omedelbart efter avslutad isoflurananestesi och proceduren kräver inte smärtstillande behandling.
2. In vivo nålmatris EIM
- Bedöva djuret och förbered benet med samma procedur som beskrivs i steg 1.1-1.4. Det är dock inte nödvändigt att använda ett hårborttagningsmedel vid utförande av EIM in vivo med hjälp av en nåluppsättning.
- Anslut nålmatrisen (figur 2A-F) till EIM-enheten och låt den vila i en vägningsbåt som innehåller saltlösning. Kontrollera om anslutningen och signalstabiliteten är (indikeras av gröna staplar).
- Desinficera huden och nålarna med alkohol. Placera nåluppsättningen i ett längsgående läge jämfört med myofibrerna och tryck in den ordentligt i huden tills alla nålar tränger in i huden och den underliggande muskeln upp till plastskyddet på matrisen. Hämta data.
- Ta försiktigt bort matrisen och sätt tillbaka den genom huden och in i muskeln i en 90 ° vinkel i förhållande till den första mätningen, i tvärriktningen. Hämta data.
OBS: Vid användning av nålmatriser bör mätningar endast förvärvas en gång i varje riktning för att minska nålelektrodernas inverkan på huden och muskelvävnaden. Om blödning uppstår, torka försiktigt bort blodet innan du utför den andra mätningen. Djuråtervinning sker omedelbart efter avslutad isoflurananestesi och proceduren kräver inte smärtstillande behandling.
3. Ex vivo EIM
- Bered den ex vivo dielektriska cellen (figur 2G,H), tillsätt saltlösning i kammaren och anslut cellen till EIM-anordningen för att erhålla referensvärdena.
OBS: Fas- och reaktansvärdena för saltlösning bör förbli konstanta vid eller nära noll och motståndsvärdena för saltlösning bör förbli konstanta vid cirka 100 ± 25 Ω över frekvensområdet från 1 kHz till 1 MHz. - Avliva djuret enligt respektive IACUC-riktlinjer.
- Skär huden nära hälsenan med en sax. Använd pincett och dra huden i en uppåtgående rörelse för att avslöja de underliggande musklerna och fascian. Dissekera försiktigt ut biceps femoris som överlagrar gastrocnemiusmuskeln och delar ischiasnerven.
- Skär hälsenan för att frigöra den distala änden av gastrocnemius- och soleusmusklerna och dra försiktigt senan uppåt medan du använder sax för att ta bort eventuella fästen. När alla tillbehör har tagits bort, använd sax för att klippa rostraländen av soleusmuskeln och ta bort den.
- Använd sax för att dissekera huvudena på gastrocnemiusmuskeln runt patella.
OBS: Efter avlägsnande av gastrocnemius-muskeln är det viktigt att komma ihåg den ursprungliga orienteringen av myofibrerna. - Placera gastrocnemiusmuskeln på ett ark tandvax och dela den med ett rakblad och en linjal för att få en 10 mm x 10 mm sektion från mitten av gastrocnemiusmuskeln.
OBS: Den dielektriska cellstorleken kan anpassas. För råttor användes en 10 mm x 10 mm cell och för möss användes en 5 mm x 5 mm cell. - Använd pincett, placera försiktigt gastrocnemius i de dielektriska cellerna och se till att fibrerna är orienterade i längdriktningen (dvs kaudala och rostrala extremiteter bör vidröra elektroderna). Se till att muskeln är helt i kontakt med metallelektroderna.
- Fäst den övre delen av den dielektriska cellen och sätt in två monopolnålar (26 G) i de två hålen. Anslut ledningarna från EIM-enheten till ex vivo-cellen i följande ordning: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, där I representerar strömelektroderna och V representerar spänningselektroderna). Skaffa den längsgående mätningen.
- Öppna den dielektriska cellen och omorientera muskeln i tvärriktningen genom att rotera den 90 °. Sätt tillbaka toppen av den dielektriska cellen. Skaffa den tvärgående mätningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EIM kan erhållas under många förhållanden, inklusive yt-in vivo-matriser (figur 1), nålar in vivo-matriser (figur 2A-F) och ex vivo-dielektriska celler (figur 2G,H).
EIM ger en nästan omedelbar ögonblicksbild av muskeltillståndet baserat på de uppmätta impedansvärdena. Mätningar förvärvas snabbt och resulterar i en enkel utdatafil som inte kräver någon speciell programvara (figur 3A). Faktum är att alla multifrekvensimpedansanordningar som tillhandahåller data för enskilda frekvenser kommer att kunna producera en standard .csv utgång som kan öppnas oberoende. Systemet som beskrivs i detta protokoll ger också experimentets namn och villkor, med värden på fas, reaktans och motstånd för varje försök vid varje uppmätt frekvens, inom utdatafilen. För att säkerställa reproducerbarhet erhålls och beräknas i allmänhet två försök med longitudinella (försök 1 och 3) och tvärgående (försök 2 och 4) värden och används för alla efterföljande analyser.
När EIM-värden visas som en frekvensfunktion resulterar de i standardkurvor som kan analyseras för att identifiera falska eller artefaktförorenade data. Sådana oegentligheter är vanligtvis relaterade till kontaktproblem vid ytmätningar, vilket resulterar i extrema värden som observeras vid låga frekvenser (vanligtvis stora positiva eller negativa värden). Representativa kurvor visas för fas (figur 3B), reaktans (figur 3C) och motstånd (figur 3D) för längsgående (blå cirklar) och tvärgående (grå fyrkanter). En graf som visar reaktansen som en funktion av motstånd (Cole-Cole-diagram) i både längsgående och tvärgående riktningar visas också (figur 3E). Det här steget är viktigt eftersom det är en del av datakontrollen, vilket möjliggör enkel identifiering av falska eller artefaktförorenade data. Om överdriven artefakt (vanligtvis på grund av dålig kontakt mellan ytuppsättningen och huden) detekteras, kan flera procedurer följas för att förbättra kontakten. Dessa inkluderar applicering av en ytterligare applicering av hårborttagningskräm, fuktar huden i ca 1 min med en saltlösning blöt gasväv eller applicerar försiktigt tryck på elektroduppsättningen. I allmänhet kommer den enkla processen att upprepa mätningen flera gånger också att hjälpa till att lösa detta.
EIM-mätningar återspeglar muskelvävnadens svar på elektrisk ström över ett brett spektrum av frekvenser, var och en inriktad på olika strukturer. Till exempel tränger låga frekvenser (dvs 5 kHz) inte in i myofibermembranet, vilket ger en analys av de extracellulära egenskaperna som kan användas för att detektera inflammation och neutrofil infiltration14. Däremot kan höga frekvenser (>1 MHz) tränga igenom cellmembran och därför förhöra både intracellulära och extracellulära utrymmen och har använts för att differentiera muskelfiber typ1.
Bild 1: 3D-utskriven ytmatris. Fotografier av en ytmatris som 3D-printades för att erhålla ytimpedansmätningar (både längsgående och tvärgående) hos möss in vivo. (A) Ett fotografi som visar ytmatrisen som är ansluten till förvärvsenheten. (B) En närbild av ytmatrisen som visar det hjul som används för att vrida matrisen till 90° för att få både längsgående och tvärgående mätningar. (C) En närbild av ytelektroderna. Ytelektroderna har följande egenskaper: elektrodbredd = 0,5 mm, yttre elektrodlängd = 4 mm, inre elektrodlängd = 3 mm och avstånd mellan elektroder = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Andra matriser som kan användas för att hantera specifika experimentella konstruktioner. Fotografier av: (A) en nåluppsättning som används för råttor och belagd (med icke-metallisk nagellack) för att minska bidraget från subkutant fett (2 mm utrymme, 4 mm djupt, 2 mm beläggning); B) En nålställning med 2 mm avstånd och 4 mm djup. C) En nåluppsättning med 2 mm avstånd och 3 mm djup. D) En nåluppsättning med 2 mm avstånd och 2 mm djup. E) En nåluppsättning för mindre djur och ungar med 1 mm avstånd och 2 mm djup. F) En nålmatris med 1 mm avstånd och 1 mm djup. G) En dielektrisk cell ex vivo som är skräddarsydd för vuxna musmuskler (5 mm x 5 mm). och (H) en ex vivo dielektrisk cell skräddarsydd för råttmuskler (10 mm x 10 mm). Modifieringar (resultat som inte presenteras här) för att få mätningar på överviktiga djur (dvs. ob / ob eller db / db-möss) kan utföras genom att öka nållängden, lägga till icke-ledande beläggning och öka / minska nålavståndet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Datautdata och representativa kurvor som erhållits hos möss med in vivo-yt-EIM i längsgående (blå) och tvärgående (grå) riktning. (A) Utdatafil i .csv format som erhållits efter förvärv av två längsgående (mätningarna 1 och 3, färgade i blått) och två tvärgående (mätningarna 2 och 4, färgade i grått) EIM-mätningar in vivo . Värdena anges för varje frekvens (kolumn A). Analyser utförs därefter med hjälp av medelvärdet av de längsgående respektive tvärgående mätningarna. Information som finns i cellerna A1:B4 fylls i automatiskt av programvaran, enligt de etiketter som valdes vid EIM-förvärvet. Representativa kurvor för både längsgående (blå cirklar) och tvärgående (grå kvadrater) värden för fas (B), reaktans (C) och motstånd (D) som en funktion av frekvensen. I överensstämmelse med standardpraxis i impedansfältet indikeras x-axeln med hjälp av en logaritmisk skala. (E) Representativa reaktanskurvor som en funktion av resistans för både längsgående och tvärgående mätningar. LP: längsgående fas; TP: tvärgående fas; LX: longitudinell reaktans; TX: tvärgående reaktans; LR: longitudinellt motstånd; och TR: tvärgående motstånd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel innehåller de grundläggande metoderna för att utföra EIM hos gnagare, både in vivo och ex vivo. För att få tillförlitliga mätningar är det viktigt att utföra en serie steg. Först måste man korrekt identifiera muskeln av intresse, eftersom varje muskel kommer att ha olika svar på sjukdomar, behandling och patologi. Man måste vara medveten om att data som förvärvats på en muskel (t.ex. gastrocnemius) inte kommer att ge samma information som på en annan muskel (t.ex. tibialis anterior). För det andra måste man noggrant välja den bästa elektroduppsättningen för att utföra impedansmätningarna. Även om varje arraytyp har både fördelar och nackdelar, är det viktigt att välja en array som passar den experimentella designen samtidigt som man tar hänsyn till sjukdomsprogression och effekten på anatomi (t.ex. svår atrofi). Slutligen tillåter EIM utredare att samla in en otrolig mängd data på några sekunder, men kvalitetskontroll måste utföras korrekt för att säkerställa frånvaron av artefakter.
EIM-systemet är mycket anpassningsbart på flera nivåer. Medan systemet som används här har utformats för klinisk och preklinisk datainsamling, kan alla multifrekvensimpedansmätningssystem användas för detta ändamål, så länge det tillhandahåller individuella frekvensdata. I allmänhet tillhandahåller impedanssystem en standard .csv fil som utdata. På samma sätt kan ytterligare modifieringar göras angående matriserna, eftersom allt som verkligen krävs är fyra elektroder placerade i en linje. I detta protokoll har till exempel en mängd skräddarsydda elektroder använts för att uppfylla kraven, men matriser kan skräddarsys efter individuella behov med hjälp av enkla (t.ex. epoxilim, subdermala nålar) eller komplexa (t.ex. 3D-skrivare) verktyg. Alternativt kan de fyra elektroderna kombineras till en enda nål, som tidigare beskrivits20. I vårt laboratorium har matriser utvecklats för valpar genom att minska avståndet mellan elektroder för att säkerställa att små muskler kan mätas i både längsgående och tvärgående riktningar. Vid arbete med överviktiga djur, som har ett betydligt större lager av subkutant fett, rekommenderas användning av delvis belagda nålelektroder. Detta möjliggör ett större bidrag från muskelvävnaden till impedansmätningen samtidigt som bidraget från fettvävnaden21 minskar.
Medan nålmetoder och ytmetoder kan användas hos både råttor och möss, som beskrivs och demonstreras, rekommenderas det i allmänhet att använda nålmätningarna hos råttor, eftersom dessa är snabbare eftersom de inte kräver ansträngning för att förbereda huden. Dessutom innebär deras större storlek att nålelektroderna endast skadar muskeln minimalt. Hos möss, med tanke på deras lilla storlek, rekommenderas ytmätningar för att undvika muskelskada och med tanke på att hudberedningen är relativt enkel och snabb.
Varje EIM-teknik har sin egen uppsättning begränsningar. En viktig begränsning är att elektrodmatriser inte är lätt tillgängliga via leverantörer, utan istället kräver anpassad generering i laboratoriet. För att hjälpa nya utredare innehåller detta protokoll mätningar för flera matriser (både handgjorda och 3D-utskrivna), och författarna kommer att tillhandahålla anpassade matriser eller göra relaterade CAD-filer tillgängliga på begäran. Som tidigare nämnts är datakvaliteten kritisk och ytterligare problem kan störa datakvaliteten för var och en av mättyperna (t.ex. yta, nål och ex vivo). För bra ytdata är det nödvändigt att ta bort håret helt, och sannolikt också hudens stratum corneum, för att få bästa resultat med minimal kontaktartefakt. Användningen av hårborttagningsmedlet innebär emellertid också att huden långsamt blir edematös med tiden, så det är nödvändigt att snabbt slutföra impedansmätningarna efter hårborttagning. Att vänta 10 min eller längre kan ge väsentligt olika värden jämfört med att utföra mätningarna inom en minut eller två efter hårborttagningen. Nåluppsättningsmätningar hos antingen råttor eller möss kommer vanligtvis att inducera åtminstone en liten mängd blödning, vilket kan påverka avläsningarna om det förvandlas till ett större hematom runt de införda nålarna. Slutligen kräver ex vivo-mätningar särskild försiktighet för att säkerställa att muskelfibrerna i den dielektriska cellen är exakt inriktade i förhållande till metallplattorna. Slutligen, hos små eller sjuka möss, kan det vara omöjligt att få tvärgående mätningar, med tanke på musklernas lilla storlek. Men som nämnts ovan är det fortfarande möjligt att designa anpassade 4-elektrodmatriser som kan vara tillräckligt små för att göra längsgående mätningar inom även de minsta musklerna.
Dataanalys kan hållas ganska enkel - till exempel genom att mäta en enda utgång (t.ex. fas) vid en enda frekvens (t.ex. 50 kHz) i en enda riktning (t.ex. längsgående) - eller ganska komplex, genom att införliva alla impedansparametrar över hela frekvensspektrumet i både längsgående och tvärgående riktningar. När enfrekvensimpedansvärden används ligger de vanligtvis i intervallet 30-100 kHz, eftersom muskler tenderar att vara mest reaktiva (dvs det är mest "laddningsbara") i detta frekvensområde. Kondenserade eller kollapsade parametrar, som försöker fånga formen på frekvensspektrumet, har emellertid också använts. Dessa värden har inkluderat sluttningar av linjära passningar av motstånd, reaktans och fasdata22 och 2-frekvensförhållanden23. Alternativt kan Cole-Cole-parametrar beräknas utifrån passningar av impedansdata, inklusive R0 (bestämning av motståndet vid nollfrekvens), Rinf (bestämning av motståndet vid oändlighetsfrekvens) och fc (centrumfrekvens)24,25,26,27. Slutligen kan maskininlärning användas för att analysera alla data samtidigt och förbättra prediktiva modeller, både för regression12,13,15,16 och klassificering.
Trots dessa begränsningar är EIM ett kraftfullt och relativt enkelt verktyg för att bedöma flera aspekter av muskelhälsa. Medan fokus i detta manuskript ligger på en enda muskel (gastrocnemius), finns det inget som hindrar användningen av EIM på andra ytliga muskler (t.ex. quadriceps eller biceps brachii) med hjälp av ytelektroder eller djupare muskler med hjälp av nålelektroduppsättningen. Hos människor har tekniken faktiskt använts i en mängd olika muskler, inklusive både övre och nedre extremitetsmuskler 8,28, samt axiella muskler (t.ex. paraspinalmuskler och magmuskler)29,30.
Det har visat sig att EIM tillhandahåller tillförlitliga mått avseende sjukdomsprogression, remission av atrofi och behandling över tid. Enfrekvensdata kan vara fullt tillräckliga för att bedöma sjukdomsstatus över tid31. Ändå är värdet av multifrekvensdata att det fortfarande kan hjälpa till att bedöma mätningens kvalitet, som beskrivits ovan. Enfrekventa data isolerat kan vara väsentligt förorenade av kontaktartefakter, och detta skulle inte vara uppenbart utan att granska hela impedansspektrumet. I kliniska studier kan yt-EIM användas ofta för att få smärtfria mätningar vilket gör det till ett enkelt verktyg att applicera32. Detta överflöd av data kan vara avgörande för att mer känsligt spåra sjukdomsprogression. Dessutom kan tillägget av EIM till kliniska protokoll avsevärt minska antalet deltagare som krävs under en klinisk prövning28,31.
EIM finner ökande tillämpning vid bedömning av en mängd olika neuromuskulära tillstånd hos människor. Följaktligen bidrar förmågan att utföra tekniken effektivt hos gnagare till att utöka det potentiella praktiska värdet av tekniken samtidigt som vi förbättrar vår förståelse för förhållandet mellan olika EIM-utgångar och underliggande histologi. Tekniken är i allmänhet enkel att använda och tillsammans med de användbara kvantitativa data som den ger, förtjänar att inkluderas i standardbeväpningen av verktyg för bedömning av nerv- och muskelsjukdomar i modeller för gnagarsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S. B. Rutkove har eget kapital i, och fungerar som konsult och vetenskaplig rådgivare till, Myolex, Inc., ett företag som designar impedansanordningar för klinisk användning och forskningsanvändning, och mView-systemet som används här. Han är också medlem i bolagets styrelse. Bolaget har även option att licensiera patenterad impedansteknik varav S. B. Rutkove är namngiven som uppfinnare. De andra författarna har inga andra relevanta anknytningar eller ekonomiskt engagemang med någon organisation eller enhet med ett ekonomiskt intresse i eller ekonomisk konflikt med ämnet eller materialet som diskuteras i manuskriptet förutom de som avslöjas.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Charley's Fund och NIH R01NS055099.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Formlabs Inc. | Form 2 Desktop | 3D printer |
| 3D Printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD | Creality Ender 3 V2 | 3D printer |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher | 19-027761 and 19-061655 | models 1530-0 and 1530-1 |
| 3M TRANSPORE surgical tape | Fisher | 18-999-380 and 18-999-381 | models 1527-0 and 1527-1 |
| Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing | Digi-Key (Sullins connector solution) | S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) | Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 22-363-172 | |
| Dental Wax | Fisher | NC9377103 | |
| Depilatory agent | NAIR | NA | hair remover lotion with softening baby oil |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | No. 11270-20 | Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm |
| Electronic Digital Caliper | Fisher | 14-648-17 | Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle |
| Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life | Devcon | series 14265, model 2217 | Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Ex vivo dielectric impedance cell | Custom | NA | Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | No. 11051-10 | Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material |
| Hair clipper | Amazon | NA | Wahl professional animal BravMini+ |
| Impedance Animal Device | Myolex | EIM1103 | mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research |
| In vivo needle arrays | Custom | NA | Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory |
| In vivo surface array | Custom | NA | The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supplies | 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) | Pivetal - 250 mL bottle |
| Non-woven gauze | Fisher | 22-028-559 | 2 x 2 inch |
| Polystyrene Weighing Dishes | Fisher | S67090A | Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | No. 91460-11 | Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality |
| Subdermal needles 27 G Neuroline | Ambu | 745 12-50/24 | Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | No. 14002-13 | Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm |
| TECA ELITE monopolar needle electrodes | Natus | 902-DMG50-S | 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub |
| Teknova 0.9% saline solution | Fisher | S5815 | 1000 mL sterile |
References
- Rutkove, S. B., Sanchez, B. Electrical impedance methods in neuromuscular assessment: An overview. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 9 (10), 034405 (2019).
- Rutkove, S. B. Electrical impedance myography: Background, Current State, and Future Directions. Muscle & Nerve. 40, 936-946 (2009).
- Sanchez, B., Rutkove, S. B. Present uses, future applications, and technical underpinnings of electrical impedance myography. Current Neurology and Neuroscience Reports. 17 (11), 86 (2017).
- Garmirian, L. P., Chin, A. B., Rutkove, S. B. Discriminating neurogenic from myopathic disease via measurement of muscle anisotropy. Muscle & Nerve. 39 (1), 16-24 (2009).
- Rutkove, S. B., et al. Loss of electrical anisotropy is an unrecognized feature of dystrophic muscle that may serve as a convenient index of disease status. Clinical Neurophysiology. 127 (12), 3546-3551 (2016).
- Wang, L. L., et al. Assessment of alterations in the electrical impedance of muscle after experimental nerve injury via finite-element analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58 (6), 1585-1591 (2011).
- Katirji, B., Ruff, R. L., Kaminski, H. J. Neuromuscular Disorders in Clinical Practice. , Springer New York. New York, NY. (2014).
- Rutkove, S. B., et al. Electrical impedance myography for assessment of Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 81 (5), 622-632 (2017).
- Semple, C., et al. Using electrical impedance myography as a biomarker of muscle deconditioning in rats exposed to micro- and partial-gravity analogs. Frontiers in Physiology. 11, 557796 (2020).
- Kortman, H. G. J., Wilder, S. C., Geisbush, T. R., Narayanaswami, P., Rutkove, S. B. Age- and gender-associated differences in electrical impedance values of skeletal muscle. Physiological Measurement. 34 (12), 1611-1622 (2013).
- Clark, B. C., Rutkove, S., Lupton, E. C., Padilla, C. J., Arnold, W. D. Potential utility of electrical impedance myography in evaluating age-related skeletal muscle function deficits. Frontiers in Physiology. 12, 666964 (2021).
- Kapur, K., et al. Predicting myofiber size with electrical impedance myography: A study in immature mice. Muscle and Nerve. 58 (1), 106-113 (2018).
- Kapur, K., Nagy, J. A., Taylor, R. S., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Estimating myofiber size with electrical impedance myography: a study in amyotrophic lateral sclerosis mice. Muscle and Nerve. 58 (5), 713-717 (2018).
- Mortreux, M., Semple, C., Riveros, D., Nagy, J. A., Rutkove, S. B. Electrical impedance myography for the detection of muscle inflammation induced by λ-carrageenan. PLoS ONE. 14 (10), 0223265 (2019).
- Pandeya, S. R., et al. Predicting myofiber cross-sectional area and triglyceride content with electrical impedance myography: A study in db/db mice. Muscle and Nerve. 63 (1), 127-140 (2021).
- Pandeya, S. R., et al. Estimating myofiber cross-sectional area and connective tissue deposition with electrical impedance myography: A study in D2-mdx mice. Muscle & Nerve. 63 (6), 941-950 (2021).
- Stålberg, E., et al. Standards for quantification of EMG and neurography. Clinical Neurophysiology. 130 (9), 1688-1729 (2019).
- Theodorou, D. J., Theodorou, S. J., Kakitsubata, Y. Skeletal muscle disease: Patterns of MRI appearances. British Journal of Radiology. 85 (1020), 1298-1308 (2012).
- Simon, N. G., Noto, Y., Zaidman, C. M. Skeletal muscle imaging in neuromuscular disease. Journal of Clinical Neuroscience. 33, 1-10 (2016).
- Kwon, H., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance myography needle electrodes. Physiological Measurement. 38 (9), 1748-1765 (2017).
- Kwon, H., Di Cristina, J. F., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Recording characteristics of electrical impedance-electromyography needle electrodes. Physiological Measurement. 39 (5), 055005 (2018).
- Rutkove, S. B., et al. Characterizing spinal muscular atrophy with electrical impedance myography. Muscle and Nerve. 42 (6), 915-921 (2010).
- Schwartz, S., et al. Optimizing electrical impedance myography measurements by using a multifrequency ratio: A study in Duchenne muscular dystrophy. Clinical Neurophysiology. 126 (1), 202-208 (2015).
- Li, J., Pacheck, A., Sanchez, B., Rutkove, S. B. Single and modeled multifrequency electrical impedance myography parameters and their relationship to force production in the ALS SOD1G93A mouse. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration. 17 (5-6), 397-403 (2016).
- Hu, N., et al. Antisense oligonucleotide and adjuvant exercise therapy reverse fatigue in old mice with myotonic dystrophy. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 23, 393-405 (2021).
- Sanchez, B., et al. Non-invasive assessment of muscle injury in healthy and dystrophic animals with electrical impedance myography. Muscle & Nerve. 56 (6), 85-94 (2017).
- Sanchez, B., Li, J., Bragos, R., Rutkove, S. B. Differentiation of the intracellular structure of slow- versus fast-twitch muscle fibers through evaluation of the dielectric properties of tissue. Physics in Medicine and Biology. 59 (10), 2369-2380 (2014).
- Shefner, J. M., et al. Assessing ALS progression with a dedicated electrical impedance myography system. Amyotrophic Lateral Sclerosis & Frontotemporal Degeneration. 19 (7-8), 555-561 (2018).
- Lungu, C., et al. Quantifying muscle asymmetries in cervical dystonia with electrical impedance: a preliminary assessment. Clinical Neurophysiology. 122 (5), 1027-1031 (2011).
- Wang, Y., et al. Electrical impedance myography for assessing paraspinal muscles of patients with low back pain. Journal of Electrical Bioimpedance. 10 (1), 103-109 (2019).
- Leitner, M. L., et al. Electrical impedance myography for reducing sample size in Duchenne muscular dystrophy trials. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (1), 4-14 (2020).
- Rutkove, S. B., et al. Improved ALS clinical trials through frequent at-home self-assessment: a proof of concept study. Annals of Clinical and Translational Neurology. 7 (7), 1148-1157 (2020).
