Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mønstergenerering til mikromønstertrækkraftmikroskopi

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/63628
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

Vi beskriver forbedringer af en standardmetode til måling af cellulære trækkrafter baseret på mikrokontaktudskrivning med et enkelt subtraktivt mønstertrin af dot arrays af ekstracellulære matrixproteiner på bløde hydrogeler. Denne metode giver mulighed for enklere og mere konsekvent fremstilling af ømønstre, der er afgørende for at kontrollere celleklyngeformen.

Abstract

Mikromønster trækkraftmikroskopi tillader kontrol af formen af enkeltceller og celleklynger. Desuden tillader evnen til at mønstre på mikrometerlængdeskalaen brugen af disse mønstrede kontaktzoner til måling af trækkraft, da hver mikromønstret prik muliggør dannelsen af en enkelt fokal vedhæftning, som derefter deformerer den bløde, underliggende hydrogel. Denne tilgang er blevet anvendt til en bred vifte af celletyper, herunder endotelceller, glatte muskelceller, fibroblaster, blodplader og epitelceller.

Denne gennemgang beskriver udviklingen af teknikker, der tillader udskrivning af ekstracellulære matrixproteiner på polyacrylamidhydrogeler i et regelmæssigt udvalg af prikker af forudspecificeret størrelse og afstand. Da mikrometerskalamønstre er vanskelige at udskrive direkte på bløde underlag, genereres mønstre først på stive glasdæksler, der derefter bruges til at overføre mønsteret til hydrogelen under gelering. For det første beskrives den originale mikrokontaktudskrivningsmetode til at generere arrays af små prikker på omslagssedlen. Et andet trin, der fjerner det meste af mønsteret for at forlade øer med små prikker, er nødvendigt for at kontrollere formerne af celler og celleklynger på sådanne arrays af mønstrede prikker.

Dernæst beskrives en udvikling af denne tilgang, der muliggør generering af øer af prikker ved hjælp af et enkelt subtraktivt mønstertrin. Denne tilgang er stærkt forenklet for brugeren, men har ulempen ved en nedsat levetid for masterformen, der er nødvendig for at fremstille mønstrene. Endelig beskrives de beregningsmetoder, der er udviklet til analyse af billeder af forskudte prikker og efterfølgende cellegenererede trækkraftfelter, og opdaterede versioner af disse analysepakker leveres.

Introduction

De fleste cellefænotyper udøver trækkraft på deres miljø. Disse trækkrafter genereres af en celles kontraktile cytoskelet, som er et netværk af actin og myosin og andre trådformede biopolymerer og tværbindingsproteiner 1,2,3,4. Kræfter, der genereres i cellen, kan overføres til det ekstracellulære miljø eller tilstødende celler, primært via transmembranproteiner såsom integriner og cadheriner, henholdsvis 5,6. Hvordan en celle spredes eller trækker sig sammen - og størrelsen af de trækkrafter, der er forbundet med disse bevægelser - er resultatet af en intim samtale med sit miljø, som i vid udstrækning afhænger af typen og mængden af protein, der er til stede i den ekstracellulære matrix (ECM)7,8 og stivheden af ECM. Faktisk er trækkraftmikroskopi blevet et uvurderligt værktøj til at forstå celleresponsivitet over for lokale stimuli såsom substratstivhed, pålagt mekaniske belastninger og stammer eller kontakt med andre celler. Disse oplysninger er direkte relevante for forståelsen af sygdomme som kræft og astma 9,10,11,12.

Et system, der kan bruges til at måle kraftinduceret deformation af et substrat med kendte materialeegenskaber, er nødvendigt for at beregne trækkraft. Disse ændringer skal spores over tid, hvilket kræver både billedbehandlings- og billedbehandlingsteknikker. En af de første metoder, der blev brugt til at bestemme cellulære trækkrafter, var observation og analyse af sammentrækningen af kollagenhydrogeler podet med celler, selvom denne metode kun var semikvantitativ13. En anden, mere raffineret metode var at måle de trækkrafter, der udøves af enkeltceller, ved at bestemme de kræfter, der er resultatet af deformationen af et tyndt ark silikone14. Senere blev der udviklet mere kvantitative måleteknikker, og disse metoder tillod også anvendelse af bløde hydrogeler såsom polyacrylamid (PAA)12,15,16. Ved anvendelse af disse bløde materialer kunne trækkraften bestemmes ud fra den kraftinducerede forskydning af tilfældigt forskudte perler indlejret i hydrogelen og de mekaniske egenskaber af gelen16,17. Et andet fremskridt kom med udviklingen af mikropostarrays lavet af blød polydimethylsiloxan (PDMS), så deres afbøjning kunne måles og konverteres til kraft ved hjælp af stråleteorien18.

Endelig blev der udviklet metoder til mikromønster af bløde hydrogeler, da disse tilgange tillader kontrol af kontaktområderne for celleadhæsion. Ved at måle deformationen af mikromønsteret inden for en celles kontaktområde kan trækkraften let beregnes, fordi der ikke kræves et kraftfrit referencebillede19. Denne metode er blevet bredt vedtaget, da den giver mulighed for indirekte mønster af et regelmæssigt udvalg af mikron-størrelse, diskrete fluorescerende proteinadhæsionspunkter på PAA-geler til måling af cellulære trækkraftkræfter20. For at beregne disse kræfter er der udviklet en billedbehandlingsalgoritme, der kan spore bevægelserne af hver mikromønstret prikke uden at kræve brugerinput21.

Mens denne metode er enkel til at skabe hele gitre af prikker mønstre, er det mere kompliceret, når mønstre af isolerede patches (eller øer) af prikker ønskes. Mikromønstrede øer er nyttige, når der er behov for kontrol af form og til en vis grad af størrelse af klynger af celler. For at skabe disse øer kræver den førnævnte metode til mikrokontaktudskrivning to forskellige trin: i) brug af et PDMS-stempel til at skabe et high-fidelity-mønster af prikker på et omslagsseddel og derefter ii) brug af et andet andet PDMS-stempel til at fjerne de fleste af disse prikker og efterlade isolerede øer af prikker21. Vanskeligheden ved at skabe øer med denne oprindelige metode forværres af det faktum, at det er udfordrende i sig selv at lave konsistente gittermønstre i det første trin i processen. Mikroprintstempler består af en række cirkulære mikrostolper, hvis diameter svarer til den ønskede prpoststørrelse. Disse frimærker belægges derefter med et jævnt lag protein og stemples derefter med en præcis mængde tryk på behandlede dæksedler for at skabe det ønskede mønster. På den ene side kan påføring af for meget tryk på frimærket resultere i ujævn proteinoverførsel og dårlig mønstertroskab på grund af søjlespændning eller sagging mellem søjler, hvilket fører til kontakt med glasset. På den anden side resulterer anvendelse af for lidt tryk i lidt eller ingen proteinoverførsel og dårlig mønstertroskab. Af disse grunde ønskes en overførselsproces, der kan bruges til konsekvent at skabe mikromønstre af høj kvalitet af isolerede øer af prikker i kun et trin.

Heri beskrives en metode til indirekte mikromønster af øer af fluorescerende proteinadhæsionspunkter i mikronstørrelse på en PAA-gel, der er mere konsistent og alsidig end tidligere udviklede metoder. Mens ældre indirekte mikromønstermetoder er afhængige af overførsel af proteinmønstre fra et PDMS-stempel til et mellemliggende substrat, bruger den metode, der introduceres her, PDMS-stempler i stedet som et kar til proteinfjernelse, ikke tilsætning. Dette gøres ved først fundamentalt at ændre strukturen af de anvendte PDMS-frimærker. I stedet for at lave frimærker, der er sammensat af et mønster af jævnt fordelte cirkulære søjler, består frimærker af et mønster af jævnt fordelte cirkulære huller i denne metode.

Med denne nye struktur kan overfladen på disse PDMS-frimærker derefter behandles med glutaraldehyd som beskrevet tidligere 20,29,30, hvilket gør frimærket i stand til at binde kovalent med protein. Når de anvendes på et glasdæksler, der er jævnt belagt med fluorescerende protein, bruges disse glutaraldehydbehandlede PDMS-stempler til at fjerne det meste af proteinet på overfladen af dæksedlen og efterlader kun det ønskede mønster af prikker, der er forudbestemt af placeringen af mikronstore huller på frimærket. Denne ændring øger succesraten for at generere mønstre, der består af et næsten kontinuerligt gitter af prikker og for at skabe isolerede øer af prikker gennem kun et trin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Oprettelse af silikonemestre

BEMÆRK: Det meste af processen med design, oprettelse og fejlfinding af siliciummastere til gentagen støbning af PDMS-frimærker er tidligere blevet dækket21, så kun nøgleforskelle i denne nye tilgang vil blive beskrevet her.

  1. Opret designet til fotomasken ved hjælp af AutoCAD eller lignende designsoftware. Belæg den ene side af fotomasken, et tyndt stykke glas, med et tyndt lag krom for at kontrollere UV-lysspredning. Design fotomasken, så skinnende UV-lys gennem den på den valgte photoresist vil skabe en silikonemester med det omvendte af de ønskede funktioner på de endelige PDMS-frimærker. Se figur 1 for udformningen af denne maske.
    BEMÆRK: Om de ønskede funktioner eller området uden for dem skal gøres gennemsigtigt på fotomasken afhænger af den valgte photoresist. Photoresist, der anvendes her, er SU-8 2005 (FORSIGTIG: brandfarlig, hud- og øjenirriterende; hold dig væk fra varme / flammer / gnister og brug beskyttelseshandsker og briller ved håndtering), en negativ fotoresist, der er i stand til at lave 5 μm høje funktioner med næsten lodrette sidevægge.
    1. Helbred den negative fotoresist ved at udsætte den for UV-lys og fjerne den uhærdede SU-8 med et kemisk opløsningsmiddel. Design derfor maskens primære egenskaber til at være gennemsigtige, mens det omgivende område af masken er uigennemsigtigt.
    2. Til denne nye fjernelsesmetode skal du designe fotomasken, så den består af to firkanter på 1,5 x 1,5 cm (figur 1A), en fuld af et jævnt gitter på 2 μm cirkler med en afstand på 6 μm fra centrum til centrum, og en anden består af mange firkantede øer, som er mindre, isolerede versioner af det samme gittermønster (figur 1B). Lav øer i følgende størrelser: 6 x 6 prikker, 12 x 12 prikker, 25 x 25 prikker og 42 x 42 prikker.
      BEMÆRK: Diameteren af adhæsionspunkterne (2 μm) blev valgt ud fra tidligere undersøgelser, der målte cellulæretrækkrafter 22,23. Masken, der bruges her, er 101,6 x 101,6 mm og er belagt på den ene side med et 0,06 μm tykt lag krom, hvilket anbefales på grund af masterens små træk. Fotomasken, der blev brugt her, blev bestilt hos et eksternt fotomasketrykkeri.
  2. Inden for et renrum skal du belægge den valgte siliciumskive jævnt med photoresist. Som et valgfrit trin skal du overfladebehandle waferen i en plasmaasykker, inden den belægges med modstand.
    BEMÆRK: Her anvendes wafere med en diameter på 100 mm. Behandling i plasmaaske gør waferen mere modtagelig for binding til SU-8 og hjælper med at forhindre delaminering af SU-8 fra waferen.
  3. Udfør følgende trin i henhold til photoresist-producentens anvisninger:
    1. Drej den belagte wafer for at skabe den ønskede funktionstykkelse, varierende centrifugeringstiden baseret på den ønskede tykkelse og typen af modstand. For en 5 μm tyk SU-8 2005 skal du opdele det anbefalede spin-program i følgende tre trin:
      1. Belæg waferen med photoresist ved at dreje ved 500 RPM i 10 s med en rampe på 100 RPM / s.
      2. Reducer modstandstykkelsen til ca. 5 μm ved at dreje waferen ved 3.000 omdr./min. med en rampe på 300 omdr./min. i 30 s.
      3. Sænkede langsomt waferen efter centrifugering ved at reducere hastigheden til 0 RMP med en rampe på 500 rpm / s i 1 s.
    2. Forbered modstanden til UV-eksponering ved at bage den kort på en 95 °C varmplade. Rediger den tid, der bruges på kogepladen i henhold til den ønskede tykkelse af modstanden; bagetiden er 2 min for en 5 μm tyk SU-8 2005.
    3. Udsæt modstanden mod UV-lys for fuldt ud at helbrede de ønskede funktioner. Vær forsigtig med overeksponering, da dette kan gøre SU-8 sprød og påvirke den samlede kvalitet af den resulterende mester.
      1. Brug eksponeringsenergi på 105 mJ/cm2 til en 5 μm tyk SU-8 2005. Baseret på effekten af den tilgængelige UV-lampe beregnes eksponeringstiden ved at dividere eksponeringsenergien med lampens effekt i mW.
        BEMÆRK: Da lampen, der bruges her, har en effekt på 8 mW, skal eksponeringstiden være 13,1 s.
    4. For at indstille SU-8-funktionerne efter udvikling skal du bage igen på en 95 ° C kogeplade, denne gang i 3 minutter. Vent på, at de ønskede funktioner i masteren vises inden for 1 minut under dette bagetrin, hvis modstanden blev udsat korrekt.
    5. Fjern uhærdet SU-8 fra siliciumskiven ved hjælp af SU-8-udvikleren. Vær grundig, når du fjerner den uhærdede SU-8, da den kan sidde fast mellem mikronstørrelse og mellemrumsfunktioner på waferen.
      FORSIGTIG: SU-8-udvikler er en brandfarlig hud- og øjenirriterende; hold det væk fra varme/flammer/gnister og brug beskyttelseshandsker og briller, når du håndterer det.
    6. Efter udvikling skylles med acetone for at fjerne overskydende udvikler på waferen og tørres helt med en nitrogensprøjtepistol.
      FORSIGTIG: Acetone er en brandfarlig hud- og øjenirriterende; hold det væk fra flammer/gnister og brug beskyttelseshandsker og briller, når du håndterer det.
    7. Eventuelt til SU-8 2005 bages på en 200 °C kogeplade i 10 min.
      BEMÆRK: Denne hårde bagning tilføjer mekanisk styrke til photoresist.
  4. Efter at have fået lov til at køle af, skal du lægge waferen i en waferbærerbakke og derefter støbe den i PDMS. Først skal du gennemføre en silaniseringsbehandling på waferen for at gøre SU-8-funktionerne i siliciummasteren mindre tilbøjelige til at binde sig til PDMS og dermed mindre tilbøjelige til at blive fjernet fra waferens overflade.
    1. For at afslutte silaniseringsoverfladebehandlingen skal du placere masteren og et lille glasdæksel inde i en tørremaskine, der kun er beregnet til brug med silaner. Anbring 1-2 små dråber Trichlor(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan på dæksedlen, luk tørremaskinen, og kør den under vakuum i 30 minutter ved et tryk på 4.500 Pa24.
      FORSIGTIG: Trichlor (1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan er en brandfarlig hud- og øjenirriterende; hold den væk fra varme/flammer/gnister, brug beskyttelseshandsker og briller ved håndtering, og arbejd under en stinkhætte.
    2. Sluk for vakuummet, og lad masteren og dæksedlen stå i tørressikkatoren i yderligere 30 minutter.
      BEMÆRK: Masteren er nu klar til casting i PDMS.

2. Subtraktiv mikrokontaktudskrivning

  1. Bland PDMS i det korrekte forhold mellem hærdningsmiddel og base baseret på producentens anvisninger. Lad det sidde ved stuetemperatur og tryk i 15 minutter; derefter afgasses under vakuum i 15 minutter.
  2. Hæld PDMS i masteren og læg den i en inkubator, der er indstillet til 37 ° C natten over for at hærde.
  3. Fjern masteren fra inkubatoren og lad den afkøle til stuetemperatur.
  4. Mens masteren køler ned, soniker 25 mm dækker i ethanol i 10 minutter. Brug lige så mange omslag som antallet af frimærker, der forberedes.
  5. Skyl grundigt 25 mm dæksler med deioniseret (DI) vand og tør med en filtreret luftpistol.
  6. Plasma behandler dækslipsene i 1 minut ved hjælp af en plasmarenser under vakuum på høj (radiofrekvenseffekt på 30 W). Sørg for at frigøre vakuumet langsomt efter behandlingen for at forhindre, at dækslipsene bevæger sig inde i kammeret.
    BEMÆRK: Plasmabehandling af glasoverfladen tjener to formål: det renser overfladen af glasset for at fjerne forurenende stoffer og genererer iltbaserede polære grupper på overfladen af glasset for at gøre dethydrofobt 25. Denne hydrofobicitet gør overfladen af glasset mere modtagelig for proteinbinding.
  7. I et rum uden direkte sollys/overheadbelysning skal du belægge hvert dækslip med 100 μL fluorescerende mærket proteinopløsning i en koncentration på mindst 100 μg/ml, dække for ekstra beskyttelse mod lys og lade det sidde i 20 minutter.
    BEMÆRK: Her anvendes fibronectin isoleret fra humant plasma og farvet med AlexaFluor 488.
    1. For at farve fibronectin kombineres umærket fibronectin med kendt koncentration og volumen med den passende mængde fluorescerende farvestof i et 1,5 ml rør. Dæk røret med aluminiumsfolie for at beskytte farvestoffet mod lys og inkuber det ved stuetemperatur i 1 time, bland forsigtigt hvert 10. minut ved at dreje røret på hovedet 5-10 gange.
      BEMÆRK: Mængden af farvestof, der kræves, varierer afhængigt af det anvendte farvestof og massen af protein, der anvendes. Se Supplerende fil 1 for den lommeregner, der bruges til at bestemme den passende mængde farvestof til fibronectin mærket med Alexa 488. I henhold til producentens anvisninger kan overskydende farvestof filtreres ud ved hjælp af afsaltningskolonner (se materialetabellen).
  8. Skyl hvert dækslip grundigt med DI-vand, og fjern overskydende vand fra overfladen ved forsigtigt at trykke på siderne af hvert dækslip på et papirhåndklæde eller lignende absorberende materiale. Lad dæksedlerne stå afdækket i mørke i mindst 30 minutter, så de tørrer helt.
  9. Mens det proteinbelagte dæksler tørrer, skal du fjerne PDMS-stemplet fra masteren ved at skære det med en skalpel eller et andet skarpt blad.
    BEMÆRK: Det er bedst ikke at forsøge at skære igennem PDMS ved første forsøg, da anvendelse af så meget tryk vil knække siliciumskiven og beskadige masteren.
  10. Plasma behandler PDMS-stemplerne i 2 minutter under vakuum på høj (radiofrekvenseffekt på 30 W).
  11. I en stinkhætte anbringes frimærkerne i en beholder med låg og belægges hvert stempel med et meget tyndt lag (<100 μL) på 10% (3-aminopropyl)trimethoxysilen (3-APTMS) fortyndet i 100% ethanol.
    FORSIGTIG: 3-APTMS er en brandfarlig hud- og øjenirriterende; hold det væk fra flammer/gnister, brug beskyttelseshandsker og briller ved håndtering, og arbejd under en stinkhætte. Overdreven belægning af 3-APTMS-opløsning vil medføre, at der dannes en orange film senere i denne proces. Denne 3-APTMS overfladebehandling inkorporerer aminfunktionaliteten i overfladen af PDMS-stemplet, hvilket vil muliggøre yderligere afledning af frimærkets overflade senere den26.
  12. Dæk beholderen med frimærkerne og lad dem sidde ved stuetemperatur i 5 minutter.
  13. Brug DI-vand til at skylle hvert stempel grundigt på begge sider.
  14. Læg frimærkerne i en ren beholder og belæg dem rundhåndet med 2,5% glutaraldehyd i DI-vand.
    FORSIGTIG: Glutaraldehyd er giftigt; Brug beskyttelseshandsker og briller, når du håndterer og arbejder under en stinkhætte). Denne glutaraldehydbehandling sammen med den tidligere 3-APTMS-behandling giver aldehydfunktioner på overfladen af PDMS-frimærkerne, som kan reagere med amingrupperne i proteinerne for at skabe en sekundær aminforbindelse, hvilket er kritisk for proteinfjernelsesprocessen27.
  15. Dæk frimærkerne, lad dem sidde ved stuetemperatur i 30 min. og skyl derefter grundigt med DI-vand igen. Fjern overskydende vand fra frimærkernes overflade på samme måde som dæksedlerne, og lad frimærkerne tørre utildækket i ~30 min.
  16. Efter 30 min skal du kontrollere, om både de proteinbelagte dæksedler og frimærkerne er tørre. Hvis en af dem ikke er helt tør, skal du bruge en filtreret luftpistol til at tørre dem helt, så dækslipsene ikke udsættes for lys i længere tid.
  17. Når både omslagene og frimærkerne er tørre, skal du skubbe frimærkemønsteret med siden nedad på dækslipsene med tilstrækkeligt tryk, så frimærkerne kommer i fuld kontakt med overfladen på omslagsslipsen. Lad frimærkerne stå i kontakt med dæksedlerne i 15 min.
    BEMÆRK: På grund af den kovalente amidbinding mellem glutaraldehydstemplet med proteinlaget på glasdækslen - som er meget stærkere end de svage hydrofobe interaktioner mellem proteinlaget og glasdækslerne - skal proteinerne skrælle glasset af i henhold til mønsteret på PDMS-stemplet, når det er fjernet.
  18. Efter 15 minutter skal du forsigtigt skrælle PDMS-stemplerne af dæksedlerne.
    BEMÆRK: Hvis fjernelsesprocessen fungerede korrekt, bør stemplerne ikke komme ud af dækslipsene uden modstand, men bør heller ikke sidde så fast på dækslipsene, at de ikke kan fjernes uden overdreven kraft.
  19. Kontroller troskaben af de mønstrede dæksedler ved hjælp af det relevante filter på et fluorescerende mikroskop (afhængigt af hvilket fluorescerende farvestof proteinerne er markeret med).
  20. Brug de mønstrede dæksler med det samme, eller gem dem og opbevar dem væk fra direkte lys.

3. Aktiverede dæksedler

BEMÆRK: Bunddækslipsene til brug i forsøgskammeret til PAA-geler er lavet i dette trin. Denne bunddæksler er specielt behandlet, så PAA-gelen kan forblive sikkert klæbet til, når det øverste mønstrede dækslip fjernes under mønsterprocessen. Lignende teknikker er også beskrevet andetsteds 10,12,15,28.

  1. Sonikat 30 mm dækker i 100% ethanol i 10 minutter, skylles med DI-vand og tørres derefter grundigt med en filtreret luftpistol. Forbered op til 6 dæksedler ad gangen pr. batch i en 6-brønds plade.
  2. Plasma behandler dæksedlerne i 1 min på høj (radiofrekvenseffekt på 30 W) og placerer derefter hvert dækslip i en brønd på en 6 brøndplade.
  3. Belæg hvert coverlip med et meget tyndt lag af 5% APTMS i ethanol i en stinkhætte.
    BEMÆRK: Der dannes en orange rest i tilfælde af overdreven belægning i denne proces.
  4. Dæk pladen med 6 brønde til og lad dækslipsene sidde i 5 min.
  5. Skyl dæksedlerne (begge sider) og indersiden af hver brønd grundigt med DI-vand og fjern overskydende vand inde i brøndene.
  6. Læg dækslipsene tilbage i pladen med 6 brønde, og tilsæt ca. 2 ml 0,5% glutaraldehyd i DI-vand.
  7. Dæk pladen med 6 brønde og lad dækslipsene sidde i glutaraldehydopløsningen i 30 minutter; Skyl derefter grundigt både dækslipsene og brøndene på hver plade med DI-vand.
  8. Opbevar de behandlede dæksedler i DI-vand i pladerne med 6 brønde i op til to uger, eller brug dem med det samme. Sørg for, at dæksedlerne er helt tørre inden brug.

4. PAA gel fabrikation og mønsteroverførsel

BEMÆRK: Når mønstrede dæksedler er lavet, skal de bruges til at overføre disse proteinmønstre til PAA-hydrogelen kort tid efter (<24 h) 1,29,30. Følgende opskrift er på en PAA gel med et Youngs modul på 3,6 kPa. Mængderne af bis-acrylamid, acrylamid og DI-vand kan varieres for at justere stivheden af PAA-gelerne12.

  1. Lige før du begynder at fremstille PAA-hydrogelprækursoren, skal du fjerne akrylsyren N-hydroxysuccinimid (NHS)-ester fra køleskabet, så den kan nå stuetemperatur, inden den åbnes. Forbered et udskifteligt coverslipsfad ved at sterilisere det med 70% ethanol og lade det sidde under UV-lys i et biosikkerhedsskab i mindst 30 minutter før brug.
    FORSIGTIG: NHS er en giftig hud- og øjenirriterende; Brug beskyttelseshandsker og briller, når du håndterer det, og arbejd under en stinkhætte.
    1. Tilsæt 1,25 ml 40% acrylamid i DI-vand til et 15 ml konisk rør.
      FORSIGTIG: Acrylamid er en giftig hud- og øjenirriterende; Brug beskyttelseshandsker og briller, når du håndterer det, og arbejd under en stinkhætte.
    2. Der tilsættes 175 μL bis-acrylamidopløsning i DI-vand til det samme rør (trin 4.1.1).
      FORSIGTIG: Bis-acrylamid er en giftig hud- og øjenirriterende; Brug beskyttelseshandsker og briller, når du håndterer det, og arbejd under en stinkhætte.
    3. Der tilsættes 500 μL 10x fosfatbufret saltvand (PBS).
      FORSIGTIG: PBS er øjenirriterende; Brug beskyttelseshandsker og briller ved håndtering.
    4. Tilsæt 2.915 ml DI-vand.
  2. Pipette 969 μL af denne prækursor i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og opbevare resten ved 4 °C i op til to uger.
  3. Mål ~ 50-100 mg ammoniumpersulfat (APS) i et andet mikrocentrifugerør og fortynd det i DI-vand ned til 100 mg / ml; sæt det til side til brug senere. Åbn NHS-esteren (nu ved stuetemperatur) i emhætten og mål omhyggeligt op til 3 mg NHS i et mikrocentrifugerør. Fortynd NHS-esteren til 1 mg/ml i 1x PBS.
    FORSIGTIG: APS er hud- og øjenirriterende; Brug beskyttelseshandsker og briller, når du håndterer det, og arbejd under en stinkhætte. Både APS og NHS-ester vil hydrolysere over tid, hvilket får aktiviteten af kemikalierne i stamopløsningen til at variere. Derfor skal begge disse opløsninger tilberedes friske hver gang (i modsætning til resten af forløberen).
  4. Udfør de næste tre trin i en røghætte:
    1. Der tilsættes 2 μL tetramethylethylendiamin (TEMED) til mikrocentrifugerøret, der indeholder 969 μL-alikvote PAA-prækursoren.
      FORSIGTIG: TEMED er en brandfarlig hud- og øjenirriterende; hold den væk fra varme/flammer/gnister, brug beskyttelseshandsker og briller ved håndtering, og arbejd under en stinkhætte. TEMED er et af to tværbindingsmidler, der er kritiske for polymerisationen af PAA-hydrogelen, den anden er APS.
    2. Der tilsættes 15 μL 1 M saltsyre for at reducere hydrogelopløsningens pH-værdi og undgå hydrolyse af NHS-esteren.
      FORSIGTIG: Saltsyre er en ætsende hud- og øjenirriterende; Brug beskyttelseshandsker og briller, når du håndterer det, og arbejd under en stinkhætte.
    3. Tilsæt 10 μL af NHS-esteropløsningen til røret.
      BEMÆRK: NHS er afgørende for mønsterprocessen. Det vil reagere med amingrupper i proteinerne på det mønstrede dækslip for at danne en stabil amidbinding, som gør det muligt at overføre mønsteret fra glasdækslaget til overfladen af PAA-gelen, da det polymeriserer31.
  5. Udfør disse sidste trin i et biosikkerhedsskab:
    1. Anbring forsigtigt 30 mm dæksedlen i metaldelen af dækslipskålsættet (3-APTMS og glutaraldehydbehandlet med siden op), og skru plastringen ovenpå. Konfigurer det mønstrede dæksel, så det let kan nås i næste trin, og beskyt det stadig mod lys så meget som muligt.
    2. Pipette 5 μL APS-opløsning i resten af PAA-prækursoren i mikrocentrifugerøret, vende den om for at blande den og derefter straks pipette 35 μL af denne opløsning på 30 mm dæksedlen.
    3. Slip det mønstrede dækslipprotein med siden nedad på opløsningen, og pas på ikke at skabe luftbobler i hydrogelen. Beskyt hydrogelen mod lys og lad den polymerisere i 90 minutter.
    4. Når hydrogelen er polymeriseret, skal du bruge et barberblad eller skalpel til at fjerne det øverste dækslip, hvilket sikrer, at dæksedlen ikke glider af gelen eller falder tilbage på gelen, når den er fjernet, da dette vil ødelægge mønsteret på gelens overflade.
      BEMÆRK: Efterlad ikke gelen afdækket i et område med betydelig luftstrøm (såsom et biosikkerhedsskab).
    5. For at passivere eventuelle resterende NHS-estere i hydrogelen tilsættes 2 ml steril PBS til gelen og inkuberes ved 37 °C i 45 minutter. Gelerne forberedes straks til forsøg eller opbevares natten over i steril PBS ved 4 °C indtil brug.

5. Billeddannelse

  1. For at forberede sig på eksperimenter med celler skal du tænde for varmen (37 ° C) og fugtigheden (70%) i mikroskopet eftermiddagen før et planlagt eksperiment for at gøre det muligt for udstyret inde i mikroskopkammeret at udligne til den højere temperatur.
    BEMÆRK: Dette trin minimerer z-drift forårsaget af temperaturudsving.
  2. Lige før forsøgets start skal du tænde for kammerets CO2 - kilde.
  3. For at forhindre x-y-drift forårsaget af den gentagne bevægelse af mikroskoptrinnet under eksperimentet skal du fastgøre det udskiftelige dækslipskålsæt, der holder den cellefrøede hydrogel til scenen med dobbeltsidet tape.
  4. Kig over gelen for at finde rammer af interesse for billedet, og gem hver trinposition af de sektioner, der skal afbildes.
  5. I både lysfeltvisningen og den fluorescerende visning, der svarer til det mærkede protein, skal du indstille mikroskopsoftwaren til at afbilde hver ramme en gang hvert 5. minut i 2 timer.

6. Billedanalyse

BEMÆRK: Der er udviklet et system, der kan måle deformationen af de mønstrede PAA-geler ved at bestemme placeringen af trækpunkterne, interpolere de oprindelige placeringer af de deformerede punkter og derefter beregne de cellulære trækkrafter på hvert sted. Ethvert softwaresystem, der er i stand til at udføre billedbehandling og numeriske beregninger, kan bruges. Programmet sigter mod at bestemme trækkraft hurtigt, eliminere brugerinput og forbehandlingsprocedurer, der ville bidrage til brugerrelaterede fejl. Koden, der bruges her, er tilgængelig her som supplerende filer 2-10, og disse filer sammen med et par øvelsesbilleder kan tilgås på www.bu.edu/mml/downloads.

  1. I en billedbehandlingssoftware skal du åbne alle individuelle billeder, der er taget under et timelapse-eksperiment fra hver mikroskopvisning, der bruges i rækkefølge, fra det første til det sidste billede, der er taget, og omdanne dem til en enkelt billedstak (klik på Billede | Stakke | Billeder, der skal stables). Sørg for, at der er to separate billedstakke: en af lysefeltvisningen af cellerne og en af den fluorescerende visning af det mønster, som de er knyttet til.
    1. Hvis der er drifting i de fluorescerende billeder (dvs. øen af interesse bevæger sig rundt i x- og / eller y-retningen mellem hver ramme med >1-2 μm), skal du først behandle billedstakken med StackReg-pluginet (P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne) for at recentrere hvert billede i stakken baseret på placeringen af det første (klik på Plugins | StackReg | Oversættelse | OKAY).
      BEMÆRK: Dette er kritisk, fordi selv sub-μm drift kan påvirke den endelige beregning af trækkraft betydeligt, især på stivere geler, hvor denne x-y drift er uden for området for forventet støj. Denne kode gemmer billederne, efter at drift er fjernet, som derefter kan laves til en ny billedstak, der skal analyseres.
  2. Indtast lysfelt- og fluorescerende billedstakke i CTFTimelapse.m (Supplerende fil 2).
    1. Angiv den filmappe, hvor billedstakkene er placeret på linje 7.
    2. På linje 8 og 9 skal du angive navnene på henholdsvis den fluorescerende billedstak og den tilsvarende lysfeltfluorescerende stak.
    3. Angiv PAA-gelstivhed (Pa):
      1. I linje 11-14, som omfatter et par forskellige elastiske moduler af PAA-hydrogeler, der oftest anvendes, kommenteres (type % i starten af linjen) alt undtagen gelens elastiske modul på de billeder, der analyseres. Alternativt kan du tilføje det elastiske modul, hvis det ikke allerede er til stede, og kommentere resten (3658.19 Pa til testbilleder).
    4. Angiv dot radius (m) på linje 15 (1 × 10-6 m for testbilleder).
    5. Angiv den maksimalt mulige dotdiameter (μm) på linje 16 (2,5 μm for testbilleder).
    6. Angiv pixelforhold (μm/pixel):
      1. I linje 17-20, som indeholder et par forskellige billedpixelforhold baseret på billedopsætninger, der tidligere er brugt, skal du kommentere (type % i starten af linjen) alt undtagen pixelforholdet for de billeder, der analyseres. Alternativt kan du tilføje det anvendte pixelforhold, hvis det ikke allerede er til stede, og kommentere resten (0,1613 μm/pixel til testbilleder).
    7. På linje 35 og 87 skal du angive den filmappe, hvor de nødvendige billedbehandlingsfiler er placeret.
      BEMÆRK: Fra den fluorescerende billedstak bestemmer koden placeringen af hver fluorescerende dot og sporer bevægelsen af hver post mellem hvert billede i stakken20. Startpositionen af de mikrokontakttrykte punkter er kendt, fordi de ikke deformeres, når de overføres korrekt til hydrogelen32.
  3. Vent på, at to figurer og en dialogboks vises, når programmet finder prikkerne. Brug figur 1 til at sikre, at programmet har fundet de korrekte prikker og ikke fandt mange prikker, hvor der ikke var nogen. Brug figur 2 til at vælge det rektangulære gitter, der hjælper programmet med at lokalisere og beregne cellulære trækkrafter.
    BEMÆRK: Figur 1 er lysfeltbilledet af cellen med prikkerne fundet af programmet (som vil være rødt) overlejret over det (se figur 3A). Figur 2 er et billede, der viser de samme prikker vist i figur 1, men uden lysfeltbilledet i baggrunden.
    1. Vent på, at dialogboksen beder om at trykke på Enter efter valg af punkt - hvor hvert punkt er en af de røde prikker, der findes af programmet - og har en stor knap inde i den mærket Enter.
    2. Vælg fire forskellige prikker i figur 2 for at oprette et rektangulært gitter omkring og inkludere cellen/klyngen på det pågældende mønster. Vælg hver prikken en efter en med et venstre klik med musen, og bekræft den ved at trykke på Enter på knappen i den førnævnte dialogboks. Hold styr på, hvor mange prikker der er mellem den første og anden prel samt den første og tredje prykke, da programmet vil bede om disse værdier, når alle firehjørnet prikker er valgt. Indtast disse værdier i kommandovinduet (skriv antallet af prikker, og klik på enter-knappen på tastaturet, når du bliver bedt om det).
  4. Når det rektangulære gitter er valgt, skal du vente på, at scriptet beregner trækkraft, som det finder inden for gitteret baseret på placeringen af de fluorescerende prikker. Bemærk, at scriptet først finder forskydningsvektoren (u) af det geometriske centrum af hver og derefter beregner den tilsvarende trækkraftvektor (F) ved hjælp af Eq (1):
    Equation 1(1)
    Hvor E er Youngs modul af PAA-substratet, er a radius af de fluorescerende prikkemarkører, og ν er Poissons forhold mellem PAA-substratet32. Eq (1) forudsætter, at substratet er et uendeligt elastisk halvrum, at trækkraften påføres i midten af hver cirkulær prikkemarkør, og at afstanden mellem prikkemarkørerne er tilstrækkelig stor til, at deres respektive forskydninger ikke interagerer med hinanden23.
    BEMÆRK: I de her beskrevne eksperimenter anvendes prakmarkører med radius a = 1 μm og 6 μm center-til-center afstand. Trækkraftpile inde i cellen/klyngen, der peger indad mod midten af cellen, skal være til stede, mens området uden for cellen/klyngen ikke bør have trækpile til stede (se figur 3C-E). Trækpile, der peger udad inde fra cellen / klyngen eller mange store trækpile, der er til stede uden for cellen, er tegn på et dårligt valgt rektangulært gitter.
  5. Når det korrekte trækkraftfelt er fundet, skal du vælge et passende interesseområde (ROI), der omgiver cellen/klyngen, som omfatter alle trækkraftpile i cellen ved hjælp af markøren.
    1. For at tegne ROI skal du venstreklike så mange gange som nødvendigt for at tegne en polygonform med så mange sider som ønsket, justere formen eller flytte ROI'et, efter at det er tegnet ved at venstreklike på henholdsvis hjørnerne eller kanterne. Når ROI er tegnet, skal du dobbeltklikke til venstre for at gå videre til det næste billede i stakken. Gentag dette for alle billeder i brightfield-stakken.
      BEMÆRK: Koden gemmer trækkraft- og forskydningsdata for hvert tidspunkt i samme mappe som de originale billedstakke, som derefter kan analyseres yderligere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PAA-hydrogeler med Youngs modul af E = 3,6 kPa og Poissons forhold på ν = 0,445 blev lavet til brug ved denne subtraktive mikromønstermetode. Hydrogelerne blev lavet til at være ~ 100 μm tykke, hvilket gør det muligt at afbilde dem med den billedbehandlingsopsætning, der anvendes her, samtidig med at cellerne forhindres i at registrere det stive dækslip under gelen, hvilket ville forårsage problemer i undersøgelser med fokus på cellulær stivhed, der senserer23,33. Geler med mange andre stivhedsniveauer (op til 30 kPa) er blevet fremstillet med succes og afbildet ved hjælp af den indirekte mikromønstermetode34, så metoden er ikke begrænset til brugen af kun 3,6 kPa hydrogeler. Dæksedlerne behandles på forhånd med glutaraldehyd, så gelen kan forblive fastgjort til det nederste dækslip, når det øverste mønstrede dækslip fjernes (figur 2C,D).

For at visualisere og måle cellulære trækkrafter inden for klynger blev 3,6 kPa-hydrogelerne indirekte mønstret med fluorescerende fibronectin (figur 2A-D) for at skabe ømønstre af forudbestemt størrelse og form (figur 2E). Andre typer proteiner kan også mønstres på disse bløde hydrogeler 21,35,36,37,38. Kvaliteten af det overførte mønster er direkte relateret til troskaben af masterformen, hvorfra PDMS-stemplet er støbt. Forme, der har haft SU-8 delaminering, vil se en forringelse af kvaliteten af mønstrene fremstillet af frimærker støbt af disse delaminerede forme. For eksempel vil skimmelsvampe med delamineret SU-8 ofte skabe mikromønstre, der indeholder sektioner af umønstret fibronectin mellem de forudbestemte øer. Hvis de støbes på en gel, tillader disse mønstre cellefastgørelse til gelen i områder uden for øens mikromønster. På grund af dette var billeddannelse af celleklynger knyttet til helt eller for det meste intakte ømønstre prioriteten.

Bovin vaskulære glatte muskelceller (BVSMC'er) blev podet på disse hydrogeler med en densitet på ca. 60-80 × 103 celler / gel for at fremme klyngedannelse og fik lov til at klæbe i 18-24 timer før billeddannelse. Lige før eksperimenterne blev celler farvet med en levende cellekerneplet for at gøre det muligt at identificere levende celler og bestemme antallet af celler i hver klynge. Mikromønstre med og uden celler blev afbildet og analyseret. Billeddannelse af øer uden celler tillod beregning af den støj, der var til stede i trækkraftberegninger for 3,6 kPa geler. Disse falsk-positive forskydningsmålinger kan derefter bruges til at bestemme en passende tærskelværdi, under hvilken forskydninger bør udelukkes.

Det har vist sig, at 0,3 μm normalt er tilstrækkeligt til at eliminere mønster utroskab, der fører til falsk-positive forskydningsmålinger. Dette kan medføre tab af trækkraft med lav kraft, men er afgørende for at fjerne falsk-positive trækkrafter. Ved billeddannelse blev celleklynger på for det meste intakte ømønstre prioriteret (dvs. dem, der ikke manglede mange, hvis nogen prikker) og for det meste intakte mønstre uden celler. Hver ROI blev afbildet en gang hvert 5. minut i 2 timer. Mikroskopet, der blev brugt til at tage billeder af både celler og de mønstrede PAA-geler under udvidede timelapse-eksperimenter, var et fluorescensmikroskop med et automatisk trin, en fluorescenslyskilde, et kamera og standard mikroskopsoftware. Dette mikroskop har et brugerdefineret sæt filtre til at observere mange forskellige farver af fluorescens. Målet, der bruges til at se cellerne og den mønstrede hydrogel, er et 40x vandnedsænkningsmål, NA = 1,15. Dette mikroskop er også udstyret med en tilpasset temperatur (37 ° C) -, fugtighed (70%) - og CO2 (5%) -reguleret system for at holde cellerne levedygtige under lange eksperimenter.

For at beregne trækkraften fra billederne af mikromønsterøerne blev billedanalysesoftware brugt til at spore forskydningerne af de fluorescerende fibronectin prikker over tid. Ved at kende forskydningerne af de fluorescerende prikker og stivheden af PAA-gelen, som prikkerne er mønstret på, kan programmet bestemme værdierne for de trækkrafter, der gives af både individuelle celler og klynger på PAA-substratet. Der er dog to måder, hvorpå programmet ikke bliver i stand til at bestemme trækkraftværdier. Hvis for mange prikker inden for en given ramme af interesse deformeres, kæmper programmet med at beregne kræfter, da programmet er afhængigt af, at de fleste prikker i et analyseret billede er uformede. Desuden, hvis to prikker er for tæt på hinanden (center-til-center afstand på ≤2 μm20), kan forskydningerne af de enkelte prikker forstyrre hinanden, hvilket forhindrer nøjagtig bestemmelse af deres faktiske forskydningsværdier og dermed deres trækkraftværdier. Så længe mikromønstrene er designet med prikker, der er godt adskilt fra hinanden, bør celler ikke være i stand til at fortrænge prikkerne så meget, at de bliver så tæt på hinanden, selv på blødere underlag.

Figur 3 viser mulighederne for fjernelsesmønstermetoden. Her er denne metodes evne til at fremstille isolerede, veldefinerede ømønstre af forudbestemt form vist i figur 3B-E, hvor fibronectinadhæsionsperne kun er til stede inden for det ønskede område af øen. Disse isolerede øer af adhæsionsp prikker giver yderligere mulighed for bedre kontrol med klyngeformen, som vist i figur 3A. Fordi øernes form og størrelse er konsistent, vil celleklyngerne, der knytter sig til og vokser på dem, også have en tendens til at have ensartet form, da ømønstrene begrænser klyngevækstområdet. Endelig viser figur 3B-E også disse øers evne til at blive brugt til at beregne cellulære trækkrafter og tendensen til, at disse trækkraftkræfter ændrer sig over tid. Her er klyngens trækkraft de største omkring øens kanter. Dette forventes, fordi cellerne i kanterne af en klynge har færre interaktioner med andre celler i klyngen end dem i det indre af klyngen. Således udøver disse celler ved kanterne større kræfter på substratet som reaktion på cytoskeletal sammentrækning end cellerne i det indre.

Figure 1
Figur 1: Design af fotomaske. (A) En repræsentation af den første halvdel af fotomaskedesignet, der anvendes her, et diskret gitter med prikker med en diameter på 2 μm fordelt på 6 μm center-til-center. Mens billedet vist her kun er en lille del af designet, fylder dette gitter et mellemrum på 1,5 x 1,5 cm i alt på fotomasken. B) en gengivelse af anden halvdel af fotomaskedesignet her er vist seks små øer med 6 x 6 prikker. På fotomasken er der flere forskellige østørrelser: 6 x 6 (vist her), 12 x 12, 25 x 25 og 42 x 42 prikker. Et ligeligt fordelt (50 μm mellem øer) array af hver østørrelse optager et rum på 1,5 x 0,375 cm, og arrays af forskellige øer er adskilt af 50 μm. Prikkerne på hver ø er 2 μm i diameter og fordelt 6 μm center-til-center. De to sektioner af masken beskrevet i A og B er adskilt af 0,75 cm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Subtraktiv mikrokontaktudskrivning. (A) Et PDMS-stempel behandles med glutaraldehyd og kommer i kontakt med et glasdæksler, der er jævnt belagt med fluorescerende fibronectinopløsning. (B) Når PDMS-stemplet fjernes fra omslagssedlen, fjerner det meste af det fluorescerende fibronectin på overfladen af omslagssedlen og efterlader kun prikker af protein i mikronstørrelse på steder, der er forudbestemt af PDMS-stemplets design. (C) Det mønstrede dækslip placeres i kontakt med en PAA-præfolymer og NHS-opløsning. (D) Når PAA-gelen har fået lov til at polymerisere fuldt ud, fjernes topdækslen, og et mønster af fibronectin udskrives på PAA-geloverfladen. (E) Et eksempel på et diskret ømønster bestående af jævnt fordelte prikker på en PAA-hydrogel med et Youngs modul på 3,6 kPa. Skalabjælke = 20 μm. Forkortelser: PDMS = polydimethylsiloxan; PAA = polyacrylamid; NHS = N-hydroxysuccinimid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Analyse af celler på ømikromønstre. (A) Et lysfeltbillede af en klynge af 3 BVSMC'er overlejret på en fluorescerende fibronectin ø mikromønster på en PAA hydrogel med en Youngs modul på 3,6 kPa er vist. Prikker er 2 μm i diameter og adskilles af 6 μm center-til-center. (B) Det fluorescerende mønster viser, at en række af fibronectinpunkterne på øen er blevet forskudt på grund af BVSMC'ernes anvendelse af kræfter. (C) De trækkrafter, der påføres adhæsionspunkterne på tidspunktet punkt 1 (start af et 2 timers eksperiment). Retningen af disse kraftvektorer er angivet ved retning af de farvede pile. Deres størrelse er angivet med pilfarven og dens tilsvarende værdi på farvelinjen (alle kraftværdier er i nN). Vektorlængden er relativ baseret på de minimale og maksimale kræfter beregnet af programmet for hvert tidspunkt. (D) Trækkrafter i samme klynge på tidspunktet punkt 13 (halvvejs gennem et 2 timers eksperiment) (E) Trækkrafter i samme klynge på tidspunktet punkt 25 (slutningen af et 2 timers eksperiment). Forkortelser = BVSMC'er = kvægvaskulære glatte muskelceller; PAA = polyacrylamid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Lommeregner til mærkning af fibronectin Dette er et værktøj til beregning af den korrekte mængde Alexa488 fluorescerende farvestof, der skal bruges ved mærkning af fibronectin. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: CTFTimelapse.m Dette er billedbehandlingsfilen, som gør det muligt at beregne cellulære trækkrafter som beskrevet i afsnit 5 (Billedanalyse). Dette omfatter valg af et ønsket gitter med prikker (trin 6.3-6.3.2) og valg af det område, der er af interesse for CTF-beregningerne (trin 6.5 og 6.5.1). Alle følgende supplerende filer kaldes direkte af dette script eller en af de andre funktioner, der bruges i det. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 3: analyze_initial_image_4.m Denne funktion kaldes af CTFTimelapse.m, og dens formål er at lokalisere og justere de fluorescerende prikker på et gitter fra den første ramme af billedstakken i det deformerede gittermønster for at matche det oprindelige uformede gittermønster. Dette giver mulighed for trækkraftberegninger for den første ramme i billedstakken. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 4: analyze_subsequent_images.m Denne funktion kaldes af CTFTimelapse.m, og dens formål er at lokalisere og justere de fluorescerende prikker på et gitter fra alle rammer i billedstakken i det deformerede gittermønster efter det første. Dette giver mulighed for trækkraftberegninger for alle rammer i billedstakken efter den første. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 5: bpass.m Denne funktion kaldes af både analyze_initial_image_4 og analysere subsequent_images, og dens formål er at implementere et real-space bandpass-filter, der behandler billedstakken af det deformerede gittermønster. Dette filter undertrykker pixelstøj og billedvariationer med lang bølgelængde, samtidig med at der bevares oplysninger af en karakteristisk størrelse. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 6: CellBoundary.m Denne funktion kaldes af CTFTimelapse.m, og dens formål er, at den giver programbrugeren mulighed for at tegne et område af interesse omkring cellen / klyngen, for hvilket trækkraften skal beregnes. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 7: pkfnd.m Denne funktion kaldes af både analyze_initial_image_4.m og analyze_subsequent_images.m, og dens formål er at finde lokal maks. i et billede med nøjagtighed på pixelniveau. Disse toppe bruges af cntrd.m til at lokalisere det fluorescerende gittermønster for CTFTimelapse.m. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 8: cntrd.m Denne funktion kaldes af både analyze_initial_image_4.m og analyze_subsequent_images.m, og dens formål er at lokalisere centroiden af lyse pletter i et billede til sub-pixel nøjagtighed. Dette gør det muligt at placering af det fluorescerende gittermønster ved hjælp af CTFTimelaspe.m, som beskrevet i trin 6.3. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 9: FourCorners.m Denne funktion kaldes af både analyze_initial_image_4.m og analyze_subsequent_images.m, og dens formål er at tage det gitter, som brugeren har valgt (trin 6.3-6.3.2) og beregne afstanden mellem hver hjørnepeg i to ortogonale akser. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 10: track.m Denne funktion kaldes af både analyze_initial_image_4 og analyze_subsequent_images, og dens formål er at spore bevægelsen af prikkerne i det fluorescerende gittermønster mellem rammer, hvilket er afgørende for beregning af de tilsvarende trækkrafter. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En forbedret metode til indirekte mønster af PAA-hydrogeler er beskrevet i dette papir. Denne tilgang bygger på metoder, der tidligere har været anvendt 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Den primære ændring er, at PDMS-stempler nu bruges til at fjerne protein og efterlade det ønskede mønster på det mellemliggende substrat i stedet for direkte at stemple mønsteret ned på det. Dette giver mulighed for meget mere konsekvent oprettelse af high-fidelity mikromønstre og oprettelse af isolerede mikromønstrede øer, der tidligere nødvendiggjorde to produktionstrin. Formen og størrelsen af ømønstrene, der er lavet med denne metode, er også lettere at kontrollere end dem, der er lavet med den foregående totrinsmetode. Den nye teknik er mindre modtagelig for mængden af tryk, der påføres under mikroprint end den gamle teknik. En anden fordel er, at denne fjernelsesmetode kan lave ømønstre af kontrolleret form og størrelse i kun ét trin. I modsætning hertil krævede tidligere metoder to trin for at lave øer, herunder stempling til deponering og efterfølgende stempling til fjernelse, og formerne på disse øer er mindre præcise end dem, der er lavet med fjernelsesmetoden.

Den største ulempe ved denne metode er, at levetiden for de mestre, der bruges til at forme den nye stil af PDMS-frimærker, synes at være kortere end dem, der blev brugt i den tidligere stemplingsmetode. Dette kan sandsynligvis tilskrives formen på de nye mestre, der anvendes i fjernelsesmetoden. De gamle mestre var sammensat af et 1,5 x 1,5 cm areal af SU-8 sammensat af lige store 5 μm dybe cirkulære huller, som, når de blev støbt i PDMS, ville skabe frimærker bestående af jævnt fordelte cylindriske stolper af samme højde. Omvendt består de nye mastere af et 1,5 x 1,5 cm område med 5 μm høje SU-8 cylindriske stolper, der, når de er støbt i PDMS, laver frimærker, der består af jævnt fordelte huller.

Med denne ændring i masternes struktur har det vist sig, at SU-8 har tendens til at blive delamineret fra overfladen meget lettere end i den gamle metode. Der blev truffet forholdsregler for at forhindre dette, såsom overfladebehandling af siliciumskivene i en plasmaasker for at gøre dem mere modtagelige for binding til SU-8. Wafers overflade blev også silaniseret før den første støbning i PDMS for at forhindre SU-8 i at klæbe til PDMS ved fjernelse af frimærkerne. På trods af dette er SU-8 delaminering fra siliciumskivene blevet observeret efter gentagen støbning i PDMS, og der skal udvises forsigtighed for at sikre, at der fremstilles nye siliciumskiver inden tab af den nuværende master. En mulig måde at undgå denne delaminering på er at bruge PDMS-dobbeltstøbningsmetoden, som tidligere er beskrevet43, selvom denne anden metode har sine begrænsninger.

En anden mangel ved denne metode (og andre metoder, der bruger deformerbare hydrogeler til at måle trækkraft44) er, at trækkraftfeltet ikke er i mekanisk ligevægt på grund af eksperimentel støj. Der er således behov for en efterbehandlingsanalyse for at opnå et ligevægtet trækkraftfelt, efter at trækkraften er beregnet. En måde at afbalancere trækkraften på er at opnå de kræfter, der er tættest på målingerne, der tilfredsstiller ligevægten ved hjælp af en mindst kvadratisk metode. Som følge heraf ændres størrelsen og orienteringen af målte trækkrafter45.

Der er begrænsninger for denne metode til beregning af cellulære trækkrafter. For nøjagtigt at bestemme cellulære trækkrafter ved hjælp af Eq. (1) (trin 5.4) skal mønsteret være konstrueret således, at forskydningen af en vedhæftningspr ikke i væsentlig grad påvirker forskydningen af dem, der støder direkte op til det. Teoretisk falder forskydningen af et cirkulært vedhæftningsområde på overfladen af et uendeligt halvrum på grund af en tangentiel kraft, der virker i midten, da en radial afstand fra midten af cirklen øges23. Specifikt for et substrat, hvis Poissons forhold er ~ 0,445 (som dem, der er beskrevet her), er forskydningen ved kanten af det cirkulære område ca. to tredjedele af forskydningen i midten af regionen. Teoretiske forudsigelser strækker sig imidlertid ikke ud over den cirkulære region. Det antages således, at den faldende tendens i forskydningsstørrelse, bestemt teoretisk23, fortsætter ud over kanten af vedhæftningscirklen. I mikromønsterdesignet, der er beskrevet her, anvendes 2 μm cirkulære prikker med en afstand på 6 μm center-til-center. Årsagen til denne afstand er, at en forskydning i 6 μm afstanden fra midten af en dot anslås at være ca. 1/12th forskydningen i midten af prikken, som antages at være lille nok til at påvirke forskydningsværdierne for tilstødende prikker. Det er imidlertid muligt, at de trækkrafter, der udøves af celler, kunne fortrænge vedhæftnings prikkerne på et substrat så meget, at center-til-center-afstanden mellem dem bliver mindre end 2 μm. I dette tilfælde holder antagelsen om forskydningen af tilstødende vedhæftnings prikker, der ikke forstyrrer hinanden, ikke, og trækkraften kan ikke beregnes nøjagtigt med ligningen i trin 6.4 (Eq (1)).

Den foreslåede teknik giver et kraftfuldt værktøj til måling af cellulære trækkrafter. Disse kræfter giver indsigt i det mekaniske miljø i både individuelle celler og klynger og kan hjælpe med at forstå, om og hvordan forskellige typer celler opretholder mekanisk stabilitet. Opretholdelse af et homeostatisk niveau af cellespænding er afgørende for mange cellulære processer, og tab af denne spændingshomeostase har været forbundet med forskellige sygdomme, såsom aterosklerose, astma og kræft 9,10,12. Spændingshomeostase defineres som en celles eller en celleklynges evne til at opretholde et ensartet spændingsniveau med en lav tidsmæssig variabilitet omkring et sætpunkt46.

Denne indirekte mikromønstermetode kan bruges til at bestemme forskellige celletypers evne til at opretholde spændingshomeostase, både på individuelt og multicellulært niveau. Dette gøres ved at spore ændringer i værdierne i det cellulære trækkraftfelt over tid og derefter kvantificere tidsmæssig udsving i trækkraftfeltet ved hjælp af variationskoefficienten (CV), som repræsenterer forholdet mellem standardafvigelsen af trækkraftfeltets størrelse og dets middelværdi. Summen af størrelsen af trækkraftkræfterne og størrelsen af det kontraktile moment (det første øjeblik af trækkraftkræfterne) anvendes som skalarmålinger af trækkraftfeltets størrelse46. Hvis CV'et for trækkraftfeltet forbliver tæt på nul gennem et timelapse-eksperiment, viser det, at cellen / klyngen opretholdt spændingshomeostase over tid46.

Sammenfattende tilbyder denne nye metode til indirekte mikromønster af bløde hydrogeler en enklere og mere effektiv metode til at skabe mønstrede hydrogeler end tidligere metoder. Der er visse skridt, der kan tages for at forbedre og udvide denne metode. Primært vil forbedring af siliciummasternes fremstillingsproces på en måde, der forlænger deres levetid, eliminere den primære ulempe ved denne mikromønstermetode. Hvad angår måder at udvide denne metode på, ville udforskning af forskellige øformer ud over blot de firkantede øer, der er beskrevet her, forbedre alsidigheden af denne metode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Dr. Paul Barbone fra Boston University Department of Mechanical Engineering for nyttige diskussioner og hjælp til dataanalyse. Denne undersøgelse blev støttet af NSF-bevilling CMMI-1910401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma Aldrich #281778
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher Scientific #05-408-129
15 mL conical tube Fisher Scientific #05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask Advance Reproductions Corporation N/A Custom-designed mask
6 Well Plates Fisher Scientific #07-200-83
Acetone Fisher Scientific #A18P-4
Acrylamide Solution, 40% Sigma Aldrich #A4058
AlexaFluor 488 Thermo Fisher #A20000
Aminonium Persulfate Fisher Scientific #BP179-25
Bisacrylamide Fisher Scientific #PR-V3141
Ethanol Greenfield Global #111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round Fisher Scientifc #12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round Warner #64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera Hamamatsu #C10600-10B
Human Plasma Valley Biomedical #HP1051P Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N Millipore Sigma #1.09057
ImageJ Wayne Rasband #1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set Bioptechs #190310-35
Kim Wipes Fisher Scientific #06-666-11C
Mask Alinger Karl Suss #MA6
Matlab 2021 Mathworks #R2021a
MetaMorph Basic Molecular Devices #v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester Sigma Aldrich #130672-5G
NucBlue Live Cell Stain Thermo Fisher #R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope Olympus #IX81
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare #52-1308-00
Photoresist Spinner Hood Headway Research #PWM32
Plasma Cleaner Harrick #PDC-001
Plasma Etcher TePla #M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source Prior Scientific #L200
Silicon Wafers, 100 mm University Wafer #809
SU-8 2005 Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9463827
SU-8 Developer Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer Essex Brownell #DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine Fisher Scientific #BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich #448931
UAPON-40XW340 Objective Olympus #N2709300
UV Flood Exposure Newport #69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm Ted Pella, Inc. #19395-40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923 (2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Tags

Bioengineering udgave 180
Mønstergenerering til mikromønstertrækkraftmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bunde, K. A., Stamenović, D.,… More

Bunde, K. A., Stamenović, D., Smith, M. L. Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63628, doi:10.3791/63628 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter