Kvantitativ analyse av viskoelastiske egenskaper til røde blodlegemer ved hjelp av optisk pinsett og defokuseringsmikroskopi

Summary

Her beskrives en integrert protokoll basert på optisk pinsett og defokuseringsmikroskopi for å måle cellens reologiske egenskaper. Denne protokollen har bred anvendelighet ved å studere de viskoelastiske egenskapene til erytrocytter under variable fysiopatologiske forhold.

Abstract

De viskoelastiske egenskapene til erytrocytter har blitt undersøkt ved hjelp av en rekke teknikker. De rapporterte eksperimentelle dataene varierer imidlertid. Dette tilskrives ikke bare den normale variasjonen av celler, men også til forskjellene i metoder og modeller for cellerespons. Her brukes en integrert protokoll ved hjelp av optisk pinsett og defokuseringsmikroskopi for å oppnå de reologiske egenskapene til røde blodlegemer i frekvensområdet 1 Hz til 35 Hz. Mens optisk pinsett brukes til å måle erytrocytkompleksets elastiske konstant, er defokuseringsmikroskopi i stand til å oppnå cellehøydeprofilen, volumet og dens formfaktor en parameter som tillater konvertering av kompleks elastisk konstant til kompleks skjærmodul. Ved å anvende en myk glassaktig reologimodell, kan skaleringseksponenten for begge modulene oppnås. Den utviklede metoden gjør det mulig å utforske den mekaniske oppførselen til røde blodlegemer, karakterisere deres viskoelastiske parametere, oppnådd under veldefinerte eksperimentelle forhold, for flere fysiologiske og patologiske forhold.

Introduction

Eldre røde blodlegemer (RBC), også kjent som erytrocytter, er i stand til å strekke seg mer enn dobbelt så store når de passerer gjennom de smaleste kapillærene^{i menneskekroppen.} Slike kapasiteter tilskrives deres unike evne til å deformere når de utsettes for ytre belastninger.

De siste årene har forskjellige studier karakterisert denne funksjonen i RBC-overflater ^2,3. Fysikkområdet som beskriver materialets elastiske og viskøse responser på grunn av ytre belastninger kalles reologi. Generelt, når en ekstern kraft påføres, avhenger den resulterende deformasjonen av materialets egenskaper og kan deles inn i elastiske deformasjoner, som lagrer energi, eller viskøse deformasjoner, som sprer energi⁴. Alle celler, inkludert RBC, utviser en viskoelastisk oppførsel; Med andre ord blir energi både lagret og spredt. Den viskoelastiske responsen til en celle kan således karakteriseres ved dens komplekse skjærmodul G * (ω) = G'(ω) + iG"(ω), hvor G '(ω) er lagringsmodulen, relatert til den elastiske oppførselen, og G "(ω) er tapsmodulen, relatert til viskositeten⁴. Videre har fenomenologiske modeller blitt brukt til å beskrive celleresponser, en av de mest brukte kalles den myke glassaktige reologimodellen⁵, preget av en kraftlovavhengighet av den komplekse skjærmodulen med lastfrekvensen.

Encellebaserte metoder har blitt brukt til å karakterisere de viskoelastiske egenskapene til RBC, ved å anvende kraft og måle forskyvning som en funksjon av den påførte belastningen ^2,3. For den komplekse skjærmodulen finnes imidlertid få resultater i litteraturen. Ved bruk av dynamisk lysspredning ble verdier for RBC-lagring og tapsmoduli rapportert varierende fra 0,01-1 Pa, i frekvensområdet 1-100 Hz⁶. Ved bruk av optisk magnetisk vridningscytometri fikk man en tilsynelatende kompleks elastisk modul⁷, og for sammenlikningsformål hevdet man en multiplikativ faktor som eventuelt kunne avklare avvikene.

Mer nylig ble^{det etablert en} ny metodikk basert på optisk pinsett (OT) sammen med defokuseringsmikroskopi (DM), som et integrert verktøy for kvantitativt å kartlegge lagring og tap av skjærmoduler av humane erytrocytter over tidsavhengige belastninger, ^8,9. I tillegg ble en myk glassaktig reologimodell brukt for å passe resultatene og oppnå en kraftlovkoeffisient som karakteriserer RBCene ^8,9.

Samlet sett klargjør den utviklede metodikken^8,9, protokollen som er beskrevet i detalj nedenfor, tidligere uoverensstemmelser ved å bruke de målte verdiene for formfaktoren, F_f^, som relaterer krefter og deformasjoner til spenninger og tøyninger i RBC-overflaten og kan brukes som en ny diagnostisk metode som er i stand til kvantitativt å bestemme viskoelastiske parametere og myke glassaktige egenskaper av RBC oppnådd fra individer med forskjellig blod Patologi. Slik karakterisering, ved hjelp av protokollen beskrevet nedenfor, kan åpne for nye muligheter for å forstå oppførselen til RBC fra et mekanobiologisk perspektiv.

Protocol

Menneskelige blodprøver ble levert av voksne menn og kvinner frivillige i henhold til protokoller godkjent av forskningsetisk komité ved Federal University of Rio de Janeiro (protokoll 2.889.952) og registrert i Brasil-plattformen under CAAE-nummer 88140418.5.0000.5699. En skriftlig form for samtykke ble utstedt til og samlet inn fra alle frivillige. De med hemoglobinopati og/eller kontrollerte medikamenter ble ekskludert. Hele prosessen fulgte de retningslinjer som ble godkjent av instituttets etiske komité.

1. Utarbeidelse av prøveholdere

1. Skaff deg to deksel (24 mm x 60 mm og 24 mm x 32 mm; tykkelse = 0,13-0,17 mm) og en gummiring (diameter = 10 mm; tykkelse = 2 mm) for hver prøveholder.
2. Hell silikonfett over gummiringoverflaten på en måte som dekker hele omkretsen.
3. Plasser gummiringen på dekselet med fettsiden mot dekselet. Vent i 5 min for riktig vedlegg, prøveholderne er deretter klare til å motta cellekulturen.
   MERK: I tillegg kan enten kommersielle eller hjemmelagde glassbunnretter også brukes, som tidligere beskrevet¹⁰.

2. Cellekultur

MERK: Trinnene nedenfor beskriver hvordan du får sunne RBC fra humant blod. Det er viktig at prøvene er ferskt forberedt før hvert forsøk.

1. Fortynn 20 μL blod i 250 μL 1x fosfatbuffer saltoppløsning (PBS) inneholdende 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH₂PO₄, 10 mM glukose og supplert med 1 mg / ml bovint serumalbumin (BSA).
2. Etter sentrifugering ved 200 x g i 2 minutter ved romtemperatur, aspirer supernatanten med en pipette og resuspender cellepelleten i 1 ml 1x PBS/BSA-oppløsning. Vask cellene 2x i bufferen.
3. Beregn celletetthet ved hjelp av et hemocytometrer og frø 50 000 til 100 000 celler i prøveholderen fremstilt i trinn 1. Vent i 10-15 min for uspesifikt cellefeste til dekselet; Ventetiden påvirker ikke cellene.
4. Legg til prøven 0,2 μL av en 10% v / v polystyren kuleløsning (radius = 1,52 ± 0,02 μm) for ytterligere OT-eksperimenter. Bekreft riktig blanding ved å se på prøvene under mikroskopet.
5. Etter cellesåing plasserer du bare den andre dekselslipen over gummiringen (det er ikke nødvendig å legge til fett for festing), lukk oppsettet og fullfør prøveprepareringen. Prøvene er klare for mikroskopianalyse og manipulasjon.

3. Optisk pinsett mikroskop oppsett

MERK: OT er verktøy som bruker en svært fokusert laserstråle for å fange mikroskopiske gjenstander og for å måle krefter i piconewton-området og forskyvninger i nanometerskalaen. OT-laseren som brukes (1064 nm bølgelengde) må være riktig justert, som tidligere beskrevet¹⁰.

1. Kort sagt, ved hjelp av minst to speil atskilt med en avstand på noen få centimeter (minst 10-20 cm), rett en lineært polarisert laserstråle mot bakinngangen til et omvendt mikroskop. Juster laserstrålen nøyaktig for å komme inn i mikroskopet i en rett linje (figur 1).
2. Deretter reflekterer laserstrålen ved hjelp av et dikroisk speil, installert i mikroskopet, for å fortsette parallelt med objektivlinsens akse og gå inn i linsen nær midten av bakinngangen. Dette vil fokusere laseren for å lage den optiske fellen (figur 1).
3. Deretter, for å måle krefter med OT, kalibrer systemet for å oppnå fellestivhet (κ_OT). Se¹⁰ for en mer detaljert beskrivelse av OT-kalibreringsprosedyren. Når κ_OT er funnet, er OT-systemet klart for reologiforsøkene.

4. DM-oppsett

MERK: DM er en brightfield-basert optisk mikroskopiteknikk som gjør at gjennomsiktige objekter kan bli synlige hvis mikroskopet er litt defokusert^11,12. En slik teknikk har blitt brukt for å oppnå RBC-formen¹³. Det samme mikroskopet som brukes til OT-systemet kan brukes til DM, for å oppnå en høydeprofil gjennom 3D-rekonstruksjoner.

1. Juster mikroskopbelysningssystemet ved å utføre Köhler-belysning¹⁴ , og for bedre oppløsning, åpne kondensatormembranen helt for å utføre eksperimentene.
2. Bruk et piezoelektrisk posisjoneringssystem for å forskyve prøven i alle koordinater, med nanometrisk presisjon i z-aksen. Utfør autokalibrering av det piezoelektriske systemet på alle akser. Når alle prosedyrene er utført, er mikroskopsystemet klart for DM-eksperimenter.

5. OT-basert reologieksperiment og analyse

MERK: Reologieksperimentet består i å observere cellens respons på små svingninger med varierende frekvenser.

1. Eksperimentering
   1. Bruk OT-systemet, fell sfæren med OT-laseren og fest den deretter til en RBC ved å trykke sfæren mot celleoverflaten nær toppoverflaten og nær cellekanten. Bruk mikroskopet for dette trinnet. Deretter fanger du en annen kule og gjentar den samme festeprosedyren, men fest den nå til dekselet, nær cellen. Kulen festet til dekselet er referanseperlen (figur 2), som er nødvendig for å følge piezoforskyvningen og for å sammenligne med RBC-sfæren.
   2. Forsikre deg om at den valgte cellen er godt festet til dekselet, og at RBC- og referansekulene har festet seg til henholdsvis RBC-overflaten og dekselet før du starter målingen. Identifiser visuelt de ikke-klebende cellene da de vil bevege seg over tid, til tross for den høye adhesjonshastigheten (rundt 80% -90%).
   3. Legg til en sinusformet funksjon av amplitude, ξ 0 = 0,500 ± 0,001 μm og varierende frekvenser på 1 Hz, 7 Hz, 14 Hz, 21 Hz, 28 Hz og 35 Hz, med respektive vinkelfrekvenser, ω, på 6,3 rad/s, 169 rad/s, 88 rad/s, 132 rad/s, 176 rad/s og 220 rad/s, til den piezoelektriske sceneprogramvaren, ved hjelp av den piezoelektriske programvaren, som tidligere demonstrert ^8,9.
   4. Ved hjelp av det piezoelektriske trinnet, trykk på startknappen for å tillate den piezoelektriske forskyvningen og hold RBC-sfæren i fellen, send prøven til en bevegelsessyklus ved hjelp av sinusformet funksjon som tidligere er innstilt. Bruk et kamera som kan produsere bilder med 790 bilder/s eller høyere for å registrere prøvebevegelsen. Et skjema over eksperimentet er vist i figur 2.
   5. Mens prøven sendes til sinusformede bevegelser, aktiver OT for å fange sfæren festet til RBC-overflaten. Uansett hvilken temperatur som er valgt for å utføre forsøkene, romtemperatur, 37 °C eller en annen temperatur, må du overvåke temperaturen nøye for å unngå variasjoner under målingene. Den infrarøde (1064 nm) laseren som brukes til å lage OT, forårsaker nesten ingen skade eller oppvarming av cellene.
2. Analyse
   1. Analyser bildene som er oppnådd under sinusformede bevegelser ved hjelp av ImageJ for å finne massesenteret for hver av sfærene over tid.
      MERK: Disse dataene tillater generering av plott som kan vise fase- og amplitudeforskjeller mellom begge sfærene. Slik informasjon er avgjørende for å oppnå den viskoelastiske responsen til RBC.
   2. For å få massesenteret for hver av kulene, åpne ImageJ-programvaren. Importer hele filmen som er oppnådd under sinusformede bevegelser.
   3. I kategorien Bilde klikker du på Juster, og deretter velger du Terskelverdi. Terskelvinduet åpnes. Velg svart-hvitt. Dette vil gjøre bakgrunnen hvit og kulene svarte.
   4. Juster terskelen med begge rullefeltene under histogrammet slik at begge sfærene vises med maksimalt antall piksler.
   5. Velg referansesfæren ved å klikke på File > Rectangle. Tegn et rektangel for å velge sfæren. Når du har valgt referansesfæren i ett bilde, må du kontrollere at rektangelet også markerer den samme sfæren riktig i alle andre bilder av filmen.
   6. Deretter, i kategorien Analyser , klikker du på Angi målinger og velger alternativet Massesenter .
   7. Klikk igjen på Analyser-fanen og velg Analyser partikler. Et nytt vindu åpnes. Definer størrelse og sirkularitet (avhengig av sfæreradiusen). Merk av i følgende bokser : Vis resultater og Fjern resultater. Til slutt klikker du på OK for å behandle alle bildene.
   8. Et nytt vindu som inneholder en tabell med xy-koordinater for sentrum av massen vises. Lagre disse koordinatverdiene som en .txt-fil. Gjenta prosedyren for den andre sfæren, festet til RBC-overflaten.
   9. For å oppnå amplitude og forskjeller i fase for begge sfærer, åpne analyseprogramvaren. Importer de .txt filene som er hentet tidligere.
   10. Opprett en ny tabell med tre kolonner. I den første kolonnen (c0) legger du til antall rammer, i den andre kolonnen (c1) legger du til x-koordinatene for referansesfæren, og i den tredje kolonnen (c2), x-koordinatene for sfæren festet til RBC-overflaten.
       MERK: I dette eksemplet, da sinusformede bevegelser bare ble utført i x-aksen, er det bare nødvendig å bruke x-koordinatene for begge sfærene.
   11. Deretter korrelerer rammene med tiden. Klikk på Windows > formeloppføring. Et nytt vindu kalt formeloppføring åpnes. I dette vinduet er det mulig å sette opp åtte forskjellige ligninger, hver av dem i en bestemt nøkkel (fra F1 til F8).
   12. Velg F1, skriv inn følgende formel:
       c 3 = c0 / (kamera fps)
       Klikk på Kjør. Dette oppretter en ny kolonne for en tid i tabellen (kolonne 4).
   13. Trekk fra x-koordinatverdien for hvert delbilde med den respektive middelverdien. Hvis du vil gjøre dette, angir du to nøkler i formeloppføringen og skriver inn følgende formler for hver nøkkel:
       c 4 = (c 1 - gjennomsnitt (c 1)) og c 5 = (c 2 - gjennomsnitt (c2))
       Klikk på Kjør-knappen . Resultatene vises i kolonne 5 og 6 for henholdsvis referanse- og RBC-sfærer.
   14. Konverter massesenteret fra piksler til mikrometer. For dette, bruk en annen nøkkel på formeloppføringen og skriv inn følgende formel:
       c 4 = c 4 / konverteringsnummer
       Gjenta den samme prosessen for kolonne 5.
       MERK: Konvertering oppnås ved hjelp av en mikrometerskala / linjal og får bildet med samme mikroskopoppsett som brukes til målingene (inkludert samme objektivlinse). Denne prosedyren kan utføres under mikroskopkalibreringen. En piksel/mikrometer-relasjon oppnås dermed.
   15. Generer et plott med massesentrene til begge sfærene på y-aksen og tiden på x-aksen. For dette, klikk på Galleri > Lineær og Scatter. Et nytt vindu åpnes. Velg tidskolonnen for x-aksen, og velg kolonnene i massesenteret i mikrometer for både referanse- og RBC-sfærer i y-aksen.
   16. I plottet velger du bare dataene relatert til den første vinkelfrekvensen (6,3 rad / s). Bruk verktøyene som er angitt i figur 3.
   17. Definer ligningen som justerer datakurven for referansesfæren. For dette, klikk på Curve Fit > General og Fit1, velg boksen med data relatert til posisjonen til referansesfæren, og klikk deretter på Definer. Et nytt vindu åpnes for å definere ligningen. Posisjonen ξ(t) til referansesfæren beskrives ved:
       ξ(t) = ξ₀cos(ωt)
       hvor ξ er den sinusformede bevegelsen til prøven, ω er vinkelfrekvensen og t er tiden i s. Ved å transponere denne ligningen til analyseprogramvaren, vil den se slik ut:
       , hvor m1 er ξ, m2 er f, m0 er tiden t og m3 er fasen av cosinusfunksjonen for t = 0.
   18. Beregn verdiene for m1, m2 og m3 fra tomten. Etter å ha definert ligningen, klikk på OK. Dataene vil bli montert basert på ligningen, og en kurve sammen med en liten firkant vil vises i grafen med verdiene m1, m2 og m3.
   19. Definer ligningen som justerer datakurven for RBC-sfæren. For dette, klikk på Kurvetilpasning > Generelt og definer ligningen som vil justere kurven for dataene. Posisjonen ρ(t) til RBC-sfæren er gitt ved:
       
       hvor ξ' er ut av fase-amplitude, og φ er ut av fasevinkelen. Når du transponerer denne formelen til analyseprogramvaren, vil den se slik ut:
       , hvor m1, m2 og m3 er verdiene som er oppnådd i kurvetilpasningen til referansesfæren. M4 er ξ' og M5 er φ.
   20. Beregn verdiene for m4 og m5 fra plottet. Etter å ha definert formelen, klikk på OK. Dataene vil bli tilpasset basert på ligningen, og en kurve sammen med en liten firkant vil vises i grafen med verdiene m4 og m5.
   21. Deretter oppretter du en ny tabell for å legge til dataene hentet fra kurvetilpasningen i de respektive kolonnene. Definer fem forskjellige kolonner for følgende parametere: vinkelfrekvens, amplitude (referansesfære), starttid, amplitude (RBC-sfære) og ut av fasevinkel. Utfør samme prosedyre for alle andre frekvenser.
   22. Bruk følgende formler til å finne lagringskonstantene (K') og tapskonstantene (K"):
       
       
       hvor κ_OT er OTs elastiske konstant og β er Stokes dragkoeffisient. Ved å transponere ligningene til analyseprogramvaren, vil det se ut som følger:
       og
       
        , der β og κ_OT må erstattes av verdiene som finnes i systemet.
   23. Plott resultatene på en graf, ved hjelp av x-aksen for K " og y-aksen for K' (figur 4).

6. DM-eksperiment og analyse for å oppnå den generelle celleformfaktoren

1. Video-anskaffelse
   1. Flytt det piezoelektriske trinnet i xy-retningen ved hjelp av programvaren for å søke etter en isolert celle festet til dekselet. Fell og fest en polystyrenkule med kjent diameter til RBC-overflaten. Bruk det piezoelektriske trinnet, flytt den fangede perlen litt, også festet til RBC-overflaten, for å deformere cellen, og fest deretter perlen til dekselet.
      MERK: Det er også mulig å bruke samme celle fra OT-målingene.
   2. Endre z-akseposisjonen for å finne det fokuserte bildet, der fokusplanet er midt i den valgte cellen. Dette bildet viser den mindre kontrasten med grånivået i midten av cellen som tilsvarer grånivået utenfor cellen (bakgrunnen).
   3. Når posisjonen er fast, bruk kameraprogramvaren til å lage en film av hele cellen med omtrent 5000 bilder ved 8-bit og 256 piksler x 256 piksler, med en bildefrekvens på 25 fps. Flytt deretter z-akseposisjonen 2 μm ned eller opp for å få et defokusert bilde for den valgte cellen. Gjenta parametrene for å lage en film for denne situasjonen.
   4. Til slutt, uten å endre z-akseposisjonen, søk etter et område uten celler for å gjenta samme prosedyre og lage en film av bildebakgrunnen.
2. Anskaffelse av kontrastbilde
   1. Konverter hver av de tre filmene til tre gjennomsnittlige bilder. Bruk ImageJ, velg en av filmene, klikk på Image > Stacks > Z Project og velg alternativet Gjennomsnittlig intensitet . Gjenta denne prosedyren for de andre filmene for å få sine respektive bilder.
   2. Endre alle de oppnådde bildene fra 8-biter til flytpunkt 32-biter. Ved hjelp av ImageJ klikker du på Bilde > skriver > 32-biter. Klikk deretter på Analyser > Angi målinger og velg alternativet Gjennomsnittlig grå verdi . Til slutt klikker du igjen på Analyser > mål.
   3. Deretter klikker du på Prosess > bildekalkulator og deler det fokuserte bildet med bakgrunnsbildet. Dette resultatet multipliserer du gjennomsnittsverdien for det grå nivået for det fokuserte bildet. Få gjennomsnittsverdien ved å klikke på Prosess > Matematikk > Multipliser.
   4. For å få gjennomsnittsverdien, velg det fokuserte bildet, og klikk deretter på Analyser > mål. For det representative bildet er gjennomsnittsverdien for grånivået 69 199. Gjenta prosedyrene ovenfor for det ufokuserte bildet. I dette tilfellet er gjennomsnittsverdien for det grå nivået 69 231. Figur 5 viser fokuserte og ufokuserte bilder før og etter prosedyren.
   5. Bilder kan miste visuell kontrast under operasjoner. For bedre å visualisere bildene, klikk på Bilde > Juster > lysstyrke / kontrast og velg alternativet Auto .
   6. Neste, for å finne bildekontrasten, bruk følgende relasjon:
      , der N _Img er det grå nivået i cellen, er N₀ det grå nivået utenfor cellen, og er en konstant parameter som tilsvarer grånivået for null lysintensitet som avhenger av kameraet.
   7. For å finne verdien B, bruk en effektmåler for å måle lysintensiteten. For hver verdi av lysintensitet må en video spilles inn; Dermed kan forskjellige intensitetsverdier relateres til forskjellige nivåer av grått. Til slutt, oppnå en lineær passform og relatere B til null lysintensitet¹⁵.
   8. Finn verdien av N₀, klikk på Polygon Selection-ikonet og tegne et polygon som det i figur 6. Klikk deretter på Analyser-fanen og velg Mål for å finne gjennomsnittlig grått nivå for det valgte området. Hvert bilde er dannet av et sett med piksler, og hver piksel har et visst grått nivå. Settet med alle gråtoner på grunn av alle piksler som utgjør bildet, tilsvarer N_Img.
   9. Bruk kontrastligningen til å bestemme N _Img - N_o og utfør dette ved å velge Prosess > Math > Subtract. Del resultatet med N₀ - B. Til slutt finner du kontrasten for det fokuserte (C 0) og defokuserte bildet (C1).
3. Få høydeprofilen
   1. For å oppnå høydeprofilen, bruk den allerede beskrevne metoden¹³. Kort sagt, bruk Hartley-transformasjonen (FHT) for å oppnå RBC-tykkelsen. I ImageJ klikker du på Process > FFT > FFT Options, og velger deretter FHT.
   2. Trekk fra bildene C0 og C1 i ImageJ ved hjelp av Process > Math > Subtrahere for å få bildet for følgende fremgangsmåte, C = C0 - C1.
   3. For bilde C, klikk på Behandle > FFT > FFT-alternativer, og velg deretter FHT for å utføre Hartley-transformasjonen av bildet. Del deretter med romlig frekvens q² ved hjelp av det skreddersydde pluginet DivideQ2. Klikk på Plugin > DivideQ2.
      MERK: Filen DivideQ2.class må kopieres i plugins-mappen der ImageJ er installert. Programtillegget leveres som en .class-fil (tilleggsfil 1) som skal inkluderes i plugin-mappen til ImageJ.
   4. Deretter utfører du den inverse transformeringen FHT ved hjelp av Process > FFT > FFT for å få et bilde med et grått nivå proporsjonalt med høyden på cellen.
   5. Til slutt klikker du på Prosess > matematikk > multiplisere for å multiplisere det resulterende bildet ved å bruke følgende konstant:
      
      som er definert basert på egenskapene til bildene, prøven og det eksperimentelle oppsettet¹³. Her er n = 1,51 oljebrytningsindeksen, p = 0,0721 μm er forholdet mellom mikrometer og piksler på bildene, Δ n = 0,058 er forskjellen mellom RBC og de vandige brytningsindeksene, avstanden mellom fokuserings- og defokuseringsbildene (Z _f1 - Z _f2) = 2μm, og størrelsen på bildene, N 2 = 256 pxl².
   6. Bruk det resulterende bildet for å få høydeprofilen (figur 7). Det resulterende bildet brukes i ImageJ til å observere forskjellige høydeprofiler. Det avhenger av hvor i cellen den gule vertikale linjen er plassert, for eksempel i figur 7 oppnås en høydeprofil begrenset av den vertikale linjen, observer dette ved å trykke Ctrl + K.
4. Formfaktor
   1. Når du har funnet bildet som inneholder RBC-høydeprofilen, bruker du den 2 μm defokuserte kontrasten til å opprette et sett med to bilder i ImageJ. Klikk på Bilde > Stabler, og velg deretter alternativet Bilder som skal stables. Hvis du vil finne formfaktoren, bruker du en ImageJ-tilpasset makro til å analysere stakken. Den tilpassede makroen ImageJ er tilgjengelig for nedlasting som tilleggsfil 2.
      MERK: Programmet bruker defokuseringsbildet til å bestemme cellekantene. Den bestemmer deretter omkretsen, ved hjelp av bildet som inneholder høydeprofilen, for hver horisontal posisjon. I tillegg til kantene bestemmer den omkretsen, så vel som den inverse av omkretsen. Summen av de inverse perimeterverdiene, multiplisert med pikseltykkelsen, tilsvarer den inverse av formfaktoren.
   2. Sett inn piksel/mikrometer-relasjonen i programmet. Få denne verdien fra mikroskopets objektive kalibreringseksperiment. I eksemplet som brukes, er verdien 13,87 piksler/μm.
   3. Velg den vannrette startposisjonen for å plassere den gule linjen i det første bildet av stakken. Start linjen før begynnelsen av cellen og tegn den utover cellens vertikale grenser. I eksemplet har den gule linjen 153 piksler lengde og startposisjonen er mellom i = 70, y1 = 80 og i = 70 og y2 = 195. Flytt deretter den gule linjen horisontalt til sluttposisjonen er f = 245, y1 = 80 og f = 245 og y2 = 195.
   4. Til slutt, for å finne cellekantene, omkretsen og den omvendte av omkretsen, velg kategorien Makro og klikk på Kjør makro. Makroen vil levere en tabell med kantposisjonen, omkretsen og den inverse av omkretsen, og et bilde av den analyserte cellen. Kontroller om kantene på dette bildet ligner kantene på figur 7, ellers gjenta prosedyren.
   5. Bruk summen av den inverse av omkretsen for å finne formfaktoren⁸.

7. Myk glassaktig reologimodell og eksperimentell analyse

1. Organisere eksperimentelle data i en tabell
   1. Opprett en ny tabell i analyseprogrammet ved å klikke på Fil-fanen . Bestem 10 forskjellige kolonner (fra c0 til c9) for følgende parametere: vinkelfrekvenser brukt (rad / s): c0; K' (pN/μm) verdier oppnådd for hver vinkelfrekvens: c1; ErrK': c2; K" (pN / μm) verdier oppnådd for hver vinkelfrekvens: c3; ErrK": c4; G'(Pa) verdier oppnådd for hver vinkelfrekvens: c5; ErrG': c6; G" (Pa) verdier oppnådd for hver vinkelfrekvens: c7; ErrG": c8 og F_f med sin respektive feil: c9 (figur 8). Bruk følgende formel til å fylle ut følgende kolonner:
      C5 = (3 x C1) / (8 x 1,28 x 0,087)
      C6 = (3 / (8 x 0,087 x 1,28)) x SQRT (C2^2 + (C1 x 0,01 / 1,28)^2 + (C1 x 0,008 / 0,087) ^ 2)
      C7 = (3 x C3) / (8 x 1,28 x 0,087)
      C8 = (3 / (8 x 0,087 x C4)) x SQRT (C4^2 + (C3 x 0,01 / 1,28)^2 + (C3 x 0,008 / 0,087)^2)
2. Plottekurve G' (ω) versus G" (ω)
   1. For å generere kurven G' (ω) versus G" (ω) i analyseprogramvaren, bruk dataene fra forrige tabell. Klikk på Galleri > lineær og velg Scatter Plot-formatet.
   2. Et nytt vindu åpnes. Velg G " -kolonnen som x-aksen og G' -kolonnen som y-aksen. Til slutt klikker du på Plot-knappen for å få grafen.
   3. For å legge til feilfeltene i plottet, klikk på Plot-vinduet, og klikk deretter på Plot > Error Bars. Et nytt vindu åpnes. Merk først alternativet Y Err . Et annet vindu, kalt Innstillinger for feillinje, åpnes.
   4. Klikk på % av verdien, velg Datakolonne, og klikk deretter på kolonnen ErrG'. Til slutt klikker du på OK > Plot, feilfeltene for y-verdiene vises. Gjenta samme prosedyre for x-akseverdier ved nå å velge X Err-kvadratet og riktig kolonne for ErrG". Det endelige plottet vil være likt det som er vist i figur 9.
3. Montering av parametrene til den myke glassaktige reologimodellen
   MERK: Dataanalysen er delt inn i to deler: 1) kurve som passer til G' (ω) versus G" (ω) plottet for å oppnå parametrene Γ og G_m; 2) kurvetilpasning G' (ω) og G" (ω) som en funksjon av frekvensen ω, for å oppnå potensloveksponenten α.
   1. Kurve som passer G' (ω) versus G" (ω) plottet for å oppnå parametrene Γ og G_m.
      1. Klikk på fanen Kurvetilpasning , velg Tilpass1. Et nytt vindu åpnes. Velg firkanten og klikk på Definer-knappen . Et vindu som heter generell kurvetilpasningsdefinisjon vises. Skriv inn følgende formel:
         m1 + m0/m2
         hvor m1 = 61.576; m2 = 1, med tillatt feil på 1 x ^10-5. Her representerer m0 G ", m1 representerer G_m og m2 representerer Γ.
         MERK: For m1 og m2 er det nødvendig å estimere deres respektive verdier under kurvetilpasningsdefinisjonen. Estimatene ovenfor var basert på eksempeleksperimentet vist. I forsøkene estimerer du tallene i henhold til verdiene observert i plottet.
      2. Klikk på OK-knappen i begge vinduene, og beslaget vises, som vist i figur 10 - en svart kurve. Kontroller de riktige verdiene for m1 og m2, oppført i kurvetilpasningstabellen som ble vist med plottet.
   2. Kurvetilpasning G ' og G" som en funksjon av vinkelfrekvensen ω
      1. Deretter lager du to andre plott, nemlig G' som en funksjon av ω og G' som en funksjon av ω. Plasser feilfeltene bare på y-aksen, som tidligere vist.
      2. Gjenta fremgangsmåten for kurvetilpasning, men velg nå G i alternativet Kurvetilpasning, og skriv deretter følgende ligning i Generell tilpassing > kurvedefinisjon:
         
         I dette tilfellet ble m1 estimert til å være verdien av G" (ω) = 23.683 Pa, når ω = 6.3 rad/s; m2 ble estimert til 0,5 (husk at m2 er eksponenten α og varierer mellom 0 og 1). Sett inn verdien for Γ = 2,0293, i henhold til resultatet av m2 i figur 10.
      3. Merk alternativet Vektdata. Etter alle disse prosedyrene, klikk på OK, og en kurvetilpasning lik den i figur 11 - en blå kurve vises. Verdiene for α, α = 0,63 ± 0,02 og G 0, G 0 = (3,7 ± _0,3)Pa vises. Bruk disse verdiene til å tilpasse den neste kurven, G' (ω).
      4. Klikk på neste kurve, gjenta kurvetilpasningsprosedyren, men nå i General Fit Curve Definition, skriv følgende ligning:
         
         I dette tilfellet er m3 bare en estimert verdi på α for å bekrefte den tidligere oppnådde verdien. Bruk verdiene for G ₀ = 3,703 og G' (ω) = 23,683 Pa når ω = 6,3 rad/s.
      5. Igjen, legg til 1 x ^10-5 som tillatt feil og merk alternativet Vektdata. Etter alle disse prosedyrene, klikk på OK, og en kurvetilpasning lik den i figur 11 - en grønn kurve vises.

Representative Results

Figur 1 viser skjemaene til OT-systemet som ble brukt til reologimålingene. Figur 2 viser skjemaene til mikroreologieksperimentet med begge sfærer, og en representativ RBC er også vist. Figur 3 viser en typisk kurve for amplitudene til begge sfærene som en funksjon av tiden når sinusformede bevegelser produseres av det piezoelektriske stadiet. Mens referansesfæren (figur 3 - rød kurve) svinger etter scenebevegelsen, svinger RBC-sfæren (figur 3 - en blå kurve) med en annen amplitude og fase. Ved å måle disse parametrene er det mulig å bestemme den komplekse elastiske konstanten K * (ω) for forskjellige RBC i prøven. Figur 4 viser et typisk plott for lagringselastisiteten K' (ω) som funksjon av tapselastisiteten K" (ω). Den lineære avhengigheten som observeres viser at RBC-overflaten kan betraktes som et mykt glassaktig materiale. Deretter, for å oppnå den totale celleformfaktoren, F_f, er en DM-prosedyre nødvendig, og figur 5, figur 6 og figur 7 inkluderer noen av de nødvendige trinnene for formålet. Deretter, for å konvertere krefter og deformasjoner til spenninger og tøyninger, er det nødvendig å gjøre K * (ω) til G * (ω).

Den komplekse RBC-elastiske konstanten er definert som K* (ω) = K' (ω) + iK" (ω). Videre er K* (ω) relatert til RBC-kompleksskjærmodulen G* (ω) = G' (ω) + iG" (ω). G' (ω) og G" (ω) er henholdsvis RBC-skjærlagring og tapsmoduli. Forholdet mellom K* (ω) og G* (ω) er gitt ved:

hvor F_f er en formfaktor som avhenger av RBC-geometrien, som tidligere nevnt, og ζ er RBC-membrantykkelsen, tidligere bestemt som ζ = (0,087 ± 0,009) μm ^8,15.

Videre er lagringsaggregatet G' (ω) og G" (ω) tapsskjærmoduli henholdsvis relatert til lagringskonstantene K' (ω) og tap K" (ω) gjennom ligningene ^8,9

og

For å finne standardfeilene for G' (ω) og G" (ω), bruker henholdsvis Err G' og Err G" forplantningen av usikkerhetsligninger med resultatene av K' (ω) og K" (ω), i henhold til følgende ligninger ^8,9:

.

I følge teorien om myk glassaktig reologi oppfører RBC-ene seg som viskoelastiske materialer som emulsjoner, pastaer og oppslemminger ^8,9, og deres lagrings- og tapsmoduler adlyder følgende ligninger:

Således, hvor G _m er cellemembranskjærmodulen, G 0 er den lavfrekvente lagringsmodulen, Γ er forholdet , α er kraftloveksponenten for myk glassaktig reologimodell, og ω₀ = 1 rad / s ^8,9.  

Verdiene funnet for F_f og også RBC-overflatetykkelsen ζ ble brukt (estimert til 87 ± 8 nm 8,9,15). Resultatene er vist i figur 8, figur 9 og figur 10. Igjen er den lineære avhengigheten mellom G 'og G" i tråd med hypotesen om at RBC-overflater kan modelleres som myke glassaktige materialer. Også fra den lineære passformen til denne tomten kan verdien av G _m oppnås, og ved å introdusere denne verdien til den myke glassaktige reologikurvetilpasningen til G "bestemmes verdiene av G₀ og α (figur 11 - en blå kurve). Videre, etter å ha brukt det oppnådde resultatet for G ₀ og lagt det til den myke glassaktige reologikurvetilpasningen til G', blir den samme verdien for eksponenten avledet i feilfelt (figur 11 - en grønn kurve).

Figur 1 Skjematisk fremstilling av OT-mikroskopet. Hele systemet er bygget på et antivibrasjonsbord. Laseren er justert ved hjelp av minst to forskjellige dikroiske speil (hvit) og rettet mot bakinngangen til mikroskopets objektivlinse ved hjelp av et annet dikroisk speil (lyseblått). En piezoelektrisk scene og et digitalt vitenskapelig kamera koblet til en datamaskin er også nødvendig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Skjema for mikroreologieksperimentet. Referansesfæren (mørkegrå) er festet til dekselet og RBC-sfæren (blå) er festet til erytrocytoverflaten (rød) og fanget av OT (indikert med ferskentrekanter når laseren er på). ρ er likevektsposisjonen til RBC-sfæren i fellen; ξ er den sinusformede bevegelsen av prøven og x er celledeformasjonen. Det skjematiske bildet ble opprettet i Biorender. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Plott som illustrerer amplitudene (μm) til begge sfærer over tid(er) når sinusformede bevegelser produseres av det piezoelektriske stadiet. Referansesfæren (rød kurve) svinger etter scenebevegelsen, mens RBC-sfæren (blå kurve) svinger med en annen amplitude og fase. Den grønne pilen til høyre angir datamerkingsverktøyet, mens den gule pilen angir zoommerkingsverktøyet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: RBC-mikroreologiresultater. Lagre elastisk konstant som funksjon av tapselastisk konstant for ulike RBC i prøven (n = 10 forskjellige celler fra tre forskjellige prøver). Datapunkter representerer middelverdiene for både K ' (y-aksen) og K" (x-aksen) med sine respektive feilstreker (standard gjennomsnittsfeil), oppnådd for hver vinkelfrekvens som brukes i det eksperimentelle oppsettet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: DM brukt på en RBC . (A) Defokusert bilde, størrelse = 2 μm. (B) Bilde i fokus. (C) Bakgrunnsbilde. Ved å dele hvert bilde (A) og (B) med bakgrunnsbildet (C), og deretter multiplisere med den gjennomsnittlige gråverdien til hvert bilde, er det mulig å få bilder (D) og (E). Skala bar: 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Bakgrunnsgrått nivå N₀. Etter å ha åpnet det representative bildet i ImageJ (A), velg et område (gul geometrisk figur rundt RBC-cellen) som brukes til å oppnå middelverdien av bakgrunnsgrånivået og resultatet (B). Hvis du vil utføre den gule markeringen i A, bruker du mangekantmarkeringsverktøyet i bilde J (angitt med en grønn pil). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Høydeprofil for deformert RBC. Høydeprofil (venstre) representert langs den loddrette gule linjen i bildet (høyre). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Representativt skjermbilde av en typisk resultattabell i analyseprogrammet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: RBC viskoelastiske parametere. Lagre skjærmodul som en funksjon av tapsskjærmodulen for forskjellige RBC i prøven (n = 10 forskjellige celler fra tre forskjellige prøver). Datapunkter representerer middelverdiene for begge, G ' (y-aksen) og G " (x-aksen), med deres respektive feilfelt (standard gjennomsnittsfeil), oppnådd for hver vinkelfrekvens som brukes i forsøkene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 10: Kurvetilpasning av G ' (Pa) som funksjon av G" (Pa). Den lineære svarte linjen er kurven som passer for datapunktene. N = 10 forskjellige celler fra tre forskjellige prøver. Feilfelt representerer standardfeilen til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 11: Justering av den myke glassaktige reologimodellen til resultatene. Den komplekse skjærmodulen (G *) som en funksjon av vinkelfrekvensen ω for forskjellige RBC i prøven. De grønne sirklene i plottet representerer middelverdiene til G', mens de blå sirklene representerer middelverdiene til G", plottet med sine respektive feilfelt. De kontinuerlige grønne og blå linjene representerer kurvebeslagene for den myke glassaktige reologimodellen. Parametrene m 1, m 2 og m3 er angitt i plottet. Mens m 1 er G₀, m 2 og m3 er eksponenten, α. N = 10 forskjellige celler fra tre forskjellige prøver. Feilfelt representerer standardfeilen til gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: ImageJ plugin DivideQ2.class. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: ImageJ tilpasset makro for å hente formfaktoren. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I denne protokollen presenteres en integrert metode basert på optisk pinsett og defokuseringsmikroskopi for kvantitativt å kartlegge de viskoelastiske egenskapene til RBC. Resultater for lagrings- og tapsskjærmoduli, sammen med skaleringseksponenten som karakteriserer den myke glassaktige reologien til RBC, bestemmes. Anvendelse av denne protokollen for forskjellige eksperimentelle forhold, som i fysiologisk situasjon⁸ eller langs hvert stadium av P. falciparum intra-erytrocytisk syklus⁹ er allerede utført.

Referanser i litteraturen peker på avvik i RBC-reologi, delvis tilskrevet endringer i cellemorfologi som ikke er riktig tatt hensyn til under måling ^6,7. Ved bruk av dynamisk lysspredning ble verdier for RBC-lagrings- og tapsmoduli rapportert fra 0,01-1 Pa, i frekvensområdet 1-100 Hz⁶. I en annen studie, ved bruk av optisk magnetisk vridningscytometri, ble den tilsynelatende komplekse elastiske modulen bestemt⁷, men avvek fra de dynamiske lysspredningsverdiene; Dermed ble en multiplikativ faktor på 84 brukt til komparative formål. Etter prosedyrene beskrevet i denne protokollen ble disse forskjellene klargjort⁸ ved å karakterisere RBC-formfaktoren ved hjelp av en ikke-invasiv defokuseringsmikroskopiteknikk^11,12,13. Den komplekse skjærmodulen, som karakteriserer celleoverflater, kan bare oppnås hvis geometrien betraktes som^16,17 og dette ikke alltid ble utført riktig.

Den integrerte metodikken som presenteres i denne protokollen gjør det mulig å utføre begge metodene (OT-måling og DM-måling) for samme enkeltcelle, den ene etter den andre. Det gjør det også mulig å utføre OT-målinger for forskjellige celler i en populasjon, og deretter utføre DM-målinger for andre celler i samme cellepopulasjon. Det siste alternativet vil trolig introdusere mer variabilitet til begge resultatene, men feilene kan forplantes tilsvarende, på en slik måte at resultatene vil korrelere den totale RBC-morfologien med de samlede RBC-viskoelastiske egenskapene i en gitt populasjon av celler som tilsvarer en bestemt eksperimentell tilstand.

Hovedbegrensningen for å utføre denne protokollen er den iboende vanskeligheten med å utføre selve metoden, siden det er en integrering av optisk pinsett og defokuseringsmikroskopi; Dermed kan tilgjengeligheten av instrumenter for å utføre alle trinnene som er beskrevet, være en utfordring. Men hvis man har tilgang til et OT-anlegg, er det mye mer gjennomførbart å etter hvert tilpasse anlegget til å utføre eksperimentene. Det er her den nåværende protokollen passer inn, og beskriver ikke bare hvert trinn for å utføre målingene og analysen, men hjelper også folk med å identifisere og ta i bruk disse OT-systemene i stedet for å lage et oppsett fra bunnen av.

Også RBC-vedlegg til dekkslips blir en begrensende faktor siden de ikke er adherente celler, og slike trinn kan introdusere vanskeligheter med målinger, da noen RBC-er kan løsnes. Det er derfor viktig å velge en godt overholdt RBC. En måte å sjekke om valget var vellykket, kan skje på tidspunktet for utarbeidelse av prøven for målingen. Etter å ha plassert den OT-fangede RBC-sfæren til celleoverflaten, flytt prøven litt for å sikre at cellen er ordentlig festet og ikke har endret posisjon etter den OT-fangede perlen. Hvis ja, se etter en annen celle i prøven. Fremtidige forbedringer som bruk av dual-beam OT for samtidig å fange RBC og utføre reologimålingene samtidig, kan også gjøres.

Bortsett fra det, muliggjør muligheten for å trekke ut enkeltcellebasert kvantitativ viskoelastisk informasjon fra RBC en rekke applikasjoner som bare begynner å bli utforsket ^8,9. Dermed kan den presenterte metoden utvides til karakterisering av RBC mekanisk oppførsel under andre fysiopatologiske forhold som jernmangelanemi og diabetes eller i genetiske blodsykdommer som seglcellesykdom og talassemi, for eksempel. Et slikt integrert verktøy kan gi grunnlag for utvikling av nye diagnostiske metoder som er i stand til å korrelere endringene i RBC-viskoelastiske egenskaper med modifikasjoner i blodstrømmen hos individer med forskjellige patologier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm culture dishes	Corning	430165
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Coverslips	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01
Glass-bottom dishes	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Immersion oil	Nikon	MXA22165
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
Microscope camera	Hamamatsu	C11440-10C
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
Objective lens	Nikon	PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2
Optical table	Thorlabs	T1020CK
OT laser	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
Polystyrene microspheres	Polysciences	17134-15
rubber ring	Forever Seals	NBR O-Ring
Silicone grease	Dow Corning	Z273554
Stage positioning	PI	P-545.3R8S
Pipette	Gilson	P1000