Summary
Här syftade vi till att erhålla en formulering genom dopaminladdning av de isolerade exosomerna av stamceller från Whartons gelémesenkymala stamceller. Exosomisolering och karakterisering, läkemedelsladdning i de resulterande exosomerna och den cytotoxiska aktiviteten hos den utvecklade formuleringen beskrivs i detta protokoll.
Abstract
Exosomer mellan 40 och 200 nm i storlek utgör den minsta undergruppen av extracellulära vesiklar. Dessa bioaktiva vesiklar som utsöndras av celler spelar en aktiv roll i intercellulär last och kommunikation. Exosomer finns främst i kroppsvätskor som plasma, cerebrospinalvätska, urin, saliv, fostervatten, råmjölk, bröstmjölk, ledvätska, sperma och pleurasyra. Med tanke på exosomernas storlek tror man att de kan spela en viktig roll vid sjukdomar i centrala nervsystemet eftersom de kan passera genom blod-hjärnbarriären (BBB). Därför syftade denna studie till att utveckla ett exosombaserat nanobärarsystem genom att kapsla in dopamin i exosomer isolerade från Whartons gelémesenkymala stamceller (WJ-MSC). Exosomer som klarade karakteriseringsprocessen inkuberades med dopamin. De dopaminladdade exosomerna omkarakteriserades i slutet av inkubationen. Dopaminladdade exosomer undersöktes i läkemedelsfrisättnings- och cytotoxicitetsanalyser. Resultaten visade att dopamin framgångsrikt kunde kapslas in i exosomerna och att de dopaminladdade exosomerna inte påverkade fibroblasternas viabilitet.
Introduction
Exosomer, bioaktiva vesiklar med betydande egenskaper, varierar i storlek från 40 nm till 200 nm. Exosomer härstammar från cellmembranet och bildas på grund av frisättningen av endosomerna1. Dessa strukturer fungerar som cell-till-cell-kommunikatörer och interagerar med närliggande celler för att underlätta överföringen av aktiva molekyler. Exosomer kan isoleras från många olika källor. Dessa inkluderar kroppsvätskor som plasma, urin, cerebrospinalvätska, saliv samt cellinjer odlade under in vitro-förhållanden . Exosomer har en viktig roll i elimineringen av nervskador, tack vare de biomakromolekyler de innehåller, såsom lipider, proteiner och nukleinsyror2. Glia, som är stödcellerna i nervsystemet3, överför proteiner och mikro-RNA till nervcellernas axoner via exosomer4.
Lipider som bildar myelinskidan, som är ett karakteristiskt drag i nervledning, frisätts också från oligodendrocyter via exosomer 4,5. Exosomer är också involverade i processer som synaptisk plasticitet, neuronal stressrespons, cell-cell-kommunikation och neurogenes i hjärnan 6,7. Det faktum att exosomer har nanodimensioner gör det möjligt för dem att passera genom BBB. Det finns en speciell övergångsväg från interstitialvätskan till cerebrospinalvätskan efter att ha penetrerat detta membran8. Tack vare sina ytegenskaper kan exosomer interagera effektivt med målceller som ett system för läkemedelstillförsel och aktivt leverera de laddade läkemedlen.
På grund av uttrycket av olika vidhäftande proteiner (tetraspaniner och integriner) på exosomernas yta kan dessa extracellulära vesiklar lätt interagera och smälta samman med värdcellmembran9. Man tror att exosomer kan användas som ett system för läkemedelstillförsel, särskilt vid behandling av sjukdomar i centrala nervsystemet på grund av deras förmåga att tränga igenom BBB och deras ytegenskaper. Mesenkymala stamceller (MSC)-härledda exosomer har en lägre risk för immunavstötning jämfört med allogena cellterapier, och i detta avseende kan de vara en viktig komponent i cellfria behandlingsapplikationer10.
Dopamin är en molekyl vars brist i hjärnan är det karakteristiska kännetecknet för Parkinsons sjukdom (PD), som förvärras dag för dag11,12,13. Det är känt att PD är associerat med degeneration av dopaminerga neuroner i substantia nigra av mesencephalon och förlust av motorneuronfunktioner14,15. Döden av dopaminerga nervceller förhindrar tillförseln av signalsubstansen dopamin till hjärnans striatum. Detta resulterar i sin tur i uppkomsten av PD-specifika symtom16. Dessa symtom på PD är bradykinesi, postural instabilitet, stelhet och särskilt vilotremor12,13. Även om PD först beskrevs för mer än två århundraden sedan, pågår fortfarande studier för att förstå sjukdomens patologi och etiologi och det är för närvarande accepterat att PD är en komplex systemisk sjukdom17. Det förutspås att dopaminbrist uppstår, och kliniska PD-symtom observeras när mer än 80 % av neuronerna degenererar18. Vid behandling av sjukdomen är ofullständigt dopamintillskott att föredra för att minska motoriska symtom. In vivo-studier har visat att direkt infusion av dopamin i hjärnan avsevärt minskar symtomen hos djur19. Dopaminprekursorer som L-DOPA (L-3,4-dihydroxifenylalanin) och dopaminreceptorläkemedel används i kliniken eftersom den direkta infusionen av dopamin i hjärnan inte är möjlig hos människor och dopamin som kommer in i systemet inte kan passera BBB20. Dessa typer av läkemedel förlorar sin effektivitet med tiden. Det finns dock fortfarande ingen botande behandlingsmetod för Parkinsons sjukdom. Därför finns det ett stort behov av att utveckla nya terapeutiska strategier och behandlingsmetoder för att avslöja sjukdomens patofysiologi och minska effekterna av PD på patienter.
Exosombaserade studier har nyligen uppmärksammats för att samla in information om både terapeutiska metoder och patologier för sjukdomar i nervsystemet. MSC-härledda exosomer har visat sig minska inflammation i nervskador och bidra till neuronal regenerering21,22,23. Dessutom har det rapporterats att MSC-härledda exosomsekretomer minskar apoptos genom att visa neurotrofiska och neuroprotektiva effekter, särskilt på dopaminerga neuroner24,25. Forskningen om plattformar där exosomer används som terapeutiska system för läkemedelstillförsel har accelererat intensivt de senaste åren. I många studier har det observerats att relevanta läkemedel lätt kan kapslas in i exosomer och levereras säkert till målceller, vävnader och organ26,27. Olika metoder såsom inkubation, frysning/upptining cykler, ultraljudsbehandling och extrudering kan användas för läkemedelsladdning i exosomer28.
Sammanföring med exosomer eller exosomliknande vesiklar gör det möjligt för lipofila små molekyler att passivt kapslas in i dessa leveranssystem28,29,30. I synnerhet laddades olika molekyler som curcumin31, katalas 30, doxorubicin 32 och paklitaxel33 effektivt in i exosomer. Det har observerats att exosomer som innehåller katalas, som har antioxidantaktivitet, effektivt ackumulerades i neuroner och mikrogliaceller i hjärnan och uppvisade starka neuroprotektiva aktiviteter30. I samma studie visade det sig att saponin, som tillsattes i komplexet för att öka laddningseffektiviteten, ökade läkemedelsladdningsprocenten under inkubation30,34. Ytterligare studier behövs dock för att fastställa standarderna för läkemedelsladdning i exosomer.
Denna artikel beskriver utvecklingen av ett nanobärarsystem genom inkapsling av dopamin i exosomer som isolerades från WJ-MSC. Alla steg, inklusive odling av WJ-MSCs, isolering och karakterisering av exosomer, läkemedelsladdningsexperiment, karakterisering av dopaminladdade exosomer med olika tekniker och in vitro cytotoxicitetsanalys förklaras i detalj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material och utrustning som används i detta protokoll.
1. Odling och kryokonservering av Whartons gelémesenkymala stamceller
- Ta bort WJ-MSC (från ATCC) från frysen -80 °C. Frö cellerna i en kolv som innehåller DMEM-F12 medium kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (FBS). Inkubera dem vid 37 °C i en inkubator som innehåller 5 % CO2 .
- Byt odlingsmedium varannan dag. Passera cellerna när de når 80 % sammanflöde. Tvätta cellerna som ska passera med 5 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
OBS: Tvättning med PBS innan trypsin tillsätts säkerställer enkel separation av celler från kolvens yta. - Ta bort PBS och tillsätt 5 ml trypsin-EDTA-lösning till kolven. Inkubera kolven i 5 minuter vid 37 °C i en inkubator som innehåller 5 % CO2 .
- Samla upp supernatanten i röret och centrifugera vid 1 500 x g i 5 minuter. Efter centrifugering, ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml DMEM-F12 + 10 % FBS till röret genom pipettering.
- Överför cellerna till en större kolv och fortsätt odlingen genom att tillsätta DMEM-F12 + 10 % FBS tills tillräckligt många exosomererhålls.
OBS: Odlade celler fryses med en densitet av 1 miljon/ml med 10 % dimetylsulfoxid (DMSO) och lagras vid -80 °C.
2. Produktion av exosomer från Wharton's Jelly mesenkymala stamceller
Anmärkning: Exosomer isoleras från odlade WJ-MSC. Exosomisolering utförs när cellerna täcker kolvens yta och når cirka 80 % densitet.
- Ta bort supernatantmediet som innehåller 10 % FBS från kolven och tvätta cellerna med 5 ml PBS. Tillsätt serumfritt DMEM-F12-medium till cellerna efter sköljning med PBS. Inkubera kolvarna i 48 timmar vid 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator. Efter inkubationen samlas det serumfria mediet upp i röret och förvaras vid -20 °C.
OBS: I steg 2.1 samlas 180 ml serumfritt medium upp och förvaras vid -20 °C. Efter upptining startas en satsvis centrifugeringsprocess, som beskrivs nedan. - Isolering av exosomer
- Centrifugera det uppsamlade serumfria mediet vid 300 x g i 10 minuter vid +4 °C. Dra försiktigt ut supernatanten och överför den till ett annat rör.
- Centrifugera den uppsamlade supernatanten vid 2 000 × g i 10 minuter vid +4 °C. Dra försiktigt ut supernatanten och överför den till ett annat rör.
- Centrifugera den uppsamlade supernatanten vid 10 000 × g i 30 minuter vid +4 °C. Dra försiktigt ut supernatanten och överför den till ett annat rör.
- Överför den uppsamlade supernatanten till ultracentrifugrör och ultracentrifugera vid 110 000 × g i 130 minuter. Ta långsamt bort supernatanten och tillsätt 1 ml PBS till pelleten.
- Virvla pelleten och ultracentrifugen vid 110 000 × g i 70 minuter vid +4 °C36 (figur 1). Ta långsamt bort supernatanten och tillsätt 1 ml PBS till pelleten.
OBS: Efter att ultracentrifugeringsstegen är klara kan de erhållna exosomerna förvaras vid -80 °C. Den erhållna pelleten är nu klar för karakterisering.
Figur 1: Exosomisolering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Karakterisering av exosomer
- Analys av spårning av nanopartiklar (NTA)
OBS: Nanopartikelspårningsanalys utförs för att bestämma storleken och koncentrationen av de isolerade exosomerna. Tabletter som används för 1x PBS-lösning måste ligga i intervallet pH 7,3-7,5. 1x PBS-lösning innehåller 10 mM fosfatbuffert, 137 mM natriumklorid och 2,7 mM kaliumklorid. Lösningen bereds genom att tillsätta 1 PBS-tablett i 100 ml destillerat vatten. Denna beredda lösning steriliseras genom autoklavering.- Späd exosomerna 100 gånger genom att tillsätta 990 μl PBS till 10 μL exosomer. Lägg den utspädda suspensionen i en engångsspruta.
- Slå på NTA-enheten och anslut datorn. Öppna programvaran.
- Injicera provet i sprutan i slangen i enhetens kassettdel. Stäng kassettluckan på enheten.
- I programvaran som öppnas klickar du på knappen Starta analys . Spara de erhållna resultaten genom att trycka på inspelningsknappen .
- Dynamisk ljusspridningsanalys
OBS: Exosomer isolerade för mätning av zetapotential och storlek späds också ut på samma sätt som för NTA-analys.- Tillsätt 980 μl PBS till 20 μL av exosomerna.
- Öppna zeta-storleksenheten och den anslutna datorn. Öppna programvaran.
- Tillsätt suspensionen från punkt 3.2.1 till engångskyvetten. Öppna locket på enheten, placera kyvetten i kassetten och stäng locket.
- Välj kyvetttyp i enhetens programvara. Klicka på knappen Starta analys för zeta-potential- och dimensionsanalys.
OBS: Analyser utförs separat för dimensionsanalys och zetapotential.
4. Dopamin laddas in i exosomer
OBS: Efter att karakteriseringen av WJ-MSCs exosomer är klar erhölls dopaminladdade exosomer som ett läkemedelsleveranssystem. Läkemedelsladdning i exosomer utförs med hjälp av inkubationsmetoden.
- Tillsätt 3 ml PBS till exosomsuspensionen från steg 2.2.5. Sterilisera den utspädda suspensionen genom filtrering med 0,22 μm filter. Överför 500 μl av den steriliserade exosomsuspensionen till ett annat rör.
- Bered dopaminlösning (0,5 mg/ml) med destillerat vatten. Tillsätt 500 μl dopaminlösning i rören som innehåller exosomerna.
- Tillsätt saponin till suspensionen i steg 4.2. Inkubera den beredda exosom-dopaminsuspensionen i 24 timmar vid 37 °C.
OBS: Saponinkoncentrationen bör inte överstiga 0.002 % av den totala lösningen. - Ultracentrifugera suspensionen vid 90 000 × g i 70 minuter för att avlägsna fritt dopamin och saponin från mediet. Förvara de isolerade exosomerna vid -20 °C tills de används för vidare analys37.
OBS: Tillsätt 0,02 % askorbinsyra för stabiliteten hos den beredda dopaminlösningen.
5. Karakterisering av dopaminladdade exosomer
- Analys av spårning av nanopartiklar (NTA)
OBS: Nanopartikelspårningsanalys utförs för att bestämma storleken och koncentrationen av isolerade exosomer.- Följ steg 3.1.1-3.1.4 för att späda ut exosomerna och utföra NTA.
- Dynamisk ljusspridningsanalys
OBS: Exosomer isolerade för mätning av zetapotential och storlek späds också ut på samma sätt som NTA-analys.- Följ steg 3.2.1-3.2.4 för att späda ut exosomerna och utföra dynamisk ljusspridningsanalys.
OBS: Storlek och zetapotentialer för varje lösning (saponin, dopamin, exosom-dopamin) analyseras separat.
- Följ steg 3.2.1-3.2.4 för att späda ut exosomerna och utföra dynamisk ljusspridningsanalys.
6. Högpresterande vätskekromatografi (HPLC)
OBS: Mängderna dopamin som laddas in i exosomer mäts med metoden för högpresterande vätskekromatografi (HPLC). För att detektera närvaron av dopamin i den erhållna formuleringen detoneras exosomer genom en speciell process.
- Placera formuleringen i en 75 °C värmare för att avdunsta. Tillsätt acetonitril (50:50-förhållande) till suspensionen och virveln. Ultraljudsbehandla lösningen i 10 min.
- Centrifugera lösningen i 10 minuter vid 10 000 × g. Filtrera supernatanten genom ett 0,22 μm filter.
- Analysera alla analyter med användning av en C18-kolonn vid 30 °C vid en flödeshastighet av 1 ml/min (den mobila fasen H2O/acetonitril). Mät absorbansen vid 230 nm38.
7. Mätning av läkemedelsladdningskapacitet (DL) och kinetik för frisättning av läkemedel in vitro
- Kapacitet för läkemedelsbelastning (DL)
OBS: Mängden dopamin som laddas in i exosomer kvantifieras med hjälp av UV-Vis-spektroskopi. Absorbansen avläses vid 280 nm. De insamlade supernatanterna under syntesen används för att mäta mängden oladdat läkemedel. Dopaminkoncentrationen i supernatanten bestäms via en standardkalibreringskurva för dopamin.- Bered en stamlösning av 1 mg/ml dopamin. Bered koncentrationerna 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 och 0,5 mg/ml från stamlösningen med destillerat vatten.
OBS: Tillsätt 0,02 % askorbinsyra för stabiliteten hos den beredda dopaminlösningen. - Generera en standardkalibreringskurva genom att mäta absorbansen för varje utspädning av dopamin vid 280 nm i en UV-spektrofotometer.
- Mät supernatantens absorbans vid 280 nm.
- Beräkna läkemedelsladdningskapaciteten för dopamin med hjälp av Eq (1)39.
DL (%) =
100 (1)
OBS: Analysen utförs i tre exemplar.
- Bered en stamlösning av 1 mg/ml dopamin. Bered koncentrationerna 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 och 0,5 mg/ml från stamlösningen med destillerat vatten.
- Kinetik för frisättning av läkemedel in vitro
OBS: Läkemedelsfrisättningskinetik för dopaminladdade exosomer utförs med hjälp av ett dialysmembran. PBS, pH 7,4, används som frisättningsmedium för att simulera en fysiologisk mikromiljö.- Tillsätt 1 ml dopaminladdade exosomer till dialysmembranet. Placera membranet i en bägare. Tillsätt 15 ml PBS till bägaren.
- Ta prov på 1 ml släppmedium i en bägare vid 0,5, 1, 2, 4, 6 och 8 timmar. Vid varje tidpunkt, byt ut volymen på sample med färsk PBS. Analysera proverna som tagits med bestämda intervall vid 280 nm med hjälp av en UV-Vis-spektrometer.
- Beräkna resultaten med hjälp av Eq (2)40.
Släpp (%) =
100 (2)
OBS: En kalibreringskurva utarbetas för bestämning av in vitro-kinetik för frisättning av läkemedel. Dopaminlösning bereds i koncentrationerna 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 och 5,0 mg/ml. UV-absorbansvärdet för varje koncentration bestäms vid 280 nm med en UV-Vis-spektrofotometer.
100 (1)
100 (2)8. Cytotoxicitetstest in vitro
- Revitalisering och odling av fibroblaster
- Ta ut fibroblasterna ur frysen vid -80 °C. Sådd cellerna i en kolv som innehåller DMEM-F12 + 10% FBS.
- Inkubera cellerna vid 37 °C i en inkubator som innehåller 5 % CO2 . Byt odlingsmedium varannan dag.
- Låt cellerna passera tills de når 80 % sammanflöde. Följ steg 1.3-1.5. Efter centrifugering vid 1 500 × g i 5 minuter, avlägsna supernatanten, tillsätt 1 ml DMEM-F12 + 10 % FBS och sådd 10 000 celler per brunn i en 96-hålsplatta.
- Tillsätt DMEM-F12 medium + 10 % FBS och inkubera cellerna vid 37 °C i 18 timmar i en inkubator som innehåller 5 % CO2 . Byt medium på brunnarna i slutet av inkubationen.
- Bered stamberedningen av den dopaminladdade exosomsuspensionen. Späd den dopaminladdade exosomformuleringen med medium för att erhålla koncentrationer på 100 μL/ml, 250 μL/ml, 500 μL/ml och 1 000 μL/ml.
- Tillsätt de beredda koncentrationerna till cellerna i varje brunn på 96-hålsplattan. Inkubera plattorna vid 37 °C i 18 timmar i en inkubator som innehåller 5 % CO241.
- Analys av MTT-cellers viabilitet
Anmärkning: I slutet av inkubationen bestäms cellernas viabilitetsförhållanden genom MTT-testet.- Bered MTT-lösningen (5 mg/ml) med PBS. Tillsätt 10 μl MTT-lösning till varje brunn. Inkubera i 4 timmar vid 37 °C.
- I slutet av inkubationen tillsätts 100 μl DMSO till varje brunn. Inkubera plattorna i 30 minuter i rumstemperatur i mörker. Mät absorbansvärdena i ELISA-läsaren vid 570 nm42,43.
OBS: MTT-lönsamhetstestet utförs i tre exemplar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exosomisolering och karakterisering
Wharton geléstamceller odlas och inkuberas i ett serumfritt medium i 48 timmar när kulturen når tillräcklig densitet. Efter inkubationens slut förvaras supernatanten vid -20 °C. De uppsamlade supernatanterna späds med PBS och genomgår ultracentrifugering (figur 1). Den erhållna lösningen analyseras med NTA- och DLS-analyser. Exosomerna steriliseras genom att passera genom ett 0,22 μm filter. Den genomsnittliga storleken på de erhållna exosomerna bestämdes till 98 nm (Video 1). Cirka 10 miljarder exosompartiklar erhölls i slutet av centrifugeringen. Antalet nanopartiklar som avslöjas av NTA- och DLS-analyser överensstämmer med varandra. Dessutom uppmättes zetapotentialen för exosomer som härstammar från WJ-MSC till -15,7 mV (figur 2 och figur 3).
Video 1: Nanopartikelspårningsanalys av Wharton Jelly-härledda exosomer. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Laddning av dopamin i exosomer
Enligt NTA-analysen fanns det cirka 1,5 miljarder nanopartiklar i 500 μL av de isolerade proverna från Whartons gelé. Dopaminlösning (5 mg/ml) blandades med 500 μl exosomer och suspensionen inkuberades i 24 timmar vid 37 °C. Efter inkubation karakteriserades den erhållna lösningen med NTA- och DLS-analyser. Enligt NTA-resultaten visade sig lösningens genomsnittliga partikelstorlek vara 110 nm. En jämförelse av partikelstorlekarna hos exosomer och dopaminladdade exosomer avslöjar att det fanns en signifikant ökning av dimensionerna av de dopaminladdade exosomerna. Antalet nanopartiklar som avslöjades av NTA- och DLS-analyser överensstämde med varandra. Dessutom uppmättes zetapotentialen hos dopaminladdade exosomer till -17,6 Mv (figur 2 och figur 3).
Video 2: Nanopartikelspårningsanalys av dopaminladdade exosomer. Klicka här för att ladda ner den här videon.
| Prov | Zeta-potential |
| Exosom | -15,7 mV ± 1,1 |
| Saponin | -12 mV ± 0,7 |
| Dopamin | -14,4 mV ± 1,3 |
| Dopaminladdad exosom | -17,6 mV ± 0,8 |
Tabell 1: Zeta-potential för alla lösningar.
DSL-analyser, Zeta-sizer och Zeta-potentialtabellen för den dopamin-, saponin- och dopaminladdade exosomlösningen visas i tabell 1.
Figur 2: Nanopartikelspårningsanalys av exosomer. a) Exosomer. B) dopaminladdade exosomer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Zetasizer analys . (A) Exosomer, (B) dopaminladdade exosomer, (C) Saponin, (D) Dopamin. Förkortning: d = storlek. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Förekomsten av dopamin i lösningen bestämdes genom HPLC-analys. Dopaminladdade exosomer ultracentrifugerades och filtrerades för att avlägsna fritt dopamin. Om dopaminladdningen i exosomerna lyckas i slutet av inkubationen kan den detekteras genom direkt mätning av dopamin efter att exosomerna brustit. För detta ändamål värmdes den dopaminladdade exosomsuspensionen upp med ånga, acetonitril tillsattes, och suspensionen sonikerades. Absorbansen mättes vid 230 nm för att bedöma mängden dopamin som frigjordes från de störda exosomerna.
Figur 4: Förekomst av dopamin i formuleringen bestämd genom HPLC-analys. Alla analyser utfördes med en C-18-kolonn med en mobil fas av H2O/acetonitril vid en flödeshastighet på 1 ml/min vid 30 °C. Absorbansen mäts vid 230 nm för att övervaka elueringen av dopamin. (A) Dopamin, (B) Saponin, (C) Dopaminladdade exosomer. Förkortning: HPLC = högpresterande vätskekromatografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Som ett resultat av HPLC-analys observerades den resulterande toppen för dopamin efter 6,45 minuter. Förekomst av saponin upptäcktes också efter exosomfragmentering (Figur 4).
Läkemedelsladdningskapacitet och in vitro-kinetik för frisättning av läkemedel
Dopaminbelastningskapaciteten beräknades med hjälp av UV-spektrofotometrimätningar och Eq (1) och Eq (2). Beläggningsgraden visade sig vara 10,89 ± 0,33. Den kumulativa frisättningsprofilen visas i figur 5. Läkemedelsfrisättningskinetik som övervakades under 8 timmar visade att 74,8 % av inkapslat dopamin frisattes från exosomer inom de första 8 timmarna (figur 5).
Figur 5: Kumulativ frisättningsprofil. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Cytotoxicitetstest in vitro
Cytotoxiciteten hos dopaminladdade och fria exosomer undersöktes på fibroblaster. Fibroblaster exponerades för olika koncentrationer av formuleringar (100 μL/ml, 250 μL/ml, 500 μL/ml och 1 000 μL/ml) och inkuberades i 18 timmar. Även om dopaminladdade exosomer inte visade några anmärkningsvärda cytotoxiska effekter, minskade saponin som tillsats till formuleringen för att öka inkapslingen av dopamin fibroblastviabiliteten (p < 0,05, figur 6). Det fanns en ökning av cellviabiliteten när fibroblasterna behandlades med dopaminladdade exosomer upp till 500 μL/ml koncentration. I slutet av den 18 timmar långa inkubationen bestämdes cellviabiliteten med MTT-testet (figur 7). Den statistiska signifikansen av resultaten utvärderades genom att utföra envägs ANOVA.
Figur 6: Mikroskopbilder (10x) efter inkubation av formuleringen med cellerna. (A) Dopamin, (B) Saponin, (C) Dopaminladdade exosomer 100 μL/ml, (D) Dopaminladdade exosomer 250 μL/ml, (E) Dopaminladdade exosomer 500 μL/ml, (F) Dopaminladdade exosomer 1 000 μL/ml. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Statistisk analys av resultat från MTT-viabilitetstest i celler inkuberade i 18 timmar med olika koncentrationer av dopamin, saponin och dopaminladdade exosomer . (A) Cytotoxicitetsresultat, (B,C) Statistiska analyser. Förkortningar: D = dopamin; S = Saponin; Exo-DA1 = dopaminladdade exosomer 100 μL/ml; Exo-DA2 = dopaminladdade exosomer 250 μL/ml; Exo-DA 3 Dopaminladdade exosomer 500 μL/ml; Exo-DA 4 = Dopaminladdade exosomer 1 000 μL/ml; MTT = 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Dessutom undersöktes de cytotoxiska effekterna av fria exosomer på fibroblaster vid liknande koncentrationer (Figur 8). Före experimentet späddes exosomer ut med PBS till 60 miljoner partiklar per ml. Därefter tillsattes 10 μL, 25 μL, 50 μL och 100 μL av exosomsuspensionen till varje brunn på en 96-hålsplatta.
Figur 8: Statistisk analys av resultat från MTT-viabilitetstest i celler som inkuberats i 18 timmar med olika koncentrationer av exosomer . A) Cytotoxicitetsresultat. (B,C) statistiska analyser. Förkortningar: EXO = exosomer; MTT = 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Fibroblastviabiliteten visade sig vara högre med 500 μL/ml dopaminladdade exosomer och 25 μL/ml fria exosomer jämfört med andra koncentrationer. Ingen signifikant cytotoxicitet observerades dock vid någon koncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exosomer är små membranvesiklar med dimensioner på 40-200 nm som utsöndras av de flesta celltyper, t.ex. MSC1. Exosomer kan möjliggöra kommunikation mellan celler och kan komma in i celler på olika sätt såsom endocytos, fagocytos, mikropinocytos, lipidmedierad internalisering och fusion33,44. Jämfört med andra nanobärarsystem ger lipiderna och kolesterolet som finns på exosomens yta förmågan att bära både hydrofila och hydrofoba molekyler, med vätebindningen av kolesteroländarna som möjliggör tät förpackning45.
Isolering av MSC-härledda exosomer, läkemedelsladdningsexperiment och cytotoxicitetsanalyser utfördes i den aktuella studien. Det är känt att exosomer har en viktig roll i neurogenesen, särskilt i hjärnan, utöver deras viktiga funktioner som last och kommunikation mellan celler 6,7. Dessutom tolereras MSC-härledda exosomer relativt väl, har inneboende terapeutiska egenskaper och uppvisar hög stabilitet och målsökande förmåga46,47. Under de senaste åren har forskning om behandlingsmetoder i nanoskala, såsom exosomapplikationer, rönt stor uppmärksamhet som alternativa behandlingar mot neurodegenerativa sjukdomar eftersom det inte finns något botemedel mot dessa sjukdomar som orsakas av neuronala skador. Dessutom gör exosomernas förmåga att passera genom BBB dem till utmärkta plattformar som ett läkemedelsbärarsystem.
Även om det finns flera metoder för exosomisolering, använde vi här ultracentrifugisoleringsmetoden, som är accepterad som en av de mest effektiva metoderna. I den aktuella studien är WJ-MSC, som valts ut som donatorceller, kända för sin låga immunogena potential47 och används som en källa till exosomer i kliniska prövningar48. De erhållna exosomerna inkuberades sedan med dopaminlösning under vilken saponin tillsätts till lösningen för att öka framgången med läkemedelsladdningen. I slutet av inkubationen avlägsnades fritt dopamin och saponin från mediet. Saponin förväntas selektivt avlägsna det membranbundna kolesterolet i exosomer och skapa porer i de exosomala lipiddubbelskikten, vilket främjar inträdet av dopaminmolekyler. Som ett resultat observeras att exosomernas dimensioner ökade något, troligen på grund av dopaminbelastning.
Zetapotentialen visar större elektrostatisk repulsion mellan partiklar och deras tendens att aggregera. Zetapotentialen hos den erhållna formuleringen var förenlig med resultaten från tidigare studier49. I HPLC-analysen som utfördes i slutet av inkubationstiden upptäcktes förekomsten av dopamin efter fragmentering av exosomerna. Som nämnts ovan främjar saponin inkapsling av dopamin. Läkemedelsladdningskapaciteten mättes med UV-vis-spektrofotometri baserat på absorbansvärden39. Även om inkubationsmetoden för läkemedelsladdning är enkel och billigare än andra metoder, är laddningseffektiviteten låg i denna metod26. I denna studie var lastkapaciteten cirka 11 %. Saponin är ett effektivt permeabiliserande medel för cytoplasmamembranet50 och verkar öka exosomernas belastningskapacitet med dopamin.
I framtida studier, Det kan vara mer effektivt att föredra ultraljudsbehandling metod för att förbättra exosomal läkemedelsladdningeffektivitet 38. Den kumulativa frisättningsprofilen visade att stora mängder dopamin frisattes i slutet av 8 timmars inkubation. Ett explosivt utsläpp observerades under de första 5 timmarna av in vitro-frisättningsstudien. Eftersom frisättningsprofilen för exosomformuleringar beror på många parametrar såsom läkemedelsegenskaper, bilagerfluiditet och molekylvikt, kan skillnader i mängden frisatta läkemedel per timme observeras i många studier51. Dessutom observerades inga cytotoxiska effekter av formuleringarna på fibroblaster i denna studie. Den toxiska effekten av saponin som tillsatts för att öka dopaminladdningen i exosomer upptäcktes dock på fibroblastceller. Enligt dessa data är endogeniteten hos exosomer en naturlig och unik fördel jämfört med liposomer, mikrosfärer, mikroemulsioner och andra syntetiska läkemedelsleveranssystem52. För att minska nackdelarna med den nuvarande metoden kan olika transfektionsreagenser, elektroporeringstekniker eller endogena dopaminproducerande celler, företrädesvis genetiskt modifierade MSC, användas som källa till exosomer.
Exosomisolering utfördes med detta protokoll. Isoleringssteget är dock en mycket lång och svår process. Försiktighet bör iakttas för att säkerställa att supernatanten som samlas in från cellodlingen finns i det serumfria mediet. Dessutom har mängden exosomer hittills kopplats till proteinkoncentrationen. Vi föreslår dock att beräkning och tillämpning av antalet exosompartiklar kan bidra till att öka noggrannheten i kliniska studier. Inkubationsmetoden som användes för läkemedelsladdning av isolerade exosomer visade sig vara låg i fråga om läkemedelsladdningskapacitet. Ultraljudsbehandling, som har en hög läkemedelsbelastningskapacitet, kan bidra till att få effektivare resultat.
Dessa fynd visade att WJ-MSC-härledda exosomer är kraftfulla bärare för dopaminleverans. Tillsammans med deras förmåga att passera BBB och med deras immunmodulerande egenskaper kan riktade terapier för Parkinsons eller andra CNS-sjukdomar utvecklas med läkemedelsbärande exosomer. Studier bör dock utföras in vivo och stödjas av kliniska prövningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Arbetet stöddes främst av forskningsfinansiering från Yıldız Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
References
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. L., Kwon, Y. L. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Riazifar, M., et al. Stem cell-derived exosomes as nanotherapeutics for autoimmune and neurodegenerative disorders. ACS Nano. 13 (6), 6670-6688 (2019).
- Ursavaş, S., Darıci, H., Karaoz, E. Olfactory ensheathing cells: Unique glial cells promising for treatments of spinal cord injury. Journal of Neuroscience Research. 99 (6), 1579-1597 (2021).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Fruhbeis, C., Frohlich, D., Kramer-Albers, E. M. Emerging roles of exosomes in neuron-glia communication. Frontiers in Physiology. 3 (119), 1-7 (2012).
- Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: new players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabil Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).
- Saeedi, S., Israel, S., Nag, C., Turecki, G. The emerging role of exosomes in mental disorders. Translational Psychiatry. 9 (1), 122 (2019).
- Jan, A. T., et al. Perspective insights of exosomes in neurodegenerative diseases: A critical appraisal. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 317 (2017).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
- Pahuja, R., et al. Trans-blood brain barrier delivery of dopamine-loaded nanoparticles reverses functional deficits in Parkinsonian rats. ACS Nano. 9 (5), 4850-4871 (2015).
- Rao, S. S., Hofmann, L. A., Shakil, A. Parkinson's disease: Diagnosis and treatment. American Family Physician. 15 (74), 2046-2054 (2006).
- Teves, J. M. Y., et al. Parkinson's disease skin fibroblasts display signature alterations in growth, redox homeostasis, mitochondrial function, and autophagy. Frontiers Neuroscience. 11, 737 (2017).
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson disease in 2015: Evolving basic, pathological and clinical concepts in PD. Nature Reviews Neurology. 12 (2), 65-66 (2016).
- Poewe, W., et al.
- Carlsson, T., Björklund, T. Restoration of the striatal dopamine synthesis for Parkinson's disease: Viral vector-mediated enzyme replacement strategy. Current Gene Therapy. 7 (2), 109-120 (2007).
- Simon, D. K., Tanner, C. M., Brundin, P. Parkinson disease epidemiology, pathology, genetics, and pathophysiology. Clinics in Geriatric Medicine. 36 (1), 1-12 (2020).
- Salat, D., Tolosa, E. Levodopa in the treatment of Parkinson's disease: Current status and new developments. Journal of Parkinson's Disease. 3 (3), 255-269 (2013).
- Senthilkumar, K. S., et al. Unilateral implantation of dopamine-loaded biodegradable hydrogel in the striatum attenuates motor abnormalities in the 6-Hydroxydopamine model of Hemi-Parkinsonism. Behavioral Brain Research. 184 (1), 11-18 (2007).
- Krishna, R., Ali, M., Moustafa, A. A. Effects of combined MAO-B inhibitors and levodopa vs. monotherapy in Parkinson's disease. Frontiers Aging Neuroscience. 6, 180 (2014).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. JAMA. 323 (6), 548-560 (2020).
- Rivero Vaccari, J. P. Exosome-mediated inflammasome signaling after central nervous system injury. Journal of Neurochemistry. 136, Suppl. S1 39-48 (2016).
- Han, D., Wu, C., Xiong, Q., Zhou, L., Tian, Y. Anti-inflammatory mechanism of bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in rat model of spinal cord injury. Cell Biochemistry and Biophysics. 71 (3), 1341-1347 (2015).
- Vilaça-Faria, H., Salgado, A. J., Teixeira, F. G. Mesenchymal stem cells-derived exosomes: A new possible therapeutic strategy for Parkinson's disease? Cells. 8 (2), 118-135 (2019).
- Mendes-Pinheiro, B., et al. marrow mesenchymal stem cells secretome exerts neuroprotective effects in a Parkinson's disease rat model. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 294 (2019).
- Kalani, A., Kamat, P. K., Chaturvedi, P., Tyagi, S. C., Tyagi, N. Curcumin-primed exosomes mitigate endothelial cell dysfunction during hyperhomocysteinemia. Life Sciences. 107 (1-2), 1-7 (2014).
- Kalani, A., Tyagi, A., Tyagi, N. Exosomes: Mediators of neurodegeneration, neuroprotection, and therapeutics. Molecular Neurobiology. 49 (1), 590-600 (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C.
- Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Molecular Therapy. 23 (5), 812-823 (2015).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Sun, D., et al. A novel nanoparticle drug delivery system: The anti-inflammatory activity of curcumin is enhanced when encapsulated in exosomes. Molecular Therapy. 18 (9), 1606-1614 (2010).
- Tian, Y., et al. A doxorubicin delivery platform using engineered natural membrane vesicle exosomes for targeted tumor therapy. Biomaterials. 35 (7), 2383-2390 (2014).
- Yang, T., et al. Exosome delivered anticancer drugs across the blood-brain barrier for brain cancer therapy in danio rerio. Pharmaceutical Research. 32 (6), 2003-2014 (2015).
- Chen, H. X., et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Disease. 11 (4), 288 (2020).
- Yu, F., et al. Olfactory ensheathing cells seeded decellularized scaffold promotes axonal regeneration in spinal cord injury rats. Journal of Biomedical Materials Research. 109 (5), 779-787 (2020).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Qu, M., et al. Dopamine-loaded blood exosomes targeted to brain for better treatment of Parkinson's disease. Journal of Controlled Release. 287, 156-166 (2018).
- Kim, M. S., et al. Development of exosome-encapsulated paclitaxel to overcome MDR In cancer cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 12 (3), 655-664 (2016).
- Branquinho, R. T., et al. HPLC-DAD and UV-spectrophotometry for the determination of lychnopholide in nanocapsule dosage form: Validation and application to release kinetic study. Journal of Chromatographic Science. 52 (1), 19-26 (2014).
- Karagöz Kutlutürk, I., et al. Producing aflibercept loaded poly (lactic-co-glycolic acid) [PLGA] nanoparticles as a new ocular drug delivery system and its challenges. Fresenius Environmental Bulletin. 30 (2), 1481-1493 (2021).
- Setiawatie, E. M., et al. Viability of nigella sativa toothpaste with SLS compared non-SLS on fibroblast cell culture. Journal of International Dental and Medical Research. 14 (2), 525-528 (2021).
- Jebelli, A., Khalaj-Kondori, M., Rahmati-Yamchi, M. The effect of beta-boswellic acid on the expression of Camk4 and Camk2α genes in the PC12 cell line. Advanced Pharmaceutical Bulletin. 10 (3), 437-443 (2020).
- Cantelmo, R. A., Santos, N. A., Santos, A. C., Regiane, S., Joca, L. Dual effects of S-Adenosyl-Methionine on Pc12 cells exposed to the dopaminergic neurotoxin MPP. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 72 (10), 1427-1435 (2020).
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Kooijmans, S. A., Vader, P., van Dommelen, S. M., van Solinge, W. W., Schiffelers, R. M. Exosome mimetics: A novel class of drug delivery systems. International Journal of Nanomedicine. 7 (1), 1525-1541 (2012).
- Yuan, Z., Kolluri, K. K., Gowers, K. H., Janes, S. M. Trail delivery by MSC-derived extracellular vesicles is an effective anticancer therapy. Journal Extracell Vesicles. 6 (1), 1265291 (2017).
- Darici, H., Sun, E., Koyuncu-Irmak, D., Karaöz, E. Mesenchymal stem cells for the treatment of COVID-19: Why and when they should be used? in Human Mesenchymal Stem Cells. Journal of Stem Cells. Khan, M. 4 (15), 159-181 (2021).
- Koyuncu-Irmak, D., Darici, H., Karaoz, E. Stem cell-based therapy option in COVID-19: Is it promising? Aging and Disease. 11 (5), 1174-1191 (2020).
- Leblanc, P., et al. Isolation of exosomes and microvesicles from cell culture systems to study prion transmission. Exosomes Microvesicles. 1545, 153-176 (2017).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect Of porphyrins. Journal of Control Release. 205, 35-44 (2015).
- Mehryab, F., et al. Exosomes as a next-generation drug delivery system: An update on drug loading approaches, characterization, and clinical application challenges. Acta Biomaterialia. 113, 42-62 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
