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Bioengineering

एक्सोसोम-आधारित डोपामाइन वाहक प्रणाली तैयार करना और चिह्नित करना

Published: April 4, 2022 doi: 10.3791/63624
Automatic Translation
1,2, 3,4,5,6, 2,7, 2, 2, 8, 8, 3,4,5,6,9
1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

Summary

यहां, हमने व्हार्टन की जेली मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से स्टेम कोशिकाओं के पृथक एक्सोसोम के डोपामाइन लोडिंग द्वारा एक सूत्रीकरण प्राप्त करने का लक्ष्य रखा। एक्सोसोम अलगाव और लक्षण वर्णन, परिणामी एक्सोसोम में दवा लोड करना, और विकसित फॉर्मूलेशन की साइटोटोक्सिक गतिविधि को इस प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है।

Abstract

आकार में 40 और 200 एनएम के बीच एक्सोसोम बाह्य पुटिकाओं के सबसे छोटे उपसमूह का गठन करते हैं। कोशिकाओं द्वारा स्रावित ये बायोएक्टिव पुटिकाएं अंतरकोशिकीय कार्गो और संचार में सक्रिय भूमिका निभाती हैं। एक्सोसोम ज्यादातर शरीर के तरल पदार्थ जैसे प्लाज्मा, मस्तिष्कमेरु द्रव, मूत्र, लार, एमनियोटिक द्रव, कोलोस्ट्रम, स्तन के दूध, संयुक्त द्रव, वीर्य और फुफ्फुस एसिड में पाए जाते हैं। एक्सोसोम के आकार को ध्यान में रखते हुए, यह सोचा जाता है कि वे केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं क्योंकि वे रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) से गुजर सकते हैं। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य व्हार्टन की जेली मेसेनकाइमल स्टेम सेल (डब्ल्यूजे-एमएससी) से अलग एक्सोसोम में डोपामाइन को एनकैप्सुलेट करके एक एक्सोसोम-आधारित नैनोकैरियर सिस्टम विकसित करना था। लक्षण वर्णन प्रक्रिया को पारित करने वाले एक्सोसोम को डोपामाइन के साथ इनक्यूबेट किया गया था। डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम को इनक्यूबेशन के अंत में फिर से चिह्नित किया गया था। डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम की जांच दवा रिलीज और साइटोटॉक्सिसिटी परख में की गई थी। परिणामों से पता चला कि डोपामाइन को एक्सोसोम के भीतर सफलतापूर्वक समझाया जा सकता है और डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करते हैं।

Introduction

एक्सोसोम, महत्वपूर्ण विशेषताओं के साथ बायोएक्टिव पुटिका, आकार में 40 एनएम से 200 एनएम तक होती है। एक्सोसोम कोशिका झिल्ली से उत्पन्न होते हैं और एंडोसोम1 की रिहाई के कारण बनते हैं। ये संरचनाएं सेल-टू-सेल कम्युनिकेटर के रूप में काम करती हैं और सक्रिय अणुओं के हस्तांतरण की सुविधा के लिए पड़ोसी कोशिकाओं के साथ बातचीत करती हैं। एक्सोसोम को कई अलग-अलग स्रोतों से अलग किया जा सकता है। इनमें शरीर के तरल पदार्थ जैसे प्लाज्मा, मूत्र, मस्तिष्कमेरु द्रव, लार, साथ ही इन विट्रो स्थितियों के तहत संवर्धित सेल लाइनें शामिल हैं। तंत्रिका क्षति के उन्मूलन में एक्सोसोम की महत्वपूर्ण भूमिका होती है, बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स के लिए धन्यवाद, जैसे लिपिड, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड2। ग्लिया, जो तंत्रिका तंत्र3 की सहायक कोशिकाएं हैं, एक्सोसोम4 के माध्यम से न्यूरॉन्स के अक्षतंतु में प्रोटीन और माइक्रो आरएनए को स्थानांतरित करती हैं।

माइलिन म्यान बनाने वाले लिपिड, जो तंत्रिका चालन में एक विशिष्ट विशेषता हैं, एक्सोसोम 4,5 के माध्यम से ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स से भी जारी किए जाते हैं। एक्सोसोम मस्तिष्क 6,7 में सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी, न्यूरोनल तनाव प्रतिक्रिया, सेल-सेल संचार और न्यूरोजेनेसिस जैसी प्रक्रियाओं में भी शामिल हैं। तथ्य यह है कि एक्सोसोम में नैनो-आयाम होते हैं, जो उन्हें बीबीबी से गुजरने में सक्षम बनाता है। इस झिल्ली को भेदने के बाद अंतरालीय द्रव से मस्तिष्कमेरु द्रव तक एक विशेष संक्रमण मार्ग होताहै। उनके सतह गुणों के लिए धन्यवाद, एक्सोसोम एक दवा वितरण प्रणाली के रूप में लक्ष्य कोशिकाओं के साथ कुशलता से बातचीत कर सकते हैं और सक्रिय रूप से भरी हुई दवाओं को वितरित कर सकते हैं।

एक्सोसोम की सतह पर विभिन्न चिपकने वाले प्रोटीन (टेट्रास्पैनिन और इंटीग्रिन) की अभिव्यक्ति के कारण, ये बाह्य पुटिकाएं आसानी से मेजबान कोशिका झिल्ली के साथ बातचीत और फ्यूज कर सकतीहैं। यह माना जाता है कि एक्सोसोम का उपयोग दवा वितरण प्रणाली के रूप में किया जा सकता है, विशेष रूप से बीबीबी और उनके सतह गुणों में प्रवेश करने की उनकी क्षमता के कारण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोगों के उपचार में। मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) -व्युत्पन्न एक्सोसोम में एलोजेनिक सेलुलर उपचारों की तुलना में प्रतिरक्षा अस्वीकृति का कम जोखिम होता है, और इस संबंध में, वे सेल-मुक्तउपचार अनुप्रयोगों का एक महत्वपूर्ण घटक हो सकते हैं।

डोपामाइन एक अणु है जिसकी मस्तिष्क में कमी पार्किंसंस रोग (पीडी) की विशेषता है, जो दिन-प्रतिदिन 11,12,13 बिगड़ती जा रही है। यह ज्ञात है कि पीडी मेसेन्सेफेलॉन के ठोस निग्रा में डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स के अध: पतन और मोटर न्यूरॉन कार्यों14,15 के नुकसान से जुड़ा हुआ है। डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स की मृत्यु मस्तिष्क स्ट्रेटम को न्यूरोट्रांसमीटर डोपामाइन की आपूर्ति को रोकती है। यह बदले में, पीडी-विशिष्ट लक्षणों के उद्भव में परिणामदेता है। पीडी के ये लक्षण ब्रैडीकिनेसिया, पोस्टुरल अस्थिरता, कठोरता और विशेष रूप से आराम करने वाले कंपकंपी12,13 हैं। यद्यपि पीडी को पहली बार दो शताब्दियों से अधिक पहले वर्णित किया गया था, रोग की विकृति और एटियलजि को समझने के लिए अध्ययन अभी भी चल रहे हैं और वर्तमान में यह स्वीकार किया जाता है कि पीडी एक जटिलप्रणालीगत बीमारी है। यह भविष्यवाणी की जाती है कि डोपामाइन की कमी होती है, और नैदानिक पीडी लक्षण तब देखे जाते हैं जब 80% से अधिक न्यूरॉन्स पतितहो जाते हैं। रोग के उपचार में, मोटर लक्षणों को कम करने के लिए अपूर्ण डोपामाइन पूरकता को प्राथमिकता दी जाती है। विवो अध्ययनों से पता चला है कि मस्तिष्क में डोपामाइन का प्रत्यक्ष जलसेकजानवरों में लक्षणों को काफी कम कर देता है। क्लिनिक में डोपामाइन अग्रदूत जैसे एल-डीओपीए (एल -3,4-डिहाइड्रॉक्सीफेनिलएलनिन) और डोपामाइन रिसेप्टर दवाओं का उपयोग किया जाता है क्योंकि मस्तिष्क में डोपामाइन का प्रत्यक्ष जलसेक मनुष्यों में संभव नहीं है और सिस्टम में प्रवेश करने वाला डोपामाइन बीबीबी20 को पार नहीं कर सकता है। इस प्रकार की दवाएं समय के साथ अपनी प्रभावशीलता खो देती हैं। इसलिए, रोग के पैथोफिज़ियोलॉजी को प्रकट करने और रोगियों पर पीडी के प्रभाव को कम करने के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों और उपचार के तौर-तरीकों को विकसित करने की एक बड़ी आवश्यकता है।

एक्सोसोम-आधारित अध्ययनों ने हाल ही में तंत्रिका तंत्र रोगों के चिकित्सीय दृष्टिकोण और विकृति दोनों के बारे में जानकारी इकट्ठा करने के लिए ध्यान आकर्षित किया है। एमएससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम को तंत्रिका क्षति में सूजन को कम करने और न्यूरोनल पुनर्जनन21,22,23 में योगदान करने के लिए दिखाया गया है। इसके अलावा, यह बताया गया है कि एमएससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम स्राव न्यूरोट्रॉफिक और न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव दिखाकर एपोप्टोसिस को कम करते हैं, विशेष रूप से डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स24,25 पर। उन प्लेटफार्मों पर अनुसंधान जिसमें एक्सोसोम का उपयोग चिकित्सीय दवा वितरण प्रणाली के रूप में किया जाता है, हाल के वर्षों में गहन रूप से तेज हो गया है। कई अध्ययनों में, यह देखा गया है कि प्रासंगिक दवाओं को आसानी से एक्सोसोम में समझाया जा सकता है और लक्ष्य कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों में सुरक्षितरूप से पहुंचाया जा सकता है। एक्सोसोम28 में दवा लोडिंग के लिए इनक्यूबेशन, फ्रीज / पिघलना चक्र, सोनिकेशन और एक्सट्रूज़न जैसे विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है।

एक्सोसोम या एक्सोसोम जैसी पुटिकाओं के साथ कॉइनक्यूबेशन लिपोफिलिक छोटे अणुओं को इन वितरण प्रणालियों 28,29,30 में निष्क्रिय रूप से समझाया जा सकता है। विशेष रूप से, विभिन्न अणु जैसे कि कर्क्यूमिन31, कैटालेज 30, डॉक्सोर्यूबिसिन 32, और पैक्लिटैक्सेल33 को प्रभावी रूप से एक्सोसोम में लोड किया गया था। यह देखा गया है कि कैटालेज युक्त एक्सोसोम, जिनमें एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि होती है, मस्तिष्क में न्यूरॉन्स और माइक्रोग्लियल कोशिकाओं में कुशलता पूर्वक जमा होते हैं और मजबूत न्यूरोप्रोटेक्टिवगतिविधियों का प्रदर्शन करते हैं। उसी अध्ययन में, लोडिंग दक्षता बढ़ाने के लिए परिसर में जोड़े गए सैपोनिन को30,34 इनक्यूबेशन दौरान दवा लोडिंग प्रतिशत में वृद्धि करने के लिए पाया गया था। हालांकि, एक्सोसोम में दवा लोडिंग के मानकों को स्थापित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।

यह पेपर डोपामाइन को एक्सोसोम में एनकैप्सुलेशन द्वारा एक नैनोकैरियर सिस्टम के विकास का वर्णन करता है जो डब्ल्यूजे-एमएससी से अलग थे। डब्ल्यूजे-एमएससी की खेती, एक्सोसोम के अलगाव और लक्षण वर्णन, दवा लोडिंग प्रयोगों, विभिन्न तकनीकों के साथ डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम के लक्षण वर्णन और इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी विश्लेषण सहित सभी चरणों को विस्तार से समझाया गया है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों और उपकरणों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. व्हार्टन की जेली मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं का संवर्धन और क्रायोप्रिजर्वेशन।

  1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से डब्ल्यूजे-एमएससी (एटीसीसी से) निकालें। कोशिकाओं को डीएमईएम-एफ 12 माध्यम युक्त फ्लास्क में बीज दें जो 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक है। उन्हें 5% सीओ2 युक्त इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. हर 2 दिनों में संस्कृति माध्यम बदलें। 80% संगम तक पहुंचने पर कोशिकाओं को पारित करें। कोशिकाओं को 5 मिलीलीटर फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के साथ पारित करने के लिए धोएं।
    नोट: ट्रिप्सिन जोड़ने से पहले पीबीएस के साथ धोना फ्लास्क की सतह से कोशिकाओं का आसान पृथक्करण सुनिश्चित करता है।
  3. पीबीएस को निकालें और फ्लास्क में ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें। फ्लास्क को 5% सीओ2 युक्त इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. ट्यूब में तैरनेवाला इकट्ठा करें और 5 मिनट के लिए 1,500 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और पाइपिंग द्वारा ट्यूब में डीएमईएम-एफ 12 + 10% एफबीएस के 1 एमएल जोड़ें।
  5. कोशिकाओं को एक बड़े फ्लास्क में स्थानांतरित करें और डीएमईएम-एफ 12 + 10% एफबीएस जोड़कर संस्कृति को जारी रखें जब तक कि पर्याप्त एक्सोसोमप्राप्त न हो जाएं।
    नोट: सुसंस्कृत कोशिकाओं को 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) के साथ 1 मिलियन / एमएल के घनत्व पर जमे हुए हैं और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

2. व्हार्टन की जेली मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से एक्सोसोम का उत्पादन

एक्सोसोम को सुसंस्कृत डब्ल्यूजे-एमएससी से अलग किया जाता है। एक्सोसोम अलगाव तब किया जाता है जब कोशिकाएं फ्लास्क की सतह को कवर करती हैं और लगभग 80% घनत्व तक पहुंच जाती हैं।

  1. फ्लास्क से 10% एफबीएस युक्त सुपरनैटेंट माध्यम को हटा दें और 5 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें। पीबीएस के साथ कुल्ला करने के बाद कोशिकाओं में सीरम-मुक्त डीएमईएम-एफ 12 माध्यम जोड़ें। 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट फ्लास्क। इनक्यूबेशन बाद, ट्यूब में सीरम मुक्त माध्यम एकत्र करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: चरण 2.1 में, सीरम-मुक्त माध्यम के 180 एमएल एकत्र और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है। पिघलने के बाद, एक बैच सेंट्रीफ्यूजेशन प्रक्रिया शुरू की जाती है, जैसा कि नीचे वर्णित है।
  2. एक्सोसोम का अलगाव
    1. एकत्रित सीरम-मुक्त माध्यम को 300 x g पर 10 मिनट के लिए +4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को सावधानी से वापस लें और इसे दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. एकत्र किए गए सुपरनैटेंट को +4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को सावधानी से वापस लें और इसे दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    3. एकत्र किए गए सुपरनैटेंट को 10,000 × ग्राम पर 30 मिनट के लिए +4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनैटेंट को सावधानी से वापस लें और इसे दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. एकत्रित सतह पर तैरनेवाला को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में 130 मिनट के लिए 110,000 × ग्राम पर स्थानांतरित करें। धीरे-धीरे सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और गोली में 1 एमएल पीबीएस जोड़ें।
    5. 110,000 × ग्राम पर +4 डिग्री सेल्सियस36 पर 70 मिनट के लिए पेलेट और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज को भंवर (चित्रा 1)। धीरे-धीरे सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और गोली में 1 एमएल पीबीएस जोड़ें।
      नोट: अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन चरण ों के पूरा होने के बाद, प्राप्त एक्सोसोम को -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। प्राप्त गोली अब लक्षण वर्णन के लिए तैयार है।

Figure 1
चित्र 1: एक्सोसोम अलगाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. एक्सोसोम का लक्षण वर्णन।

  1. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए)
    नोट: नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण पृथक एक्सोसोम के आकार और एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। 1x PBS समाधान के लिए उपयोग की जाने वाली गोलियाँ pH 7.3-7.5 की सीमा में होनी चाहिए। 1x PBS समाधान में 10 mM फॉस्फेट बफर, 137 mM सोडियम क्लोराइड और 2.7 mM पोटेशियम क्लोराइड होता है। 100 एमएल आसुत जल में 1 पीबीएस टैबलेट जोड़कर घोल तैयार किया जाता है। इस तैयार समाधान को ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल किया जाता है।
    1. एक्सोसोम के 10 μL में 990 μL PBS जोड़कर एक्सोसोम को 100 गुना पतला करें। पतला निलंबन को डिस्पोजेबल सिरिंज में लें।
    2. NTA डिवाइस चालू करें और कंप्यूटर कनेक्ट करें। सॉफ़्टवेयर खोलें.
    3. सिरिंज में नमूने को डिवाइस के कैसेट अनुभाग में टयूबिंग में इंजेक्ट करें। डिवाइस के कैसेट कवर को बंद करें।
    4. खुलने वाले सॉफ़्टवेयर में, स्टार्ट एनालिसिस बटन पर क्लिक करें। प्राप्त परिणामों को रिकॉर्ड बटन दबाकर सहेजें.
  2. गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन विश्लेषण
    नोट: जेटा क्षमता और आकार माप के लिए अलग किए गए एक्सोसोम को भी एनटीए विश्लेषण के समान ही पतला किया जाता है।
    1. एक्सोसोम के 20 μL में 980 μL PBS जोड़ें।
    2. Zeta साइज़िंग डिवाइस और कनेक्टेड कंप्यूटर खोलें। सॉफ़्टवेयर खोलें.
    3. डिस्पोजेबल क्यूवेट में चरण 3.2.1 से निलंबन जोड़ें। डिवाइस का ढक्कन खोलें, कैसेट में क्यूवेट रखें, और ढक्कन बंद करें।
    4. डिवाइस के सॉफ़्टवेयर में क्यूवेट प्रकार का चयन करें। ज़ेटा क्षमता और आयामी विश्लेषण के लिए प्रारंभ विश्लेषण बटन पर क्लिक करें।
      नोट: आयामी विश्लेषण और ज़ेटा क्षमता के लिए विश्लेषण अलग से किए जाते हैं।

4. एक्सोसोम में डोपामाइन लोड हो रहा है।

नोट: डब्ल्यूजे-एमएससी एक्सोसोम के लक्षण वर्णन पूरा होने के बाद, डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम को दवा वितरण प्रणाली के रूप में प्राप्त किया गया था। एक्सोसोम में दवा लोडिंग इनक्यूबेशन विधि का उपयोग करके की जाती है।

  1. चरण 2.2.5 से एक्सोसोम निलंबन में पीबीएस के 3 एमएल जोड़ें। 0.22 μm फिल्टर का उपयोग करके निस्पंदन द्वारा पतला निलंबन को निष्फल करें। स्टरलाइज्ड एक्सोसोम सस्पेंशन के 500 μL को दूसरी ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  2. आसुत जल के साथ डोपामाइन समाधान (0.5 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें। एक्सोसोम युक्त ट्यूबों में डोपामाइन घोल के 500 μL जोड़ें।
  3. चरण 4.2 में निलंबन में सैपोनिन जोड़ें। तैयार एक्सोसोम-डोपामाइन निलंबन को 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: सैपोनिन एकाग्रता कुल समाधान के 0.002% से अधिक नहीं होनी चाहिए।
  4. माध्यम से मुक्त डोपामाइन और सैपोनिन को हटाने के लिए 70 मिनट के लिए 90,000 × ग्राम पर निलंबन को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज करें। पृथक एक्सोसोम को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि आगेके विश्लेषण के लिए उपयोग न किया जाए।
    नोट: तैयार डोपामाइन समाधान की स्थिरता के लिए 0.02% एस्कॉर्बिक एसिड जोड़ें।

5. डोपामाइन लोडेड एक्सोसोम का लक्षण वर्णन।

  1. नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए)
    नोट: नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण पृथक एक्सोसोम के आकार और एकाग्रता को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।
    1. एक्सोसोम को पतला करने और एनटीए करने के लिए चरण 3.1.1-3.1.4 का पालन करें।
  2. गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन विश्लेषण
    नोट: जेटा क्षमता और आकार माप के लिए पृथक एक्सोसोम भी एनटीए विश्लेषण के समान पतला हैं।
    1. एक्सोसोम को पतला करने और गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन विश्लेषण करने के लिए चरण 3.2.1-3.2.4 का पालन करें।
      नोट: प्रत्येक समाधान (सैपोनिन, डोपामाइन, एक्सोसोम-डोपामाइन) के लिए आकार और ज़ेटा क्षमता का अलग से विश्लेषण किया जाता है।

6. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी)

नोट: एक्सोसोम में लोड किए गए डोपामाइन की मात्रा को उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) विधि द्वारा मापा जाता है। प्राप्त फॉर्मूलेशन के भीतर डोपामाइन की उपस्थिति का पता लगाने के लिए, एक्सोसोम को एक विशेष प्रक्रिया द्वारा विस्फोट किया जाता है।

  1. फॉर्मूलेशन को वाष्पित करने के लिए 75 डिग्री सेल्सियस हीटर में रखें। निलंबन और भंवर में एसिटोनिट्राइल (50: 50 अनुपात) जोड़ें। 10 मिनट के लिए घोल को सोनियादें।
  2. 10,000 × ग्राम पर 10 मिनट के लिए घोल को सेंट्रीफ्यूज करें। 0.22 μm फ़िल्टर के माध्यम से सतह पर तैरने वाला फ़िल्टर करें।
  3. 1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर 30 डिग्री सेल्सियस पर सी 18 कॉलम का उपयोग करके सभी विश्लेषणों का विश्लेषण करें (मोबाइल चरण एच2ओ / एसिटोनिट्राइल)। 230 एनएम38 पर अवशोषण को मापें।

7. ड्रग लोडिंग क्षमता (डीएल) माप और इन विट्रो ड्रग रिलीज कैनेटीक्स।

  1. दवा लोडिंग क्षमता (डीएल)
    नोट: एक्सोसोम में लोड किए गए डोपामाइन की मात्रा यूवी-विस स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके निर्धारित की जाती है। अवशोषण 280 एनएम पर पढ़ा जाता है। संश्लेषण के दौरान एकत्र किए गए सुपरनैटेंट का उपयोग अनलोडेड दवा की मात्रा को मापने के लिए किया जाता है। सतह पर तैरनेवाला में डोपामाइन एकाग्रता डोपामाइन के लिए एक मानक अंशांकन वक्र के माध्यम से निर्धारित की जाती है।
    1. डोपामाइन के 1 मिलीग्राम / एमएल का स्टॉक समाधान तैयार करें। आसुत जल का उपयोग करके स्टॉक समाधान से 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 और 0.5 मिलीग्राम / एमएल की सांद्रता तैयार करें।
      नोट: तैयार डोपामाइन समाधान की स्थिरता के लिए 0.02% एस्कॉर्बिक एसिड जोड़ें।
    2. यूवी-स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 280 एनएम पर डोपामाइन के प्रत्येक कमजोर पड़ने के अवशोषण को मापकर एक मानक अंशांकन वक्र उत्पन्न करें।
    3. 280 एनएम पर सुपरनैटेंट के अवशोषण को मापें।
    4. ईक्यू (1)39 का उपयोग करके डोपामाइन के लिए दवा लोडिंग क्षमता की गणना करें।
      डीएल (%) = Equation 1 100 (1)
      नोट: विश्लेषण तीन प्रतियों में किया जाता है।
  2. इन विट्रो ड्रग रिलीज कैनेटीक्स।
    नोट: डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम की दवा रिलीज कैनेटीक्स एक डायलिसिस झिल्ली का उपयोग करके किया जाता है। पीबीएस, पीएच 7.4, का उपयोग शारीरिक माइक्रोएन्वायरमेंट को अनुकरण करने के लिए रिलीज माध्यम के रूप में किया जाता है।
    1. डायलिसिस झिल्ली में डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम के 1 एमएल जोड़ें। झिल्ली को एक बीकर में रखें। बीकर में पीबीएस के 15 एमएल जोड़ें।
    2. 0.5, 1, 2, 4, 6, और 8 घंटे पर बीकर में रिलीज माध्यम का नमूना 1 मिलीलीटर। प्रत्येक समय बिंदु पर, नमूने की मात्रा को ताजा पीबीएस के साथ बदलें। यूवी-विस स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके 280 एनएम पर निर्दिष्ट अंतराल पर लिए गए नमूनों का विश्लेषण करें।
    3. Eq (2)40 का उपयोग करके परिणामों की गणना करें।
      रिलीज (%) = Equation 2 100 (2)
      नोट: इन विट्रो ड्रग रिलीज कैनेटीक्स के निर्धारण के लिए एक अंशांकन वक्र तैयार किया गया है। डोपामाइन समाधान 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, और 5.0 मिलीग्राम / एमएल सांद्रता पर तैयार किया जाता है। प्रत्येक एकाग्रता का यूवी अवशोषण मूल्य यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 280 एनएम पर निर्धारित किया जाता है।

8. इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी टेस्ट

  1. फाइब्रोब्लास्ट का पुनरोद्धार और संस्कृति।
    1. -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से फाइब्रोब्लास्ट निकालें। कोशिकाओं को डीएमईएम-एफ 12 + 10% एफबीएस युक्त फ्लास्क में बीज दें।
    2. 5% सीओ2 युक्त इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। हर 2 दिनों में संस्कृति माध्यम बदलें।
    3. कोशिकाओं को तब तक पारित करें जब तक कि वे 80% संगम तक न पहुंच जाएं। चरण 1.3-1.5 का पालन करें। 5 मिनट के लिए 1,500 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरने वाले को हटा दें, डीएमईएम-एफ 12 + 10% एफबीएस के 1 एमएल जोड़ें, और 96 वेल प्लेट में प्रति कुएं 10,000 कोशिकाओं को बीज दें।
      1. डीएमईएम-एफ 12 मध्यम + 10% एफबीएस जोड़ें और 5% सीओ2 युक्त इनक्यूबेटर में 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंत में कुओं का माध्यम बदलें।
    4. डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम सस्पेंशन का स्टॉक तैयार करें। 100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL, और 1,000 μL/mL की सांद्रता प्राप्त करने के लिए माध्यम के साथ डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम फॉर्मूलेशन को पतला करें।
    5. 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं के भीतर कोशिकाओं पर तैयार सांद्रता जोड़ें। 5% सीओ241 युक्त इनक्यूबेटर में 18 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  2. एमटीटी सेल व्यवहार्यता परख
    नोट: इनक्यूबेशन के अंत में, कोशिकाओं के व्यवहार्यता अनुपात एमटीटी परीक्षण द्वारा निर्धारित किए जाते हैं।
    1. पीबीएस के साथ एमटीटी समाधान (5 मिलीग्राम / एमएल) तैयार करें। प्रत्येक कुएं में 10 μL MTT घोल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    2. इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक कुएं में डीएमएसओ के 100 μL जोड़ें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्लेटों को इनक्यूबेट करें। एलिसा रीडर में अवशोषण मूल्यों को 570 एनएम42,43 पर मापें।
      नोट: एमटीटी व्यवहार्यता परीक्षण तीन प्रतियों में किया जाता है।

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Representative Results

एक्सोसोम अलगाव और लक्षण वर्णन।
व्हार्टन जेली स्टेम कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए सीरम-मुक्त माध्यम में सुसंस्कृत और इनक्यूबेट किया जाता है जब संस्कृति पर्याप्त घनत्व तक पहुंच जाती है। इनक्यूबेशन के अंत के बाद, सतह पर तैरनेवाला -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होता है। एकत्रित सुपरनैटेंट को पीबीएस के साथ पतला किया जाता है और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के अधीन किया जाता है (चित्रा 1)। प्राप्त समाधान का विश्लेषण एनटीए और डीएलएस विश्लेषण द्वारा किया जाता है। एक्सोसोम को 0.22 μm फ़िल्टर से गुजरकर निष्फल किया जाता है। प्राप्त एक्सोसोम का औसत आकार 98 एनएम निर्धारित किया गया था (वीडियो 1)। सेंट्रीफ्यूजेशन के अंत में लगभग 10 बिलियन एक्सोसोम कण प्राप्त किए गए थे। एनटीए और डीएलएस विश्लेषणों द्वारा सामने आए नैनोकणों की संख्या एक दूसरे के अनुरूप हैं। इसके अलावा, डब्ल्यूजे-एमएससी से उत्पन्न एक्सोसोम की जेटा क्षमता को -15.7 एमवी (चित्रा 2 और चित्रा 3) के रूप में मापा गया था।

वीडियो 1: व्हार्टन जेली-व्युत्पन्न एक्सोसोम का नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

एक्सोसोम में डोपामाइन लोड करना।
जैसा कि एनटीए विश्लेषण में गणना की गई है, व्हार्टन की जेली से पृथक नमूनों के 500 μL में लगभग 1.5 बिलियन नैनोकण थे। डोपामाइन समाधान (5 मिलीग्राम / एमएल) को एक्सोसोम के 500 μL के साथ मिलाया गया था, और निलंबन को 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। इनक्यूबेशन बाद, प्राप्त समाधान एनटीए और डीएलएस विश्लेषणों की विशेषता थी। एनटीए के परिणामों के अनुसार, समाधान का औसत कण आकार 110 एनएम पाया गया। एक्सोसोम और डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम के कण आकार की तुलना से पता चलता है कि डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम के आयामों में उल्लेखनीय वृद्धि हुई थी। एनटीए और डीएलएस विश्लेषणों द्वारा सामने आए नैनोकणों की संख्या एक दूसरे के अनुरूप थी। इसके अलावा, डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम की जेटा क्षमता को -17.6 एमवी (चित्रा 2 और चित्रा 3) के रूप में मापा गया था।

वीडियो 2: डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम का नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

नमूना Zeta postal
एक्सोसोम। -15.7 एमवी ± 1.1
सैपोनिन -12 एमवी ± 0.7
डोपामाइन -14.4 एमवी ± 1.3
डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम -17.6 एमवी ± 0.8

तालिका 1: सभी समाधानों की ज़ेटा क्षमता।

डीएसएल विश्लेषण, डोपामाइन, सैपोनिन और डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम समाधान की ज़ेटा संभावित तालिका 1 में दिखाई गई है।

Figure 2
चित्रा 2: एक्सोसोम का नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण। (ए) एक्सोसोम; (बी) डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: ज़ेटासाइज़र विश्लेषण । (ए) एक्सोसोम, (बी) डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम, (सी) सैपोनिन, (डी) डोपामाइन। संक्षिप्त नाम: डी = आकार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समाधान में डोपामाइन की उपस्थिति एचपीएलसी विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी। डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज किया गया और मुक्त डोपामाइन को हटाने के लिए फ़िल्टर किया गया। यदि एक्सोसोम में डोपामाइन लोडिंग इनक्यूबेशन के अंत में सफल होती है, तो एक्सोसोम के टूटने के बाद डोपामाइन के प्रत्यक्ष माप से इसका पता लगाया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम सस्पेंशन को भाप के साथ गर्म किया गया था, एसिटोनिट्राइल जोड़ा गया था, और निलंबन को सोनिकेटेड किया गया था। बाधित एक्सोसोम से जारी डोपामाइन की मात्रा का आकलन करने के लिए अवशोषण को 230 एनएम पर मापा गया था।

Figure 4
चित्रा 4: एचपीएलसी विश्लेषण द्वारा निर्धारित सूत्रीकरण में डोपामाइन की उपस्थिति। सभी विश्लेषण 30 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल / मिनट की प्रवाह दर पर एच2ओ / एसिटोनिट्राइल के मोबाइल चरण के साथ सी -18 कॉलम का उपयोग करके किए गए थे। डोपामाइन के क्षालन की निगरानी के लिए अवशोषण को 230 एनएम पर मापा जाता है। (ए) डोपामाइन, (बी) सैपोनिन, (सी) डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम। संक्षिप्त नाम: एचपीएलसी = उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

एचपीएलसी विश्लेषण के परिणामस्वरूप, डोपामाइन के लिए परिणामी शिखर 6.45 मिनट पर देखा गया था। एक्सोसोम विखंडन (चित्रा 4) के बाद सैपोनिन की उपस्थिति का भी पता चला था।

ड्रग लोडिंग क्षमता और इन विट्रो ड्रग रिलीज कैनेटीक्स।
डोपामाइन लोडिंग क्षमता की गणना यूवी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री माप और ईक्यू (1) और ईक्यू (2) का उपयोग करके की गई थी। लोडिंग क्षमता प्रतिशत 10.89 ± 0.33 पाया गया। संचयी दवा रिलीज प्रोफ़ाइल चित्रा 5 में दिखाया गया है। 8 घंटे के लिए निगरानी की गई ड्रग रिलीज़ कैनेटीक्स से पता चला कि पहले 8 घंटे के भीतर एक्सोसोम से 74.8% एन्कैप्सुलेटेड डोपामाइन जारी किया गया था (चित्रा 5)।

Figure 5
चित्रा 5: संचयी दवा रिलीज प्रोफ़ाइल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इन विट्रो साइटोटॉक्सिसिटी टेस्ट
फाइब्रोब्लास्ट ्स पर डोपामाइन-लोडेड और फ्री एक्सोसोम की साइटोटॉक्सिसिटी की जांच की गई। फाइब्रोब्लास्ट्स को विभिन्न सांद्रता के योगों (100 μL/mL, 250 μL/mL, 500 μL/mL, और 1,000 μL/mL) के संपर्क में लाया गया और 18 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया। यद्यपि डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम ने किसी भी उल्लेखनीय साइटोटोक्सिक प्रभाव का प्रदर्शन नहीं किया, सैपोनिन ने डोपामाइन के एनकैप्सुलेशन को बढ़ाने के लिए फॉर्मूलेशन में जोड़ा जिससे फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार्यता कम हो गई (पी < 0.05, चित्रा 6)। सेल व्यवहार्यता में वृद्धि हुई थी जब फाइब्रोब्लास्ट को डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम के साथ 500 μL / mL एकाग्रता तक इलाज किया गया था। 18 घंटे की इनक्यूबेशन के अंत में, सेल व्यवहार्यता एमटीटी परीक्षण (चित्रा 7) द्वारा निर्धारित की गई थी। परिणामों के सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन एक-तरफ़ा एनोवा का प्रदर्शन करके किया गया था।

Figure 6
चित्रा 6: कोशिकाओं के साथ सूत्रीकरण के इनक्यूबेशन के बाद माइक्रोस्कोप छवियां (10x)। (ए) डोपामाइन, (बी) सैपोनिन, (सी) डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम 100 μL/mL, (D) डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम 250 μL/mL, (E) डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम 500 μL/mL, (F) डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम 1,000 μL/mL। स्केल सलाखों = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: एमटीटी व्यवहार्यता परीक्षण के सांख्यिकीय विश्लेषण के परिणामों में डोपामाइन, सैपोनिन और डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम की विभिन्न सांद्रता के साथ 18 घंटे के लिए इनक्यूबेट की गई कोशिकाएं होती हैं । (ए) साइटोटॉक्सिसिटी परिणाम, (बी, सी) सांख्यिकीय विश्लेषण। संक्षेप: डी = डोपामाइन; एस = सैपोनिन; एक्सो-डीए 1 = डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम 100 μL / एक्सो-डीए 2 = डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम 250 μL / एक्सो-डीए 3 डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम 500 μL / एक्सो-डीए 4 = डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम 1,000 μL / एमटीटी = 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल)-2,5-डाइफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

इसके अतिरिक्त, मुक्त एक्सोसोम के साइटोटोक्सिक प्रभावों की भी समान सांद्रता में फाइब्रोब्लास्ट पर जांच की गई (चित्रा 8)। प्रयोग से पहले, एक्सोसोम को पीबीएस के साथ 60 मिलियन कण प्रति एमएल तक पतला किया गया था। फिर, एक्सोसोम सस्पेंशन के 10 μL, 25 μL, 50 μL, और 100 μL को 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में जोड़ा गया।

Figure 8
चित्रा 8: एमटीटी व्यवहार्यता परीक्षण के सांख्यिकीय विश्लेषण के परिणामस्वरूप एक्सोसोम की विभिन्न सांद्रता के साथ 18 घंटे के लिए इनक्यूबेट की गई कोशिकाएं होती हैं । (ए) साइटोटॉक्सिसिटी परिणाम, (बी, सी) सांख्यिकीय विश्लेषण। संक्षेप: एक्सो = एक्सोसोम; एमटीटी = 3-(4,5-डाइमिथाइलथियाज़ोल-2-वाईएल)-2,5-डाइफेनिलटेट्राज़ोलियम ब्रोमाइड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फाइब्रोब्लास्ट व्यवहार्यता अन्य सांद्रता की तुलना में 500 μL / mL डोपामाइन-लोडेड एक्सोसोम और 25 μL / mL मुक्त एक्सोसोम के साथ अधिक पाई गई। हालांकि, किसी भी एकाग्रता पर कोई महत्वपूर्ण साइटोटॉक्सिसिटी नहीं देखी गई।

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Discussion

एक्सोसोम छोटे झिल्ली पुटिका होते हैं जिनमें अधिकांश कोशिका प्रकारों द्वारा स्रावित 40-200 एनएम के आयाम होते हैं, उदाहरण के लिए, एमएससी1। कोशिकाओं के बीच संचार को सक्षम करने में सक्षम, एक्सोसोम एंडोसाइटोसिस, फागोसाइटोसिस, माइक्रोपिनोसाइटोसिस, लिपिड-मध्यस्थता आंतरिककरण और संलयन33,44 जैसे विभिन्न तरीकों से कोशिकाओं में प्रवेश कर सकते हैं। अन्य नैनोकैरियर प्रणालियों की तुलना में, एक्सोसोम सतह पर पाए जाने वाले लिपिड और कोलेस्ट्रॉल हाइड्रोफिलिक और हाइड्रोफोबिक अणुओं दोनों को ले जाने की क्षमता प्रदान करते हैं, जिसमें कोलेस्ट्रॉल के हाइड्रोजन बॉन्डिंग के साथ तंग पैकेजिंगकी अनुमति मिलती है।

वर्तमान अध्ययन में एमएससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम, ड्रग लोडिंग प्रयोगों और साइटोटॉक्सिसिटी परख का अलगाव किया गया था। यह ज्ञात है कि एक्सोसोम की न्यूरोजेनेसिस में एक महत्वपूर्ण भूमिका है, विशेष रूप से मस्तिष्क में, उनके महत्वपूर्ण कार्यों जैसे कार्गो और कोशिकाओं के बीच संचार 6,7। इसके अलावा, एमएससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम अपेक्षाकृत अच्छी तरह से सहन किए जाते हैं, अंतर्निहित चिकित्सीय गुण होते हैं, और उच्च स्थिरता और होमिंग क्षमता46,47 दिखाते हैं। हाल के वर्षों में, एक्सोसोम अनुप्रयोगों जैसे नैनोस्केल उपचार विधियों पर शोध ने न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के खिलाफ वैकल्पिक उपचार के रूप में व्यापक ध्यान आकर्षित किया है क्योंकि न्यूरोनल क्षति के कारण इन विकारों का कोई इलाज नहीं है। इसके अलावा, एक्सोसोम की बीबीबी से गुजरने की क्षमता उन्हें दवा वाहक प्रणाली के रूप में उत्कृष्ट मंच बनाती है।

यद्यपि एक्सोसोम अलगाव के लिए कई तरीके हैं, यहां, हमने अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज अलगाव विधि का उपयोग किया, जिसे सबसे प्रभावी तरीकों में से एक के रूप में स्वीकार किया जाता है। वर्तमान अध्ययन में, दाता कोशिकाओं के रूप में चयनित डब्ल्यूजे-एमएससी को उनकी कम इम्युनोजेनिक क्षमता47 के लिए जाना जाता है औरनैदानिक परीक्षणों में एक्सोसोम के स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है। प्राप्त एक्सोसोम को तब डोपामाइन समाधान के साथ इनक्यूबेट किया गया था, जिसके दौरान दवा लोडिंग की सफलता को बढ़ाने के लिए समाधान में सैपोनिन जोड़ा जाता है। इनक्यूबेशन के अंत में, माध्यम से मुक्त डोपामाइन और सैपोनिन को हटा दिया गया था। सैपोनिन से एक्सोसोम के झिल्ली-बाध्य कोलेस्ट्रॉल को चुनिंदा रूप से हटाने और एक्सोसोमल लिपिड बाइलेयर में छिद्र बनाने की उम्मीद है, जिससे डोपामाइन अणुओं के प्रवेश को बढ़ावा मिलता है। नतीजतन, यह देखा गया है कि एक्सोसोम के आयाम थोड़ा बढ़ गए, शायद डोपामाइन लोडिंग के कारण।

जेटा क्षमता कणों और एकत्रित करने की उनकी प्रवृत्ति के बीच अधिक इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण दिखाती है। प्राप्त सूत्रीकरण की जेटा क्षमतापिछले अध्ययनों के परिणामों के साथ संगत थी। इनक्यूबेशन अवधि के अंत में किए गए एचपीएलसी विश्लेषण में, एक्सोसोम के विखंडन के बाद डोपामाइन की उपस्थिति का पता चला था। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, सैपोनिन डोपामाइन के एनकैप्सुलेशन को बढ़ावा देता है। दवा लोडिंग क्षमता को यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा अवशोषण मूल्यों39 के आधार पर मापा गया था। यद्यपि दवा लोडिंग के लिए इनक्यूबेशन विधि अन्य तरीकों की तुलना में सरल और कम खर्चीली है,इस विधि में लोडिंग दक्षता कम है। इस अध्ययन में, लोडिंग क्षमता लगभग 11% थी। सैपोनिन साइटोप्लाज्मिक झिल्ली50 के लिए एक प्रभावी परमेबिलाइजिंग एजेंट है और डोपामाइन के साथ एक्सोसोम की लोडिंग क्षमता को बढ़ाता प्रतीत होता है।

भविष्य के अध्ययनों में, एक्सोसोमल दवालोडिंग दक्षता को बढ़ाने के लिए सोनिकेशन विधि को प्राथमिकता देना अधिक प्रभावी हो सकता है। संचयी दवा रिलीज प्रोफाइल से पता चला कि इनक्यूबेशन के 8 घंटे के अंत में बड़ी मात्रा में डोपामाइन जारी किया गया था। इन विट्रो रिलीज अध्ययन के पहले 5 घंटों में एक विस्फोटक रिलीज देखी गई थी। चूंकि एक्सोसोम फॉर्मूलेशन की रिलीज प्रोफाइल कई मापदंडों पर निर्भर करती है जैसे कि दवा गुण, बाइलेयर तरलता, और आणविक वजन,कई अध्ययनों में प्रति घंटे जारी दवाओं की मात्रा में अंतर देखा जा सकता है। इसके अलावा, इस अध्ययन में फाइब्रोब्लास्ट ्स पर फॉर्मूलेशन का कोई साइटोटोक्सिक प्रभाव नहीं देखा गया था। हालांकि, एक्सोसोम में डोपामाइन लोडिंग को बढ़ाने के लिए जोड़े गए सैपोनिन के विषाक्त प्रभाव का फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं पर पता चला था। इन आंकड़ों के अनुसार, लिपोसोम, माइक्रोसेफर्स, माइक्रोइमल्शन और अन्य सिंथेटिक दवावितरण प्रणालियों की तुलना में एक्सोसोम का अंतबिंदु एक प्राकृतिक और अद्वितीय लाभ है। वर्तमान विधि के नुकसान को कम करने के लिए, विभिन्न अभिकर्मक अभिकर्मकों, इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीकों, या अंतर्जात डोपामाइन-उत्पादक कोशिकाओं, अधिमानतः आनुवंशिक रूप से संशोधित एमएससी, का उपयोग एक्सोसोम के स्रोत के रूप में किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के साथ एक्सोसोम आइसोलेशन आयोजित किया गया था। हालांकि, अलगाव चरण एक बहुत लंबी और कठिन प्रक्रिया है। यह सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखा जाना चाहिए कि सेल कल्चर से एकत्र किया गया सुपरनैटेंट सीरम-मुक्त माध्यम में है। इसके अलावा, आज तक, एक्सोसोम की मात्रा प्रोटीन एकाग्रता से जुड़ी हुई है। हालांकि, हम प्रस्ताव करते हैं कि एक्सोसोम कणों की संख्या की गणना और लागू करने से नैदानिक अध्ययनों में सटीकता बढ़ाने में मदद मिल सकती है। पृथक एक्सोसोम की दवा लोडिंग के लिए इस्तेमाल की जाने वाली इनक्यूबेशन विधि दवा लोडिंग क्षमता के मामले में कम पाई गई। सोनिकेशन विधि, जिसमें उच्च दवा लोडिंग क्षमता है, अधिक प्रभावी परिणाम प्राप्त करने में मदद कर सकती है।

इन निष्कर्षों से पता चला है कि डब्ल्यूजे-एमएससी-व्युत्पन्न एक्सोसोम डोपामाइन डिलीवरी के लिए शक्तिशाली वाहक हैं। बीबीबी को पारित करने की उनकी क्षमता और उनके इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गुणों के साथ, पार्किंसंस या किसी अन्य सीएनएस रोगों के लिए लक्षित उपचार दवा-ले जाने वाले एक्सोसोम के साथ विकसित किए जा सकते हैं। हालांकि, अध्ययन विवो में किया जाना चाहिए और नैदानिक परीक्षणों के साथ समर्थित होना चाहिए।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

Acknowledgments

काम मुख्य रूप से यिल्दिज़ तकनीकी विश्वविद्यालय वैज्ञानिक अनुसंधान परियोजनाओं (टीएसए -2021-4713) द्वारा प्रदान किए गए अनुसंधान वित्त पोषण द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm membrane filter Aisimo Used for the sterilization process
0.45 µm syringe filter Aisimo Used for the sterilization process
15 mL Falcon tube Nest Used in cell culture step
25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks Nest Used in cell culture step
50 mL Falcon tube Nest Used in cell culture step
75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks Nest Used in cell culture step
96 well plates (Falcon, TPP microplates) Merck Millipore Used in cell culture step
Acetonitrile Sigma 271004-1L Used for HPLC analysis
Autoclave NUVE-OT 90L Used for the sterilization process
Cell Culture Cabin Hera Safe KS Used for the cell culture process
Centrifugal Hitachi CF16RN Used in the exosome isolation step
CO2 incubator with Safe Cell UV Panasonic Used for the cell culture process
Dopamine hydrochloride H8502-10G Sigma H8502-10G Used in exosome dopamine loading
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 Sigma RNBJ7249 Used as cell culture medium
Fetal Bovine Serum-FBS Capricorn FBS-16A It was used by adding to the cell culture medium.
Freezer -80 °C Panasonic MDF-U5386S-PE To store cells and the resulting exosomes
Fridge Panasonic MPR-215-PE Used to store cell culture and other materials
High performance liquid chromatography-HPLC Agilent Technologies The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated.
Microscope- Primovert Zeiss Used to observe cells in cell culture.
MTT Assay Biomatik Used to measure cell viability
NanoSight NS300 Malvern panalytical Malvern panalytical Used for exosome characterization
Optima XPN-100 Ultracentrifuge Beckman Coulter Used in the exosome isolation step
PBS tablet Biomatik 43602 In the preparation of the PBS solution
Penicilin/Streptomycin Solution Capricorn PB-S It was added to the medium to prevent contamination in cell culture.
Pipette Aid Isolab
Precision balance-Kern Kern-ABJ220-4NM Used in the preparation of solutions
Q500 Sonicator Qsonica, LLC Used to digest exosomes in HPLC analysis
Saponin Sigma 47036-50G-F It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process.
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry BMG LABTECH Used for MTT and drug release analyzes
SPSS 22 statistical package program
Vorteks-FinePCR FinePCR-FineVortex Used to mix solutions homogeneously
Water Bath 37 °C-Senova Senova Used in cell culture step
Wharton’s jelly mesenchymal stem cells ATCC
ZetaSizer Malvern Nano ZS Malvern Nano ZS Used for exosome characterization

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References

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