Summary
Este artigo detalha como realizar a miografia de impedância elétrica in vivo (usando matrizes de eletrodos de superfície e agulha) e ex vivo (usando uma célula dielétrica) no músculo gastrocnêmio de roedores. Ele demonstrará a técnica em camundongos e ratos e detalhará as modificações disponíveis (ou seja, animais obesos, filhotes).
Abstract
A miografia por impedância elétrica (EIM) é uma técnica conveniente que pode ser usada em estudos pré-clínicos e clínicos para avaliar a saúde e a doença do tecido muscular. O EIM é obtido aplicando uma corrente elétrica de baixa intensidade, direcionalmente focada, a um músculo de interesse em uma faixa de frequências (ou seja, de 1 kHz a 10 MHz) e registrando as tensões resultantes. A partir destes, vários componentes de impedância padrão, incluindo a reatância, resistência e fase, são obtidos. Ao realizar medições ex vivo no músculo excisado, as propriedades elétricas passivas inerentes do tecido, ou seja, a condutividade e a permissividade relativa, também podem ser calculadas. O MEI tem sido amplamente utilizado em animais e humanos para diagnosticar e rastrear alterações musculares em uma variedade de doenças, em relação à atrofia por simples desuso ou como medida de intervenção terapêutica. Clinicamente, o EIM oferece o potencial de rastrear a progressão da doença ao longo do tempo e avaliar o impacto das intervenções terapêuticas, oferecendo assim a oportunidade de encurtar a duração do ensaio clínico e reduzir os requisitos de tamanho da amostra. Como pode ser realizado de forma não invasiva ou minimamente invasiva em modelos animais vivos, bem como em humanos, o EIM oferece o potencial de servir como uma nova ferramenta translacional que permite o desenvolvimento pré-clínico e clínico. Este artigo fornece instruções passo a passo sobre como realizar medições de MEI in vivo e ex vivo em camundongos e ratos, incluindo abordagens para adaptar as técnicas a condições específicas, como para uso em filhotes ou animais obesos.
Introduction
A miografia por impedância elétrica (MEI) fornece um método poderoso para avaliar a condição muscular, potencialmente possibilitando o diagnóstico de distúrbios neuromusculares, o rastreamento da progressão da doença e a avaliação da resposta à terapia 1,2,3. Pode ser aplicado de forma análoga a modelos de doenças animais e humanos, permitindo uma tradução relativamente perfeita de estudos pré-clínicos para clínicos. As medições do EIM são facilmente obtidas usando quatro eletrodos posicionados linearmente, com os dois externos aplicando uma corrente elétrica indolor e fraca em uma faixa de frequências (geralmente entre 1 kHz e aproximadamente 2 MHz), e os dois internos registrando as tensões resultantes1. A partir dessas tensões, as características de impedância do tecido podem ser obtidas, incluindo a resistência (R), uma medida de quão difícil é para a corrente passar através do tecido, e a reatância (X) ou "carregabilidade" do tecido, uma medida relacionada à capacidade do tecido de armazenar carga (capacitância). A partir da reatância e resistência, o ângulo de fase (θ) é calculado através da seguinte equação: 
, fornecendo uma única medida de impedância somativa. Tais medições podem ser obtidas usando qualquer dispositivo de bioimpedância multifreqüência. Como as miofibras são essencialmente cilindros longos, o tecido muscular também é altamente anisotrópico, com corrente fluindo mais facilmente ao longo das fibras do que através delas 4,5. Assim, o EIM é frequentemente realizado em duas direções: com a matriz colocada ao longo das fibras, de modo que a corrente corre paralela a elas, e através do músculo, de modo que a corrente flui perpendicularmente a elas. Além disso, em medições ex vivo, onde um volume conhecido de tecido é medido em uma célula de medição de impedância, as propriedades elétricas inerentes do músculo (ou seja, a condutividade e a permissividade relativa) podem ser derivadas6.
O termo "distúrbios neuromusculares" define uma ampla gama de doenças primárias e secundárias que levam à alteração e disfunção muscular estrutural. Isso inclui esclerose lateral amiotrófica e várias formas de distrofia muscular, bem como alterações mais simples relacionadas ao envelhecimento (por exemplo, sarcopenia), atrofia por desuso (por exemplo, devido a repouso prolongado ou microgravidade) ou mesmo lesão7. Embora as causas sejam abundantes e possam se originar do neurônio motor, nervos, junções neuromusculares ou do próprio músculo, o EIM pode ser usado para detectar alterações precoces no músculo devido a muitos desses processos e para rastrear a progressão ou a resposta à terapia. Por exemplo, em pacientes com distrofia muscular de Duchenne (DMD), a MEI demonstrou detectar a progressão da doença e a resposta aos corticosteroides8. Trabalhos recentes também mostraram que o MEI é sensível a diferentes estados de desuso, incluindo a gravidade fracionada9, como seria experimentado na Lua ou em Marte, e os efeitos do envelhecimento10,11. Por fim, ao aplicar algoritmos preditivos e de machine learning ao conjunto de dados obtidos a cada medida (dados multifrequência e direcionais dependentes), torna-se possível inferir aspectos histológicos do tecido, incluindo tamanho da miofibra 12,13, alterações inflamatórias e edema 14, e tecido conjuntivo e teor de gordura 15,16.
Vários outros métodos não invasivos ou minimamente invasivos também são utilizados para avaliar a saúde muscular em humanos e animais, incluindo eletromiografia por agulha17 e tecnologias de imagem, como ressonância magnética, tomografia computadorizada e ultrassonografia18,19. No entanto, o EIM demonstra benefícios distintos em comparação com essas tecnologias. Por exemplo, a eletromiografia registra apenas as propriedades elétricas ativas das membranas miofibras e não as propriedades passivas e, portanto, não pode fornecer uma avaliação verdadeira da composição ou estrutura muscular. Em certo aspecto, os métodos de imagem estão mais intimamente relacionados com o EIM, pois também fornecem informações sobre a estrutura e a composição do tecido. Mas, em certo sentido, eles fornecem muitos dados, exigindo segmentação detalhada de imagens e análise de especialistas, em vez de apenas fornecer uma saída quantitativa. Além disso, dadas as suas complexidades, as técnicas de imagem também são muito impactadas pelas especificidades do hardware e do software que estão sendo usados, idealmente exigindo o uso de sistemas idênticos para que os conjuntos de dados possam ser comparados. Em contraste, o fato de o EIM ser muito mais simples significa que ele é menos impactado por essas questões técnicas e não requer nenhuma forma de processamento de imagem ou análise especializada.
O protocolo a seguir demonstra como realizar EIM in vivo em ratos e camundongos, usando técnicas não invasivas (matriz de superfície) e minimamente invasivas (matriz de agulhas subdérmicas), bem como EIM ex vivo em músculo recém-excisado.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Beth Israel Deaconess Medical Center sob números de protocolo (031-2019; 025-2019). Use equipamentos de EPI adequados para lidar com animais e siga as diretrizes da IACUC para todo o trabalho com animais.
1. EIM de superfície in vivo
- Coloque o animal em uma caixa de anestesia para induzir a anestesia.
NOTA: Para ratos, foram utilizados isoflurano a 1,5%-3,5% e 2 O 2 L·min-1 e, para camundongos, isoflurano a 2% e 1 O2 L·min-1. - Uma vez totalmente anestesiado, como indicado pela ausência de resposta após beliscar o pé do animal, coloque o rato no banco em decúbito ventral e utilize o cone nasal para manter a anestesia com isoflurano a 1,5% e um fluxo de oxigênio de 1 L·min-1.
- Coloque a perna do animal a ser analisada em um ângulo de 45° com a articulação do quadril (joelho estendido) e prenda o pé com fita adesiva.
- Use um cortador de cabelo para aparar a pele que sobrepõe o músculo gastrocnêmio.
- Aplique uma camada espessa de creme depilatório sobre a pele do animal e deixe-o descansar por 1 min. Em seguida, use gaze saturada de solução salina para remover o agente depilatório. Repita este processo até três vezes até que toda a pele que sobrepõe o músculo gastrocnêmio seja removida.
NOTA: Coloque uma gaze embebida em solução salina sobre a pele quando as medidas não estiverem sendo adquiridas para evitar a desidratação da pele. - Conecte a matriz de superfície (Figura 1) ao dispositivo EIM e deixe os eletrodos descansarem em um pedaço de gaze embebido em solução salina.
- Coloque a matriz de superfície diretamente sobre a pele sobre o músculo gastrocnêmio, orientada longitudinalmente para as fibras musculares.
- Após a verificação do contato apropriado, que é indicado por todas as barras que aparecem em verde no software mostrando a estabilidade dos valores de resistência, reatância e fase de 50 kHz, adquira as medidas do EIM.
NOTA: As curvas devem ser verificadas em tempo real para garantir a aquisição adequada de dados. - Gire a matriz de superfície em 90° e reposicione-a na pele sobre o gastrocnêmio para obter as medidas transversais (verifique se há barras verdes indicando a estabilidade).
- Repita as etapas 1,7, 1,8 e 1,9 para obter um total de quatro medidas por músculo: duas longitudinais e duas transversais.
NOTA: Não use um agente depilatório mais de uma vez (ou seja, até três aplicações no mesmo caso) a cada duas semanas para evitar irritação excessiva da pele e lesões. É importante realizar as medidas dentro de cerca de 5-10 min após a remoção do creme depilatório, uma vez que o desenvolvimento de edema cutâneo localizado induzido pelo agente depilatório pode afetar os dados de impedância coletados. A recuperação animal é imediata após a interrupção da anestesia com isoflurano e o procedimento não requer tratamento analgésico.
2. Matriz de agulhas in vivo EIM
- Anestesiar o animal e preparar a perna utilizando o mesmo procedimento descrito nos passos 1.1-1.4. No entanto, não é necessário usar um agente depilatório ao realizar EIM in vivo usando uma matriz de agulhas.
- Conecte o conjunto de agulhas (Figura 2A-F) ao dispositivo EIM e deixe-o descansar em um barco de pesagem contendo solução salina. Verifique a conectividade e a estabilidade do sinal (indicadas por barras verdes).
- Desinfete a pele e as agulhas com álcool. Coloque a matriz de agulhas em uma posição longitudinal em comparação com as miofibras e pressione-a firmemente na pele até que todas as agulhas penetrem na pele e no músculo subjacente até o protetor de plástico na matriz. Adquira dados.
- Remova suavemente a matriz e reinsira-a através da pele e no músculo em um ângulo de 90° em relação à primeira medição, na direção transversal. Adquira dados.
NOTA: Ao usar matrizes de agulhas, as medições só devem ser adquiridas uma vez em cada direção para reduzir o impacto dos eletrodos da agulha na pele e no tecido muscular. Se ocorrer sangramento, limpe suavemente o sangue antes de realizar a segunda medição. A recuperação animal é imediata após a interrupção da anestesia com isoflurano e o procedimento não requer tratamento analgésico.
3. EIM ex vivo
- Preparar a célula dieléctrica ex vivo (Figura 2G,H), adicionar solução salina à câmara e ligar a célula ao dispositivo EIM para obter os valores de referência.
NOTA: Os valores de fase e reatância da solução salina devem permanecer constantes em ou perto de zero e os valores de resistência da solução salina devem permanecer constantes em aproximadamente 100 ± 25 Ω na faixa de frequência de 1 kHz a 1 MHz. - Eutanasiar o animal de acordo com as respectivas diretrizes da IACUC.
- Usando um par de tesouras, corte a pele perto do tendão de Aquiles. Usando pinças, puxe a pele em um movimento ascendente para revelar os músculos subjacentes e a fáscia. Disseque suavemente o bíceps femoral que recobre o músculo gastrocnêmio e corte o nervo ciático.
- Corte o tendão de Aquiles para liberar a extremidade distal dos músculos gastrocnêmio e sóleo e puxe suavemente o tendão para cima enquanto usa uma tesoura para remover quaisquer acessórios. Uma vez que todos os anexos são removidos, use uma tesoura para cortar a extremidade rostral do músculo sóleo e removê-lo.
- Use uma tesoura para dissecar as cabeças do músculo gastrocnêmio ao redor da patela.
NOTA: Após a remoção do músculo gastrocnêmio, é importante lembrar a orientação original das miofibras. - Coloque o músculo gastrocnêmio em uma folha de cera dentária e separe-o usando uma lâmina de barbear e uma régua para obter uma seção de 10 mm x 10 mm do centro do músculo gastrocnêmio.
NOTA: O tamanho da célula dielétrica pode ser personalizado. Para os ratos, foi utilizada uma célula de 10 mm x 10 mm e, para os camundongos, uma célula de 5 mm x 5 mm. - Usando uma pinça, coloque suavemente o gastrocnêmio nas células dielétricas, certificando-se de que as fibras estejam orientadas longitudinalmente (ou seja, as extremidades caudais e rostral devem estar tocando os eletrodos). Certifique-se de que o músculo está totalmente em contato com os eletrodos de metal.
- Anexe a parte superior da célula dielétrica e insira duas agulhas monopolares (26 G) nos dois orifícios. Conecte os fios do dispositivo EIM à célula ex vivo na seguinte ordem: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, onde I representa os eletrodos de corrente e V representa os eletrodos de tensão). Adquira a medida longitudinal.
- Abra a célula dielétrica e reoriente o músculo na direção transversal, girando-o 90°. Reconecte a parte superior da célula dielétrica. Adquira a medida transversal.
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Representative Results
O EIM pode ser obtido em muitas condições, incluindo matrizes de superfície in vivo (Figura 1), matrizes de agulha in vivo (Figura 2A-F) e células dielétricas ex vivo (Figura 2G,H).
O EIM fornece um instantâneo quase instantâneo da condição muscular com base nos valores de impedância medidos. As medições são adquiridas rapidamente e resultam em um arquivo de dados de saída simples que não requer nenhum software especial (Figura 3A). De fato, qualquer dispositivo de impedância multifreqüência que forneça dados para frequências individuais será capaz de produzir uma saída de .csv padrão que pode ser aberta de forma independente. O sistema descrito neste protocolo também fornece o nome e as condições do experimento, com valores de fase, reatância e resistência para cada ensaio em cada frequência medida, dentro do arquivo de saída. Para garantir a reprodutibilidade, dois ensaios de valores longitudinais (ensaios 1 e 3) e transversais (ensaios 2 e 4) são geralmente obtidos e calculados em média, e utilizados para todas as análises subsequentes.
Quando exibidos em função da frequência, os valores de EIM resultam em curvas padrão que podem ser analisadas para detectar dados espúrios ou contaminados por artefatos. Tais irregularidades geralmente estão relacionadas a problemas de contato em medições de superfície, resultando em valores extremos observados em baixas frequências (tipicamente grandes valores positivos ou negativos). Curvas representativas são exibidas para medidas de fase (Figura 3B), reatância (Figura 3C) e resistência (Figura 3D) para medidas longitudinais (círculos azuis) e transversais (quadrados cinzas). Um gráfico mostrando a reatância em função da resistência (gráfico de Cole-Cole) nas direções longitudinal e transversal também é exibido (Figura 3E). Essa etapa é crítica, pois faz parte da verificação de dados, permitindo a detecção direta de dados espúrios ou contaminados por artefatos. Se o artefato excessivo (geralmente devido ao mau contato entre a matriz de superfície e a pele) for detectado, vários procedimentos podem ser seguidos para melhorar o contato. Estes incluem a aplicação de uma aplicação adicional de creme depilatório, umedecimento da pele por cerca de 1 minuto com uma almofada de gaze embebida em solução salina ou a aplicação de pressão suave na matriz de eletrodos. Geralmente, o simples processo de repetir a medição várias vezes também ajudará a resolver isso.
As medições do EIM refletem a resposta do tecido muscular à corrente elétrica em uma ampla gama de frequências, cada uma visando diferentes estruturas. Por exemplo, baixas frequências (ou seja, 5 kHz) não penetram na membrana miofibrar, fornecendo uma análise das características extracelulares que podem ser usadas para detectar inflamação e infiltração de neutrófilos14. Em contraste, as altas frequências (>1 MHz) podem penetrar nas membranas celulares e, portanto, interrogar espaços intracelulares e extracelulares e têm sido usadas para diferenciar a fibra muscular tipo1.
Figura 1: Matriz de superfície impressa em 3D. Fotografias de uma matriz de superfície que foi impressa em 3D para obter medições de impedância de superfície (longitudinais e transversais) em camundongos in vivo. (A) Uma fotografia mostrando a matriz de superfície conectada ao dispositivo de aquisição. (B) Um close-up da matriz de superfície mostrando a roda usada para girar a matriz a 90° para obter medições longitudinais e transversais. (C) Um close-up dos eléctrodos de superfície. Os eletrodos de superfície têm as seguintes características: largura dos eletrodos = 0,5 mm, comprimento dos eletrodos externos = 4 mm, comprimento dos eletrodos internos = 3 mm e espaçamento entre os eletrodos = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Outras matrizes que podem ser usadas para acomodar experimentos específicos. Fotografias de: (A) uma matriz de agulhas utilizada para ratos e revestida (usando laca ungueal não metálica) para diminuir a contribuição da gordura subcutânea (espaço de 2 mm, 4 mm de profundidade, revestimento de 2 mm); (B) um conjunto de agulhas com espaçamento de 2 mm e profundidade de 4 mm; (C) um conjunto de agulhas com espaçamento de 2 mm e profundidade de 3 mm; (D) um conjunto de agulhas com espaçamento de 2 mm e profundidade de 2 mm; (E) um conjunto de agulhas para animais menores e filhotes com espaçamento de 1 mm e 2 mm de profundidade; (F) um conjunto de agulhas com espaçamento de 1 mm e profundidade de 1 mm; G) Uma célula dieléctrica ex vivo adaptada aos músculos adultos dos ratinhos (5 mm x 5 mm); e (H) uma célula dielétrica ex vivo adaptada para a musculatura de ratos (10 mm x 10 mm). Modificações (resultados não apresentados aqui) para a aquisição de medidas em animais obesos (ou seja, camundongos ob/ob ou db/db) podem ser realizadas aumentando o comprimento da agulha, adicionando revestimento não condutor e aumentando/diminuindo o espaçamento entre agulhas. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Saída de dados e curvas representativas obtidas em camundongos com EIM de superfície in vivo nas direções longitudinal (azul) e transversal (cinza). (A) Arquivo de saída em formato .csv obtido após a aquisição de duas medidas longitudinais (medidas 1 e 3, coloridas em azul) e duas transversais (medidas 2 e 4, coloridas em cinza) EIM in vivo . Os valores são indicados para cada frequência (coluna A). As análises são realizadas posteriormente utilizando o valor médio das medidas longitudinais e transversais, respectivamente. As informações encontradas nas células A1:B4 são preenchidas automaticamente pelo software, de acordo com as etiquetas escolhidas durante a aquisição do EIM. Curvas representativas para valores longitudinais (círculos azuis) e transversais (quadrados cinzentos) de fase (B), reatância (C) e resistência (D) em função da frequência. Consistente com as práticas padrão no campo da impedância, o eixo x é indicado usando uma escala logarítmica. (E) Curvas representativas de reatância em função da resistência para medições longitudinais e transversais. PL: fase longitudinal; TP: fase transversal; LX: reatância longitudinal; TX: reatância transversal; LR: resistência longitudinal; e TR: resistência transversal. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este artigo fornece os métodos básicos para a realização de EIM em roedores, tanto in vivo quanto ex vivo. Para adquirir medições confiáveis, é fundamental executar uma série de etapas. Primeiro, é preciso identificar adequadamente o músculo de interesse, pois cada músculo terá respostas diferentes a doenças, tratamento e patologia. Deve-se estar ciente de que os dados adquiridos em um músculo (por exemplo, gastrocnêmio) não fornecerão as mesmas informações que em outro músculo (por exemplo, tibial anterior). Em segundo lugar, é preciso escolher cuidadosamente a melhor matriz de eletrodos para realizar as medições de impedância. Embora cada tipo de matriz venha com vantagens e desvantagens, é importante escolher uma matriz que se encaixe no projeto experimental, levando em conta a progressão da doença e o efeito na anatomia (por exemplo, atrofia grave). Por fim, o EIM permite que os investigadores coletem uma quantidade incrível de dados em poucos segundos, mas o controle de qualidade precisa ser realizado adequadamente para garantir a ausência de artefatos.
O sistema EIM é altamente personalizável em vários níveis. Embora o sistema usado aqui tenha sido projetado para coleta de dados clínicos e pré-clínicos, qualquer sistema de medição de impedância multifreqüência pode ser usado para esse fim, desde que forneça dados de frequência individuais. Geralmente, os sistemas de impedância fornecem um arquivo de .csv padrão como saída. Da mesma forma, modificações adicionais podem ser feitas em relação às matrizes, pois tudo o que é realmente necessário são quatro eletrodos colocados em uma linha. Por exemplo, neste protocolo, uma variedade de eletrodos feitos sob medida foram usados para atender aos requisitos, mas as matrizes podem ser adaptadas às necessidades individuais usando ferramentas simples (por exemplo, cola epóxi, agulhas subdérmicas) ou complexas (por exemplo, impressoras 3D). Alternativamente, os quatro eletrodos podem ser combinados em uma única agulha, conforme descrito anteriormente20. Em nosso laboratório, matrizes foram desenvolvidas para filhotes, diminuindo o espaçamento entre os eletrodos para garantir que pequenos músculos pudessem ser medidos nas direções longitudinal e transversal. Ao trabalhar com animais obesos, que têm uma camada significativamente maior de gordura subcutânea, recomenda-se o uso de eletrodos de agulha parcialmente revestidos. Isso possibilita uma maior contribuição do tecido muscular para a medida da impedância, ao mesmo tempo em que diminui a contribuição do tecido adiposo21.
Embora os métodos de agulha e métodos de superfície possam ser usados em ratos e camundongos, conforme descrito e demonstrado, geralmente recomenda-se usar as medidas de agulha em ratos, pois estas são mais rápidas, uma vez que não exigem esforço para preparar a pele. Além disso, seu tamanho maior significa que os eletrodos da agulha apenas machucam minimamente o músculo. Em camundongos, dado o seu pequeno tamanho, as medições de superfície são recomendadas para evitar lesões musculares e dado que a preparação da pele é relativamente simples e rápida.
Cada técnica EIM vem com seu próprio conjunto de limitações. Uma limitação fundamental é que as matrizes de eletrodos não estão prontamente disponíveis por meio de fornecedores e, em vez disso, exigem geração personalizada em laboratório. Para ajudar novos investigadores, este protocolo inclui medições para várias matrizes (impressas à mão e em 3D), e os autores fornecerão matrizes personalizadas ou disponibilizarão os arquivos CAD relacionados mediante solicitação. Como mencionado anteriormente, a qualidade dos dados é crítica e problemas adicionais podem interferir na qualidade dos dados para cada um dos tipos de medição (por exemplo, superfície, agulha e ex vivo). Para bons dados de superfície, é necessário remover o cabelo completamente, e provavelmente o estrato córneo da pele também, para obter os melhores resultados com o mínimo de artefato de contato. No entanto, o uso do agente depilatório também significa que a pele se tornará lentamente edematosa ao longo do tempo, por isso é necessário completar rapidamente as medições de impedância após a depilação. Esperar 10 minutos ou mais pode produzir valores significativamente diferentes em comparação com a realização das medições dentro de um minuto ou dois de depilação. As medições da matriz de agulhas em ratos ou camundongos normalmente induzem pelo menos uma pequena quantidade de sangramento, o que pode afetar as leituras se ele se transformar em um hematoma maior ao redor das agulhas inseridas. Finalmente, as medições ex vivo requerem cuidados especiais para garantir que as fibras musculares dentro da célula dielétrica estejam alinhadas com precisão em relação às placas metálicas. Finalmente, em camundongos pequenos ou doentes, pode ser impossível obter medidas transversais, dado o pequeno tamanho dos músculos. Mas, como observado acima, continua sendo possível projetar matrizes personalizadas de 4 eletrodos que poderiam ser suficientemente pequenas para fazer medições longitudinais até mesmo dentro do menor dos músculos.
A análise de dados pode ser mantida bastante simples - por exemplo, medindo uma única saída (por exemplo, fase) em uma única frequência (por exemplo, 50 kHz) em uma única direção (por exemplo, longitudinal) - ou bastante complexa, incorporando todos os parâmetros de impedância em todo o espectro de frequência em direções longitudinais e transversais. Quando os valores de impedância de frequência única são usados, eles estão tipicamente na faixa de 30-100 kHz, uma vez que o músculo tende a ser mais reativo (ou seja, é mais "carregável") nessa faixa de frequência. No entanto, parâmetros condensados ou colapsados, que tentam capturar a forma do espectro de frequência, também foram utilizados. Esses valores incluíram inclinações de ajustes lineares das razões de resistência, reatância e fase22 e 2-frequência23. Alternativamente, os parâmetros de Cole-Cole podem ser calculados a partir de ajustes dos dados de impedância, incluindo o R0 (determinação da resistência na frequência zero), Rinf (determinação da resistência na frequência infinita) e fc (frequência central)24,25,26,27. Finalmente, o aprendizado de máquina pode ser usado para analisar todos os dados de uma só vez e melhorar os modelos preditivos, tanto para regressão12,13,15,16 quanto para classificação.
Apesar dessas limitações, o MEI é uma ferramenta poderosa e relativamente simples para avaliar múltiplos aspectos da saúde muscular. Embora o foco deste manuscrito esteja em um único músculo (gastrocnêmio), não há nada que impeça o uso de MEI em outros músculos superficiais (por exemplo, quadríceps ou bíceps braquiais) usando eletrodos de superfície ou músculos mais profundos usando a matriz de eletrodos de agulha. De fato, em humanos, a técnica tem sido utilizada em uma ampla variedade de músculos, incluindo os músculos dos membros superiores e inferiores 8,28, bem como os músculos axiais (por exemplo, músculos paraespinhais e músculos abdominais)29,30.
Demonstrou-se que o MEI fornece medidas confiáveis em relação à progressão da doença, remissão da atrofia e tratamento ao longo do tempo. Os dados de frequência única podem ser inteiramente suficientes para avaliar o estado da doença ao longo do tempo31; no entanto, o valor dos dados de multifrequência é que eles ainda podem ajudar a avaliar a qualidade da medição, conforme descrito acima. Dados de frequência única isoladamente poderiam ser substancialmente contaminados por artefatos de contato, e isso não seria aparente sem a revisão de todo o espectro de impedância. Em estudos clínicos, o MEI de superfície pode ser utilizado com frequência para a obtenção de medidas indolores, tornando-se uma ferramenta simples de aplicar32. Essa abundância de dados pode ser crítica para rastrear de forma mais sensível a progressão da doença. Além disso, a adição de MEI aos protocolos clínicos pode reduzir significativamente o número de participantes necessários durante um ensaio clínico28,31.
O EIM está encontrando uma aplicação crescente na avaliação de uma variedade de condições neuromusculares em humanos. Assim, a capacidade de executar a técnica de forma eficaz em roedores ajuda a expandir o potencial valor prático da tecnologia, ao mesmo tempo em que aprimora nossa compreensão da relação entre várias saídas de EIM e a histologia subjacente. A técnica é geralmente fácil de usar e, juntamente com os dados quantitativos úteis que fornece, merece ser incluída no arsenal padrão de ferramentas para avaliação de distúrbios nervosos e musculares em modelos de doenças de roedores.
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Disclosures
S. B. Rutkove tem participação e atua como consultor e consultor científico da Myolex, Inc., uma empresa que projeta dispositivos de impedância para uso clínico e de pesquisa, e o sistema mView usado aqui. Ele também é membro do Conselho de Administração da empresa. A empresa também tem a opção de licenciar a tecnologia de impedância patenteada da qual S. B. Rutkove é nomeado como inventor. Os outros autores não têm outras afiliações relevantes ou envolvimento financeiro com qualquer organização ou entidade com interesse financeiro ou conflito financeiro com o assunto ou materiais discutidos no manuscrito além daqueles divulgados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Charley's Fund e NIH R01NS055099.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D Printer | Formlabs Inc. | Form 2 Desktop | 3D printer |
| 3D Printer | Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD | Creality Ender 3 V2 | 3D printer |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher | 19-027761 and 19-061655 | models 1530-0 and 1530-1 |
| 3M TRANSPORE surgical tape | Fisher | 18-999-380 and 18-999-381 | models 1527-0 and 1527-1 |
| Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing | Digi-Key (Sullins connector solution) | S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK) | Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Cotton-tipped applicators | Fisher | 22-363-172 | |
| Dental Wax | Fisher | NC9377103 | |
| Depilatory agent | NAIR | NA | hair remover lotion with softening baby oil |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | No. 11270-20 | Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm |
| Electronic Digital Caliper | Fisher | 14-648-17 | Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle |
| Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life | Devcon | series 14265, model 2217 | Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Ex vivo dielectric impedance cell | Custom | NA | Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | No. 11051-10 | Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material |
| Hair clipper | Amazon | NA | Wahl professional animal BravMini+ |
| Impedance Animal Device | Myolex | EIM1103 | mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research |
| In vivo needle arrays | Custom | NA | Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory |
| In vivo surface array | Custom | NA | The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory |
| Isoflurane | Patterson Veterinary Supplies | 07-893-8441 (NDC: 46066-755-04) | Pivetal - 250 mL bottle |
| Non-woven gauze | Fisher | 22-028-559 | 2 x 2 inch |
| Polystyrene Weighing Dishes | Fisher | S67090A | Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm |
| Razor Blades | Fisher | 12-640 | Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades |
| Student Fine Scissors | Fine Science Tools | No. 91460-11 | Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality |
| Subdermal needles 27 G Neuroline | Ambu | 745 12-50/24 | Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A |
| Surgical Scissors - Sharp | Fine Science Tools | No. 14002-13 | Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm |
| TECA ELITE monopolar needle electrodes | Natus | 902-DMG50-S | 0.46 mm diameter (26 G). Blue hub |
| Teknova 0.9% saline solution | Fisher | S5815 | 1000 mL sterile |
References
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