Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Frysfrakturelektronmikroskopi för extracellulär vesikelanalys

Published: September 16, 2022 doi: 10.3791/63550
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Medicine, Institute of Cell Biology, University of Ljubljana

Summary

Vi presenterar ett protokoll för isolering och frysfrakturering av extracellulära vesiklar (EV) med ursprung i cancerösa urotelceller. Frysfrakturtekniken avslöjade elbilarnas diameter och form och - som en unik funktion - den interna organisationen av EV-membranen. Dessa är av enorm betydelse för att förstå hur elbilar interagerar med mottagarmembranen.

Abstract

Extracellulära vesiklar (EV) är membranbegränsade strukturer som frigörs från cellerna till det extracellulära utrymmet och är inblandade i intercellulär kommunikation. Elbilar består av tre populationer av vesiklar, nämligen mikrovesiklar (MV), exosomer och apoptotiska kroppar. Det begränsande membranet hos elbilar är avgörande involverat i interaktionerna med mottagarcellerna, vilket kan leda till överföring av biologiskt aktiva molekyler till mottagarcellerna och följaktligen påverka deras beteende. Frysfrakturelektronmikroskopitekniken används för att studera den interna organisationen av biologiska membran. Här presenterar vi ett protokoll för MV-isolering från odlade cancerösa urotelceller och frysfraktur av MV i stegen för snabb frysning, sprickbildning, tillverkning och rengöring av replikerna och analys av dem med transmissionselektronmikroskopi. Resultaten visar att protokollet för isolering ger en homogen population av elbilar, vilket motsvarar formen och storleken på MVs. Intramembranpartiklar finns huvudsakligen i det begränsande membranets protoplasmiska yta. Därför är frysfraktur den teknik som valts för att karakterisera MV: s diameter, form och fördelning av membranproteiner. Det presenterade protokollet är tillämpligt på andra populationer av elbilar.

Introduction

Extracellulära vesiklar (EV) är membranbegränsade vesiklar som frigörs från celler till det extracellulära utrymmet. De tre huvudpopulationerna av elbilar är exosomer, mikrovesiklar (MV) och apoptotiska kroppar, som skiljer sig åt i ursprung, storlek och molekylär sammansättning 1,2,3. Elbilarnas sammansättning återspeglar donatorcellens molekylära profil och dess fysiologiska status (dvs. frisk eller sjuk)4,5. Detta ger elbilar enorm potential i diagnos, prognos och behandling av mänskliga sjukdomar, och de har lovande medicinska tillämpningar för användning i personlig medicin 6,7,8.

Elbilar är medlare för intercellulär kommunikation. De innehåller biologiskt aktiva proteiner, lipider och RNA, som stör biologiska processer i mottagarcellen och kan ändra dess beteende 9,10. Sammansättningen av EV-begränsande membran är dock avgörande för interaktionen med mottagarcellmembranet.

Källorna till elbilar är kroppsvätskor och konditionerade odlingsmedier. För att isolera en EV-population måste en lämplig isoleringsteknik användas. Till exempel ger centrifugering vid 10 000 × g en fraktion berikad i MV, medan centrifugalkrafter på ≥100 000 × g ger en fraktion berikad i exosomer11,12. Den isolerade delen av elbilar måste valideras med avseende på renhet, storlek och form. För detta ändamål rekommenderade International Society for Extracellular Vesicles 2018 tre klasser av högupplösta bildtekniker: elektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi och ljusmikroskopibaserad superupplösningsmikroskopi13. Ingen av dessa tekniker kan ge information om EV-membranets inre.

Frysfrakturelektronmikroskopi är en teknik för att bryta frysta prover för att avslöja deras inre strukturer, särskilt för att ge en bild av membranets inre. Stegen för provberedning är (1) snabb frysning, (2) sprickbildning, (3) att göra repliken och (4) rengöring av repliken14. I steg 1 fixeras provet (valfritt) kemiskt, kryoskyddas med glycerol och fryses i flytande freon. I steg 2 bryts det frusna provet i en frysfrakturenhet, som exponerar membranets inre dubbelskikt. I steg 3 skuggas de exponerade spruckna ytorna med platina (Pt) och kol (C) för att producera repliker. I steg 4 avlägsnas det organiska materialet. Repliken analyseras i transmissionselektronmikroskopet (TEM). För korrekt tolkning av mikrograferna måste man följa riktlinjer för deras korrekta orientering14,15. Kortfattat är skuggriktningen i mikrografen en referens för att orientera mikrografen (dvs. för att bestämma riktningen för Pt-skuggning) och följaktligen för att bestämma konvexa och konkava former (Figur 1). Två inre vyer som kallas brutna ytor på membranbilagret kan ses som ett resultat av att membranet splittras genom frysfrakturering: det protoplasmiska ansiktet (P-ansiktet) och det exoplasmatiska ansiktet (E-ansiktet). P-ansiktet representerar membranbroschyren intill cellprotoplasman, medan E-ansiktet representerar membranbroschyren intill det extracellulära utrymmet. Integrerade membranproteiner och deras associationer ses som utskjutande intramembranpartiklar14,15.

Här är målet att tillämpa frysfrakturtekniken för att karakterisera MV när det gäller storlek, form och strukturen hos deras begränsande membran. Här presenterar vi ett protokoll för isolering och frysfrakturering av MV som härrör från humana invasiva urinblåscancerösa urotelceller.

Protocol

1. Odling av cancerösa urotelceller och isolering av elbilar

OBS: Ett protokoll för att erhålla elbilar från en human invasiv urinblåsecancer urotelial (T24) cellinje presenteras. Odlingsförhållandena måste dock optimeras för att använda andra celltyper.

  1. Platta T24-celler med en densitet av 3 × 104 celler/cm2 i tre kolvar (odlingsyta på 75 cm2) och börja med att odla cellerna i en CO2-inkubator i 3 dagar vid 37 °C och en 5%CO2 (figur 2A).
    1. Använd ett odlingsmedium för T24-celler i en 1:1 (v/v) blandning av A-DMEM och F12 kompletterat med 5% fetalt bovint serum (FBS), 4 mM Glutamax, 100 mg/ml streptomycin och 100 U/ml penicillin.
      OBS: Följande isolering ger elbilar berikade i MV. Innan isoleringen påbörjas, inspektera cellerna med ett ljusmikroskop för att bekräfta livskraft och sammanflöde (figur 2B). Börja samla in elbilarna från de konditionerade odlingsmedierna när T24-cellerna har 70% sammanflöde.
  2. Samla odlingsmediet med MV med en pipett från kolvar (T75) till koniska centrifugrör (figur 2C). Centrifugera vid 300 × g i 10 min vid 4 °C (figur 2D).
  3. Samla försiktigt supernatanten i ett nytt centrifugrör med pipetten (figur 2E).
  4. Centrifugera supernatanten vid 2 000 × g i 20 minuter vid 4 °C.
  5. Samla försiktigt supernatanten med pipetten i ett nytt centrifugrör.
  6. Centrifugera vid 10 000 × g i 40 minuter vid 4 °C. Leta efter närvaron av en vitaktig pellet längst ner på röret.
    OBS: Byt vid behov centrifugrotorn för att nå önskad g-kraft. EV-pelleten ses som en vit pellet i botten av centrifugröret (figur 2F); markera dess plats för att undvika att förlora pelleten under pipettering (figur 2G).
  7. Kassera försiktigt supernatanten med en pipett. Tillsätt 1,5 ml PBS till pelleten och återsuspendera pelleten som innehåller MV. Sätt suspensionen i ett nytt centrifugrör.
  8. Centrifugera vid 10 000 × g i 40 minuter vid 4 °C och leta efter närvaron av en vit pellet i botten av röret.
    OBS: EV-pelleten ses som en vit lapp längst ner på centrifugröret; markera dess plats för att undvika att förlora pelleten under pipettering.
  9. Kassera försiktigt supernatanten med en pipett. Tillsätt försiktigt fixeringsmedlet, 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkacodylatbuffert (pH 7,2). Låt stå i 20 minuter vid 4 °C (figur 2H).
    VARNING: Glutaraldehyd och natriumkacodylat är giftiga. Arbeta i en dragskåp, använd skyddshandskar och kassera dem på lämpligt sätt.
  10. Ta försiktigt bort fixeringsmedlet med en pipett. Tillsätt tvättbuffert (0,1 M natriumkacodylatbuffert) till pelleten. Låt stå i 10 min vid 4 °C utan att pelleten återanvänds.

2. Frysning av elbilar

OBS: Innan du fryser, först kryoskydda proverna med glycerol.

  1. Förbered 0,1 M natriumkacodylatbuffert. Ta bort tvättbufferten och tillsätt 50 μl 30% glycerol i 0,1 M cacodylatbuffert. Dra försiktigt tillbaka elbilarna för att göra lösningen homogen. Inkubera i 30 min vid 4 °C.
  2. Rengör kopparbärarna med en central grop i ultraljudsbadet med kloroform i 5 minuter (figur 3A). Lufttorka dem och markera dem med färger om du använder flera prover (figur 3B). Håll bärarna på en torr, ren plats fram till användning (t.ex. på linspapper i en petriskål). Rör inte bärarna med bara händer.
    1. Förbered pipetter, lösningar, filterpapper, pincett, ett stereomikroskop, en Dewar-kolv med freon och flytande kväve (LN2), en metallstav och kryotyper. Kyl ner det med LN2.
      VARNING: Använd skyddsutrustning och arbeta därefter vid hantering av LN2 och kyld freon.
  3. Resuspendera elbilarna igen innan de fryser. Undvik bildandet av luftbubblor.
    OBS: Utför steg 2.4-2.7 snabbt.
  4. Arbeta under ett stereomikroskop (figur 3C). Överför 1,5-1,7 μl av provet till kopparbärarens centrala grop för att göra ett konvext fall som når högre än kopparbärarkanten utan att spilla provet över kanten (figur 3D). Vid överdosering, använd filterpapper för att torka bärarens yttre ring.
  5. Blanda stelnad freon med en metallstav för att kondensera den igen (figur 3E).
  6. Greppa kopparbärarens yttre ring med pincett och sänk ner den i kyld freon med en försiktig skakning av pincett i 8 s (figur 3F). Efter 8 s, överför snabbt bäraren till en annan Dewar-kolv fylld med LN2.
  7. Fortsätt omedelbart med sprickbildning eller lagring av proverna i LN2. I det senare fallet markerar du en kryovial och kyler injektionsflaskan och pincettspetsarna genom att sänka ner dem i LN2 (figur 3G). Under LN2, samla frysta kopparbärare i injektionsflaskan, stäng den och förvara dem i LN2-behållaren (figur 3H) tills frysfrakturering.

3. Sprickbildning av elbilar och tillverkning av repliker

OBS: Förbered frysfraktureringsenheten enligt tillverkarens bruksanvisning. (Figur 4A). Rengör enhetens kammare. Placera platina( Pt/C) och kol (C) kanoner i vinklar på 45° respektive 90° (figur 4B).

  1. Starta enhetens vakuumsystem. När ett tryck på 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) uppnås, kyl ner enhetskammaren till −150 °C.
  2. Överför kopparbärarna med frysta prover till en frysfraktureringsenhet med torr pincett (figur 4C). Använd kryotransfer eller arbeta snabbt för att undvika upptining av provet och avsättning av iskristallerna. Säkra bärarna på provbordet.
  3. Vänta tills vakuumet når igen 6,6 × 10−2 Pa (5 × 10−4 Torr) och ställ sedan in knivtemperaturen på −100 °C (figur 4D).
  4. Vänta tills vakuumet når 1,0 × 10−3 Pa (8 × 10−6 Torr).
  5. Observera provet med kikare och närma dig försiktigt kniven (figur 4E).
  6. Börja sektionera provet genom att slå på knivens motoriserade rörelse (figur 4F) och sektion tills provets yta är jämn (figur 4G).
  7. För sprickbildning, stäng av knivens motoriserade rörelse och fortsätt med långsam manuell kontroll av kniven och därigenom spricka provet (figur 4H). För att skydda den spruckna ytan från att bilda iskristaller och skräp tills de skuggas, flytta kniven ovanför det brutna provet.
  8. Fortsätt med Pt-skuggningen vid 45 ° (figur 4I, J).
    1. Förbered ett stoppur och / eller slå på kvartskristallmonitorn på frysfraktureringsenheten, vilket möjliggör övervakning av tjockleken på Pt på provet. Den rekommenderade tjockleken på Pt-skiktet mätt på kvartskristallmonitorn är 2,5 nm, vilket motsvarar 4 s skuggning vid en given hög spänning och ström (dvs. hastigheten för Pt-skuggning är 0,63 nm / s).
    2. Innan du börjar skugga, flytta kniven bort från provet. Applicera hög spänning på Pt/C-pistolen (1 600 V) och öka strömmen till 60 mA. Gnistor av Pt ska visas och bör börja skugga provet. Starta nu nedräkningen på 4 s och / eller observera och lokalisera pt-positionen på kvartskristallmonitorn.
      OBS: Den rekommenderade tjockleken på C-skiktet är 2,5 nm, vilket motsvarar 10 s skuggning vid en given hög spänning och ström.
    3. Stäng av strömmen och högspänningen när önskad tjocklek på Pt erhålls.
  9. Fortsätt med C-skuggningen vid 90 ° (dvs. hastigheten för C-skuggning är 0,25 nm / s).
    1. Applicera hög spänning på C-pistolen (1 900 V), öka strömmen till 90 mA, och gnistor av C ska dyka upp och börja skugga provet; i det ögonblicket, starta nedräkningen på 10 s. Stäng av strömmen och högspänningen när önskad tjocklek på C erhålls.

4. Rengöring av repliker och replikanalys

  1. Använd kopparbärarna från provbordet och överför dem med pincett till destillerat vatten vid rumstemperatur i en porslinsplatta med 12 brunnar (figur 4K). Replikerna flyter på vattenytan medan bärarna sjunker (figur 4L).
  2. Överför replikerna med en trådslinga från destillerat vatten till en brunn med natriumhypoklorit. Täck och lämna över natten vid rumstemperatur i en dragskåp.
    VARNING: Natriumhypoklorit är giftigt. Arbeta i en dragskåp, använd skyddshandskar och kassera dem på lämpligt sätt.
  3. Överför replikerna till ddH2O och tvätta i 30 minuter. Upprepa 3 gånger.
  4. Överför replikerna med en trådslinga till ett TEM-rutnät i kopparnät (t.ex. fyrkantigt eller bikakenät med över 100 sidor). Lufttorka gallret i 2 timmar och förvara dem sedan i en gallerförvaringslåda tills mikroskopi.
    OBS: I allmänhet kan galler lagras i månader i mörka, torra, rumstemperaturförhållanden.
  5. Använd ett TEM-mikroskop för att avbilda replikerna och få mikrografer.
    1. Det gör du genom att sätta in ett TEM-rutnät med en replik och starta TEM-avbildning enligt tillverkarens bruksanvisningar. Arbeta vid 80 kV eller 100 kV.
  6. Inspektera provet och skaffa mikrografer vid lägre och högre förstoringar med en kamera på TEM.
  7. Analysera MVs mikrografer. För mätningar av MV-diametrarna, använd Fiji/ImageJ-programvara16. Diametern på MVs är 4/π gånger mätningen på mikrograferna enligt Hallett et al.17.

Representative Results

MV isolerades från det konditionerade mediet av cancerurotelial T24-celler efter differentiella centrifugeringar. Efter protokollet detekterades EV-fraktionen först efter centrifugering vid 10 000 × g när den sågs som en vit pellet (figur 2G).

Därefter bearbetades elbilarna enligt ovanstående protokoll och undersöktes enligt TEM. Pt/C-skuggning producerade (figur 4L) relativt stora repliker som ofta bröts upp i mindre fragment under rengöringssteget. Stora repliker och deras mindre fragment plockades på TEM-rutnätet och jämfördes under mikroskopet. Resultaten visade inga skillnader i kvaliteten på replikytorna oavsett storlek, och de kan därför alla användas. Undersökningar med låg förstoring visade regioner i repliken med i) en homogen yta (bakgrund), ii) konkava och konvexa sfäriska profiler (vesiklar) och iii) regioner med skadad yta (artefakter; Figur 5A). Typiska artefakter sågs som sprickor, veck och oregelbundna dimmerskuggor (dvs kopior av iskristallavlagringar på provet). Det är också viktigt att notera att inga cellrester eller cellulära organeller sågs, vilket bekräftar provets renhet (figur 5B).

De isolerade vesiklarna samlades vanligtvis antingen i kluster om tre eller fler eller var individuellt fördelade (figur 5B). Blåsorna var sfäriska, vilket pekar på god bevarande av ultrastrukturen under isolering, fixering och frysning (figur 5C). "Flat-ball" och långsträckta vesiklar (figur 5C), som sågs ibland, var förmodligen artefakter av beredning och inkluderades inte i de efterföljande mätningarna av vesikeldiametern. Diametern på de synliga profilerna var 238,5 nm (±8,0 nm, n = 190), vilket med hänsyn till den korrektionsfaktor som föreslagits av Hallett et al.17 motsvarar den genomsnittliga vesikeldiametern på 304 nm (±10 nm; Figur 5D). Storleken korrelerar med ett diameterområde för MV mellan 100 nm och 1000 nm och bevisar effektiviteten hos det använda isoleringsprotokollet. Bilderna av vesiklarna tillsammans med diameterbestämning bekräftade otvetydigt att elbilarna i isolatet var berikade med MV.

Analysen av replikerna avslöjade organisationen av P-ansikte och E-ansikte av MV-begränsande membran. MV observerades som konkava och konvexa runda former (figur 5C,E,F), vilket återspeglar sprickplanet. De konvexa formerna representerar E-ansikten (dvs. frakturerad exoplasmatisk bipacksedel av membranen; Figur 5E). Elbilarnas exoplasmiska ansikten hade ett jämnt, enhetligt utseende. De konkava formerna motsvarar P-ansikten (figur 5F). I P-ansikten sågs några utskjutande intramembranpartiklar i släta membran (figur 5C,F). Detta innebär att MV isolerade från cancer urotelial T24-celler endast innehåller en låg mängd membranproteiner.

Figure 1
Figur 1: Schematisk presentation av membranbestämning efter frysfrakturering. (B) Mikrovesikeln är begränsad med P- och E-membranbroschyr tills frysfraktionering, vilket delar upp broschyrerna och exponerar insidan av broschyrer, så kallade brutna ansikten. (C) Efter Pt / C-skuggning kan två brutna ansikten urskiljas: det protoplasmiska ansiktet (P-ansiktet) med en konvex form som vetter mot cytoplasman (protoplasma) och ett exoplasmiskt ansikte (E-ansikte) med en konkav form som vetter mot det extracellulära utrymmet. Bild 1 skapades med hjälp av Biorender.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Isolering av elbilar (A) T24-celler som odlas i en CO2-inkubator undersöks med (B) ett ljusmikroskop för att bekräfta deras livskraft och sammanflöde före MV-isolering. C) Cellodlingsmediet uppsamlas och (D) centrifugeras i följd vid 300 × g och vid 2 000 × g (E) varje gång supernatanten uppsamlas. (F,G) Efter centrifugeringen vid 10 000 × g är en vit lapp som indikerar en pellet synlig och markerad. Supernatanten avlägsnas och (H) fixeringsmedel tillsätts försiktigt till pelleten utan att den återsuspergeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Frysning av elbilar. Mikrovesiklar återsuspenderas i glycerol för att få ett homogent prov och (C) läggs till en central grop av en cooperbärare under ett stereomikroskop. (D) Man måste tillsätta en volym av provet så att det bildar en konvex droppe i den centrala gropen. (E) Blanda LN2-kyld freon omedelbart före frysning med en metallstav för att kondensera freon. (F) Frys provet genom att sänka det i freon och sedan (G) överföra det till LN2. (H) Bärare med det frysta provet kan samlas upp i kryotyper och förvaras i en LN2 Dewar-behållare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Bild 4: Frysfrakturering och tillverkning av en replika. Inuti enhetskammaren (B) finns en platina (Pt) och kol (C) elektronpistol, en kniv och provbordet. (C) För att starta sprickbildning överförs bärare med provet till provtabellen, (D) frysfraktureringsenheten kyls och ett vakuum upprättas. (E) Sektionering görs genom motoriserad (F) rörelse av kniven, men sprickbildning görs företrädesvis manuellt. (G) Prov före sektionering och (H) efter sprickbildning. (I) Omedelbart efter sprickbildning görs repliken. (J) Under denna process skuggas Pt på provet. Platinaskuggning ses som ett starkt ljus (gnistor) i kammaren. (K) Provbärare samlas upp i en porslinsbrunn fylld med vatten. (L) Replika (pil) som flyter i natriumhypokloritlösningen under rengöringssteget. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Elektronmikrografer av frysfrakturerade och Pt/C-skuggade MV(A) En översikt över den frysfrakturerade och skuggade EV-pelleten (i) vid lägre förstoring. Den homogena ytan är bakgrund (ii), ljusa områden är sprickor i replikerna (iii), mörkare områden är veck av repliker (asterisk) och oregelbundna dimmerskuggor beror på iskristaller (två asterisker). (B) Kluster av rundformade elbilar med konkava och konvexa ytor. (C) Hög förstoring av elfordon. I konvexa frakturer, som uppvisar P-ansiktet på EV-membranen, ses intramembranpartiklar (pilar) och fläckar av en slät yta (pilspetsar). Extracellulära vesiklar med långsträckta (stjärna) och platta bollformer (två stjärnor) finns. D) Medeldiametern för isolerade uroteliala MV är 304 nm ± 10 nm enligt de storleksmått som föreslagits av Hallett et al.17. Data presenteras som medelvärde ± SEM. (E,F) E-ansikte och P-ansikte av MVs. Legend: pilar = intramembranpartiklar i P-ansikte, omringade pilar = riktningen för Pt / C-skuggning. Skalstänger: A = 10 μm, B-F = 400 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Karakteriseringen av MV, eller någon annan population av isolerade elbilar, är av största vikt till att börja med innan nedströmsanalyser som "omics" -studier eller funktionella studier11,18 påbörjas. Häri isolerades elbilar från human invasiv blåscancer urotelial T24-celler genom centrifugering, och enligt det tillhandahållna protokollet för analys med frysfrakturelektronmikroskopi visade vi att den isolerade fraktionen berikades i MV11,13. Isolatet av MV saknade cellrester eller organeller, vilket bekräftade ett framgångsrikt isolerings- och reningsprotokoll.

Kombinationen av kemisk fixering och frysning, som är kritiska steg i protokollet, behöll den sfäriska formen på EV12. Försiktighetsåtgärder krävs dock vid bedömning av EV-diameter genom frysfrakturering17. Eftersom frakturen passerar slumpmässigt genom provet delas MV-membran upp i sina ekvatoriella och icke-ekvatoriella plan. För att ge en rigorös metod för att analysera bilderna av frysfrakturerade och skuggade exemplar visade Hallett m.fl. att den genomsnittliga vesikeldiametern är 4/π gånger den faktiska storleken på vesikulärdiametern på bilden17. Med hänsyn till det beräknades elbilar från T24-celler ha en diameter på 304 nm, vilket passar in i MV: s teoretiska storleksfördelningsområde på 100-1000 nm19.

Frysfrakturering kan komplettera negativ färgning, den mest använda TEM-tekniken för att visualisera elbilar. Genom negativ färgning fixeras provet vanligtvis kemiskt, torkas och fästs på ett TEM-rutnät och kontrasteras med uranyllösning. Utan att stödja media tenderar elbilar att kollapsa, vilket ger dem ett koppformat utseende. Genom frysfrakturering visar vi att MV är sfärer, vilket återspeglar deras form i extracellulära utrymmen och kroppsvätskor12. Därmed överensstämmer våra resultat också med observationer av elbilar i kryo-ultratunna avsnitt20.

En avgörande fördel med frysfrakturtekniken är dess förmåga att lösa den interna organisationen av det begränsande membranet, vilket är en nyckelfaktor för att förstå hur elbilar riktas mot och interagerar med mottagarmembran. Här analyserade vi membranen hos MV, men frysfrakturering kunde avslöja membranorganisationen för alla andra populationer av elbilar. MVs bildas av plasmamembran spirande; därför förväntas plasmamembranproteiner och proteinkluster hittas i MV-membranet. Våra resultat stödde att MV från T24-celler innehöll intramembranpartiklar och presenterade integrerade membranproteiner. Baserat på partikelfördelning mellan E-ansiktet och P-ansiktet är det rimligt att förvänta sig att partiklarna som observerats i MV är transmembranproteiner uroplakiner, som är urotelialcellsspecifika21,24. De observerade partiklarna var glesa, vilket är i enlighet med tidigare studier som rapporterar en minskning av uroplakiner under urotelial carcinogenes 21,22,23. För att ytterligare undersöka proteinsammansättningen i MV-membran rekommenderas dock användning av fril-tekniken (freeze-fracture replica immune-labeling). FRIL är en uppgradering av den presenterade frysfrakturtekniken och är dedikerad till att avslöja identiteten hos proteiner i repliker genom antikroppsigenkänning24,25. Sammanfattningsvis är frysfrakturtekniken en elektronmikroskopiteknik som är lämplig för karakterisering av EV-begränsande membran, liksom formen, storleken och renheten hos de isolerade EV-fraktionerna. Det presenterade protokollet kan också användas för bedömning av andra populationer av isolerade elbilar; därför förtjänar frysfraktureringstekniken att inkluderas i International Society for Extracellular Vesicles riktlinjer för studier som utforskar organisationen av EV-begränsande membran.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna forskning finansierades av den slovenska forskningsbyrån (forskningskärnfinansiering nr. P3-0108 och projekt J7-2594) och MRIC UL IP-0510 Infrastrukturprogram. Detta arbete bidrar till COST Action CA17116 International Network for Translating Research on Perinatal Derivatives into Therapeutic Approaches (SPRINT), med stöd av COST (European Cooperation in Science and Technology). Författarna vill tacka Linda Štrus, Sanja Čabraja, Nada Pavlica Dubarič och Sabina Železnik för teknisk hjälp med cellodling och förberedelse av proverna och Marko Vogrinc, Ota Širca Roš och Nejc Debevec för teknisk hjälp med att förbereda videon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A-DMEM ThermoFisher Scientific, USA 12491015
Balzers freeze-fracture device Balzers AG, Liechtenstein Balzers BAF 200
Centrifuge Eppendorf, Germany model 5810R
CO2 incubator HeraCell  Heraues, Germany
Copper carriers Balzers BB 113 142-2 100+ mesh
Copper grids SPI, United States 2010C
Culture flask T75 TPP, Switzerland growing surface 75 cm2
F12 (HAM) Sigma-Aldrich, Germany 21765029
FBS Gibco, Life Technologies, USA 10500064
Glazed Porcelain Plate 6 Well Fischer Sientific, United States 50-949-072
Glycerol Kemika, Croatia 711901 final concentration 30 % (v/v)
Glutaradehyde  Serva, Germany 23114.01 final concentration 2.5 % (v/v)
GlutaMAX Gibco, Life Technologies 35050-079 final concentration 4 mM
Penicillin Gibco, Life Technologies 15140163 final concentration 100 U/ml
Phase-contast inverted microscope Nikon, Japan model Eclipse
Rotor Eppendorf, Germany A 4-44
Rotor  Eppendorf, Germany F-34-6-38
Serological pipetts TPP, Switzerland 50mL volume
Sodium hypochloride solution in water Carlo Erba, Italy 481181
Stereomicroscope Leica, Germany
Streptomycin Gibco, Life Technologies 35050038 final concentration 100 mg/mL
Transmission electron microscope Philips, The Netherlands model CM100 working at 80 kV
Tweezers SPI, United States

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Willms, E., Cabanas, C., Mager, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738 (2018).
  3. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).
  4. Cocucci, E., Racchetti, G., Meldolesi, J. Shedding microvesicles: Artefacts no more. Trends in Cell Biology. 19 (2), 43-51 (2009).
  5. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 318 (1), 29-39 (2020).
  6. Tricarico, C., Clancy, J., D'Souza-Schorey, C. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  7. Georgantzoglou, N., Pergaris, A., Masaoutis, C., Theocharis, S. Extracellular vesicles as biomarkers carriers in bladder cancer: Diagnosis, surveillance, and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2744 (2021).
  8. Słomka, A., Urban, S. K., Lukacs-Kornek, V., Żekanowska, E., Kornek, M. Large extracellular vesicles: Have we found the holy grail of inflammation. Frontiers in Immunology. 9, 2723 (2018).
  9. Han, L., Lam, E. W. F., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: Old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
  10. Muralidharan-Chari, V., Clancy, J. W., Sedgwick, A., D'Souza-Schorey, C. Microvesicles: Mediators of extracellular communication during cancer progression. Journal of Cell Science. 123, 1603-1611 (2010).
  11. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 968-977 (2016).
  12. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3, Unit 3.22 (2006).
  13. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  14. Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2 (3), 547-576 (2007).
  15. Severs, N. J., Robenek, H. Freeze-fracture cytochemistry in cell biology. Methods in Cell Biology. 88, 181-186 (2008).
  16. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  17. Hallett, F. R., Nickel, B., Samuels, C., Krygsman, P. H. Determination of vesicle size distributions by freeze-fracture electron microscopy. Journal of Electron Microscopy Technique. 17 (4), 459-466 (1991).
  18. Nigro, A., et al. Selective loss of microvesicles is a major issue of the differential centrifugation isolation protocols. Scientific Reports. 11, 3589 (2021).
  19. Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1153 (2017).
  20. Iliev, D., et al. Stimulation of exosome release by extracellular DNA is conserved across multiple cell types. The FEBS Journal. 285 (16), 3114-3133 (2018).
  21. Zupančič, D., Zakrajšek, M., Zhou, G., Romih, R. Expression and localization of four uroplakins in urothelial preneoplastic lesions. Histochemistry and Cell Biology. 136 (4), 491-500 (2011).
  22. Wu, X. R., Manabe, M., Yu, J., Sun, T. T. Large scale purification and immunolocalization of bovine uroplakins I, II, and III. Molecular markers of urothelial differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 19170-19179 (1990).
  23. Kreft, M. E., Hudoklin, S., Jezernik, K., Romih, R. Formation and maintenance of blood-urine barrier in urothelium. Protoplasma. 246 (1-4), 3-14 (2010).
  24. Kreft, M. E., Robenek, H. Freeze-fracture replica immunolabelling reveals urothelial plaques in cultured urothelial cells. PLoS One. 7 (6), 38509 (2012).
  25. Robenek, H., et al. Topography of lipid droplet-associated proteins: Insights from freeze-fracture replica immunogold labeling. Journal of Lipids. 2011, 409371 (2011).

Tags

Cancerforskning nummer 187
Frysfrakturelektronmikroskopi för extracellulär vesikelanalys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Resnik, N., Romih, R., Kreft, M. E., … More

Resnik, N., Romih, R., Kreft, M. E., Hudoklin, S. Freeze-Fracture Electron Microscopy for Extracellular Vesicle Analysis. J. Vis. Exp. (187), e63550, doi:10.3791/63550 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter