Summary
Hier haben wir uns zum Ziel gesetzt, eine Formulierung durch Dopaminbeladung der isolierten Exosomen von Stammzellen aus Whartons mesenchymalen Jelly-Stammzellen zu erhalten. Die Isolierung und Charakterisierung von Exosomen, die Wirkstoffbeladung der resultierenden Exosomen und die zytotoxische Aktivität der entwickelten Formulierung werden in diesem Protokoll beschrieben.
Abstract
Exosomen zwischen 40 und 200 nm Größe bilden die kleinste Untergruppe der extrazellulären Vesikel. Diese bioaktiven Vesikel, die von Zellen abgesondert werden, spielen eine aktive Rolle bei der interzellulären Fracht und Kommunikation. Exosomen kommen meist in Körperflüssigkeiten wie Plasma, Liquor, Urin, Speichel, Fruchtwasser, Kolostrum, Muttermilch, Gelenkflüssigkeit, Sperma und Pleurasäure vor. In Anbetracht der Größe der Exosomen wird angenommen, dass sie eine wichtige Rolle bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems spielen könnten, da sie die Blut-Hirn-Schranke (BHS) passieren können. Daher zielte diese Studie darauf ab, ein auf Exosomen basierendes Nanocarrier-System zu entwickeln, indem Dopamin in Exosomen eingekapselt wird, die aus Whartons mesenchymalen Jelly-Stammzellen (WJ-MSCs) isoliert wurden. Exosomen, die den Charakterisierungsprozess bestanden hatten, wurden mit Dopamin inkubiert. Die Dopamin-beladenen Exosomen wurden am Ende der Inkubation neu charakterisiert. Dopamin-beladene Exosomen wurden in Wirkstofffreisetzungs- und Zytotoxizitätsassays untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass Dopamin erfolgreich in die Exosomen eingekapselt werden konnte und dass die Dopamin-beladenen Exosomen die Lebensfähigkeit der Fibroblasten nicht beeinflussten.
Introduction
Exosomen, bioaktive Vesikel mit signifikanten Merkmalen, haben eine Größe von 40 nm bis 200 nm. Exosomen entstehen aus der Zellmembran und entstehen durch die Freisetzung der Endosomen1. Diese Strukturen dienen als Zell-zu-Zell-Kommunikatoren und interagieren mit benachbarten Zellen, um den Transfer aktiver Moleküle zu erleichtern. Exosomen können aus vielen verschiedenen Quellen isoliert werden. Dazu gehören Körperflüssigkeiten wie Plasma, Urin, Liquor, Speichel sowie Zelllinien, die unter In-vitro-Bedingungen kultiviert werden. Exosomen spielen dank der enthaltenen Biomakromoleküle wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren eine wichtige Rolle bei der Beseitigung von Nervenschäden2. Gliazellen, die Stützzellen des Nervensystems3, übertragen Proteine und Mikro-RNAs über Exosomen4 auf die Axone von Neuronen.
Lipide, die die Myelinscheide bilden, die ein charakteristisches Merkmal der Nervenleitung sind, werden ebenfalls über Exosomen 4,5 von Oligodendrozyten freigesetzt. Exosomen sind auch an Prozessen wie synaptischer Plastizität, neuronaler Stressantwort, Zell-Zell-Kommunikation und Neurogenese im Gehirn beteiligt 6,7. Die Tatsache, dass Exosomen Nanodimensionen besitzen, ermöglicht es ihnen, die BHS zu passieren. Es besteht ein spezieller Übergangsweg von der interstitiellen Flüssigkeit zum Liquor cerebrospinalis nach Durchdringung dieser Membran8. Dank ihrer Oberflächeneigenschaften können Exosomen als Wirkstoffverabreichungssystem effizient mit Zielzellen interagieren und die beladenen Medikamente aktiv abgeben.
Aufgrund der Expression verschiedener adhäsiver Proteine (Tetraspanine und Integrine) auf der Oberfläche von Exosomen können diese extrazellulären Vesikel leicht mit Wirtszellmembranen interagieren und fusionieren9. Es wird angenommen, dass Exosomen aufgrund ihrer Fähigkeit, die BHS zu durchdringen, und ihrer Oberflächeneigenschaften als Arzneimittelverabreichungssystem verwendet werden können, insbesondere bei der Behandlung von Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Aus mesenchymalen Stammzellen (MSC) gewonnene Exosomen haben im Vergleich zu allogenen Zelltherapien ein geringeres Risiko für eine Immunabstoßung und können in dieser Hinsicht ein wichtiger Bestandteil zellfreier Behandlungsanwendungen sein10.
Dopamin ist ein Molekül, dessen Mangel im Gehirn das charakteristische Merkmal der Parkinson-Krankheit (PD) ist und sich von Tag zu Tag verschlimmert11,12,13. Es ist bekannt, dass Parkinson mit einer Degeneration von dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra des Mesencephalons und einem Verlust von Motoneuronenfunktionen verbunden ist14,15. Das Absterben von dopaminergen Neuronen verhindert die Versorgung des Gehirnstriatums mit dem Neurotransmitter Dopamin. Dies wiederum führt zur Entstehung von Parkinson-spezifischen Symptomen16. Diese Symptome der Parkinson-Krankheit sind Bradykinesie, posturale Instabilität, Rigidität und insbesondere Ruhetremor12,13. Obwohl Parkinson erstmals vor mehr als zwei Jahrhunderten beschrieben wurde, sind Studien zum Verständnis der Pathologie und Ätiologie der Krankheit noch im Gange, und es wird derzeit akzeptiert, dass Parkinson eine komplexe systemische Erkrankung ist17. Es wird prognostiziert, dass ein Dopaminmangel auftritt, und klinische Parkinson-Symptome werden beobachtet, wenn mehr als 80 % der Neuronen degenerieren18. Bei der Behandlung der Krankheit wird eine unvollständige Dopamin-Supplementierung bevorzugt, um motorische Symptome zu reduzieren. In-vivo-Studien haben gezeigt, dass die direkte Infusion von Dopamin in das Gehirn die Symptome bei Tieren signifikant reduziert19. Dopaminvorstufen wie L-DOPA (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin) und Dopaminrezeptor-Medikamente werden in der Klinik eingesetzt, da die direkte Infusion von Dopamin in das Gehirn beim Menschen nicht möglich ist und Dopamin, das in das System gelangt, die BHS20 nicht überwinden kann. Diese Art von Medikamenten verliert mit der Zeit ihre Wirksamkeit. Es gibt jedoch immer noch keinen kurativen Behandlungsansatz für Parkinson. Daher besteht ein großer Bedarf, neue therapeutische Strategien und Behandlungsmodalitäten zu entwickeln, um die Pathophysiologie der Krankheit aufzudecken und die Auswirkungen von Parkinson auf die Patienten zu reduzieren.
Exosomen-basierte Studien haben in jüngster Zeit Aufmerksamkeit erregt, weil sie Informationen sowohl über Therapieansätze als auch über Pathologien von Erkrankungen des Nervensystems sammeln. Es wurde gezeigt, dass MSC-abgeleitete Exosomen Entzündungen bei Nervenschäden reduzieren und zur neuronalen Regeneration beitragen21,22,23. Darüber hinaus wurde berichtet, dass MSC-abgeleitete Exosomensekretome die Apoptose reduzieren, indem sie neurotrophe und neuroprotektive Wirkungen zeigen, insbesondere auf dopaminerge Neuronen24,25. Die Forschung an Plattformen, in denen Exosomen als therapeutische Drug-Delivery-Systeme eingesetzt werden, hat sich in den letzten Jahren intensiv beschleunigt. In zahlreichen Studien wurde beobachtet, dass relevante Medikamente leicht in Exosomen eingekapselt und sicher in Zielzellen, Gewebe und Organe eingebracht werden können26,27. Verschiedene Methoden wie Inkubation, Gefrier-/Auftauzyklen, Beschallung und Extrusion könnten für die Wirkstoffbeladung in Exosomen verwendet werden28.
Die Koinkubation mit Exosomen oder Exosomen-ähnlichen Vesikeln ermöglicht es, lipophile kleine Moleküle passiv in diese Verabreichungssysteme einzukapseln28,29,30. Insbesondere wurden verschiedene Moleküle wie Curcumin 31, Katalase 30, Doxorubicin32 und Paclitaxel33 effektiv in Exosomen geladen. Es wurde beobachtet, dass Katalase-haltige Exosomen, die eine antioxidative Aktivität haben, sich effizient in den Neuronen und Mikrogliazellen im Gehirn ansammelten und starke neuroprotektive Aktivitäten zeigten30. In derselben Studie wurde festgestellt, dass Saponin, das dem Komplex zugesetzt wird, um die Beladungseffizienz zu erhöhen, den Prozentsatz der Wirkstoffbeladung während der Inkubation erhöht30,34. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die Standards für die Beladung von Exosomen mit Medikamenten festzulegen.
Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung eines Nanocarrier-Systems durch Einkapselung von Dopamin in Exosomen, die aus WJ-MSCs isoliert wurden. Alle Schritte, einschließlich der Kultivierung von WJ-MSCs, der Isolierung und Charakterisierung von Exosomen, der Wirkstoffbeladungsexperimente, der Charakterisierung von Dopamin-beladenen Exosomen mit verschiedenen Techniken und der In-vitro-Zytotoxizitätsanalyse werden ausführlich erläutert.
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Protocol
HINWEIS: In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Kultivierung und Kryokonservierung von mesenchymalen Wharton-Jelly-Stammzellen
- Nehmen Sie die WJ-MSCs (von ATCC) aus dem Gefrierschrank bei -80 °C. Die Zellen werden in einen Kolben mit DMEM-F12-Medium gesät, der mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) angereichert ist. Sie werden bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert.
- Wechseln Sie das Nährmedium alle 2 Tage. Passieren Sie die Zellen, wenn sie 80% Konfluenz erreicht haben. Waschen Sie die zu passierenden Zellen mit 5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
HINWEIS: Das Waschen mit PBS vor der Zugabe von Trypsin gewährleistet eine einfache Trennung der Zellen von der Kolbenoberfläche. - Das PBS wird entfernt und 5 ml Trypsin-EDTA-Lösung in den Kolben gegeben. Der Kolben wird 5 min bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert.
- Sammeln Sie den Überstand im Röhrchen und zentrifugieren Sie ihn 5 Minuten lang bei 1.500 x g . Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und geben Sie 1 ml DMEM-F12 + 10% FBS durch Pipettieren in das Röhrchen.
- Die Zellen werden in einen größeren Kolben überführt und die Kultur durch Zugabe von DMEM-F12 + 10% FBS fortgesetzt, bis genügend Exosomen vorliegen35.
HINWEIS: Kultivierte Zellen werden mit einer Dichte von 1 Million/ml mit 10% Dimethylsulfoxid (DMSO) eingefroren und bei -80 °C gelagert.
2. Herstellung von Exosomen aus mesenchymalen Wharton-Jelly-Stammzellen
HINWEIS: Exosomen werden aus kultivierten WJ-MSCs isoliert. Die Exosomenisolierung wird durchgeführt, wenn die Zellen die Kolbenoberfläche bedecken und eine Dichte von etwa 80 % erreichen.
- Das überstehende Medium, das 10 % FBS enthält, wird aus dem Kolben entnommen und die Zellen mit 5 ml PBS gewaschen. Geben Sie serumfreies DMEM-F12-Medium nach dem Spülen mit PBS zu den Zellen. Kolben 48 h bei 37 °C in einem 5%igen CO2 -Inkubator inkubieren. Nach der Inkubation wird das serumfreie Medium im Röhrchen aufgefangen und bei -20 °C gelagert.
HINWEIS: In Schritt 2.1 werden 180 ml serumfreies Medium gesammelt und bei -20 °C gelagert. Nach dem Auftauen wird ein Batch-Zentrifugationsprozess gestartet, wie unten beschrieben. - Isolierung von Exosomen
- Das gesammelte serumfreie Medium wird bei 300 x g für 10 min bei +4 °C zentrifugiert. Ziehen Sie den Überstand vorsichtig ab und füllen Sie ihn in ein anderes Röhrchen um.
- Den aufgefangenen Überstand bei 2.000 × g für 10 min bei +4 °C zentrifugieren. Ziehen Sie den Überstand vorsichtig ab und füllen Sie ihn in ein anderes Röhrchen um.
- Den gesammelten Überstand bei 10.000 × g für 30 min bei +4 °C zentrifugieren. Ziehen Sie den Überstand vorsichtig ab und füllen Sie ihn in ein anderes Röhrchen um.
- Der gesammelte Überstand wird in Ultrazentrifugenröhrchen überführt und 130 min lang bei 110.000 × g ultrazentrifugiert. Entfernen Sie langsam den Überstand und geben Sie 1 ml PBS in das Pellet.
- Das Pellet vortexen und bei 110.000 × g 70 min bei +4 °C36 ultrazentrifugieren (Abbildung 1). Entfernen Sie langsam den Überstand und geben Sie 1 ml PBS in das Pellet.
HINWEIS: Nach Abschluss der Ultrazentrifugationsschritte können die erhaltenen Exosomen bei -80 °C gelagert werden. Das erhaltene Pellet ist nun bereit für die Charakterisierung.
Abbildung 1: Exosomenisolierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Charakterisierung von Exosomen
- Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
HINWEIS: Die Nanopartikel-Tracking-Analyse wird durchgeführt, um die Größe und Konzentration der isolierten Exosomen zu bestimmen. Tabletten, die für 1x PBS-Lösung verwendet werden, müssen im Bereich von pH 7,3-7,5 liegen. 1x PBS-Lösung enthält 10 mM Phosphatpuffer, 137 mM Natriumchlorid und 2,7 mM Kaliumchlorid. Die Lösung wird durch Zugabe von 1 PBS-Tablette in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Diese vorbereitete Lösung wird durch Autoklavieren sterilisiert.- Verdünnen Sie die Exosomen um das 100-fache, indem Sie 990 μl PBS zu 10 μl Exosomen hinzufügen. Nehmen Sie die verdünnte Suspension in eine Einwegspritze.
- Schalten Sie das NTA-Gerät ein, und schließen Sie den Computer an. Öffnen Sie die Software.
- Injizieren Sie die Probe in der Spritze in den Schlauch im Kassettenteil des Geräts. Schließen Sie die Kassettenabdeckung des Geräts.
- Klicken Sie in der sich öffnenden Software auf die Schaltfläche Analyse starten . Speichern Sie die Ergebnisse, die Sie durch Drücken der Aufnahmetaste erhalten haben.
- Dynamische Lichtstreuungsanalyse
HINWEIS: Exosomen, die für die Zetapotential- und Größenmessung isoliert wurden, werden ebenfalls auf die gleiche Weise wie für die NTA-Analyse verdünnt.- Fügen Sie 980 μl PBS zu 20 μl der Exosomen hinzu.
- Öffnen Sie das Zeta-Größenmessgerät und den angeschlossenen Computer. Öffnen Sie die Software.
- Die Suspension aus Schritt 3.2.1 wird in die Einwegküvette gegeben. Öffnen Sie den Deckel des Geräts, legen Sie die Küvette in die Kassette und schließen Sie den Deckel.
- Wählen Sie den Küvettentyp in der Software des Geräts aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Analyse starten , um die Zetapotenzial- und Dimensionsanalyse durchzuführen.
HINWEIS: Die Analysen werden für die Dimensionsanalyse und das Zetapotenzial separat durchgeführt.
4. Dopaminladung in Exosomen
HINWEIS: Nachdem die Charakterisierung der WJ-MSC-Exosomen abgeschlossen ist, wurden Dopamin-beladene Exosomen als Wirkstoffabgabesystem erhalten. Das Laden des Wirkstoffs in die Exosomen erfolgt mit der Inkubationsmethode.
- 3 ml PBS zur Exosomensuspension aus Schritt 2.2.5 geben. Sterilisieren Sie die verdünnte Suspension durch Filtration mit 0,22-μm-Filtern. 500 μl der sterilisierten Exosomensuspension in ein anderes Röhrchen überführen.
- Bereiten Sie Dopaminlösung (0,5 mg/ml) mit destilliertem Wasser zu. Geben Sie 500 μl Dopaminlösung in die Röhrchen, die die Exosomen enthalten.
- In Schritt 4.2 wird der Suspension Saponin zugegeben. Die hergestellte Exosom-Dopamin-Suspension wird für 24 h bei 37 °C inkubiert.
HINWEIS: Die Saponinkonzentration sollte 0,002% der Gesamtlösung nicht überschreiten. - Ultrazentrifugieren Sie die Suspension bei 90.000 × g für 70 Minuten, um freies Dopamin und Saponin aus dem Medium zu entfernen. Lagern Sie die isolierten Exosomen bei -20 °C, bis sie für die weitere Analyse verwendet werden37.
HINWEIS: Fügen Sie 0,02% Ascorbinsäure hinzu, um die Stabilität der hergestellten Dopaminlösung zu gewährleisten.
5. Charakterisierung von Dopamin-beladenen Exosomen
- Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA)
HINWEIS: Die Nanopartikel-Tracking-Analyse wird durchgeführt, um die Größe und Konzentration isolierter Exosomen zu bestimmen.- Befolgen Sie die Schritte 3.1.1-3.1.4, um die Exosomen zu verdünnen und eine NTA durchzuführen.
- Dynamische Lichtstreuungsanalyse
HINWEIS: Exosomen, die für die Messung des Zetapotenzials und der Größe isoliert wurden, werden ebenfalls ähnlich wie bei der NTA-Analyse verdünnt.- Befolgen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.4, um die Exosomen zu verdünnen und eine dynamische Lichtstreuungsanalyse durchzuführen.
HINWEIS: Größe und Zetapotentiale für jede Lösung (Saponin, Dopamin, Exosom-Dopamin) werden separat analysiert.
- Befolgen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.4, um die Exosomen zu verdünnen und eine dynamische Lichtstreuungsanalyse durchzuführen.
6. Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
HINWEIS: Die Dopaminmengen, die in Exosomen geladen sind, werden mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gemessen. Um das Vorhandensein von Dopamin in der erhaltenen Formulierung nachzuweisen, werden Exosomen durch ein spezielles Verfahren zur Explosion gebracht.
- Geben Sie die Formulierung zum Verdampfen in eine 75 °C heiße Heizung. Acetonitril (Verhältnis 50:50) zur Suspension und zum Wirbel geben. Beschallen Sie die Lösung 10 Minuten lang.
- Die Lösung wird 10 min bei 10.000 × g zentrifugiert. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,22 μm-Filter.
- Analysieren Sie alle Analyten mit einer C18-Säule bei 30 °C und einer Flussrate von 1 ml/min (der mobilen PhaseH2O/Acetonitril). Messen Sie die Extinktion bei 230 nm38.
7. Messung der Wirkstoffbeladungskapazität (DL) und In-vitro-Wirkstofffreisetzungskinetik
- Beladungskapazität von Arzneimitteln (DL)
HINWEIS: Die Menge an Dopamin, die in Exosomen geladen ist, wird mit UV-Vis-Spektroskopie quantifiziert. Die Absorption wird bei 280 nm abgelesen. Die während der Synthese gesammelten Überstände werden verwendet, um die Menge des entladenen Arzneimittels zu messen. Die Dopaminkonzentration im Überstand wird über eine Standard-Kalibrierkurve für Dopamin bestimmt.- Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mg/ml Dopamin vor. Konzentrationen von 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 und 0,5 mg/ml aus der Stammlösung unter Verwendung von destilliertem Wasser herstellen.
HINWEIS: Fügen Sie 0,02% Ascorbinsäure hinzu, um die Stabilität der hergestellten Dopaminlösung zu gewährleisten. - Generieren Sie eine Standard-Kalibrierkurve, indem Sie die Absorption jeder Dopaminverdünnung bei 280 nm in einem UV-Spektralphotometer messen.
- Messen Sie die Absorption des Überstandes bei 280 nm.
- Berechnen Sie die Wirkstoffbeladungskapazität für Dopamin mit Gl (1)39.
DL (%) =
100 (1)
HINWEIS: Die Analyse wird in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
- Bereiten Sie eine Stammlösung von 1 mg/ml Dopamin vor. Konzentrationen von 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 und 0,5 mg/ml aus der Stammlösung unter Verwendung von destilliertem Wasser herstellen.
- In-vitro-Kinetik der Wirkstofffreisetzung
HINWEIS: Die Wirkstofffreisetzungskinetik von Dopamin-beladenen Exosomen wird mit einer Dialysemembran durchgeführt. PBS, pH 7,4, wird als Freisetzungsmedium verwendet, um eine physiologische Mikroumgebung zu simulieren.- Geben Sie 1 ml Dopamin-beladene Exosomen in die Dialysemembran. Legen Sie die Membran in ein Becherglas. 15 ml PBS in das Becherglas geben.
- Probe von 1 ml Freisetzungsmedium in einem Becherglas nach 0,5, 1, 2, 4, 6 und 8 Stunden. Ersetzen Sie zu jedem Zeitpunkt das Volumen der Probe durch frisches PBS. Analysieren Sie die Proben, die in bestimmten Intervallen bei 280 nm entnommen wurden, mit einem UV-Vis-Spektrometer.
- Berechnen Sie die Ergebnisse mit Gl (2)40.
Freigabe (%) =
100 (2)
HINWEIS: Für die Bestimmung der In-vitro-Wirkstofffreisetzungskinetik wird eine Kalibrierungskurve erstellt. Dopaminlösung wird in Konzentrationen von 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 und 5,0 mg/ml hergestellt. Der UV-Absorptionswert jeder Konzentration wird bei 280 nm mit einem UV-Vis-Spektralphotometer bestimmt.
100 (1)
100 (2)8. In-vitro-Zytotoxizitätstest
- Revitalisierung und Kultivierung von Fibroblasten
- Die Fibroblasten aus dem Gefrierschrank bei -80 °C nehmen. Säen Sie die Zellen in einen Kolben mit DMEM-F12 + 10% FBS.
- Die Zellen werden bei 37 °C in einem Inkubator mit 5 % CO2 inkubiert. Wechseln Sie das Nährmedium alle 2 Tage.
- Durchlaufen Sie die Zellen, bis sie eine 80%ige Konfluenz erreicht haben. Führen Sie die Schritte 1.3 bis 1.5 aus. Nach der Zentrifugation bei 1.500 × g für 5 Minuten wird der Überstand entfernt, 1 ml DMEM-F12 + 10 % FBS hinzugefügt und 10.000 Zellen pro Well in eine 96-Well-Platte gesät.
- DMEM-F12 Medium + 10% FBS zugeben und die Zellen bei 37 °C für 18 h in einem Inkubator mit 5% CO2 inkubieren. Wechseln Sie das Medium der Vertiefungen am Ende der Inkubation.
- Bereiten Sie die Vorräte der Dopamin-beladenen Exosomensuspension vor. Verdünnen Sie die mit Dopamin beladene Exosomenformulierung mit Medium, um Konzentrationen von 100 μl/ml, 250 μl/ml, 500 μl/ml und 1.000 μl/ml zu erhalten.
- Geben Sie die vorbereiteten Konzentrationen auf die Zellen in jeder Vertiefung der 96-Well-Platte. Die Platten werden bei 37 °C für 18 h in einem Inkubator mit 5 % CO241 inkubiert.
- MTT-Zellviabilitäts-Assay
HINWEIS: Am Ende der Inkubation werden die Viabilitätsverhältnisse der Zellen durch den MTT-Test bestimmt.- Bereiten Sie die MTT-Lösung (5 mg/ml) mit PBS vor. Geben Sie 10 μl MTT-Lösung in jede Vertiefung. 4 h bei 37 °C inkubieren.
- Geben Sie am Ende der Inkubation 100 μl DMSO in jede Vertiefung. Die Platten 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Messung der Absorptionswerte im ELISA-Reader bei 570 nm42,43.
HINWEIS: Der MTT-Viabilitätstest wird in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
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Representative Results
Isolierung und Charakterisierung von Exosomen
Wharton-Jelly-Stammzellen werden kultiviert und 48 Stunden lang in einem serumfreien Medium inkubiert, wenn die Kultur eine ausreichende Dichte erreicht hat. Nach Beendigung der Inkubation wird der Überstand bei -20 °C gelagert. Die gesammelten Überstände werden mit PBS verdünnt und einer Ultrazentrifugation unterzogen (Abbildung 1). Die erhaltene Lösung wird durch NTA- und DLS-Analysen analysiert. Die Exosomen werden sterilisiert, indem sie einen 0,22-μm-Filter passieren. Die durchschnittliche Größe der erhaltenen Exosomen wurde mit 98 nm bestimmt (Video 1). Am Ende der Zentrifugation wurden etwa 10 Milliarden Exosomenpartikel erhalten. Die Anzahl der Nanopartikel, die durch NTA- und DLS-Analysen ermittelt wurden, stimmt überein. Zusätzlich wurde das Zetapotential von Exosomen, die aus WJ-MSCs stammen, mit -15,7 mV gemessen (Abbildung 2 und Abbildung 3).
Video 1: Nanopartikel-Tracking-Analyse von aus Wharton Jelly gewonnenen Exosomen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Einspeisung von Dopamin in Exosomen
Wie in der NTA-Analyse berechnet, befanden sich etwa 1,5 Milliarden Nanopartikel in 500 μl der isolierten Proben aus Wharton-Gelee. Dopaminlösung (5 mg/ml) wurde mit 500 μl Exosomen gemischt, und die Suspension wurde 24 h lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die erhaltene Lösung durch NTA- und DLS-Analysen charakterisiert. Nach den NTA-Ergebnissen betrug die durchschnittliche Partikelgröße der Lösung 110 nm. Ein Vergleich der Partikelgrößen von Exosomen und Dopamin-beladenen Exosomen zeigt, dass die Abmessungen der Dopamin-beladenen Exosomen signifikant zugenommen haben. Die Anzahl der Nanopartikel, die durch NTA- und DLS-Analysen ermittelt wurden, stimmte überein. Darüber hinaus wurde das Zetapotential von Dopamin-beladenen Exosomen mit -17,6 Mv gemessen (Abbildung 2 und Abbildung 3).
Video 2: Nanopartikel-Tracking-Analyse von Dopamin-beladenen Exosomen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
| Probe | Zeta-Potenzial |
| Exosom | -15,7 mV ± 1,1 |
| Saponin | -12 mV ± 0,7 |
| Dopamin | -14,4 mV ± 1,3 |
| Dopamin-beladenes Exosom | -17,6 mV ± 0,8 |
Tabelle 1: Zeta-Potential aller Lösungen.
DSL-Analysen, die Zeta-Größe und die Zeta-Potential-Tabelle der Dopamin-, Saponin- und Dopamin-beladenen Exosomenlösung sind in Tabelle 1 dargestellt.
Abbildung 2: Nanopartikel-Tracking-Analyse von Exosomen. (A) Exosomen; (B) Dopamin-beladene Exosomen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Zetasizer-Analyse . (A) Exosomen, (B) Dopamin-beladene Exosomen, (C) Saponin, (D) Dopamin. Abkürzung: d = Größe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Das Vorhandensein von Dopamin in der Lösung wurde durch HPLC-Analyse bestimmt. Dopaminbeladene Exosomen wurden ultrazentrifugiert und filtriert, um freies Dopamin zu entfernen. Wenn die Dopaminbeladung der Exosomen am Ende der Inkubation erfolgreich ist, kann dies durch direkte Messung von Dopamin nach dem Bruch der Exosomen nachgewiesen werden. Zu diesem Zweck wurde die Dopamin-beladene Exosomensuspension mit Wasserdampf erhitzt, Acetonitril hinzugefügt und die Suspension beschallt. Die Absorption wurde bei 230 nm gemessen, um die Menge an Dopamin zu beurteilen, die von den gestörten Exosomen freigesetzt wurde.
Abbildung 4: Vorhandensein von Dopamin in der Formulierung, bestimmt durch HPLC-Analyse. Alle Analysen wurden mit einer C-18-Säule mit einer mobilen Phase vonH2O/Acetonitril bei einer Flussrate von 1 ml/min bei 30 °C durchgeführt. Die Absorption wird bei 230 nm gemessen, um die Elution von Dopamin zu überwachen. (A) Dopamin, (B) Saponin, (C) Dopamin-beladene Exosomen. Abkürzung: HPLC = Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Als Ergebnis der HPLC-Analyse wurde der resultierende Peak für Dopamin bei 6,45 min beobachtet. Das Vorhandensein von Saponin wurde auch nach der Exosomenfragmentierung nachgewiesen (Abbildung 4).
Wirkstoffbeladungskapazität und In-vitro-Wirkstofffreisetzungskinetik
Die Dopaminbeladungskapazität wurde mit Hilfe von UV-Spektrophotometrie-Messungen und Gl (1) und Gl (2) berechnet. Es wurde festgestellt, dass die Tragfähigkeit in Prozent 10,89 ± 0,33 betrug. Das kumulative Wirkstofffreisetzungsprofil ist in Abbildung 5 dargestellt. Die über 8 Stunden überwachte Kinetik der Wirkstofffreisetzung ergab, dass 74,8 % des eingekapselten Dopamins innerhalb der ersten 8 Stunden aus den Exosomen freigesetzt wurden (Abbildung 5).
Abbildung 5: Kumulatives Wirkstofffreisetzungsprofil. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
In-vitro-Zytotoxizitätstest
Die Zytotoxizität von Dopamin-beladenen und freien Exosomen wurde an Fibroblasten untersucht. Die Fibroblasten wurden verschiedenen Konzentrationen von Formulierungen ausgesetzt (100 μl/ml, 250 μl/ml, 500 μl/ml und 1.000 μl/ml) und 18 h lang inkubiert. Obwohl Dopamin-beladene Exosomen keine bemerkenswerten zytotoxischen Wirkungen zeigten, verringerte Saponin, das der Formulierung zugesetzt wurde, um die Verkapselung von Dopamin zu erhöhen, die Lebensfähigkeit der Fibroblasten (p < 0,05, Abbildung 6). Es gab eine Erhöhung der Zelllebensfähigkeit, wenn die Fibroblasten mit Dopamin-beladenen Exosomen mit einer Konzentration von bis zu 500 μl/ml behandelt wurden. Am Ende der 18-stündigen Inkubation wurde die Zellviabilität durch den MTT-Test bestimmt (Abbildung 7). Die statistische Signifikanz der Ergebnisse wurde durch die Durchführung einer unidirektionalen ANOVA evaluiert.
Abbildung 6: Mikroskopische Aufnahmen (10x) nach Inkubation der Formulierung mit den Zellen. (A) Dopamin, (B) Saponin, (C) Dopamin-beladene Exosomen 100 μl/ml, (D) Dopamin-beladene Exosomen 250 μl/ml, (E) Dopamin-beladene Exosomen 500 μl/ml, (F) Dopamin-beladene Exosomen 1.000 μl/ml. Maßstabsbalken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Statistische Analyse der Ergebnisse des MTT-Viabilitätstests in Zellen, die 18 Stunden lang mit unterschiedlichen Konzentrationen von Dopamin, Saponin und Dopamin-beladenen Exosomen inkubiert wurden . (A) Ergebnisse der Zytotoxizität, (B,C) Statistische Analysen. Abkürzungen: D = Dopamin; S = Saponin; Exo-DA1 = Dopamin-beladene Exosomen 100 μL/mL; Exo-DA2 = Dopamin-beladene Exosomen 250 μl/mL; Exo-DA 3 Dopamin-beladene Exosomen 500 μL/ml; Exo-DA 4 = Dopamin-beladene Exosomen 1.000 μL/mL; MTT = 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Darüber hinaus wurden die zytotoxischen Effekte von freien Exosomen auch auf Fibroblasten in ähnlichen Konzentrationen untersucht (Abbildung 8). Vor dem Experiment wurden Exosomen mit PBS auf 60 Millionen Partikel pro ml verdünnt. Dann wurden 10 μl, 25 μl, 50 μl und 100 μl der Exosomensuspension zu jeder Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzugefügt.
Abbildung 8: Statistische Analyse der Ergebnisse des MTT-Viabilitätstests in Zellen, die 18 Stunden lang mit unterschiedlichen Exosomenkonzentrationen inkubiert wurden . (A) Zytotoxizitätsergebnisse, (B,C) statistische Analysen. Abkürzungen: EXO = Exosomen; MTT = 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Es wurde festgestellt, dass die Viabilität der Fibroblasten mit 500 μl/ml Dopamin-beladenen Exosomen und 25 μl/ml freien Exosomen im Vergleich zu anderen Konzentrationen höher ist. Es wurde jedoch in keiner Konzentration eine signifikante Zytotoxizität beobachtet.
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Discussion
Exosomen sind kleine Membranvesikel mit Abmessungen von 40-200 nm, die von den meisten Zelltypen, z.B.MSCs 1, sezerniert werden. Exosomen sind in der Lage, die Kommunikation zwischen Zellen zu ermöglichen, und können auf unterschiedliche Weise in Zellen eindringen, z. B. durch Endozytose, Phagozytose, Mikropinozytose, lipidvermittelte Internalisierung und Fusion33,44. Im Vergleich zu anderen Nanocarrier-Systemen verleihen die Lipide und das Cholesterin auf der Exosomenoberfläche die Fähigkeit, sowohl hydrophile als auch hydrophobe Moleküle zu tragen, wobei die Wasserstoffbrückenbindung der Cholesterinenden eine dichte Verpackung ermöglicht45.
In der vorliegenden Studie wurden die Isolierung von MSC-abgeleiteten Exosomen, Drug-Loading-Experimente und Zytotoxizitätsassays durchgeführt. Es ist bekannt, dass Exosomen eine wichtige Rolle bei der Neurogenese, insbesondere im Gehirn, spielen, zusätzlich zu ihren wichtigen Funktionen wie Fracht und Kommunikation zwischen Zellen 6,7. Darüber hinaus sind MSC-abgeleitete Exosomen relativ gut verträglich, haben inhärente therapeutische Eigenschaften und zeigen eine hohe Stabilität und Homing-Fähigkeit46,47. In den letzten Jahren hat die Erforschung nanoskaliger Behandlungsmethoden wie Exosomenanwendungen als alternative Behandlungen gegen neurodegenerative Erkrankungen große Aufmerksamkeit erregt, da es keine Heilung für diese durch neuronale Schädigung verursachten Erkrankungen gibt. Darüber hinaus macht die Fähigkeit der Exosomen, die BHS zu passieren, sie zu hervorragenden Plattformen als Wirkstoffträgersystem.
Obwohl es mehrere Methoden zur Isolierung von Exosomen gibt, haben wir hier die Ultrazentrifugen-Isolationsmethode verwendet, die als eine der effektivsten Methoden anerkannt ist. In der aktuellen Studie sind WJ-MSCs, die als Spenderzellen ausgewählt wurden, für ihr geringes immunogenes Potenzialbekannt 47 und werden in klinischen Studien als Quelle für Exosomen verwendet48. Die erhaltenen Exosomen wurden dann mit Dopaminlösung inkubiert, wobei Saponin zur Lösung hinzugefügt wird, um den Erfolg der Wirkstoffbeladung zu erhöhen. Am Ende der Inkubation wurden freies Dopamin und Saponin aus dem Medium entfernt. Es wird erwartet, dass Saponin selektiv das membrangebundene Cholesterin von Exosomen entfernt und Poren in den exosomalen Lipiddoppelschichten bildet, was den Eintritt von Dopaminmolekülen fördert. Infolgedessen wird beobachtet, dass die Dimensionen der Exosomen leicht zunahmen, wahrscheinlich aufgrund der Dopaminbeladung.
Das Zetapotential zeigt eine stärkere elektrostatische Abstoßung zwischen den Partikeln und deren Neigung zur Aggregation. Das Zetapotential der erhaltenen Formulierung war mit den Ergebnissen früherer Studien vereinbar49. In der HPLC-Analyse, die am Ende der Inkubationszeit durchgeführt wurde, wurde das Vorhandensein von Dopamin nach Fragmentierung der Exosomen nachgewiesen. Wie bereits erwähnt, fördert Saponin die Verkapselung von Dopamin. Die Wirkstoffbeladungskapazität wurde mittels UV-Vis-Spektrophotometrie auf der Grundlage von Absorptionswerten39 gemessen. Obwohl die Inkubationsmethode für die Wirkstoffbeladung einfach und kostengünstiger ist als andere Methoden, ist die Beladungseffizienz bei dieser Methode gering26. In dieser Studie lag die Belastbarkeit bei ca. 11%. Saponin ist ein wirksames Permeabilisierungsmittel für die zytoplasmatische Membran50 und scheint die Beladungskapazität von Exosomen mit Dopamin zu erhöhen.
In zukünftigen Studien könnte es effektiver sein, die Beschallungsmethode zu bevorzugen, um die Effizienz der exosomalen Wirkstoffbeladung zu verbessern38. Das kumulative Wirkstofffreisetzungsprofil zeigte, dass am Ende der 8-stündigen Inkubation große Mengen an Dopamin freigesetzt wurden. In den ersten 5 Stunden der In-vitro-Freisetzungsstudie wurde eine explosive Freisetzung beobachtet. Da das Freisetzungsprofil von Exosomenformulierungen von vielen Parametern wie Wirkstoffeigenschaften, Doppelschichtfluidität und Molekulargewicht abhängt, können in vielen Studien Unterschiede in den Mengen der freigesetzten Wirkstoffe pro Stunde beobachtet werden51. Darüber hinaus wurden in dieser Studie keine zytotoxischen Wirkungen der Formulierungen auf Fibroblasten beobachtet. Die toxische Wirkung von Saponin, das hinzugefügt wurde, um die Dopaminladung in Exosomen zu erhöhen, wurde jedoch auf Fibroblastenzellen nachgewiesen. Diesen Daten zufolge ist die Endogenität von Exosomen ein natürlicher und einzigartiger Vorteil im Vergleich zu Liposomen, Mikrosphären, Mikroemulsionen und anderen synthetischen Arzneimittelabgabesystemen52. Um die Nachteile der derzeitigen Methode zu reduzieren, können verschiedene Transfektionsreagenzien, Elektroporationstechniken oder endogene Dopamin-produzierende Zellen, vorzugsweise genetisch modifizierte MSCs, als Quelle für Exosomen verwendet werden.
Die Exosomenisolierung wurde mit diesem Protokoll durchgeführt. Der Schritt der Isolierung ist jedoch ein sehr langer und schwieriger Prozess. Es sollte darauf geachtet werden, dass sich der aus der Zellkultur gewonnene Überstand im serumfreien Medium befindet. Darüber hinaus wurden bisher die Mengen an Exosomen mit der Proteinkonzentration in Verbindung gebracht. Wir schlagen jedoch vor, dass die Berechnung und Anwendung der Anzahl von Exosomenpartikeln dazu beitragen kann, die Genauigkeit in klinischen Studien zu erhöhen. Es wurde festgestellt, dass die Inkubationsmethode, die für die Wirkstoffbeladung isolierter Exosomen verwendet wird, in Bezug auf die Wirkstoffbeladungskapazität gering ist. Die Beschallungsmethode, die eine hohe Wirkstoffbeladungskapazität aufweist, kann dazu beitragen, effektivere Ergebnisse zu erzielen.
Diese Ergebnisse zeigten, dass WJ-MSC-abgeleitete Exosomen starke Träger für die Dopaminabgabe sind. Zusammen mit ihrer Fähigkeit, die BHS zu passieren, und mit ihren immunmodulatorischen Eigenschaften können zielgerichtete Therapien für Parkinson oder andere ZNS-Erkrankungen mit medikamententragenden Exosomen entwickelt werden. Studien sollten jedoch in vivo durchgeführt und durch klinische Studien unterstützt werden.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde in erster Linie durch Forschungsgelder unterstützt, die von den wissenschaftlichen Forschungsprojekten der Technischen Universität Yıldız (TSA-2021-4713) bereitgestellt wurden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm membrane filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 0.45 µm syringe filter | Aisimo | Used for the sterilization process | |
| 15 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 25 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 50 mL Falcon tube | Nest | Used in cell culture step | |
| 75 cm2 cell culture flasks (Falcon, TPP tissue culture flasks | Nest | Used in cell culture step | |
| 96 well plates (Falcon, TPP microplates) | Merck Millipore | Used in cell culture step | |
| Acetonitrile | Sigma | 271004-1L | Used for HPLC analysis |
| Autoclave | NUVE-OT 90L | Used for the sterilization process | |
| Cell Culture Cabin | Hera Safe KS | Used for the cell culture process | |
| Centrifugal | Hitachi | CF16RN | Used in the exosome isolation step |
| CO2 incubator with Safe Cell UV | Panasonic | Used for the cell culture process | |
| Dopamine hydrochloride H8502-10G | Sigma | H8502-10G | Used in exosome dopamine loading |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture-F12 | Sigma | RNBJ7249 | Used as cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum-FBS | Capricorn | FBS-16A | It was used by adding to the cell culture medium. |
| Freezer -80 °C | Panasonic | MDF-U5386S-PE | To store cells and the resulting exosomes |
| Fridge | Panasonic | MPR-215-PE | Used to store cell culture and other materials |
| High performance liquid chromatography-HPLC | Agilent Technologies | The presence of dopamine from the content of the obtained formulation was investigated. | |
| Microscope- Primovert | Zeiss | Used to observe cells in cell culture. | |
| MTT Assay | Biomatik | Used to measure cell viability | |
| NanoSight NS300 | Malvern panalytical | Malvern panalytical | Used for exosome characterization |
| Optima XPN-100 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Used in the exosome isolation step | |
| PBS tablet | Biomatik | 43602 | In the preparation of the PBS solution |
| Penicilin/Streptomycin Solution | Capricorn | PB-S | It was added to the medium to prevent contamination in cell culture. |
| Pipette Aid | Isolab | ||
| Precision balance-Kern | Kern-ABJ220-4NM | Used in the preparation of solutions | |
| Q500 Sonicator | Qsonica, LLC | Used to digest exosomes in HPLC analysis | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | It was used by adding it to the total solution in the exosome dopamine loading process. |
| Spectrostar-Nano-Spectrophotometry | BMG LABTECH | Used for MTT and drug release analyzes | |
| SPSS 22 | statistical package program | ||
| Vorteks-FinePCR | FinePCR-FineVortex | Used to mix solutions homogeneously | |
| Water Bath 37 °C-Senova | Senova | Used in cell culture step | |
| Wharton’s jelly mesenchymal stem cells | ATCC | ||
| ZetaSizer | Malvern Nano ZS | Malvern Nano ZS | Used for exosome characterization |
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