Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tekniska antivirala medel via ytplasmonresonans

Published: June 14, 2022 doi: 10.3791/63541
Automatic Translation
1,2
1Department of Environmental Health Sciences, University of California, Los Angeles, 2Department of General Surgery, Medical University of Vienna

Summary

Detta protokoll beskriver nya verktyg för SPR-bindningsanalyser för att undersöka CV-N-bindning till HA, S-glykoprotein, relaterade glykaner av hybridtyp och högmannosoligosackarider. SPR används för att bestämma KD för att binda antingen dimerisk eller monomer CV-N till dessa glykaner.

Abstract

Ytplasmonresonans (SPR) används för att mäta hemagglutinin (HA) bindning till domänbytta Cyanovirin-N (CV-N) dimer och för att övervaka interaktioner mellan mannosylerade peptider och CV-N: s bindningsställe med hög affinitet. Virushöljespikar gp120, HA och Ebolaglykoprotein (GP) 1,2 har rapporterats binda både hög- och lågaffinitetsbindningsställen på dimerisk CVN2. Dimannosylerad HA-peptid är också bunden vid de två bindningsställena med låg affinitet till en konstruerad molekyl av CVN2, som bär ett högaffinitetsställe för respektive ligand och muteras för att ersätta en stabiliserande disulfidbindning i kolhydratbindningsfickan, vilket bekräftar multivalent bindning. HA-bindning visas till ett bindningsställe med hög affinitet för pseudo-antikropp CVN2 vid en dissociationskonstant (KD) på 275 nM som ytterligare neutraliserar humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) genom oligomerisering. Korrelering av antalet disulfidbroar i domänbytta CVN2, som minskas från 4 till 2 genom att ersätta cystiner i polära restpar av glutaminsyra och arginin, resulterar i minskad bindningsaffinitet till HA. Bland de starkaste interaktionerna är Ebola GP1,2 bunden av CVN2 med två bindningsställen med hög affinitet i det lägre nanomolära intervallet med hjälp av kuvertglykanen utan en transmembrandomän. I den aktuella studien mäts bindningen av det multispecifika monomera CV-N till svår akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spik (S) glykoprotein vid K D = 18,6 μM jämfört med nanomolar KD till de andra virusspikarna och via dess receptorbindande domän i mitten av μ-molarområdet.

Introduction

Tetherinassocierad antiviral aktivitet induceras av interferon-α, och den består av proteinbaserade tjuder, vilket leder till retention av fullbildade virioner på infekterade cellytor1. Nödvändigheten av tetheringlykosylering vid hämning av virusfrisättning är fortfarande osäker, vilket innebär betydelsen av glykosyleringsmönster på rekombinant uttryckta glykaner för in vitro-studier 1,2, vilket beror på konformationen av (i fallet med influensavirus) ytuttryckt influensahemagglutinin HA 3,4 . Det har noterats att modifiering av oligosackarid bunden till N-länkad glykosylering är tillräcklig för tetherinmedierad begränsning av HIV-typ-1-frisättning2, medan dimerisering spelar en viktig roll för att förhindra virusfrisättning, vilket involverar transmembrandomänen eller glykosylfosfatidyl-inositol (GPI) -ankare för att binda de spirande virionerna5 . Unika egenskaper beskrivs för mänsklig och murin tetherin för att blockera flera höljeförsedda virus, retrovirus och filovirus. BST-2/tetherin är ett interferoninducerbart antiviralt protein med den medfödda immuniteten1,6, som verkar med bredspektrum antiviral aktivitet och motarbetas av kuvertglykoproteiner5 för att antingen translokera tetherin eller störa strukturen hos tetherin 6. Till exempel är ytuttryckt kuvertglykoprotein-HA och neuraminidas på influensa A-virus välkända för tetherinantagonism på ett stamspecifikt sätt7, vilket underlättar igenkänningen av värdreceptorbindningsställen8. Glykaninriktade antikroppar studeras i stökiometrin av deras interaktioner med de snabbt anpassade glykansköldarna på HA, vilket resulterar i bindningsaffinitet till influensa A H3N2 och H1N1 subtyper4.

För att belysa bindningsmekanismerna mellan antivirala medel och virushöljespikar, dvs kolhydratligander och komplementära immunologiska och spektroskopiska metoder, syntetiseras mono-, di- och tri-mannosdelar kemiskt. De mannosylerade peptiderna skapas via azidoglykosylering av glykosyl {beta}-peracetater till 1,2-transglykosylazider transformation9, vilket efterliknar de typiskt funna N-acetylglukosamin- och högmannosoligosackariderna på ytan av livshotande virus. Triazolbioisosterer används för att efterlikna kopplingar som bildar den mannosylerade återstoden av HA-peptid10 och underlätta platsspecifika interaktioner med antivirala CV-N-derivat runt den andra N-länkade glykosyleringsplatsen på HA-huvuddomänen (HA-topp med 4 N-länkade glykaner N54, N97, N181, N301)8,11,12 . Interaktioner mellan glutaminsyra (Glu) och arginin (Arg) och den resulterande spiraldipolen manifesterade god stabilitet hos både modellpeptider och proteiner men visualiseras med hjälp av SPR. Om man jämför med att känna igen ett enda kemiskt syntetiserat glykosyleringsställe på HA10 genom att direkt hämma receptorbindningen på glykandelarna, visas en högre affinitet hos en muterad Fc-struktur med fyra platser till dess receptor för att framkalla effektorfunktioner in vivo, vilket avslöjar den orelaterade sammansättningen av N-länkade glykaner bundna till Fc-mutant som ska bestämmas mekanistiskt13.

CV-N visar antiviral aktivitet mot HIV 14,15, influensa16 och ebolavirus, som förmedlas av nanomolär bindning till oligosackaridmodifieringar med hög mannos på kuvertspikproteiner12,17,18,19. Influensa-HA-bindning till ett kolhydratbindningsställe med hög affinitet (H) i CV-N eller två Hs i kovalent bunden dimerisk CVN2 bestäms ha jämviktsdissociationskonstanter (K D) = 5,7 nM (figur 1A) respektive KD = 2,7 nM. Både CV-N och CVN2 har ytterligare ett eller två kolhydratbindande ställen med låg affinitet (L) 12,17,20,21. Ebola GP1,2 binder till 2H av CVN2 med affiniteter i det lägre nanomolära området (KD = 26 nM). CV-N WT-bindning till Ebola GP1,2 och HA uppvisar affiniteter från K D = 34 nM till KD = 5,7 nM (A/New York/55/04)12. Lektiner, såsom CV-N, som specifikt riktar sig mot glykaner med hög mannos på virushöljena, hämmar ytterligare replikation av hepatit C-virus, SARS-CoV, herpesvirus, Marburg-virus och mässlingvirus22.

Den lilla CV-N-molekylen har studerats noggrant i mer än 20 år eftersom den fungerar för att binda ett brett spektrum av virus för att hämma viral inträde16,18. Strukturella analyser och bindningsaffinitetsanalyser indikerar tvärbindning av två Ls i en domänbytad CVN2-dimer genom bivalent bindning i det mikromolära intervallet för att förbättra aviditeten till virala kuvertglykoproteiner10,19. Selektiv bindning av Manα1-2Manα på Man(8) D1D3-armar och Man(9) består av två bindningsställen med olika affiniteter belägna på motsatta proteinprotomerer20 och når därmed nanomolära bindningsaffiniteter (figur 1B). Således anses CVN2 vara en pseudoantikropp angående dess tillämpning för att binda epitoper på HIV gp120, liknande virusneutraliserande antikroppar17. Häri är författaren intresserad av att undersöka den potentiella bindningen av CVN2 till SARS-CoV-2-spiken via dess receptorbindande domän (RBD). Bindningskurvor för immobiliserat humant angiotensinkonverterande enzym (ACE)-2 med SARS-CoV-2 RBD resulterar i KD = 4,7 nM för denna biologiskt relevanta bindningsinteraktion23.

Däremot känner utvalda immunglobulinklasser igen specifika och konsekventa strukturella proteinmönster, vilket ger ett substrat för affinitetsmognad i de membranförankrade HA-regionerna24. CV-N visar mycket potent aktivitet i nästan alla influensa A- och B-virus16, och det är ett i stort sett neutraliserande antiviralt medel. Vår kunskap är ofullständig om placeringen av riktade epitoper på stammen av HA1 och HA2 som möjligen involverar epitopiska strukturer för glykaninriktning genom starkt neutraliserande antikroppar och jämfört med lektinbindande25.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av SPR-bindningsanalysen för CV-N till virushöljespikar. (A) SPR-analys för CV-N-bindning till ligand: HA fullängdsprotein (90 kDa). Kinetisk datamängd (5120, 2560, 1280, 640, 320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 0 nM) som visar dubbelrefererad bindning i realtid till influensa HA A/New-York/55/04 (H3N2). (B) CVN2L0 variant V2 bindning till immobiliserad ligand DM inom ett koncentrationsområde på 500 nM till 16 μM. Sekvens: L-rester markeras med gult. H-rester markeras i grått. E58 och R73 är en ersättning för cysteiner i vildtypsproteinet och gör V2 till en stabil proteinveck med tre istället för fyra disulfidbindningar Klicka här för att se en större version av denna figur.

Medan glykanskölden på den membrandistala HA-övre delen inducerar högaffinitetsbindning till CV-N 12, har CVN2-bindning till HA intill en disulfidbro i HA-toppdelen ytterligare observerats vid dess lågaffinitetsställen10,12. Olika polära interaktioner och interaktionsställen identifieras i kolhydratbindning med CV-N. Dessa interaktioner verifieras genom att generera knock-out-varianter i bindningsstället för att korrelera bindningsaffiniteter till in silico-förutsagd glykosylering12. Således syftar projektet till att jämföra tidigare testade kemiskt mannosylerade HA-peptider i bindande affinitet och specificitet med korta peptidsekvenser från SARS-relaterade 2019-nCoV-spikar och SARS-CoV-2, naturligt förekommande modifierade av ett litet antal olika N-länkade glykosyleringsställen och O-länkad glykosylering. Med hjälp av kryoelektronmikroskopi och bindningsanalyser rapporterar Pinto och kollegor en monoklonal antikropp, S309, som potentiellt känner igen en epitop på SARS-CoV-2-spikprotein som innehåller en konserverad glykan inom Sarbecovirus-undersläktet, utan att konkurrera med receptorbindning26. Protokollet för denna studie beskriver hur design, uttryck och karakterisering av CV-N-varianter är viktiga för att studera hur CV-N och CVN2 binder till glykosylerade proteiner och syntetiska mannosylerade peptider med hjälp av SPR-tekniken10,12.

Tandembunden dimer CVN2L027 och bindningsplatsvarianter (V2-V5) uttrycks rekombinant och varianter är med disulfidbindningsersättningar (C58E och C73R) (Figur 2A). Dessutom framställs en mutant med en enpunktsmutation E41A eftersom denna position har setts som en intermolekylär korskontaktrest. Denna mutant är en annan intressant molekyl för SPR-bindande mätningar mellan lektin- och högmannosoligosackarider som dechiffrerar bindningsdomäner och möjliggör jämförelse med den dimeriska formen. Den domänbytta kristallstrukturen för CVN2 visar en flexibel länkare som sträcker sig mellan 49 och 54 rester. De två domänerna kan fortsätta att röra sig runt gångjärnet som styva kroppar och utveckla antingen en monomer genom intramolekylära domäninteraktioner (domän A-rester 1-39;90-101- med domän B -rester 40-89) eller en dimer genom intermolekylär domänbyte [domän A (av den första monomeren) med domän B (av den andra) och domän B (av den första monomeren) med domän A (av den andra kopian)]. Det finns inga nära interaktioner mellan de två protomerernas A- och B-domäner, förutom Glu4128. Genen för CV-N kan utvecklas med hjälp av en repetitiv PCR-metod med 40-mer syntetiserade oligos29 och subkloneras sedan till NdeI- och BamHI-platserna för pET11a för transformation (elektroporering) till elektrokompetenta celler som beskrivs av Keeffe, J.R.27. Proteinet, som används för att uppnå respektive kristallstruktur (PDB ID 3S3Y), inkluderar en N-terminal 6-histidinreningstagg följt av en faktor Xa-proteasklyvningsplats. Platsstyrd mutagenes används för att göra punktmutationer, byta kodoner och infoga eller ta bort enstaka eller flera baser eller kodoner för aminosyrautbyte. Dessa transformationer ger ovärderlig insikt i proteinets funktion och struktur. Rekombinant uttryckt och renat CV-N, CVN2 och CVN3 har studerats biofysiskt väl 20,21,27, är billiga att producera och används därför för att karakterisera bindningsanalyser till glykaner immobiliserade på SPR-sensorchips. Konventionell enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) ger mindre reproducerbarhet avseende immobiliseringstekniken för glykanligander och omvandlar realtidsbindning av olika bindningsplatsvarianter, vilket visas för SPR, till slutpunktsanalyser.

Bindningsaffinitetsvariant CVN2L0-V2 (en intakt vik av homodimerisk CV-N med en disulfidbrosubstitution10) uttrycks med en His-tagg i Escherichia coli (E. coli), renad över Ni-NTA-kolonn med affinitetskromatografi och testad för bindning till HA (H3N2), monomannosylerad HA-peptid och dimannosylerad HA-peptid med SPR. Kemiskt mannosylerade peptider, eller HA- och S-protein, är alla ligander och amin kopplade till den hydrofila chipytan via reaktiva estrar eller biotin-streptavidin proteinteknik. Samma procedur för sekventiella körningar tillämpas på dessa ligander, injicering av olika utspädningar av CV-N och varianter av CV-N (och CVN2) för att erhålla kinetisk information för molekylära interaktionsanalyser som beskrivs nedan30. RBD-immobiliserat SPR-sensorchip används för att binda studier på CV-N till S-peptider, och affiniteter jämförs med SARS-CoV-2-bindning med humant ACE2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

För den aktuella studien har ett CVN-litet ubiquitinliknande modifierande (SUMO) fusionsprotein använts i enzymbundna immunosorbentanalyser istället för CV-N och är lämpligt för cellbaserade analyser. Rekombinant influensa A-virus i full längd HA H3-protein erhålls kommersiellt (se materialförteckning) eller uttrycks i HEK293-cellinjer hos däggdjur och bakulovirusinfekterade insektsceller enligt standardprotokoll12. Wuhan-1 spikprotein uttrycks i HEK293-celler från däggdjur. Syntesen av monomannosylerad peptid (MM) och dimannosylerad peptid (DM) möjliggör detektion av homogena ligander till CVN2 och monomannosylerad liten molekyl10.

1. Skapa CV-N-konstruktioner

  1. För var och en av CVN2-varianterna och CVN2L0-proteinet (PDB ID 3S3Y), erhålla genkonstruktionen med en N-terminal pelB-ledarsekvens och His-tag i pET27b(+)-vektor från kommersiella källor (se Materialförteckning, tilläggsfil 1).
  2. Skaffa CVN2L0 och dess varianter (V2, V3, V4 och V5; Figur 2A,C) i bakgrunden av en CVN2L0-mallgen bestående av två distinkta DNA-sekvenser för varje CV-N-upprepning.
  3. Lös upp det frystorkade plasmid-DNA:t i sterilt avjoniserat destillerat vatten (ddH2O) till en slutlig koncentration av 100 ng/μl.

2. Framställning av LB-agarplattor med plasmid-DNA-transformerade celler

  1. Bered odlingsmediet LB-Lennox genom att lösa upp 10 g/l pepton, 5 g/l jästextrakt och 5 g/l NaCl iddH2O(se materialtabell) och justera pH-värdet till 7,4. Utför transformationen till kompetent E. coli BL21 (DE3) för varje variant (V2-V5) med kemisk metod enligt en tidigare publicerad rapport10.
  2. Dela lösningen (900 μL och 100 μL), överför 100 μL på LB-agarplattor (50 μg/ml kanamycin) och använd försiktigt en steril cellspridare. Inkubera agarplattorna över natten vid 37 °C.

3. Kloning

  1. Subklona genen för CV-N till NdeI- och BamHI-ställena för pET11a (se materialförteckning) för omvandling (elektroporering) till elektrokompetenta celler efter referens27.

4. Platsstyrd mutagenes

  1. Att generera CVN2L029 och mutant CVN-E41A i bakgrunden av en CVN2L0-mallgen som innehåller två distinkta DNA-sekvenser för varje CV-N-upprepning27.
  2. Gör mutationer med hjälp av ett platsstyrt mutageneskit (se materialtabell) och specifika mutagena primers 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' och 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' för att köra PCR31.
    1. Starta en serie provreaktioner med hjälp av flera koncentrationer av dubbelsträngad DNA (dsDNA) mall som sträcker sig från 5-50 ng (t.ex. 5, 10, 20 och 50 ng dsDNA-mall). Håll primerkoncentrationen konstant.
      OBS: PCR-blandningen och termiskt cykelprotokoll används vanligtvis enligt beskrivningen i bruksanvisningen för platsstyrd mutagenessats32.
  3. Tillsätt Dpn I-restriktionsenzymet (1 μL, 10 U/μL, se materialförteckning) under mineraloljeöverlägget. Blanda reaktionerna noggrant och försiktigt, snurra ner i en bordsmikrocentrifug i 1 min och inkubera omedelbart vid 37 °C i 1 timme för att smälta föräldrasupercoiled dsDNA.

5. Transformation av bakterieceller

  1. Tina XL1-Blue superkompetenta celler (se materialtabell) försiktigt på is. För att omvandla varje kontroll- och provreaktion, alikvotera de superkompetenta cellerna (50 μL) till ett förkylt rundbottnat polypropenrör (14 ml).
    1. Överför 1 μL av det Dpn I-behandlade enkelsträngade DNA:t (ssDNA) från varje kontroll- och provreaktion (muterat ssDNA) till separata alikvoter av de superkompetenta cellerna, som syntetiserar den komplementära strängen. Virvla transformationsreaktionerna försiktigt för att blanda och inkubera reaktionerna på is i 30 minuter.
      OBS: Innan du överför det Dpn I-behandlade DNA till transformationsreaktionen rekommenderas att du tar bort eventuell återstående mineralolja försiktigt från pipettspetsen. Som en valfri kontroll måste transformationseffektiviteten hos XL1-Blue superkompetenta celler kontrolleras genom att blanda 0,1 ng / μL av pUC18-kontrollplasmiden (1 μL) med en alikvot på 50 μL av de superkompetenta cellerna.
  2. Applicera värmepuls på transformationsreaktionerna vid 42 °C i 45 s och placera sedan reaktionerna på is i 2 minuter.
    OBS: Den applicerade värmepulsen har redan optimerats för de nämnda förhållandena i polypropen rundbottenrör (14 ml).
  3. Tillsätt 0,5 ml NZY+-buljong (innehållande per liter: 10 g NZ-amin (kaseinhydrolysat), 5 g jästextrakt, 5 g NaCl, 12,5 ml 1 M MgCl2, 12,5 ml 1 MgSO4, 10 ml 2 M glukos, pH7,5 och förvärmd till 42 °C) och inkubera transformationsreaktionerna vid 37 °C med skakning vid 225–250 rpm i 1 timme. Platta den korrekta volymen för varje transformationsreaktion (5 μL från kontrollplasmidtransformation; 250 μL från provtransformation) på LB-ampicillinagarplattor.
    ANMÄRKNING: För transformationskontroller och mutagenes, spridda celler på LB-ampicillinagarplattor med 5-brom-4-klor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid (X-gal, 80 μg/ml) och isopropyl-1-tio-β-D-galaktopyranosid (IPTG, 20 mM) (se materialförteckning). Inokulera 50 ml av cellkulturerna med en enda koloni av transformerad E. coli-celler för att rena muterat plasmid-DNA för analyser. Mutagenes bekräftas genom DNA-sekvensering vid en extern anläggning.

6. Uttryck och proteinrening

  1. För en storskalig kultur, inokulera en liten mängd LB (innehållande ampicillin) med en enda koloni från den transformerade plattan.
  2. Använd nattkulturen och inokulera uttryckskulturen med tillsatser, såsom 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 och 20 mMglukos, späd frökulturen till 1/100.
    1. Odla celler med kraftig skakning vid 37 °C. Väx cellerna till en Abs 600 nm mellan 0,4-0,6 (mitten av logfasen) innan cellerna kyls till 20 °C. Inducera med 1 mM IPTG och växa över natten.
    2. Skörda sedan cellerna genom att centrifugera vid 4 000 x g i 15 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten med pipett.
  3. Återsuspendera cellpelleten i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) buffert och återcentrifugera vid 4 000 x g i 15 minuter vid 4 °C. Kassera sedan supernatanten med en pipett. Återsuspendera den återstående pelleten i 10 ml lysbuffert och inkubera suspensionen i 1 timme vid 37 °C.
    OBS: Sammansättning av lysbuffert: (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl,2% Triton-X100, 500 ng/ml lysozym, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM ditiotreitol, 1 mM MgCl2, pH8, se Materialförteckning).
    1. Sätt blandningen under två frys-tina cykler (-80 °C). Separera lösliga och olösliga fraktioner genom centrifugering vid 4 000 x g i 15 minuter vid 4 °C och analysera dem med hjälp av polyakrylamidgelelektrofores (PAGE), särskilt natriumdodecylsulfat (SDS)-SIDA33(figur 2B,C).
      OBS: Celler kan lyseras på flera sätt, såsom frys-tina, ultraljudsbehandling, homogenisering, enzymatisk lys, eller en kombination av dessa metoder. Rening från inklusionskroppar rekommenderas för att samla höga proteinutbyten26.
  4. Rena proteiner med Ni-NTA-kolonnkromatografi (se Materialförteckning). Ladda den lösliga fraktionen på en regenererad Ni-NTA-pärlkolonn (1 ml/min). Tvätta systemet med TBS-buffert (50 mM Tris, 150 mM natriumklorid, pH 7,5) innan du påbörjar en gradient (0-100% 500 mM imidazol i TBS över 60 min) och uppsamlingsfraktioner (1 ml/min). Dialysera de renade proteinerna för biokemisk karakterisering mot 100 mM PBS (figur 2C,D).
  5. Alternativt kan du använda His-Select Ni 2+ affinitetsgel (se materialtabell) i 14 ml rör för att binda och åter suspendera hans märkta rekombinant uttryckta CV-N i buffertlösningar med 20 mM imidazol respektive 250 mM imidazol. Inkubera i sats i minst 30 minuter.
    OBS: Applicera dessa halvrenade proteiner på en färdigförpackad engångskolonn för buffertutbyte och rengöring av biologiska prover, till exempel kolhydrater och proteiner, som kan ladda 1-1,5 ml eluat från immobiliserad metallaffinitetskromatografi.
  6. Överför proteinlösningarna till centrifugeringsrör med ett 10 kDa avskärningsfilter (se materialförteckning) och koncentrera dem genom centrifugering i 10 minuter vid 4 500 x g och 4 °C. För SPR-mätningar, byt ut analytlösningarna mot 10 mM HEPES, 150 mM natriumklorid, 3 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), se materialförteckning).
    1. Tillsätt denna SPR-löpbuffert till en utspädningsfaktor på 1:10 och centrifugera fyra gånger till den ursprungliga volymen i 10 minuter vid 4 500 x g och 4 °C.
  7. Bestäm proteinkoncentrationen vid 280 nm med hjälp av en NanoDrop UV-Vis-spektrofotometer (se materialtabell) baserat på den beräknade extinktionskoefficienten (20 440 M-1 cm-1) för huvudproteinet CVN2L0 som visar en storlek på 23 474 Da34. Använd PBS (100 mM, pH 7,0) eller SPR-buffert som blankett och mät proteinkoncentrationen vid tre utspädningssteg (1:1, 1:10 och 1:100).

Figure 2
Figur 2: CV-N-sekvenser och uttryck. (A) CVN2 utan länkning mellan varje CV-N-upprepning (101 aminosyror vardera) och fyra disulfidbroar uttrycks i pET11a-vektor i E. coli. (B) Uttryck av två oberoende kolonier för CV-N (monomer) och CVN2 (dimer). (C) Disulfidbindningsvarianter renas och analyseras på SDS-PAGE. En markör med låg molekylvikt (6 μL) används som referens. WT = CVN2L0 med fyra disulfidbroar enligt markeringen i (A). V2 är en variant med en disulfidbindningsersättning med polära rester vid positionerna 58 och 73. V3-V5 är varianter med två återstående S-S-bindningar och antingen polära (C58E-C73R) eller icke-polära (C58W-C73M) som ersätter aminosyror eller en kombination av dessa restparsubstitutioner. (D) HPLC-kromatogram av renad CVN2L0 elueras med en flödeshastighet på 1 ml/min med en linjär gradient från 5%-65% buffert B i buffert A över 30 min. Buffert A är: 0,1% (v / v) trifluorättiksyra i ddH2O, buffert B är: 0,08% (v / v) trifluorättiksyra i acetonitril. Protein analyseras på en högpresterande kiselgel 300-5-C4 (150 x 4,6 mm) kolonn vid 214 nm och 280 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

7. SPR-spektroskopi

  1. Använd SPR-systemet med dubbla kanaler (se materialförteckningen) med löpbuffert HBS-EP(+) och 10 mM glycin HCl pH 1,5-1,6 som regenereringsbuffert. Slå på instrumentet, avgasaren, autoprovtagaren och pumpa och tvätta hela systemet med ddH20 i 1 h. Placera färdig löpande buffert i en separat flaska.
  2. Släpp emersionsolja på detektorn och montera ett glassensorchip (se materialtabell) belagt med en tunn guldfilm och på ovansidan funktionaliserad med karboximetyldextranhydrogel direkt på detektorn under treportsflödescellen. Fixa inställningen genom att dra ner hanteringen.
    OBS: C19RBDHC30M 200 nm streptavidin derivatiserad karboximetyldextranhydrogel med en medeltäthet av biotinylerat allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus-2 RBD-protein, är ett färdigt att använda sensorchip med den pre-immobiliserade liganden.

8. SPR-bindningsanalys för CV-N-bindning till HA, S-protein och RBD

  1. Immobilisera de proteinhaltiga liganderna till sensorchips enligt stegen nedan.
    1. Öppna en körtabell genom att klicka på Formulär i menyraden och Kör tabellredigeraren i den integrerade SPRAutoLink-programvaran (se Materialförteckning). Välj och klicka på BASIC_Immobilization från listan över tillgängliga körtabeller och följ stegen i experimentproceduren på datorskärmen. Respektive provredigerare som används visas i det övre högra hörnet.
    2. Klicka på Provuppsättningsredigeraren i avsnittet Formulär för att fylla i reagenslistan för två rack placerade i autosamplern för ytterligare analyser. Klicka på Autosampler Direct Control som ett "verktyg" i menyraden för att föra racken framåt eller hem. Välj 4 °C som driftstemperatur.
      SPR-programvaran möjliggör "SPR Instrument Direct Control" och "Pump Direct Control" genom att välja motsvarande verktyg, samt autosampler-hantering, och genom att klicka på Form; även Kör tabellredigeraren, Datadiagram eller efterbehandling kan väljas för att utföra dataanalys. Filer sparas direkt i standardkatalogen och exporteras som scrubber.files från fönstret Efterbehandling.
  2. Starta pumpen för att infusera ddH20 genom att klicka på Verktyg och pumpdirektstyrning och registrera data genom att klicka på SPR Instrument Direct Control och varje gång Starta i de nyligen visade fönstren. Sätt kopplingsreagenserna (steg 8.3) i 300 μL injektionsflaskor, lägg dem i autosamplerracken och starta körtabellen genom att klicka på Kör.
    OBS: Spånytor är antingen konditionerade med 10 mM glycinbuffert pH 9,0 eller kan ha spolats med 1 M natriumklorid, 0,1 M natriumboratbuffert pH 9,0 för att konditionera karboxylderivatiserad chipyta för EDC / NHS-aktiveringsblandning30.
  3. För denna enkla protein-proteininteraktion, använd CMD500D-chipet (se materialtabell) för att generera en mikrobrytningsindexenhet (μRIU) = 2500 - 3000 flödescell med immobiliserad HA och μRIU = 400 flödescell med spikprotein. Vid en infusionsflödeshastighet på 15 μl/min, injicera en vattenhaltig och lika blandning av 0,4 M N-etyl-N'-(dimetylaminopropyl)karbodiimidhydroklorid (EDC*HCl) och 0,1 M N-hydroxisuccinimid (NHS) genom att tillämpa följande sekventiella steg.
    1. Påfyllning av pumpen vid 25 000 μl/min, utför baslinjejustering i 30 s, injicera 90 μl provaktiveringslösning (EDC/NHS) under 6 minuters kontakttid och håll sedan i ytterligare 5 minuter.
    2. Upprepa denna cykel efter baslinjekörning i 1 min vid 10 μl/min på endast den vänstra flödescellen (blå) för att injicera och immobilisera kemiskt syntetiserade peptider 10, HA och spikprotein vid20 μg/ml, och tillåt efterföljande baslinjejustering med ddH2O i 1,5 min innan den aktiverade spånytan släcks med 1 M etanolamin HCl pH 8,5.
  4. Byt rören från vätskeprovtagaren till avgasaren från ddH20 till flaskan med HBS-EP(+) (kompletterande figur 1).
  5. Analysera SPR-sensorgrammen.
    1. För att utföra kinetiska studier, använd olika analytkoncentrationer (10-5-10-8 M), med ett regenereringssteg efter varje injektion och blankmätningar efter olika analyter. Ändra flödeshastigheten till 10 μl/min och starta injektionerna under 4 min kontakttid, sedan 5 min baslinjegenerering och två regenereringssteg på 2 min vardera med ett intervall på 30 s.
    2. Injicera buffertlösningen för blindmätningar vars sensorgram subtraheras från provkörningar för att normalisera olika proteinkoncentrationer.
  6. Klicka på Formulär, bläddra ner och ändra till "Efterbehandling" genom att klicka på det här driftläget. Klicka på Lägg till för att välja bindningskurvor som genereras över tid i datadiagramformuläret för varje flödescell och exportera överlägget som en skrubberfil (.ovr). Klicka på Arkiv för att öppna filsparalternativen. Få svarskurvor genom att justera vänster och höger kurva och subtrahera signaler från den andra referenskanalen från ligandkanalens.
    OBS: Data drivs i "Post-Processing" genom att definiera sensorgram beräkningsmässigt. Det sätts i ett överlägg av sensorgram från vänster och höger flödesceller, eller representeras som sensorgram från skillnaden mellan båda kanalerna.
  7. Rengör hela fluidiken med 50-100 mM glycinbuffert pH 9,5, vatten och 20% etanol före och efter bindningsmätningar för att avlägsna spår av salt eller någon proteinförorening, eller strängare, med 0,5% SDS och glycin.
    OBS: För att förhindra instrumentskador rekommenderas att du kontrollerar glaschipets mekaniska stabilitet innan du sätter in chippatronen i instrumentet igen om chips har lagrats under buffert eller vid 100% fuktighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En dimerisk domänbytad CVN2L0-molekyl testas för bindning till HA-toppregionen i tre separata SPR-experiment och bindningsaffinitet presenteras i KD-värden. Domän B antas omfatta H-bindande ställen, som påverkas genom att ersätta en disulfidbindning till jonrester, och domän A bildar L10,18. Enstaka injektioner av CVN2L0 och varianterna V2 (tre disulfidbroar) och V5 (två disulfidbroar) testas först för bindning till det HA-kopplade sensorchipet för att uppskatta bindningskapaciteten innan kinetikmätningen ställs in med hjälp av autosamplern och körbordsredigeraren (figur 3A och kompletterande figur 2). Upprepade injektioner automatiseras för en serie CVN2L0, V2 och V5 vid olika koncentrationer i det nanomolära och μ-molära området i systemet över tid (figur 3B-D). Genom att korrelera antalet intakta Cys-Cys-bindningar binder CVN2L0 immobiliserad HA vid KD = 255 nM när man når god mättnad. I detta fall är båda K D-värdena, beräknade antingen från kinetiska data eller genom att anpassa jämviktsdata till Langmuir-bindningsisotermen, i måttlig överensstämmelse (tabell 1 och tilläggsfigur 3, tilläggsfigur 4).

Figure 3
Figur 3: SPR-bindningsanalys för ligandbindning via multivalenta interaktioner. CVN2 (WT) och bindningsplatsvarianter V2 och V5 med disulfidersättningar i kolhydratbindningsfickan med hög affinitet testas för att binda kovalent immobiliserad HA. (A) Vänster- och högerflödescellbindningskurvor för CVN2, V2 och V5 kan extraheras från SPR-körprotokollet och sensorgram sammanfattas i ett överlägg. (B) Sensorgram från konventionellt SPR-experiment visat som kinetiska analyser för bindning av CVN2L0 till HA, injicering av analytkoncentrationer från 10-4 till 10-8 M. CVN2L0 mäts upp till den högsta koncentrationen vid 1,5 μM (översta raden) och upp till 500 nM (nedersta raden), för vilken ingen mättnad på spånytan eller jämviktsbindning uppnås. RU = Svarsenheter. Ett CMD500D-sensorchip används. C) SPR-sensorgram för V2-bindning till HA. (D) V5 bindande för HA. Figuren (B-D) återges med tillstånd från referens10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ka (M-1 s-1) KD (S-1) KD [HA]
Kinetisk		 KD [HA]
Jämvikt
CVN2 5.1 e3 1,3 x10-3 255 nM 246 nM
V2 4.0 e3 1,1 x10-3 275 nM 255 nM
V5 1.2 e3 5,8 x10-2 5 μM 4,9 μM
CVN2L0 2.07 e4 3,0 x10-3 147 nM 600 nM
2.27 E4 3,0 x10-3 133 nM 490 nM

Tabell 1: Bindningsaffiniteter för CVN2 och varianter till HA mätt via SPR. Scrubber 2.0 (en BioLogic-programvara) används för att passa SPR-associations- och dissociationskurvor i realtid och för att beräkna jämviktsdissociationskonstanterna (KD) från kinetiska och jämviktsdata. Ka = associeringshastighet konstant. Kd = dissociationshastighetskonstant.

Medan KD-värden för bindning av CVN2L0 och V2 till HA båda ligger i det nanomolära området, minskar V5 i bindning (tabell 1). I V5 ersätts två disulfidbindningar med jonparningsrester som omskolar potentiella joniska interaktioner mellan muterade Glu- och Arg-rester (figur 2A,3D). Primärdata analyseras enligt den integrerade associeringshastigheten och dissociationsekvationerna, som beskriver bindningskinetiken för interaktionen mellan löslig CV-N och immobiliserad ligand och dissociationen av det bildade komplexet från chipytan. Två oberoende mätningar utförs och sensorgram, motsvarande de som erhållits från replikat, analyseras. KD beräknas som kvoten av kav/kpå (tilläggstabell 1)10,35. KD är emellertid relaterad till jämviktsdata som passar Langmuir-bindningsisotermen 36, där jämviktsbindningssvaret plottas som en funktion av analytkoncentrationen (kompletterande figur 3A,4A,3B,4B). På ett koncentrationsberoende sätt bestäms dissociationshastighetskonstanten kd efter analyser och införlivas i associeringsfasanpassning (kpå) för att uppskatta associeringshastighetskonstanten ka. (Tabell 1, kompletterande figur 3C, tilläggsfigur 4C).

Därefter jämförs bindningen av CV-N till HA med dess interaktion med RBD. CV-N WT-bindning till SARS-CoV-2 RBD mäts vid svagare affinitet (K D = 260 μM, figur 4A) jämfört med bindning till HA (KD = 5,7 nM)8,10,12 och bindning till S-protein (KD = 18,6 μM, figur 5). Koncentration kontra respons plottas för CV-N WT-bindning till RBD, förutsatt specifik inriktning av eventuellt konserverade kolhydrater på RBD S1-underenheten (figur 4A). Samma affinitetsdiagram visas för CVN2L0-V4-bindning till DM som inte längre kan analyseras på grund av ersättning av disulfidbindningar som stör högaffinitetsbindning till små glykosylerade peptider (figur 4B).

CVN2L0-V4 (2 disulfidbindningar motsatta osymmetrisk ersättning av cysteinrester med antingen Glu-Arg-rester eller amfipatiska aminosyror Trp och Met) kan bilda icke-polära vätebindningsnätverk runt pseudodomänen B-kolhydratbindningsstället10. Högre densitet av glykaner på HA-protein når bindning med polära Glu-Arg-rester istället för cystiner (tilläggstabell 1) och en koppling till mannosylerade peptider (KD = 10 μM för DM) mellan CVN2L0 och modifieringar till Glu-Arg, men visar diskontinuerlig dissociation av varianter från denna monoglykosylerade peptid, särskilt när H modifieras på båda monomererna. För interaktionen mellan CVN2L0-V4 och DM ger svaret på 56 μM CVN2L0-V4-injektion ett högre svar änR max. (Figur 4B). V5 (2x Glu-Arg) misslyckas med dissociation från ytbunden DM (data visas inte). Sammanfattningsvis minskar responskurvorna för lägre koncentrationer innan injektionen avslutas för alla sensorgram på CVN2-bindning till peptid utan inbyggt H- och monomerbindning till RBD.

Figure 4
Figur 4: SPR-analyser av (A) CV-N WT-monomerbindning till RBD. K D beräknas genom att anpassa kinetiska data (vänster sida, K D = 260 μM) och jämförs med affinitetsdata (höger sida) med hjälp av en enkel biomolekylär modell för 1:1-bindning mellan ligand och analyt (KD equil = 274 μM). Jämviktsbindningsrespons eller bindningskapacitet plottas som en funktion av koncentrationen i jämförelse med SPR-bindningskurvorna (0-605 μM CVN). H = Bindningsställe med hög affinitet. L = Bindningsställe med låg affinitet. Båda finns på CV-N och CVN2L0. (B) Dimer CVN2L0-V4 bindning till DM, förutsatt 2L utan analyserbar KD. CVN2L0-V4-koncentrationerna är 56 μM, 28 μM, 14 μM, 7 μM, 3,5 μM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Mutant CVN-E41A och CV-N WT bindning till (A) S glykoprotein. Pilar indikerar början på associerings- och dissociationsfasen. B) CVN-E41A bindande för avrinningsdistrikt på SARS-CoV-2. Liganderna är förimmobiliserade på HC polykarboxylat och CMD500D sensorchips. Covid-19 S1-underenhet [Pinto, D. et al.26; och Barnes, C. et al.37] används för RBD-immobilisering. Flödeshastighet: 30 μl/min, 25 °C; plottade rådata. Som jämförelse avbildas bindningen av humana blodserumantikroppar till RBD med en utspädningsfaktor på 1:200. (C) SPR-analys av CV-N WT-bindning till S-glykoprotein som immobiliseras till en responsnivå på 400 μRIU för att fånga CV-N. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Det har tidigare visats att monomer CV-N med ett enda L inte tillräckligt kan binda gp120, men att CV-N: s neutraliseringsförmåga kräver tvärbindning av två kolhydratbindande ställen och huvudsakligen återställs genom dimerisering för att funktionalisera med 2H12,19. Därför uttrycks en monomer mutant CVN-E41A, som misstänks destabilisera pseudodomän B eller kan avbryta anslutningen till den andra domänen A, såsom den finns i CV-N WT. CVN-E41A-monomer avslöjar stabilitet vid bindning till S-protein som liknar CV-N-monomer. Även om SPR-respons för analytkoncentrationer på 605–680 μM resulterar i enheter med högt svar och typiska SPR-sensorgram för CV-N WT- respektive E41A-bindning, är mutanten instabil när den späds ut (figur 5).

Kompletterande figur 1: SPR-sensorgram för att fånga DM-mimik som en del av influensa HA-toppen. Skärmdump: SPR-datadiagram som visar SPR-körprotokollet för immobilisering av DM på SPR-sensorchip CMD500D, som är belagt med 500 nm karboximetyl dextranhydrogel och lämplig för kinetiska analyser av lågmolekylviktsanalyter på hög liganddensitet. Sensorchips monteras direkt på detektorn med emersionsolja och fixeras under en treportars flödescell. Efter släckning av den aktiverade spånytan med 1 M etanolamin HCl pH 8,5 injiceras CVN2 två gånger (koncentration = 1 μM respektive 2 μM). Lila: Skillnad mellan flödescell 1 och flödescell 2; svaret registreras med ett intervall på 0,2 s. Blå: Flödescell 1: 3000-4000 mikrobrytningsindexenheter (μRIU) belagda från en 400 nM-lösning av liganden DM till en aktiverad karboxylerad yta. Röd: Referensflödescell 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 2: Manuell körning på HA-funktionaliserat CMD500D-sensorchip som visar bindning av dimeriskt CVN2L0-V5, V2 och CVN2L0. Vid infusionsflöden från 30-50 μl/min injiceras CVN2L0- och disulfidbindningsvarianter uttryckta med en His-tagg och renade över Ni-NTA i mitten av μM-intervallet och testas för bindning till HA med en associeringsfas på 3 min och dissociationsfas på 2 min. Injektionerna är V5 (15 μM), V2 (2,4 μM), 0 μM, CVN2L0 subklonerade från ett SUMO-fusionsprotein (1 μM) och CVN2L0 (2 μM). Löpbuffert vid fysiologiskt pH används för alla experiment vid 25 °C. Alla lösningar avgasas och filtreras (0,2 μm) före injektion i systemet. Lila: Skillnad mellan flödescell 1 och flödescell 2; svar registreras med ett intervall på 0,2 sek. Blå: Flödescell 1: 2540 μRIU HA. Röd: Referensflödescell 2. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 3: CVN2 bindande till HA. Analyser av sensorgram när kurvor justeras automatiskt. (A) Sensorgram nollställda och justerade med hjälp av skrubberprogramvara (vänster) och bindande isoterm som visar koncentrationsberoende responskurva till bundna analyter (höger). (B) Bindande isoterm uttryckt i procents kapacitet. (C) Beräkningsanpassade teoretiska associerings- och dissociationskurvor. D) Kinetikdata på SPR-sensorgram utan anpassade kurvor. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur 4: CVN2 bindande till HA. Analyser av sensorgram när kurvor justeras manuellt. (A) Sensorgram nollställda och justerade med hjälp av skrubberprogramvara (vänster) och bindande isoterm som visar koncentrationsberoende responskurva till bundna analyter (höger). (B) Bindande isoterm uttryckt i procents kapacitet. (C) Beräkningsanpassade teoretiska associerings- och dissociationskurvor. D) Kinetikdata på SPR-sensorgram utan anpassade kurvor. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande tabell 1: Kinetiska data erhållna från SPR-sensorgram för bindning av CVN2L0- och Cys-Cys-bindningsvarianterna V2, V4 och V5 till HA med användning av en Langmuir 1:1-bindningsmodell. KD [M] = k av/k på  eller kd/ka. All data genereras vid 25 °C i HBS-EP(+)-buffert.: Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

CV-N:s bindningstillhörighet korreleras med antalet funktionella bindningsställen [2H på domänerna B och 2L på domän(er) A när de konstrueras som domänbytta dimer]. En variant med en förändrad bindningsaffinitet (CVN2L0-V2, en homodimerisk stabil vik av CV-N bestående av en disulfidbro knock-out) uttrycks i E. coli, renas och testas positivt för bindning till HA-protein (H3N2) med SPR10, och visar en konformationsförändring vid bindning av HA med antingen H- eller L-kolhydratbindningsställen och KD1 = 49 nM och KD2 = 8 μM38 . När antalet disulfidbroar nära glykanmålsfickan i CVN2 minskade från 4 till 2 minskade bindningsaffiniteten till HA-protein (figurerna 3B-D och tilläggstabell 1). Disulfidbindningsvarianter skapas genom att ersätta Cys och sätta in polära restpar Glu - Arg med något minskande stabilitet. Varianterna representerar annars samma molekyl, och de fyra bindningsställena är funktionella, även om multisitebindning på chipet påverkas för alla varianter baserat på två disulfidsubstitutioner. En icke-polär substitution av båda disulfidbindningarna i de två bindningsfickorna med hög affinitet gör variant CVN2L0-V3, som aktivt binder HA-peptiden i både dess monomannosylerade och dimannosylerade form. Interaktionerna med CVN2L0-V3 bekräftas för mikromolära koncentrationer och bindning med de syntetiska peptiderna (MM och DM) i lösning via STD-NMR. I synnerhet är CVN2 SPR-bindningsexperiment till MM inte analyserbara på grund av otillräcklig beräkning av Rmax, en allmän nackdel med SPR-tekniken och svaga bindningsaffiniteter till den immobiliserade MM10. Ökad liganddensitet hos denna peptid och andra peptider minskar bindningsselektiviteten. Med hjälp av SPR visar dimerisk CVN2L0 (2H+2L) med hög stabilitet multivalent bindning till HA, vilket uttrycks i insektsceller, och specificitet för dimannos på en enda kemiskt konstruerad biomimik för högmannosoligosackarider, förutsatt att en bindningsmodell 1:1 antas. Bindning till oligo-mannosider mäts vanligtvis med isotermisk titreringskalorimetri, vilket kräver att en högre koncentration av ligand titteras mot lektinet17.

Kompetitiv bindning till monomannos eller någon glykan som är mindre än Man(7) har inte hittats före någon av15, vilket indikerar att den kemiska kopplingen till peptidstommen är involverad i erkännandet av dessa glykandelar. Antalet mannos-mannoskopplingar i målet varierade, dechiffrera tryptofaninteraktioner i glykanfickan med hög affinitet. Typen av modifiering av peptider med triazolbunden monomannos eller triazolbunden dimannos kan bestämma KD-värden, särskilt till H. När det gäller bindningsaffiniteter mellan CVN2L0 (2H+2L) och CVN2L0-V2 (1H+2L) till DM är koff till maximalt 10 gånger högre när det gäller CVN2L0-V2-dissociation från DM kontra HA10. Förutom att mäta kinetiska hastighetskonstanter gör SPR det möjligt att uppskatta jämviktskonstanterna för mycket långsamt jämviktssystem utan att faktiskt nå jämvikt (tabell 1). Däremot uttrycker kon goda relativa responsvärden för alla bindningskurvor för domänbytta CVN2L0 och dess disulfidbindningsvarianter (V2, V4 och V5) till HA (tilläggstabell 1) eller DM, medan dissociationshastighetskonstanten kav visar snabbare offhastigheter för V4 och V5, två varianter med två funktionella L och V4 med icke-analysbar KD avseende DM (figur 4B ). Att tilldela domän B till H och domän A respektive L är ett tidigare konstaterande som grund för disulfidbindningsvarianterna för att avslöja olika bindningsaffiniteter i SPR, specificerat, till HA18,28.

SPR är ett av de ledande verktygen för biomolekylär interaktionsanalys inom biomedicinsk forskning35. Om en specifik, tidsinställd kontroll av bulkanalytkoncentrationen är möjlig i SPR-instrumentet, är den kvantitativa utvärderingen av kinetiken för bindande framsteg mellan makromolekyler möjlig, med ökande intresse för att analysera multiproteinkomplex39. Utmaningen i dess användning är den kontrollerade positioneringen av en av interaktionskomponenterna på den allmänt använda karboximetyldextran, eller HC polykarboxylathydrogelytan, som fångar små och stora biomolekyler. För att optimera immobilisering och bindningskapacitet hos chipytan finns streptavidin-biotin-smörgåsimmobilisering och immobilisering via protein His-tag till en anti-hans antikropp tillgänglig40. De biofysiska egenskaperna hos proteiner eller funktionella grupper av små molekyler kan störa immobiliseringsresultat, men eventuella svårigheter upplevs med de här beskrivna glykoproteinerna och glykopeptiderna som är kovalent bundna via EDC / NHS-kemi. De immobiliserade glykanerna, antingen glykoprotein eller de syntetiska homogent mono- eller dimannosylerade glykopeptiderna, används på återanvändbara chips för att screena olika konstruerade CV-N-varianter, och bindande analyser appliceras på fullständigt renade och rekombinant uttryckta lektiner. Föroreningar i injicerad proteinlösning skadar SPR-kanalsystemet. Även om experimentella procedurer beskrivs på ett in vitro-system i denna studie, kan glykosyleringsmönstret på virala spikar kännas igen selektivt av varje analytkoncentration av detta lilla modellprotein som injiceras över tid med optimerad massöverföringsbegränsning36. Storleken på CV-N är ~ 11 kDa och stöder reproducerbara SPR-data för dess bindning till virala spikproteiner.

CV-N: s bindningsspecificitet till glykaner med hög mannos bekräftas av den bivalenta bindningsinteraktionen med den dimannosylerade peptidmimetiken snarare än att binda till strukturellt funktionella glykaner och den mono-mannosylerade peptiden med användning av isotermisk titreringskalorimetri (data visas inte). En variant med punktmutationen Glu41Ala uttrycker det monomera 101-restproteinet med två sammanflätade kolhydratbindande ställen på varje protomer. Därför avskaffar detta mutationsställe en kontaktrest mellan kolhydratställena med hög och låg affinitet och minskar molekylär bindningsstyrka till N-acetyl-D-glukosamin. Bindning av CVN-E41A till SARS-CoV-2 spikprotein, med komplex typ N-bunden glykosylering och O-glykosylering, uppnås i SPR, men CV-N-bindning till denna spik är för både spikproteinet och RBD utan fysiologisk relevans, mätt vid mikromolära koncentrationer (figur 4,5).

Mannosylerade peptider som utvecklats och genererats i denna studie används som proteinställningar för att screena de antivirala medlens bindningsegenskaper med SPR och NMR, eftersom de representerar oföränderliga ligander för kolhydratbindande analyser kopplade till en definierad aminosyrasekvens10. Dessutom är STD-NMR-spektroskopi en etikettfri teknik, såsom SPR, som möjliggör karakterisering av kolhydratbindning genom konformationsval10,41. I sådana miljöer möjliggör STD-NMR utveckling av snabba screeningmetoder för ett stort bibliotek av föreningar för att identifiera bioaktiva ligander via bindning, epitopkartläggning och direkt bestämning av KD under olika experimentella förhållanden. Exakta K D-värden kan erhållas genom att analysera protein-ligandassociationskurvan med hjälp avSTD-värden vid gränsen för nollmättnadstid41,42. Därför uppnåddes förhöret av protein-ligandinteraktioner med STD-NMR-metoden, men KDs beräknas på SPR-systemet.

Humant 2019-nCoV (Wuhan-Hu-1-2019 nytt coronavirus) beräknas skilja sig mellan 11 (av 18) förutsagda N-länkade glykosyleringsställen till SARS-CoV43. Epitop/paratopkartläggning avslöjar några samspel med värd-härledda N-glykaner och försumbara bidrag från antikroppssomatiska hypermutationer till epitopkontakter37. Förmågan hos antivirala lektiner och i stort sett neutraliserande antikroppar att binda högt bevarade epitoper på influensa HA-glykoproteinet är viktigast för den rationella utformningen av vacciner för förebyggande och terapeutisk användning. Ytterligare undersökning behövs dock för att utvärdera effekten av immunsuppressiv N-länkad glykosylering runt värdreceptorbindningsstället. Data kan ge insikt i potentialen hos virusspikproteiner att fly från antikroppar som framkallas under infektion eller att binda icke-immunogen CV-N och därmed vägleda strukturbaserad beräkningsproteindesign för nya optimerade antivirala CVN2-varianter. Däremot kan affiniteten hos glykosylerad Fc-aminosyramutant till dess receptor för att framkalla effektorfunktioner in vivo, använder en sammansättning av glykosyleringsställen och antalet glykaner som är involverade, därför vara viktigt för bindande affinitet men kan inte bestämmas för neutraliseringsförmåga.

Sammantaget förutspås färre rotamerer binda kolhydratligander till proteiner genom beräkningsproteindesign än enbart protein-proteininteraktioner. Domänbytta CVN2, som emellertid bär olika antal kolhydratbindande ställen, ger den nödvändiga stabiliteten och flexibiliteten för att avslöja olika bindningsaffiniteter som tillskrivs H och för att bilda de multivalenta interaktionerna mellan oligomannoskluster på virala kuvertspikar och neutraliserande antikroppar (NAb), vilket möjliggör att hämningsanalyser valideras experimentellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författaren har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författaren erkänner Dr. Christian Derntl från Institutionen för bioteknik och mikrobiologi vid TU Wien och Institutionen för medicin III, Avdelningen för nefrologi och dialys vid Medicinska universitetet i Wien, särskilt Dr. Markus Wahrmann för tekniskt och vetenskapligt stöd. Proteinuttryck i däggdjursceller stöddes av institutionen för bioteknik vid University of Natural Resources and Life Sciences (BOKU) Wien. Författaren vill uttrycka sitt djupa erkännande till Dr. Nico Dankbar från XanTec bioanalytics i Düsseldorf, Tyskland, för hjälpsamma vetenskapliga diskussioner om att utföra SPR-bindande analyser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Äkta primeplus Cytiva
Amicon tubes Merck C7715
Ampillicin Sigma-Aldrich A5354
Beckmann Coulter Cooler Allegra X-30R centrifuge Beckman Coulter B06320
Cell spreader Sigma-Aldrich HS86655 silver stainless steel, bar L 33 mm
Custom DNA Oligos Sigma-Aldrich OLIGO
Custom Gensynthesis GenScript #1390661  cloning vector: pET27b(+) 
Cytiva HBS-EP+ Buffer 10, 4x50mL Thermo Scientific 50-105-5354
Dionex UlitMate 3000 Thermo Scientific IQLAAAGABHFAPBMBFB
Dpn I restriction enzyme (10 U/μL)  Fisher Scientific ER1701
DTT Merck DTT-RO
EDC Merck 39391
EDTA Merck E9884
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120086
Eppendorf Safe-Lock Tubes Eppendorf 30120094
Eppendorf Minispin and MiniSpin Plus personal microcentrifuge Sigma-Aldrich Z606235
Ethanol Merck 51976
Ethanolamine HCl Merck E6133
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-432-22
Falcon 14 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Snap Cap, Sterile, 25/Pack Corning 352057
Glucose Merck G8270
Glycine HCl Merck 55097
HA H3 protein Abcam ab69751
HEPES Merck H3375
His-select Ni2+ Merck H0537
Imidazole Merck I2399
IPTG Merck I6758
Kanamycin A Sigma-Aldrich K1377
Kromasil 300-5-C4 Nouryon
LB agar Merck 52062
LB agar Merck 19344
LB Lennox Merck L3022
Lysozyme Merck 10837059001
Magnesium chloride Merck M8266
Magnesium sulfate Merck M7506
NaH2P04 Merck S0751
NanoDrop UV-Vis2000c spectrophotometer Thermo Scientific ND2000CLAPTOP
NaOH Merck S5881
NHS Merck 130672
NZ amine (casein hydrolysate) Merck C0626
PBS Merck 806552
PD MidiTrap G-10 Sigma-Aldrich GE28-9180-11
Peptone Merck 70171
pET11a Merck Millipore (Novagen) 69436 
PMSF Merck PMSF-RO
QIAprep Spin Miniprep Kit (1000) Qiagen 27106X4
Reichert Software Package Autolink1-1-9 Reichert
Reichert SPR SR7500DC Dual Channel System Reichert
Scrubber2-2012-09-04 for data analysis Reichert
SDS Merck 11667289001
Site-directed mutagenesis kit incl pUC18 control plasmid Stratagene #200518
Sodim chloride Merck S9888
Sodium acetate.Trihydrate Merck 236500
SPR sensor chip C19RBDHC30M XanTec bioanalytics SCR C19RBDHC30M
SPR sensor chip CMD500D XanTec bioanalytics SCR CMD500D
Sterilin Standard 90mm Petri Dishes Thermo Scientific 101R20
TBS Merck T5912 10x, solution
Triton-X100 Merck T8787
Tryptone Merck 93657
Tween20 Merck P1379
Vortex-Genie 2 Mixer Merck Z258423
X-gal Merck XGAL-RO
XL1-Blue Supercompetent Cells Stratagene #200236
Yeast extract Merck Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Perez-Caballero, D., et al. Tetherin inhibits HIV-1 release by directly tethering virions to cells. Cell. 139 (3), 499-511 (2009).
  2. Waheed, A. A., Gitzen, A., Swiderski, M., Freed, E. O. High-mannose but not complex-type glycosylation of tetherin is required for restriction of HIV-1 release. Viruses. 10 (1), 26 (2018).
  3. Wilson, I. A., et al. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3 A resolution. Nature. 289 (5796), 366-373 (1981).
  4. Otterstrom, J. J., et al. Relating influenza virus membrane fusion kinetics to stoichiometry of neutralizing antibodies at the single-particle level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 5143-5148 (2014).
  5. Kaletsky, R. L., Francica, J. R., Agrawal-Gamse, C., Bates, P. Tetherin-mediated restriction of filovirus budding is antagonized by the Ebola glycoprotein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2886-2891 (2009).
  6. Tokarev, A., Skasko, M., Fitzpatrick, K., Guatelli, J. Antiviral activity of the interferon-induced cellular protein BST-2/tetherin. AIDS Research and Human Retroviruses. 25 (12), 1197-1210 (2009).
  7. Gnirss, K., et al. Tetherin sensitivity of influenza A viruses is strain specific: Role of hemagglutinin and neuraminidase. Journal of Virology. 89 (18), 9178-9188 (2015).
  8. Fleury, D., et al. A complex of influenza hemagglutinin with a neutralizing antibody that binds outside the virus receptor binding site. Nature Structural Biology. 6 (6), 530-534 (1999).
  9. Salunke, S. B., et al. Iron(III) chloride as an efficient catalyst for stereoselective synthesis of glycosyl azides and a cocatalyst with Cu(0) for the subsequent click chemistry. Chemical Communication. (Camb). 47 (37), 10440-10442 (2011).
  10. Schilling, P. E., et al. Mannosylated hemagglutinin peptides bind cyanovirin-N independent of disulfide-bonds in complementary binding sites. RSC Advances. 10 (19), 11079-11087 (2020).
  11. Fleury, D., Wharton, S. A., Skehel, J. J., Knossow, M., Bizebard, T. Antigen distortion allows influenza virus to escape neutralization. Nature Structural Biology. 5 (2), 119-123 (1998).
  12. Maier, I., Schiestl, R. H., Kontaxis, G. Cyanovirin-N binds viral envelope proteins at the low-affinity carbohydrate binding site without direct virus neutralization ability. Molecules. 26 (12), 3621 (2021).
  13. Ahmed, A. J., Keremane, S. R., Vielmetter, J., Bjorkman, P. J. Structural characterization of GASDALIE Fc bound to the activating Fc receptor FcγRIIIa. Journal of Structural Biology. 194 (1), 78-89 (2016).
  14. Boyd, R. Discovery of cyanovirin-N, a novel human immunodeficiency virus-inactivating protein that binds viral surface envelope glycoprotein gp120: potential applications to microbicide development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (7), 1521-1530 (1997).
  15. Bolmstedt, A. J., O'Keefe, B. R., Shenoy, S. R., McMahon, J. B., Boyd, M. R. Cyanovirin-N defines a new class of antiviral agent targeting N-linked, high-mannose glycans in an oligosaccharide-specific manner. Molecular Pharmacology. 59 (5), 949-954 (2001).
  16. O'Keefe, B. R., et al. Potent anti-influenza activity of cyanovirin-N and interactions with viral hemagglutinin. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (8), 2518-2525 (2003).
  17. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: calorimetric and NMR characterization. Chemical Biology. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  18. Bewley, C. A., Kiyonaka, S., Hamachi, I. Site-specific discrimination by cyanovirin-N for alpha-linked trisaccharides comprising the three arms of Man(8) and Man(9). Journal of Molecular Biology. 322 (4), 881-889 (2002).
  19. Barrientos, L. G., Matei, E., Lasala, F., Delgado, R., Gronenborn, A. M. Dissecting carbohydrate-Cyanovirin-N binding by structure-guided mutagenesis: functional implications for viral entry inhibition. Protein Engineering Design & Selection. 19 (12), 525-535 (2006).
  20. Bewley, C. A., Otero-Quintero, S. The potent anti-HIV protein cyanovirin-N contains two novel carbohydrate binding sites that selectively bind to Man(8) D1D3 and Man(9) with nanomolar affinity: implications for binding to the HIV envelope protein gp120. Journal of the American Chemical Society. 123 (17), 3892-3902 (2001).
  21. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Man alpha 1-2Man alpha complex: structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  22. Jensen, S. M. R., et al. Differential inhibitory effects of Cyanovirin-N, Griffithsin, and Scytovirin on entry mediated by envelopes of gammaretroviruses and deltaretroviruses. Journal of Virology. 88 (4), 2327-2332 (2014).
  23. Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
  24. Lingwood, D., et al. Structural and genetic basis for development of broadly neutralizing influenza antibodies. Nature. 489 (7417), 566-570 (2012).
  25. Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
  26. Pinto, D., et al. Cross-neutralization of SARS-CoV-2 by a human monoclonal SARS-CoV antibody. Nature. 583 (7815), 290-295 (2020).
  27. Keeffe, J. R., et al. Designed oligomers of cyanovirin-N show enhanced HIV neutralization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (34), 14079-14084 (2011).
  28. Yang, F., et al. Crystal structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein, shows unexpected domain swapping. Journal of Molecular Biology. 288 (3), 403-412 (1999).
  29. Stemmer, W. P., Crameri, A., Ha, K. D., Brennan, T. M., Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene. 164 (1), 49-53 (1995).
  30. Fischer, M. J. E. Amine coupling through EDC/NHS: A practical approach. Surface Plasmon Resonance. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mol, N., Fischer, M. 627, Humana Press. (2010).
  31. Novoradovsky, A., et al. Computational principles of primer design for site directed mutagenesis. Technical Proceedings of 2005 NSTI Nanotechnology Conference and Trade Show. , Anaheim. 532-535 (2005).
  32. QuikChange Site-Directed MutagenesisKit, User Manual. , Available from: https://users.drew.edu/jliu3/Docs/Stratagene%20Quikchange%20mutagenesis.pdf#:~:text=The%20QuikChange%20sitedirected%20mutagenesis%20kit%20is%20used%20to,potential%20for%20generating%20random%20mutations%20during%20the%20reaction (2005).
  33. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  34. Expasy.org. , Available from: https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam (2022).
  35. Karlsson, R. Real-time competitive kinetic analysis of interactions between low-molecular-weight ligands in solution and surface-immobilized receptors. Analytical Biochemistry. 221 (1), 142-151 (1994).
  36. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods Molecular Biology. 627, 15-54 (2020).
  37. Barnes, O., et al. SARS-CoV-2 neutralizing antibody structures inform therapeutic strategies. Nature. 588 (7839), 682-687 (2020).
  38. Using reichert Surface Plasmon Resonance (SPR) for Antiviral Development, Application Note 28. , Available from: https://www.reichertspr.com/clientuploads/directory/application_notes/Application_Note_28__Using_Reichert_Surface_Plasmon_Resonance_for_Antiviral_Testing.pdf (2022).
  39. Sundberg, E. J., Andersen, P. S., Gorshkova, I. I., Schuck, P. Surface plasmon resonance biosensing in the study of ternary systems of interacting proteins. Protein Interactions: Biophysical Approaches for the Study of Complex Reversible Systems. Schuck, P. 5, Springer. New York. 97-141 (2007).
  40. Method Development Notes. , Available from: https://www.reichertspr.com/applications/method-development-notes/ (2022).
  41. Angulo, J., Enríquez-Navas, P. M., Nieto, P. M. Ligand-receptor binding affinities from saturation transfer difference (STD)-NMR spectroscopy: the binding Isotherm of STD initial growth rates. Chemistry. 16 (26), 7803-7812 (2010).
  42. Goldflam, M., Tarragó, T., Gairí, M., Giralt, E. NMR studies of protein-ligand interactions. Methods in Molecular Biology. 831, 233-259 (2012).
  43. Kumar, S., Maurya, V. K., Prasad, A. K., Bhatt, M. L. B., Saxena, S. K. Structural, glycosylation and antigenic variation between 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) and SARS coronavirus (SARS-CoV). Virusdisease. 31 (1), 13-21 (2020).

Tags

Bioengineering Utgåva 184 Cyanovirin-N ytplasmonresonans mättnadsöverföringsskillnad-NMR kuvertspikar glykan rekombinant glykoprotein
Tekniska antivirala medel <em>via</em> ytplasmonresonans
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maier, I. Engineering Antiviral… More

Maier, I. Engineering Antiviral Agents via Surface Plasmon Resonance. J. Vis. Exp. (184), e63541, doi:10.3791/63541 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter