Summary
В данной работе мы стремились получить рецептуру путем дофаминовой загрузки изолированных экзосом стволовых клеток из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона. Выделение и характеристика экзосом, загрузка препарата в полученные экзосомы и цитотоксическая активность разработанной лекарственной формы описаны в данном протоколе.
Abstract
Экзосомы размером от 40 до 200 нм составляют наименьшую подгруппу внеклеточных везикул. Эти биологически активные везикулы, секретируемые клетками, играют активную роль в межклеточном грузе и коммуникации. Экзосомы в основном содержатся в жидкостях организма, таких как плазма, спинномозговая жидкость, моча, слюна, околоплодные воды, молозиво, грудное молоко, суставная жидкость, сперма и плевральная кислота. Учитывая размер экзосом, считается, что они могут играть важную роль в заболеваниях центральной нервной системы, поскольку они могут проходить через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Таким образом, это исследование было направлено на разработку системы наноносителей на основе экзосом путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, выделенные из желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона (WJ-MSCs). Экзосомы, прошедшие процесс характеризации, инкубировали с дофамином. Экзосомы, нагруженные дофамином, были повторно охарактеризованы в конце инкубации. Экзосомы, нагруженные дофамином, были исследованы в анализах на высвобождение лекарств и цитотоксичность. Результаты показали, что дофамин может быть успешно инкапсулирован в экзосомах, и что экзосомы, загруженные дофамином, не влияют на жизнеспособность фибробластов.
Introduction
Экзосомы, биологически активные везикулы со значительными особенностями, имеют размер от 40 нм до 200 нм. Экзосомы происходят из клеточной мембраны и образуются в результате высвобождения эндосом1. Эти структуры служат межклеточными коммуникаторами и взаимодействуют с соседними клетками, облегчая передачу активных молекул. Экзосомы могут быть выделены из множества различных источников. К ним относятся биологические жидкости, такие как плазма, моча, спинномозговая жидкость, слюна, а также клеточные линии, культивируемые в условиях in vitro . Экзосомы играют важную роль в устранении повреждений нервов благодаря содержащимся в них биомакромолекулам, таким как липиды, белки и нуклеиновыекислоты. Глии, которые являются опорными клетками нервной системы3, переносят белки и микроРНК к аксонам нейронов через экзосомы4.
Липиды, образующие миелиновую оболочку, которые являются характерной особенностью нервной проводимости, также высвобождаются из олигодендроцитов через экзосомы 4,5. Экзосомы также участвуют в таких процессах, как синаптическая пластичность, реакция нейронов на стресс, межклеточная коммуникация и нейрогенез в мозге 6,7. Тот факт, что экзосомы обладают наноразмерностью, позволяет им проходить через ГЭБ. Существует специальный путь перехода от интерстициальной жидкости к спинномозговой жидкости после проникновения через эту мембрану8. Благодаря своим поверхностным свойствам экзосомы могут эффективно взаимодействовать с клетками-мишенями в качестве системы доставки лекарств и активно доставлять загруженные лекарства.
Благодаря экспрессии различных адгезивных белков (тетраспанинов и интегринов) на поверхности экзосом эти внеклеточные везикулы могут легко взаимодействовать и сливаться с клеточными мембранамихозяина 9. Считается, что экзосомы могут быть использованы в качестве системы доставки лекарств, особенно при лечении заболеваний центральной нервной системы из-за их способности проникать в ГЭБ и их поверхностных свойств. Экзосомы, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК), имеют более низкий риск иммунного отторжения по сравнению с аллогенной клеточной терапией, и в этом отношении они могут быть важным компонентом применения бесклеточного лечения10.
Дофамин – это молекула, дефицит которой в головном мозге является характерным признаком болезни Паркинсона (БП), ухудшающейся день ото дня11,12,13. Известно, что болезнь Паркинсона ассоциирована с дегенерацией дофаминергических нейронов в черной субстанции мезэнфералона и потерей функций двигательных нейронов14,15. Гибель дофаминергических нейронов препятствует поступлению нейромедиатора дофамина в полосатое тело головного мозга. Это, в свою очередь, приводит к возникновению симптомов, специфичных для БП16. Такими симптомами БП являются брадикинезия, постуральная нестабильность, ригидность и особенно тремор в покое12,13. Несмотря на то, что болезнь Паркинсона была впервые описана более двух столетий назад, исследования, направленные на понимание патологии и этиологии заболевания, все еще продолжаются, и в настоящее время признано, что болезнь Паркинсона является сложным системнымзаболеванием. Прогнозируется, что дефицит дофамина возникает, а клинические симптомы болезни Паркинсона наблюдаются при дегенерации более 80% нейронов18. При лечении заболевания предпочтение отдается неполному приему дофамина для уменьшения двигательных симптомов. Исследования in vivo показали, что прямая инфузия дофамина в мозг значительно уменьшает симптомыу животных. Предшественники дофамина, такие как L-ДОФА (L-3,4-дигидроксифенилаланин) и препараты дофаминовых рецепторов, используются в клинике, потому что прямая инфузия дофамина в мозг у человека невозможна, и дофамин, попадая в систему, не может пересечьГЭБ-20. Эти виды препаратов со временем теряют свою эффективность. Тем не менее, до сих пор не существует подхода к лечению болезни Паркинсона. Следовательно, существует огромная необходимость в разработке новых терапевтических стратегий и методов лечения для выявления патофизиологии заболевания и снижения влияния БП на пациентов.
Исследования на основе экзосом в последнее время привлекли внимание в связи со сбором информации как о терапевтических подходах, так и о патологиях заболеваний нервной системы. Было показано, что экзосомы, полученные из МСК, уменьшают воспаление при повреждении нервов и способствуют регенерации нейронов21,22,23. Кроме того, сообщалось, что секретомы экзосом, полученные из МСК, снижают апоптоз, проявляя нейротрофические и нейропротекторные эффекты, особенно на дофаминергических нейронах24,25. Исследования платформ, в которых экзосомы используются в качестве терапевтических систем доставки лекарств, интенсивно ускорились в последние годы. В многочисленных исследованиях было замечено, что соответствующие лекарственные препараты могут быть легко инкапсулированы в экзосомы и безопасно доставлены в клетки, ткани и органы-мишени26,27. Различные методы, такие как инкубация, циклы замораживания/оттаивания, ультразвуковая обработка и экструзия, могут быть использованы для загрузки лекарств в экзосомы28.
Коинкубация с экзосомами или экзосомоподобными везикулами позволяет пассивно инкапсулировать липофильные малые молекулы в эти системы доставки28,29,30. В частности, различные молекулы, такие как куркумин31, каталаза30, доксорубицин 32 и паклитаксел33, были эффективно загружены в экзосомы. Было замечено, что каталазосодержащие экзосомы, обладающие антиоксидантной активностью, эффективно накапливаются в нейронах и клетках микроглии головного мозга и проявляют сильную нейропротекторную активность30. В этом же исследовании было обнаружено, что сапонин, добавленный в комплекс для повышения эффективности загрузки, увеличивает процент загрузки препарата во время инкубации30,34. Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования, чтобы установить стандарты загрузки лекарств в экзосомы.
В данной работе описывается разработка системы наноносителей путем инкапсуляции дофамина в экзосомы, которые были выделены из WJ-MSCs. Подробно объясняются все этапы, включая культивирование WJ-МСК, выделение и характеристику экзосом, эксперименты по загрузке лекарственными препаратами, характеристику экзосом, нагруженных дофамином, с помощью различных методов и анализ цитотоксичности in vitro .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам и оборудованию, используемым в этом протоколе.
1. Культивирование и криоконсервация желейных мезенхимальных стволовых клеток Уортона
- Извлеките WJ-MSC (из ATCC) из морозильной камеры с температурой -80 °C. Высевают клетки в колбу, содержащую среду DMEM-F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Инкубируют их при температуре 37 °C в инкубаторе, содержащем 5%СО2.
- Меняйте питательную среду каждые 2 дня. Проходите клетки, когда они достигнут 80% слияния. Промойте клетки, которые нужно пассировать, 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка PBS перед добавлением трипсина обеспечивает легкое отделение клеток от поверхности колбы. - Снимите PBS и добавьте в колбу 5 мл раствора трипсина-ЭДТА. Инкубируют колбу в течение 5 мин при 37 °С в инкубаторе, содержащем 5%СО2.
- Соберите надосадочную жидкость в пробирку и центрифугируйте при 1 500 x g в течение 5 минут. После центрифугирования удалить надосадочную жидкость и путем пипетирования добавить в пробирку 1 мл DMEM-F12 + 10% FBS.
- Переносят клетки в колбу большего размера и продолжают культивирование, добавляя DMEM-F12 + 10% FBS до получения достаточного количества экзосом35.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культивируемые клетки замораживают при плотности 1 миллион/мл с 10% диметилсульфоксидом (ДМСО) и хранят при -80 °C.
2. Получение экзосом из мезенхимальных стволовых клеток Wharton's Jelly
ПРИМЕЧАНИЕ: Экзосомы выделяют из культивируемых WJ-MSCs. Выделение экзосом выполняется, когда клетки покрывают поверхность колбы и достигают примерно 80% плотности.
- Удалить из колбы надосадочную среду, содержащую 10% ФБС, и промыть клетки 5 мл ПБС. Добавьте в клетки безсывороточную среду DMEM-F12 после промывки PBS. Инкубируют колбы в течение 48 ч при 37 °C в инкубаторе с 5%СО2. После инкубации соберите свободную от сыворотки среду в пробирку и храните при температуре -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе 2.1 собирается и хранится 180 мл среды, не содержащей сыворотки, при -20 °C. После размораживания запускается процесс периодического центрифугирования, как описано ниже. - Выделение экзосом
- Центрифугируют собранную свободную от сыворотки среду при 300 x g в течение 10 мин при +4 °C. Осторожно извлеките надосадочную жидкость и переложите ее в другую трубку.
- Центрифугируют собранную надосадочную жидкость при 2 000 × г в течение 10 мин при +4 °С. Осторожно извлеките надосадочную жидкость и переложите ее в другую трубку.
- Центрифугируют собранную надосадочную жидкость при 10 000 × г в течение 30 мин при +4 °С. Осторожно извлеките надосадочную жидкость и переложите ее в другую трубку.
- Собранную надосадочную жидкость переносят в ультрацентрифужные пробирки и ультрацентрифугу при 110 000 × г в течение 130 мин. Медленно удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл PBS к грануле.
- Вихрят гранулу и ультрацентрифугу при 110 000 × г в течение 70 мин при +4 °C36 (рисунок 1). Медленно удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл PBS к грануле.
ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения этапов ультрацентрифугирования полученные экзосомы можно хранить при -80 °C. Теперь полученная гранула готова к определению характеристик.
Рисунок 1: Изоляция экзосом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
3. Характеристика экзосом
- Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ отслеживания наночастиц выполняется для определения размера и концентрации изолированных экзосом. Таблетки, используемые для 1х раствора PBS, должны быть в пределах рН 7,3-7,5. 1x Раствор PBS содержит 10 мМ фосфатного буфера, 137 мМ хлорида натрия и 2,7 мМ хлорида калия. Раствор готовят, добавляя 1 таблетку PBS в 100 мл дистиллированной воды. Приготовленный раствор стерилизуют автоклавированием.- Разбавьте экзосомы в 100 раз, добавив 990 мкл PBS к 10 мкл экзосом. Разведенную суспензию набрать в одноразовый шприц.
- Включите устройство NTA и подключите компьютер. Откройте программное обеспечение.
- Введите образец в шприце в трубку в кассетной секции устройства. Закройте крышку кассеты устройства.
- В открывшемся программном обеспечении нажмите на кнопку «Начать анализ ». Сохраните результаты, полученные нажатием кнопки Запись .
- Динамический анализ рассеяния света
ПРИМЕЧАНИЕ: Экзосомы, выделенные для измерения дзета-потенциала и размера, также разбавляются таким же образом, как и для анализа NTA.- Добавьте 980 мкл PBS к 20 мкл экзосом.
- Откройте устройство определения размера дзета и подключенный компьютер. Откройте программное обеспечение.
- Добавьте суспензию из шага 3.2.1 в одноразовую кювету. Откройте крышку устройства, поместите кювету в кассету и закройте крышку.
- Выберите тип кюветы в программном обеспечении устройства. Нажмите кнопку «Начать анализ » для анализа дзета-потенциала и размерности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы выполняются отдельно для размерного анализа и дзета-потенциала.
4. Загрузка дофамина в экзосомы
ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как характеристика экзосом WJ-MSC завершена, были получены дофаминовые экзосомы в качестве системы доставки лекарств. Загрузка препарата в экзосомы производится инкубационным методом.
- Добавьте 3 мл PBS к суспензии экзосом, начиная с шага 2.2.5. Стерилизуют разбавленную суспензию фильтрацией с помощью фильтров 0,22 мкм. Переложите 500 мкл стерилизованной суспензии экзосом в другую пробирку.
- Раствор дофамина (0,5 мг/мл) приготовить с дистиллированной водой. Добавьте 500 мкл раствора дофамина в пробирки, содержащие экзосомы.
- Добавьте сапонин в суспензию на шаге 4.2. Готовую экзосомно-дофаминовую суспензию инкубируют в течение 24 ч при 37 °С.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация сапонина не должна превышать 0,002% от общего раствора. - Ультрацентрифугируют суспензию при концентрации 90 000 × г в течение 70 мин, чтобы удалить свободный дофамин и сапонин из среды. Изолированные экзосомы хранят при -20 °C до использования для дальнейшего анализа37.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 0,02% аскорбиновой кислоты для стабильности приготовленного раствора дофамина.
5. Характеристика экзосом, нагруженных дофамином
- Анализ отслеживания наночастиц (NTA)
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ отслеживания наночастиц выполняется для определения размера и концентрации изолированных экзосом.- Выполните шаги 3.1.1-3.1.4, чтобы разбавить экзосомы и выполнить NTA.
- Динамический анализ рассеяния света
ПРИМЕЧАНИЕ: Экзосомы, выделенные для измерения дзета-потенциала и размера, также разбавляются аналогично анализу NTA.- Выполните шаги 3.2.1-3.2.4, чтобы разбавить экзосомы и выполнить динамический анализ рассеяния света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер и дзета-потенциалы для каждого раствора (сапонин, дофамин, экзосома-дофамин) анализируются отдельно.
- Выполните шаги 3.2.1-3.2.4, чтобы разбавить экзосомы и выполнить динамический анализ рассеяния света.
6. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество дофамина, загруженного в экзосомы, измеряется методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для обнаружения присутствия дофамина в полученном препарате экзосомы детонируют специальным процессом.
- Поместите состав в нагреватель с температурой 75 °C, чтобы он испарился. Добавьте ацетонитрил (соотношение 50:50) в суспензию и вихрь. Обрабатывайте раствор ультразвуком в течение 10 мин.
- Центрифугируют раствор в течение 10 мин при 10 000 × г. Отфильтруйте надосадочную жидкость через фильтр 0,22 мкм.
- Анализируют все аналиты с помощью колонки С18 при 30 °C при скорости потока 1 мл/мин (подвижная фаза H2O/ацетонитрил). Измерьте абсорбцию при 230 нм38.
7. Измерение нагружающей способности лекарственного средства (DL) и кинетики высвобождения лекарств in vitro
- Емкость загрузки лекарственными препаратами (DL)
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество дофамина, загруженного в экзосомы, количественно оценивается с помощью УФ-видимой спектроскопии. Поглощение считывается на длине волны 280 нм. Собранные надосадочные жидкости во время синтеза используются для измерения количества незагруженного препарата. Концентрация дофамина в надосадочной жидкости определяется с помощью стандартной калибровочной кривой для дофамина.- Приготовьте исходный раствор 1 мг/мл дофамина. Готовят концентрации 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мг/мл из исходного раствора, используя дистиллированную воду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 0,02% аскорбиновой кислоты для стабильности приготовленного раствора дофамина. - Сгенерируйте стандартную калибровочную кривую, измерив поглощение каждого разведения дофамина на длине волны 280 нм в УФ-спектрофотометре.
- Измерьте абсорбцию надосадочной жидкости при длине волны 280 нм.
- Рассчитайте емкость лекарственной нагрузки для дофамина, используя уравнение (1)39.
ДЛ (%) =
100 (1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ выполняется в трех экземплярах.
- Приготовьте исходный раствор 1 мг/мл дофамина. Готовят концентрации 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5 мг/мл из исходного раствора, используя дистиллированную воду.
- Кинетика высвобождения лекарств in vitro
ПРИМЕЧАНИЕ: Кинетика высвобождения лекарственных средств экзосом, нагруженных дофамином, осуществляется с помощью диализной мембраны. PBS, рН 7,4, используется в качестве разделительной среды для моделирования физиологического микроокружения.- Добавьте 1 мл экзосом, нагруженных дофамином, в диализную мембрану. Поместите мембрану в стакан. Добавьте 15 мл PBS в стакан.
- Отобразить 1 мл разделительной среды в стакане через 0,5, 1, 2, 4, 6 и 8 ч. В каждый момент времени заменяйте объем образца свежим PBS. Анализируйте образцы, взятые через заданные интервалы на длине волны 280 нм, с помощью УФ-видимого спектрометра.
- Вычислите результаты, используя уравнение (2)40.
Выпуск (%) =
100 (2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения кинетики высвобождения лекарственного препарата in vitro составляется калибровочная кривая. Раствор дофамина готовят в концентрациях 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 и 5,0 мг/мл. Значение поглощения УФ-излучения каждой концентрации определяется на длине волны 280 нм с помощью спектрофотометра УФ-ВИДИМОГО диапазона.
100 (1)
100 (2)8. Тест на цитотоксичность in vitro
- Ревитализация и культивирование фибробластов
- Извлеките фибробласты из морозильной камеры с температурой -80 °C. Высейте клетки в колбу, содержащую DMEM-F12 + 10% FBS.
- Инкубируют клетки при температуре 37 °C в инкубаторе, содержащем 5%СО2. Меняйте питательную среду каждые 2 дня.
- Проходите ячейки до тех пор, пока они не достигнут 80% слияния. Выполните шаги 1.3-1.5. После центрифугирования при 1 500 × г в течение 5 мин удалите надосадочную жидкость, добавьте 1 мл DMEM-F12 + 10% FBS и засейте 10 000 клеток на лунку в 96-луночный планшет.
- Добавляют DMEM-F12 medium + 10% FBS и инкубируют клетки при 37 °C в течение 18 ч в инкубаторе, содержащем 5% CO2. Смените среду лунок в конце инкубации.
- Подготовьте запас дофаминовой суспензии экзосом. Разбавьте экзосомную формулу, насыщенную дофамином, средой для получения концентраций 100 мкл/мл, 250 мкл/мл, 500 мкл/мл и 1000 мкл/мл.
- Добавьте подготовленные концентрации в ячейки внутри каждой лунки 96-луночной планшета. Инкубируют планшеты при 37 °С в течение 18 ч в инкубаторе, содержащем 5%СО241.
- Анализ жизнеспособности клеток МТТ
ПРИМЕЧАНИЕ: В конце инкубации коэффициенты жизнеспособности клеток определяются с помощью теста МТТ.- Приготовьте раствор МТТ (5 мг/мл) с PBS. Добавьте 10 мкл раствора МТТ в каждую лунку. Выдерживают 4 ч при температуре 37 °C.
- В конце инкубации добавьте в каждую лунку по 100 мкл ДМСО. Выдерживают планшеты в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Измерьте значения абсорбции в ИФА-ридере при длине волны 570 нм42,43.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тест на жизнеспособность МТТ проводится в трех экземплярах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выделение и характеристика экзосом
Стволовые клетки Уортонского желе культивируют и инкубируют в безсывороточной среде в течение 48 ч, когда культура достигает достаточной плотности. После окончания инкубации надосадочную жидкость хранят при температуре -20 °С. Собранные надосадочные жидкости разбавляют ПБС и подвергают ультрацентрифугированию (рисунок 1). Полученное решение анализируется с помощью NTA и DLS анализов. Экзосомы стерилизуют, пропуская через фильтр 0,22 мкм. Средний размер полученных экзосом был определен равным 98 нм (Видео 1). В конце центрифугирования было получено около 10 миллиардов частиц экзосом. Количество наночастиц, выявленных при анализе NTA и DLS, согласуется друг с другом. Кроме того, дзета-потенциал экзосом, происходящих из WJ-MSCs, был измерен как -15,7 мВ (рис. 2 и рис. 3).
Видео 1: Анализ отслеживания наночастиц экзосом, полученных из Wharton Jelly. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Загрузка дофамина в экзосомы
Как было подсчитано при анализе NTA, в 500 мкл выделенных образцов из желе Уортона находилось около 1,5 миллиарда наночастиц. Раствор дофамина (5 мг/мл) смешивали с 500 мкл экзосом, и суспензию инкубировали в течение 24 ч при 37 °С. После инкубации полученный раствор характеризовали с помощью НТА и ДЛС-анализов. По результатам NTA средний размер частиц раствора составил 110 нм. Сравнение размеров частиц экзосом и экзосом, нагруженных дофамином, показывает, что произошло значительное увеличение размеров экзосом, нагруженных дофамином. Количество наночастиц, выявленных при анализе NTA и DLS, соответствовало друг другу. Кроме того, дзета-потенциал экзосом, нагруженных дофамином, был измерен как -17,6 Мв (рис. 2 и рис. 3).
Видео 2: Анализ отслеживания наночастиц экзосом, нагруженных дофамином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
| Образец | Дзета-потенциал |
| Экзосомы | -15,7 мВ ± 1,1 |
| Сапонин | -12 мВ ± 0,7 |
| Дофамин | -14,4 мВ ± 1,3 |
| Экзосома, нагруженная дофамином | -17,6 мВ ± 0,8 |
Таблица 1: Дзета-потенциал всех растворов.
В таблице 1 показаны DSL-анализы, таблица дзета-размера и дзета-потенциала дофамина, сапонина и дофаминового раствора экзосом.
Рисунок 2: Анализ отслеживания экзосом с помощью наночастиц. (А) экзосомы; (Б) экзосомы, нагруженные дофамином. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ Zetasizer . (А) экзосомы, (Б) экзосомы, нагруженные дофамином, (В) Сапонин, (D) Дофамин. Аббревиатура: d = размер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Наличие дофамина в растворе определяли методом ВЭЖХ-анализа. Экзосомы, загруженные дофамином, подвергали ультрацентрифугированию и фильтрации для удаления свободного дофамина. Если загрузка дофамина в экзосомы проходит успешно в конце инкубации, это может быть обнаружено путем прямого измерения дофамина после разрыва экзосом. Для этого нагруженную дофамином суспензию экзосом нагревали паром, добавляли ацетонитрил и подвергали ультразвуковой обработке. Абсорбцию измеряли на длине волны 230 нм для оценки количества дофамина, высвобождаемого из разрушенных экзосом.
Рисунок 4: Наличие дофамина в препарате определяется методом ВЭЖХ-анализа. Все анализы проводили с использованием колонки С-18 с подвижной фазойН2О/Ацетонитрил при скорости потока 1 мл/мин при 30 °С. Абсорбция измеряется на длине волны 230 нм для контроля элюирования дофамина. (А) Дофамин, (Б) Сапонин, (В) Дофамин-нагруженные экзосомы. Аббревиатура: ВЭЖХ = высокоэффективная жидкостная хроматография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
В результате ВЭЖХ-анализа результирующий пик дофамина наблюдался на 6,45 мин. Присутствие сапонина также было обнаружено после фрагментации экзосом (рис. 4).
Способность к нагрузке лекарственного средства и кинетика высвобождения лекарств in vitro
Емкость дофаминовой нагрузки рассчитывали с помощью УФ-спектрофотометрических измерений и Eq (1) и Eq (2). Процент грузоподъемности составил 10,89 ± 0,33. Кумулятивный профиль высвобождения препарата показан на рисунке 5. Кинетика высвобождения препарата, контролируемая в течение 8 ч, показала, что 74,8% инкапсулированного дофамина высвобождается из экзосом в течение первых 8 ч (рис. 5).
Рисунок 5: Кумулятивный профиль высвобождения препарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Тест на цитотоксичность in vitro
Исследована цитотоксичность дофамин-нагруженных и свободных экзосом на фибробластах. Фибробласты подвергали воздействию различных концентраций препаратов (100 мкл/мл, 250 мкл/мл, 500 мкл/мл и 1000 мкл/мл) и инкубировали в течение 18 ч. Хотя экзосомы, нагруженные дофамином, не демонстрировали каких-либо заметных цитотоксических эффектов, сапонин, добавленный в препарат для увеличения инкапсуляции дофамина, снижал жизнеспособность фибробластов (p < 0,05, рис. 6). Наблюдалось повышение жизнеспособности клеток, когда фибробласты обрабатывались экзосомами, нагруженными дофамином, до концентрации 500 мкл/мл. В конце 18-часовой инкубации жизнеспособность клеток определяли с помощью теста МТТ (рис. 7). Статистическую значимость результатов оценивали с помощью выполнения одностороннего ANOVA.
Рисунок 6: Изображения под микроскопом (10x) после инкубации препарата с клетками. (A) дофамин, (B) сапонин, (C) дофамин-нагруженные экзосомы 100 мкл/мл, (D) дофамин-нагруженные экзосомы 250 мкл/мл, (E) дофамин-нагруженные экзосомы 500 мкл/мл, (F) дофамин-нагруженные экзосомы 1000 мкл/мл. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Статистический анализ результатов теста на жизнеспособность МТТ в клетках, инкубированных в течение 18 ч с различными концентрациями дофамина, сапонина и дофамин-нагруженных экзосом. (А) Результаты цитотоксичности, (В,В) Статистический анализ. Аббревиатуры: D = Дофамин; S = сапонин; Exo-DA1 = дофамин-нагруженные экзосомы 100 мкл/мл; Exo-DA2 = дофамин-нагруженные экзосомы 250 мкл/мл; Экзосомы Exo-DA 3, нагруженные дофамином, 500 мкл/мл; Exo-DA 4 = дофамин-нагруженные экзосомы 1,000 мкл/мл; МТТ = 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Кроме того, были исследованы цитотоксические эффекты свободных экзосом на фибробластах в аналогичных концентрациях (рис. 8). Перед экспериментом экзосомы разбавляли PBS до 60 миллионов частиц на мл. Затем 10 мкл, 25 мкл, 50 мкл и 100 мкл суспензии экзосом добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета.
Рисунок 8: Статистический анализ результатов теста на жизнеспособность МТТ в клетках, инкубированных в течение 18 ч с различными концентрациями экзосом . (А) Результаты цитотоксичности, (В,С) статистический анализ. Сокращения: EXO = экзосомы; МТТ = 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Было обнаружено, что жизнеспособность фибробластов выше при содержании 500 мкл/мл экзосом, загруженных дофамином, и свободных экзосомах 25 мкл/мл по сравнению с другими концентрациями. Однако значимой цитотоксичности при любой концентрации не наблюдалось.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы размером 40-200 нм, секретируемые большинством типов клеток, например, МСК1. Способные обеспечивать коммуникацию между клетками, экзосомы могут проникать в клетки различными путями, такими как эндоцитоз, фагоцитоз, микропиноцитоз, липидно-опосредованная интернализация и слияние33,44. По сравнению с другими системами наноносителей, липиды и холестерин, обнаруженные на поверхности экзосомы, обеспечивают способность переносить как гидрофильные, так и гидрофобные молекулы, при этом водородные связи на концах холестерина обеспечивают плотную упаковку45.
В настоящем исследовании были проведены выделение экзосом, полученных из МСК, эксперименты с лекарственной нагрузкой и анализ на цитотоксичность. Известно, что экзосомы играют важную роль в нейрогенезе, особенно в головном мозге, в дополнение к их важным функциям, таким как перевозка и связь между клетками 6,7. Кроме того, экзосомы, полученные из МСК, относительно хорошо переносятся, обладают присущими им терапевтическими свойствами и демонстрируют высокую стабильность и способность к самонаведению46,47. В последние годы исследования наноразмерных методов лечения, таких как применение экзосом, привлекли широкое внимание в качестве альтернативных методов лечения нейродегенеративных заболеваний, поскольку не существует лекарства от этих расстройств, вызванных повреждением нейронов. Кроме того, способность экзосом проходить через ГЭБ делает их отличными платформами в качестве системы переносчиков лекарств.
Несмотря на то, что существует несколько методов выделения экзосом, в данном случае мы использовали метод ультрацентрифужного выделения, который признан одним из наиболее эффективных методов. В настоящем исследовании WJ-MSCs, отобранные в качестве донорских клеток, известны своим низким иммуногенным потенциалом47 и используются в качестве источника экзосом в клинических испытаниях48. Полученные экзосомы затем инкубировали с раствором дофамина, во время которого в раствор добавляли сапонин для увеличения успешности загрузки лекарственным средством. В конце инкубации из среды удаляли свободный дофамин и сапонин. Ожидается, что сапонин будет избирательно удалять связанный с мембраной холестерин экзосом и создавать поры в экзосомальных липидных бислоях, способствуя проникновению молекул дофамина. В результате наблюдается, что размеры экзосом несколько увеличились, вероятно, из-за дофаминовой нагрузки.
Дзета-потенциал показывает большее электростатическое отталкивание между частицами и их тенденцию к агрегации. Дзета-потенциал полученной формулировки был совместим с результатами предыдущих исследований49. При анализе ВЭЖХ, выполненном в конце инкубационного периода, наличие дофамина было выявлено после фрагментации экзосом. Как уже говорилось выше, сапонин способствует инкапсуляции дофамина. Нагрузочную способность препарата измеряли методом УФ-видимой спектрофотометрии на основе значений абсорбции39. Несмотря на то, что инкубационный метод загрузки препарата прост и менее затратен, чем другие методы, эффективность загрузки вэтом методе низкая. В этом исследовании грузоподъемность составила примерно 11%. Сапонин является эффективным пермеабилизирующим агентом для цитоплазматической мембраны50 и, по-видимому, увеличивает нагрузочную способность экзосом с дофамином.
В будущих исследованиях может оказаться более эффективным предпочесть метод ультразвуковой обработки для повышения эффективности экзосомальной лекарственной нагрузки38. Кумулятивный профиль высвобождения препарата показал, что большое количество дофамина высвобождается в конце 8 ч инкубации. Взрывное высвобождение наблюдалось в первые 5 ч исследования высвобождения in vitro . Поскольку профиль высвобождения экзосомных препаратов зависит от многих параметров, таких как свойства лекарственного средства, текучесть бислоя и молекулярная масса, во многих исследованиях можно наблюдать различия в количестве высвобождаемых лекарств в час51. Кроме того, в данном исследовании не наблюдалось цитотоксического действия препаратов на фибробласты. Однако токсическое действие сапонина, добавляемого для увеличения дофаминовой нагрузки в экзосомы, было обнаружено на клетках фибробластов. Согласно этим данным, эндогенность экзосом является естественным и уникальным преимуществом по сравнению с липосомами, микросферами, микроэмульсиями и другими синтетическими системами доставки лекарств52. Чтобы уменьшить недостатки существующего метода, в качестве источника экзосом можно использовать различные трансфекционные реагенты, методы электропорации или эндогенные дофамин-продуцирующие клетки, предпочтительно генетически модифицированные МСК.
Выделение экзосом проводили по этому протоколу. Однако этап изоляции – это очень долгий и сложный процесс. Следует следить за тем, чтобы надосадочная жидкость, собранная из клеточной культуры, находилась в среде, свободной от сыворотки. Кроме того, на сегодняшний день количество экзосом связано с концентрацией белка. Тем не менее, мы предполагаем, что расчет и применение количества частиц экзосом может помочь повысить точность клинических исследований. Установлено, что инкубационный метод, используемый для лекарственной загрузки изолированных экзосом, является низким по нагрузке препарата. Ультразвуковой метод, обладающий высокой способностью к нагрузке препарата, может помочь получить более эффективные результаты.
Эти результаты показали, что экзосомы, полученные из WJ-MSC, являются мощными носителями дофамина. Наряду с их способностью проходить ГЭБ и их иммуномодулирующими свойствами, таргетная терапия для болезни Паркинсона или любых других заболеваний ЦНС может быть разработана с помощью экзосом, несущих лекарственные средства. Тем не менее, исследования должны проводиться in vivo и подкрепляться клиническими испытаниями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Работа была в основном поддержана финансированием исследований, предоставленным Научно-исследовательскими проектами Технического университета Йылдыз (TSA-2021-4713).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
References
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
- Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
- Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122 (2019).
- Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
- Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
- Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737 (2017).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
- Poewe, W., et al.
- Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
- Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
- Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
- Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
- Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180 (2014).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
- Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
- Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
- Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
- Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294 (2019).
- Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
- Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
- Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288 (2020).
- Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
- Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
- Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
- Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
- Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
- Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
- Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
- Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291 (2017).
- Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
- Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
- Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
- Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
