Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/63628
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

Abstract

מיקרוסקופיית מתיחה מיקרו-פטרן מאפשרת שליטה על הצורה של תאים בודדים ואשכולות תאים. יתר על כן, היכולת לעצב בסולם אורך המיקרומטר מאפשרת שימוש באזורי מגע מעוצבים אלה למדידת כוחות מתיחה, שכן כל נקודה מיקרו-פטרנטית מאפשרת היווצרות של הידבקות מוקדית אחת המעוותת את ההידרוג'ל הרך והבסיסי. גישה זו שימשה למגוון רחב של סוגי תאים, כולל תאי אנדותל, תאי שריר חלקים, פיברובלסטים, טסיות דם ותאי אפיתל.

סקירה זו מתארת את האבולוציה של טכניקות המאפשרות הדפסה של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים של פוליאקרילאמיד במערך קבוע של נקודות בגודל ובמרווחים שצוינו מראש. מכיוון שקשה להדפיס תבניות בקנה מידה של מיקרומטר ישירות על מצעים רכים, התבניות נוצרות תחילה על כיסויי זכוכית קשיחים המשמשים לאחר מכן להעברת התבנית להידרוג'ל במהלך הג'לציה. ראשית, מתוארת גישת ההדפסה המיקרו-קונטגטית המקורית ליצירת מערכים של נקודות קטנות על הכיסוי. צעד שני שמסיר את רוב התבנית כדי להשאיר איים של נקודות קטנות נדרש כדי לשלוט בצורות של תאים ואשכולות תאים על מערכים כאלה של נקודות מעוצבות.

לאחר מכן, מתוארת אבולוציה של גישה זו המאפשרת יצירת איים של נקודות באמצעות שלב דפוס תת-קרקעי יחיד. גישה זו היא פשוטה מאוד עבור המשתמש, אבל יש את החיסרון של אורך חיים מופחת עבור תבנית האב הדרושה כדי ליצור את הדפוסים. לבסוף, מתוארות הגישות החישוביות שפותחו לניתוח תמונות של נקודות שנעקרו ושדות מתיחה שנוצרו לאחר מכן על ידי תאים, וגרסאות מעודכנות של חבילות ניתוח אלה מסופקות.

Introduction

רוב הפנוטיפים של התא מפעילים כוחות אחיזה על סביבתם. כוחות מתיחה אלה נוצרים על ידי שלד הציטוסקלטון המתכווץ של התא, שהוא רשת של אקטין ומיוזין, וביופולימרים נימיים אחרים וחלבונים צולבים 1,2,3,4. כוחות הנוצרים בתוך התא יכולים להיות מועברים לסביבה החוץ-תאית או לתאים הסמוכים, בעיקר באמצעות חלבוני טרנס-ממברנה כגון אינטגרין וקדרינים, בהתאמה 5,6. האופן שבו תא מתפשט או מתכווץ - וגודל כוחות המתיחה הקשורים לתנועות אלה - הוא תוצאה של שיחה אינטימית עם סביבתו, התלויה במידה רבה בסוג ובכמות החלבון הקיימים במטריצה החוץ-תאית (ECM)7,8 ובנוקשות של ה-ECM. ואכן, מיקרוסקופיית כוח המתיחה הפכה לכלי שלא יסולא בפז להבנת היענות התאים לגירויים מקומיים כגון נוקשות המצע, לחצים מכניים ומוטלים על מתחים, או מגע עם תאים אחרים. מידע זה רלוונטי ישירות להבנת מחלות כגון סרטן ואסתמה 9,10,11,12.

מערכת שיכולה לשמש למדידת דפורמציה המושרה בכוח של מצע של תכונות חומר ידועות נדרשת כדי לחשב את כוחות המתיחה. יש לעקוב אחר שינויים אלה לאורך זמן, הדורשים הן טכניקות הדמיה והן טכניקות עיבוד תמונה. אחת השיטות הראשונות ששימשו לקביעת כוחות המתיחה התאית הייתה תצפית וניתוח של התכווצות של קולגן הידרוג'לים שנזרעו בתאים, אם כי שיטה זו הייתה רק סמי-קוונטיטיבית13. שיטה אחרת, מעודנת יותר, הייתה למדוד את כוחות המתיחה המופעלים על ידי תאים בודדים על ידי קביעת הכוחות הנובעים מעיוות של יריעה דקה של סיליקון14. בהמשך פותחו טכניקות מדידה כמותיות נוספות, ושיטות אלה אפשרו גם שימוש בהידרוג'לים רכים כגון פוליאקרילאמיד (PAA)12,15,16. בעת שימוש בחומרים רכים אלה, ניתן היה לקבוע את כוחות המתיחה מתוך תזוזה המושרה בכוח של חרוזים שנעקרו באופן אקראי המוטמעים בהידרוג'ל והתכונות המכניות של הג'ל16,17. התקדמות נוספת הגיעה עם פיתוח מערכי מיקרופוסטים העשויים מפולידימתילסילוקסן רך (PDMS) כך שניתן יהיה למדוד את סטייתם ולהמירם לכוח באמצעות תורת הקרן18.

לבסוף, פותחו שיטות למיקרו-פטרינג הידרוג'לים רכים מכיוון שגישות אלה מאפשרות שליטה על אזורי המגע להדבקת תאים. על ידי מדידת העיוות של המיקרו-פטרן בתוך אזור המגע של התא, ניתן היה לחשב בקלות את כוחות המתיחה מכיוון שאין צורך בתמונת ייחוס נטולת כוח19. שיטה זו אומצה באופן נרחב מכיוון שהיא מאפשרת דפוס עקיף של מערך קבוע של נקודות הידבקות חלבונים פלואורסצנטיים בדידים בגודל מיקרון על ג'לים PAA למדידת כוחות המתיחה התאית20. כדי לחשב את הכוחות האלה, פותח אלגוריתם לעיבוד תמונה, שיכול לעקוב אחר התנועות של כל נקודה מיקרו-פטרית ללא צורך בקלט משתמש,21.

בעוד ששיטה זו פשוטה ליצירת רשתות שלמות של תבניות נקודות, היא מורכבת יותר כאשר רוצים תבניות של טלאים מבודדים (או איים) של נקודות. איים זעירים שימושיים כאשר יש צורך בשליטה על הצורה, ובמידה מסוימת של גודל, של אשכולות של תאים. כדי ליצור איים אלה, השיטה הנ"ל של הדפסת מיקרו-קונטיקט מחייבת שני שלבים נפרדים: i) שימוש בחותמת PDMS אחת כדי ליצור תבנית של נקודות בנאמנות גבוהה על מכסה, ולאחר מכן ii) שימוש בחותמת PDMS שונה שנייה כדי להסיר את רוב הנקודות הללו, תוך השארת איים מבודדים של נקודות21. הקושי ביצירת איים בשיטה מקורית זו מתווסף לעובדה שיצירת תבניות רשת עקביות בשלב הראשון של התהליך היא מאתגרת בפני עצמה. בולי מיקרו-הדפסה מורכבים ממערך של מיקרו-עמודים עגולים, שקוטרם מתאים לגודל הנקודה הרצוי. לאחר מכן מצופים בולים אלה בשכבה אחידה של חלבון ולאחר מכן מוטבעים בלחץ מדויק על כיסויים מטופלים כדי ליצור את התבנית הרצויה. מצד אחד, הפעלת לחץ רב מדי על החותמת עלולה לגרום להעברת חלבונים לא אחידה ולנאמנות דפוס לקויה עקב אבזם עמודים או נפול בין עמודים, מה שמוביל למגע עם הזכוכית. מצד שני, הפעלת לחץ נמוך מדי גורמת להעברת חלבון מועטה עד אפסית ולנאמנות דפוסים ירודה. מסיבות אלה, רצוי תהליך העברה שניתן להשתמש בו כדי ליצור באופן עקבי מיקרו-פטרנים באיכות גבוהה של איים מבודדים של נקודות בשלב אחד בלבד.

כאן מתוארת שיטה למיקרו-פטרציה עקיפה של איים של נקודות הידבקות חלבונים פלואורסצנטיים בגודל מיקרון על ג'ל PAA שהוא עקבי ורב-תכליתי יותר משיטות שפותחו בעבר. בעוד ששיטות מיקרו-פטרינג עקיפות ישנות יותר מסתמכות על העברת תבניות חלבונים מחותמת PDMS למצע ביניים, השיטה שהוצגה כאן משתמשת בחותמות PDMS במקום זאת ככלי להסרת חלבונים, לא כתוספת. זה נעשה על ידי שינוי יסודי הראשון של המבנה של חותמות PDMS בשימוש. במקום ליצור בולים המורכבים מתבנית של עמודים עגולים במרווחים שווים, הבולים מורכבים מתבנית של חורים עגולים במרווחים שווים בשיטה זו.

עם מבנה חדש זה, ניתן לטפל במשטח של חותמות PDMS אלה באמצעות גלוטארלדהיד כפי שתואר קודם לכן20,29,30, מה שהופך את החותמת מסוגלת להיקשר באופן קוולנטי עם חלבון. כאשר משתמשים בהם על כיסוי זכוכית המצופה באופן שווה בחלבון פלואורסצנטי, חותמות PDMS אלה, שטופלו בגלוטרלדהיד, משמשות להסרת רוב החלבון על פני השטח של הכיסוי, ומותירות אחריהן רק את התבנית הרצויה של נקודות שנקבעו מראש על ידי מיקום החורים בגודל מיקרון על החותמת. שינוי זה מגדיל את שיעור ההצלחה ביצירת תבניות המורכבות מרשת כמעט רציפה של נקודות וביצירת איים מבודדים של נקודות באמצעות צעד אחד בלבד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. יצירת מאסטרים של סיליקון

הערה: רוב התהליך של העיצוב, היצירה ופתרון הבעיות של מאסטרים של סיליקון עבור יציקה חוזרת ונשנית של חותמות PDMS כוסה בעבר21, כך שרק הבדלים מרכזיים בגישה חדשה זו יתוארו כאן.

  1. צור את העיצוב עבור מסיכת הצילום באמצעות AutoCAD או תוכנת עיצוב דומה. מצפים צד אחד של מסכת הצילום, חתיכת זכוכית דקה, בשכבה דקה של כרום כדי לשלוט בפיזור אורות UV. עצבו את מסכת הצילום כך שאור UV בוהק דרכה אל הפוטורסיסט שנבחר ייצור מאסטר סיליקון עם ההופכי של התכונות הרצויות על חותמות ה-PDMS הסופיות. ראו איור 1 לעיצוב המסכה הזו.
    הערה: השאלה אם התכונות הרצויות או האזור שמחוץ להן צריכים להיות שקופים במסכת הצילום תלויה בפוטורסיסט שנבחר. הפוטורסיסט המשמש כאן הוא SU-8 2005 (זהירות: דליק, עור ומגרה את העין; התרחקו מחום/להבות/ניצוצות והשתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול), פוטורסיסט שלילי המסוגל ליצור תכונות בגובה 5 מיקרומטר עם דפנות צדדיות כמעט אנכיות.
    1. לרפא את הפוטורסיסט השלילי על ידי חשיפתו לאור UV והסרת SU-8 הלא מרוסן עם ממס כימי. לכן, עצבו את המאפיינים העיקריים של המסכה כך שיהיו שקופים בזמן שהסביבה של המסכה אטומה.
    2. עבור שיטת ההסרה החדשה הזו, עצבו את מסיכת הצילום כך שתורכב משני ריבועים בגודל 1.5 על 1.5 ס"מ (איור 1A), אחד מלא ברשת אחידה של 2 μm circles במרווחים של 6 מיקרומטר ממרכז למרכז, והשני מורכב מאיים מרובעים רבים שהם גרסאות קטנות ומבודדות יותר של אותה תבנית רשת (איור 1B). צור איים בגדלים הבאים: 6 x 6 נקודות, 12 x 12 נקודות, 25 x 25 נקודות ו- 42 x 42 נקודות.
      הערה: קוטר נקודות ההדבקה (2 מיקרומטר) נבחר על סמך מחקרים קודמים שמדדו את כוחות המתיחה התאית22,23. המסכה המשמשת כאן היא 101.6 x 101.6 מ"מ והיא מצופה בצד אחד בשכבת כרום בעובי 0.06 מיקרומטר, המומלצת בגלל התכונות הקטנות של המאסטר. מסכת הצילום המשמשת כאן הוזמנה מחברת הדפסת מסכות צילום חיצונית.
  2. בתוך חדר נקי, מצפים את פרוסת הסיליקון שנבחרה באופן שווה עם פוטורסיסט. כצעד אופציונלי, טפלו על פני השטח בוופל בפלסמה אשר לפני שציפו אותה בהתנגדות.
    הערה: כאן נעשה שימוש בוופלים בקוטר 100 מ"מ. טיפול בפלזמה אשר הופך את הוופל לנוח יותר לקשירה ל- SU-8 ומסייע במניעת הפחתה של SU-8 מהופל.
  3. בצע את השלבים הבאים בהתאם להוראות יצרן הפוטורסיסט:
    1. סובבו את הוופל המצופה כדי ליצור את עובי התכונה הרצוי, תוך שינוי זמן הסיבוב בהתאם לעובי הרצוי ולסוג ההתנגדות. עבור SU-8 2005 בעובי 5 מיקרומטר, חלק את תוכנית הספין המומלצת לשלושת השלבים הבאים:
      1. ציפו את הוופל בפוטורסיסט על ידי סיבוב ב-500 סל"ד במשך 10 שניות עם רמפה של 100 סל"ד לשנייה.
      2. הפחיתו את עובי ההתנגדות לכ-5 מיקרומטר על ידי סיבוב הוופל ב-3,000 סל"ד עם רמפה של 300 סל"ד לשנייה למשך 30 שניות.
      3. האטו באיטיות את הוופל לאחר הסיבוב על ידי הפחתת המהירות ל-0 סל"ד עם רמפה של 500 סל"ד לשנייה למשך שנייה אחת.
    2. הכינו את ההתנגדות לחשיפה לקרינת UV על ידי אפייתו לזמן קצר על צלחת חמה של 95 מעלות צלזיוס. לשנות את הזמן בילה על הלוח החם בהתאם לעובי הרצוי של ההתנגדות; זמן האפייה הוא 2 דקות עבור SU-8 בעובי 5 מיקרומטר 2005.
    3. חשוף את ההתנגדות לאור UV כדי לרפא באופן מלא את התכונות הרצויות. היזהר מחשיפת יתר, מכיוון שזה יכול להפוך את SU-8 לשברירי ולהשפיע על האיכות הכוללת של המאסטר המתקבל.
      1. השתמש באנרגיית חשיפה של 105 mJ/cm2 עבור SU-8 2 בעובי 5 מיקרומטר 2005. בהתבסס על ההספק של מנורת ה- UV הזמינה, חשב את זמן החשיפה על ידי חלוקת אנרגיית החשיפה בעוצמת המנורה ב- mW.
        הערה: מכיוון שלמנורה המשמשת כאן יש הספק של 8 mW, זמן החשיפה צריך להיות 13.1 שניות.
    4. כדי להגדיר את התכונות SU-8 לאחר הפיתוח, יש לאפות שוב על פלטה חמה של 95 מעלות צלזיוס, הפעם למשך 3 דקות. המתן עד שתכונות הרצויות של המאסטר יופיעו תוך דקה אחת במהלך שלב אפייה זה אם ההתנגדות נחשפה כראוי.
    5. הסר SU-8 לא מרוסק מתוך פרוסת הסיליקון באמצעות מפתח SU-8. היו יסודיים בעת הסרת ה-SU-8 הלא מחוספס, מכיוון שהוא עלול להיתקע בין התכונות בגודל מיקרון ובמרווחים על הוופל.
      אזהרה: מפתח SU-8 הוא מגרה עור ועיניים דליק; הרחיקו אותו מחום/להבות/ניצוצות והשתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו.
    6. לאחר הפיתוח, יש לשטוף עם אצטון כדי להסיר מפתח עודף על הוופל ולייבש אותו לחלוטין עם אקדח ריסוס חנקן.
      אזהרה: אצטון הוא עור דליק ומגרה את העיניים; הרחיקו אותו מלהבות/ניצוצות והשתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו.
    7. לחלופין, עבור SU-8 2005, יש לאפות על צלחת חמה של 200 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      הערה: אפייה קשה זו מוסיפה חוזק מכני לפוטורסיסט.
  4. לאחר שהורשו להתקרר, הכניסו את הוופל למגש מנשא פרוסות ואז הטילו אותו ב-PDMS. ראשית, השלם טיפול סילאניזציה על הוופל כדי להפוך את תכונות SU-8 של מאסטר הסיליקון פחות סביר להיקשר PDMS ולכן פחות סביר להסיר את פני השטח של הוופל.
    1. כדי להשלים את הטיפול במשטח הסילאניזציה, הניחו את המאסטר ואת מכסה הזכוכית הקטנה בתוך מייבש המיועד לשימוש עם סילאנים בלבד. מניחים 1-2 טיפות קטנות של טריכלורו (1H,1H,2H,2H,2H-perfluorooctyl)silane על הכיסוי, סוגרים את המפרק ומפעילים אותו תחת ואקום למשך 30 דקות בלחץ של 4,500 Pa24.
      זהירות: טריכלורו (1H,1H,2H,2H,2H-perfluorooctyl)סילאן הוא עור דליק ומגרה את העיניים; הרחיקו אותו מחום/להבות/ניצוצות, השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול, ועבדו מתחת למכסה אדים.
    2. כבו את הוואקום והשאירו את המאסטר וכיסוי במייבש למשך 30 דקות נוספות.
      הערה: המאסטר מוכן כעת לליהוק ב- PDMS.

2. הדפסה זעירה תת-קרקעית

  1. ערבב PDMS ביחס הנכון של חומר ריפוי לבסיס בהתבסס על הוראות היצרן. תן לו לשבת בטמפרטורת החדר ולחץ במשך 15 דקות; לאחר מכן, דגה תחת ואקום במשך 15 דקות.
  2. שפכו את ה-PDMS לתוך המאסטר והכניסו אותו לחממה שנקבעה ל-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לרפא.
  3. הסר את המאסטר מהאינקובטור ואפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר.
  4. בזמן שהמאסטר מתקרר, sonicate כיסויים 25 מ"מ באתנול במשך 10 דקות. השתמש בכיסויים רבים כמו מספר הבולים המוכנים.
  5. יש לשטוף היטב כיסויים בקוטר 25 מ"מ במים שעברו דה-יוניזציה (DI) ויבשו באמצעות אקדח אוויר מסונן.
  6. פלזמה מטפלת בכיסויים למשך דקה אחת באמצעות שואב פלזמה תחת ואקום בעוצמה גבוהה (תדר רדיו של 30 W). הקפידו לשחרר את הוואקום באיטיות לאחר הטיפול כדי למנוע מהכיסויים לנוע בתוך התא.
    הערה: טיפול פלזמה במשטח הזכוכית משרת שתי מטרות: הוא מנקה את פני השטח של הזכוכית כדי להסיר מזהמים ומייצר קבוצות קוטביות מבוססות חמצן על פני השטח של הזכוכית כדי להפוך אותה להידרופובית25. הידרופוביות זו הופכת את פני השטח של הזכוכית ליותר נוחים לקשירת חלבונים.
  7. בחדר נטול תאורת שמש/תקורה ישירה, מצפים כל כיסוי ב-100 μL של תמיסת חלבון עם תווית פלואורסצנטית בריכוז של לפחות 100 מיקרוגרם/מ"ל, מכסים להגנה נוספת מפני אור ומניחים לו לשבת במשך 20 דקות.
    הערה: כאן נעשה שימוש בפיברונקטין שבודד מפלזמה אנושית וצבוע ב-AlexaFluor 488.
    1. כדי לצבוע פיברונקטין, שלבו פיברונקטין ללא תווית של ריכוז ונפח ידועים עם הכמות המתאימה של צבע פלואורסצנטי בצינור של 1.5 מ"ל. מכסים את הצינור בנייר אלומיניום כדי להגן על הצבע מפני אור ומדגרים אותו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, תוך ערבוב עדין כל 10 דקות על ידי הפיכת הצינור הפוך 5-10 פעמים.
      הערה: כמות הצבע הנדרשת משתנה בהתאם לצבע שבו נעשה שימוש ומסת החלבון שבה נעשה שימוש. ראה קובץ משלים 1 למחשבון המשמש לקביעת כמות הצבע המתאימה לפיברונקטין המסומן באלקסה 488. על פי הוראות היצרן, ניתן לסנן צבע עודף באמצעות שימוש בעמודות התפלה (ראו טבלת חומרים).
  8. יש לשטוף כל כיסוי ביסודיות במי DI, ולהסיר את עודפי המים מהמשטח על ידי הקשה עדינה על דפנות כל כיסוי על מגבת נייר או על חומר סופג באופן דומה. השאירו את הכיסויים חשופים בחושך למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר להם להתייבש לחלוטין.
  9. בזמן שהכיסויים המצופים בחלבון מתייבשים, הסירו את חותמת ה-PDMS מהמאסטר על ידי חיתוך שלה עם אזמל או להב חד אחר.
    הערה: עדיף לא לנסות לחתוך את ה- PDMS בניסיון הראשון, שכן הפעלת לחץ רב כל כך תפצח את פרוסת הסיליקון ותפגע במאסטר.
  10. פלזמה מטפלת בחותמות PDMS במשך 2 דקות תחת ואקום על גבוה (הספק תדר רדיו של 30 W).
  11. בתוך מכסה אדים, מניחים את הבולים במיכל עם מכסה ומצפים כל בול בשכבה דקה מאוד (<100 μL) של 10% (3-אמינופרופיל)טרימתוקסיסיליאן (3-APTMS) מדולל ב-100% אתנול.
    אזהרה: 3-APTMS הוא מגרה עור ועיניים דליק; הרחיקו אותו מלהבות/ניצוצות, השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול, ועבדו מתחת למכסה אדים. ציפוי מוגזם של תמיסת 3-APTMS יגרום להיווצרות סרט כתום בהמשך תהליך זה. טיפול זה במשטח 3-APTMS משלב את פונקציונליות האמין על פני השטח של חותמת PDMS, מה שיאפשר גזירה נוספת של פני השטח של הבול בהמשך26.
  12. מכסים את המיכל בבולים ומאפשרים להם לשבת בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
  13. באמצעות מי DI, יש לשטוף ביסודיות כל חותמת משני הצדדים.
  14. מניחים את הבולים במיכל נקי ומצפים אותם בנדיבות ב-2.5% גלוטארלדהיד במי DI.
    אזהרה: גלוטארלדהיד רעיל; השתמש בכפפות מגן ומשקפיים בעת טיפול ועבודה מתחת למכסה אדים). טיפול זה בגלוטארלדהיד לצד הטיפול הקודם של 3-APTMS מספק פונקציונליות של אלדהיד על פני השטח של בולי ה-PDMS, שיכולים להגיב עם קבוצות האמין בחלבונים כדי ליצור קישור אמין משני, שהוא קריטי לתהליך הסרת החלבון27.
  15. מכסים את הבולים, מניחים להם לשבת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ואז שוטפים היטב במי DI שוב. מוציאים עודפי מים מפני השטח של הבולים באותו אופן כמו הכיסויים, ומאפשרים לבולים להתייבש חשופים במשך כ-30 דקות.
  16. לאחר 30 דקות, בדקו אם גם הכיסויים המצופה בחלבון וגם הבולים יבשים. אם אחד מהם אינו יבש לחלוטין, השתמש באקדח אוויר מסונן כדי לייבש אותם לחלוטין, כדי לוודא שהכיסויים אינם חשופים לאור למשך תקופה ממושכת.
  17. לאחר שגם הכיסויים וגם הבולים יבשים, דחפו את תבנית הבולים לצד כלפי מטה אל הכיסויים בלחץ מספיק, כך שהבולים יבואו במגע מלא עם פני השטח של הכיסוי. השאירו את הבולים במגע עם הכיסויים למשך 15 דקות.
    הערה: בשל קשר האמיד הקוולנטי בין חותמת הגלוטרלדהיד עם שכבת החלבון על כיסוי הזכוכית - שהיא חזקה בהרבה מהאינטראקציות ההידרופוביות החלשות בין שכבת החלבון לכיסוי הזכוכית - החלבונים צריכים לקלף את הזכוכית בהתאם לתבנית שעל חותמת ה- PDMS לאחר הסרתה.
  18. לאחר 15 דקות, קלפו בזהירות את חותמות ה-PDMS מהכיסויים.
    הערה: אם תהליך ההסרה עבד כראוי, הבולים לא צריכים לרדת מהכיסויים ללא התנגדות, אלא גם לא צריכים להיות דבוקים כל כך חזק לכיסויים שלא ניתן להסיר אותם ללא כוח מופרז.
  19. בדקו את הנאמנות של הכיסויים המעוצבים באמצעות המסנן המתאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי (תלוי באיזה צבע פלואורסצנטי מסומנים החלבונים).
  20. השתמשו מיד בכיסויים המעוצבים או שמרו ואחסנו אותם הרחק מאור ישיר.

3. כיסויים מופעלים

הערה: הכיסויים התחתונים לשימוש בתא הניסוי עבור ג'לים PAA מיוצרים בשלב זה. כיסוי תחתון זה מטופל במיוחד כדי לאפשר לג'ל PAA להישאר דבוק היטב כאשר הכיסוי בעל הדוגמאות העליונות מוסר במהלך תהליך הדוגמה. טכניקות דומות מתוארות גם במקומות אחרים 10,12,15,28.

  1. Sonicate 30 מ"מ מכסה כיסויים ב 100% אתנול במשך 10 דקות, לשטוף עם מים DI, ולאחר מכן יבש ביסודיות עם אקדח אוויר מסונן. הכן עד 6 כיסויים בכל פעם לכל אצווה בצלחת של 6 בארות.
  2. פלזמה מטפלת בכיסויים למשך דקה אחת על גבי תדר רדיו גבוה (הספק תדר רדיו של 30 W) ולאחר מכן מניחה כל כיסוי לתוך באר של צלחת 6 באר.
  3. מצפים כל מכסה בשכבה דקה מאוד של 5% APTMS באתנול במכסה אדים.
    הערה: שאריות תפוזים ייווצרו במקרה של ציפוי מוגזם בתהליך זה.
  4. מכסים את הצלחת בת 6 הבארות ומניחים לכיסויים לשבת במשך 5 דקות.
  5. יש לשטוף את הכיסויים (משני הצדדים) ואת החלק הפנימי של כל באר ביסודיות במי DI ולהסיר מים עודפים בתוך הבארות.
  6. מניחים את הכיסויים בחזרה בלוח בעל 6 הבארות ומוסיפים כ-2 מ"ל של 0.5% גלוטארלדהיד במי DI.
  7. מכסים את צלחת 6 הבארות ומניחים לכיסויים לשבת בתמיסת הגלוטראלדהיד למשך 30 דקות; לאחר מכן, לשטוף ביסודיות הן את הכיסויים והן את הבארות של כל צלחת עם מי DI.
  8. אחסנו את הכיסויים המטופלים במי DI בתוך לוחות 6 הבארות למשך עד שבועיים או השתמשו בהם באופן מיידי. ודאו שהכיסויים יבשים לחלוטין לפני השימוש.

4. ייצור ג'ל PAA והעברת דוגמאות

הערה: לאחר יצירת כיסויים בתבנית, יש להשתמש בהם כדי להעביר את תבניות החלבונים הללו להידרוג'ל PAA זמן קצר לאחר מכן (<24 שעות)1,29,30. המתכון הבא הוא לג'ל PAA עם מודולוס יאנג של 3.6 kPa. ניתן לגוון את הכמויות של ביס-אקרילאמיד, אקרילאמיד ומי DI כדי להתאים את הנוקשות של ג'לים PAA12.

  1. רגע לפני שתתחילו לייצר את מבשר ההידרוג'ל PAA, הסירו את החומצה האקרילית N-hydroxysuccinimide (NHS) -אסטר מהמקרר כדי שתוכל להגיע לטמפרטורת החדר לפני פתיחתה. הכינו צלחת כיסוי להחלפה על ידי עיקור שלה עם 70% אתנול ותנו לו לשבת תחת אור UV בארון בטיחות ביולוגית לפחות 30 דקות לפני השימוש.
    אזהרה: NHS הוא מגרה עור ועיניים רעיל; השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו, ועבדו מתחת למכסה אדים.
    1. הוסיפו 1.25 מ"ל של 40% אקרילאמיד במי DI לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
      אזהרה: אקרילאמיד הוא מגרה עור ועיניים רעיל; השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו, ועבדו מתחת למכסה אדים.
    2. הוסף 175 μL של תמיסת bis-acrylamide במי DI לאותו צינור (שלב 4.1.1).
      אזהרה: ביס-אקרילאמיד הוא מגרה עור ועיניים רעיל; השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו, ועבדו מתחת למכסה אדים.
    3. הוסיפו 500 μL של 10x מלח בעל מאגר פוספט (PBS).
      אזהרה: PBS הוא מגרה עיניים; השתמש בכפפות מגן ומשקפיים בעת הטיפול.
    4. הוסף 2.915 מ"ל של מי DI.
  2. Pipette 969 μL של מבשר זה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל, ולאחסן את השאר ב 4 °C (74 °F) למשך עד שבועיים.
  3. יש למדוד כ-50-100 מ"ג אמוניום פרסולפט (APS) בצינור מיקרו-צנטריפוג' אחר ולדלל אותו במי DI עד ל-100 מ"ג/מ"ל; הניחו אותו בצד לשימוש מאוחר יותר. פתחו את האסטר NHS (כעת בטמפרטורת החדר) במכסה המנוע ומדדו בזהירות עד 3 מ"ג NHS בצינור מיקרו-סנטריפוג'. דיללו את ה-NHS-ester ל-1 מ"ג/מ"ל ב-1x PBS.
    אזהרה: APS הוא מגרה עור ועיניים; השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו, ועבדו מתחת למכסה אדים. גם APS וגם NHS-ester יעברו הידרוליזה לאורך זמן, מה שיגרום לפעילות של הכימיקלים בתמיסת המלאי להשתנות. לכן, שני הפתרונות הללו חייבים להיות מוכנים טריים בכל פעם (בניגוד לשאר המבשרים).
  4. בצע את שלושת השלבים הבאים במכסה אדים:
    1. הוסיפו 2 μL של טטרה-מתיל-אתילנדיאמין (TEMED) לצינור המיקרו-צנטריפוגה המכיל את האליקוט 969 μL של מבשר PAA.
      זהירות: TEMED הוא עור דליק ומגרה את העיניים; הרחיקו אותו מחום/להבה/ניצוצות, השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול, ועבדו מתחת למכסה אדים. TEMED הוא אחד משני סוכני קישור צולבים הקריטיים לפולימריזציה של הידרוג'ל PAA, השני הוא APS.
    2. הוסף 15 μL של 1 M חומצה הידרוכלורית כדי להפחית את ה- pH של תמיסת ההידרוג'ל ולמנוע הידרוליזה של ה- NHS-ester.
      אזהרה: חומצה הידרוכלורית היא עור קורוזיבי ומגרה את העיניים; השתמשו בכפפות מגן ובמשקפיים בעת הטיפול בו, ועבדו מתחת למכסה אדים.
    3. הוסף 10 μL של פתרון NHS-ester לצינור.
      הערה: ה- NHS הוא קריטי לתהליך התבנית. הוא יגיב עם קבוצות אמינים בחלבונים על הכיסוי המעוצב כדי ליצור קשר אמידים יציב, שיאפשר להעביר את התבנית מכיסוי הזכוכית אל פני השטח של ג'ל PAA תוך כדי פולימריזציה של31.
  5. בצע את השלבים האחרונים הבאים בארון בטיחות ביולוגית:
    1. יש למקם בזהירות את מכסה ה-30 מ"מ בתוך החלק המתכתי של ערכת הכלים לכיסויים (3-APTMS ו-glutaraldehyde-מטופלים בצד למעלה) ולהברג את טבעת הפלסטיק למעלה. הגדר את הכיסוי המעוצב כך שניתן יהיה להגיע אליו בקלות בשלב הבא, ועדיין להגן עליו מפני אור ככל האפשר.
    2. פיפטה 5 μL של תמיסת APS לתוך שאר מבשר PAA בצינור microcentrifuge, להפוך אותו כדי לערבב, ולאחר מכן מיד pipette 35 μL של תמיסה זו על כיסוי 30 מ"מ.
    3. הורידו את הכיסויים המעוצבים לצד החלבון אל התמיסה, תוך היזהרו שלא ליצור בועות אוויר בהידרוג'ל. הגן על ההידרוג'ל מפני אור ואפשר לו להתפלמר במשך 90 דקות.
    4. לאחר שההידרוג'ל עבר פולימריזציה, השתמשו בסכין גילוח או באזמל כדי להסיר את הכיסוי העליון, מה שמבטיח כי הכיסוי לא יחליק מהג'ל או ייפול בחזרה על הג'ל לאחר שהוסר, שכן הדבר יהרוס את התבנית על פני השטח של הג'ל.
      הערה: אין להשאיר את הג'ל חשוף באזור עם זרימת אוויר משמעותית (כגון ארון בטיחות ביולוגית).
    5. כדי להעביר כל NHS-ester הנותרים בהידרוג'ל, להוסיף 2 מ"ל של PBS סטרילי לג'ל ולדגירה ב 37 °C (76 °F) למשך 45 דקות. מכינים מיד את הג'לים לניסויים או מאחסנים אותם למשך הלילה ב-PBS סטרילי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

5. הדמיה

  1. כדי להתכונן לניסויים עם תאים, הפעילו את החום (37 מעלות צלזיוס) והלחות (70%) במיקרוסקופ אחר הצהריים לפני ניסוי מתוכנן כדי לאפשר לציוד שבתוך תא המיקרוסקופ להתיישב לטמפרטורה הגבוהה יותר.
    הערה: שלב זה ממזער את סחף z הנגרם על ידי תנודות טמפרטורה.
  2. רגע לפני תחילת הניסוי, הפעילו את מקור ה-CO2 של החדר.
  3. כדי למנוע סחף x-y הנגרם על ידי תנועה חוזרת ונשנית של שלב המיקרוסקופ במהלך הניסוי, תקן את ערכת הכלים הניתנת להחלפה המכסה את ההידרוג'ל שנזרע בתא לשלב עם סרט הדבקה דו-צדדי.
  4. הסתכלו על הג'ל כדי למצוא מסגרות מעניינות לתמונה, ושמרו על כל מיקום שלב של המקטעים שיש להצטלם.
  5. הן בתצוגת שדה הבהיר והן במבט הפלואורסצנטי המתאים לחלבון המסומן, הגדר את תוכנת המיקרוסקופ לצלם כל מסגרת אחת ל-5 דקות במשך 2 שעות.

6. ניתוח תמונות

הערה: פותחה מערכת שיכולה למדוד את העיוות של ג'ל ה-PAA המעוצב על ידי קביעת המיקום של נקודות המתיחה, אינטרפולציה של המיקומים ההתחלתיים של הנקודות המעוותות, ולאחר מכן חישוב כוחות המתיחה התאית בכל מיקום. ניתן להשתמש בכל מערכת תוכנה המסוגלת לבצע עיבוד תמונה וחישובים מספריים. התוכנית שואפת לקבוע כוחות אחיזה במהירות, תוך ביטול קלט משתמש והליכי עיבוד מקדים שיתרמו לשגיאות הקשורות למשתמש. הקוד המשמש כאן זמין כאן כקבצים משלימים 2-10, וניתן לגשת לקבצים אלה, יחד עם זוג תמונות תרגול, www.bu.edu/mml/downloads.

  1. בתוכנת עיבוד תמונה, פתח את כל התמונות הבודדות שצולמו במהלך ניסוי בהילוך מהיר מכל תצוגת מיקרוסקופ שנעשה בה שימוש לפי הסדר, מהתמונה הראשונה ועד האחרונה שצולמה, והפוך אותן לערימת תמונות בודדת (לחיצה על תמונה | ערימות | תמונות לערימה). ודא שיש שתי ערימות תמונה נפרדות: אחת מתצוגת השדה הבהיר של התאים ואחת מהתצוגה הפלואורסצנטית של התבנית שאליה הם מחוברים.
    1. אם יש סחיפה בתמונות הפלורסנטיות (כלומר, האי המעניין נע בכיוון x ו/או y בין כל פריים על ידי >1-2 מיקרומטר), תחילה לעבד את ערימת התמונות עם תוסף StackReg (P. Thévenaz, המכון הפדרלי השווייצרי לטכנולוגיה בלוזאן) כדי לעדכן כל תמונה בערימה בהתבסס על המיקום של הראשונה (לחיצה על תוספים | סטאקרג | תרגום | בסדר).
      הערה: זה קריטי מכיוון שאפילו סחף תת-מיקרומטר יכול להשפיע באופן משמעותי על החישוב הסופי של כוחות המתיחה, במיוחד בג'לים נוקשים יותר שבהם סחף x-y זה נמצא מחוץ לטווח הרעש הצפוי. קוד זה ישמור את התמונות לאחר הסרת הסחף, ולאחר מכן ניתן להפוך אותן לערימת תמונות חדשה לניתוח.
  2. הזן את ערימות התמונות הבהירות והפלורסנטיות לתוך CTFTimelapse.m (קובץ משלים 2).
    1. ציין את ספריית הקבצים שבה ערימות התמונות ממוקמות בשורה 7.
    2. בשורות 8 ו-9, ציין את השמות של ערימת התמונות הפלואורסצנטיות ואת הערימה הפלואורסצנטית המתאימה בשדה בהיר, בהתאמה.
    3. ציין נוקשות ג'ל PAA (Pa):
      1. בשורות 11-14, הכוללות כמה מודולים אלסטיים שונים של הידרוג'לים PAA המשמשים לרוב, ציין (סוג % בתחילת הקו) את כל המודולוסים האלסטיים של הג'ל בתמונות המנותחות. לחלופין, הוסף את המודולוס האלסטי אם עדיין לא קיים וציין את השאר (3658.19 Pa לתמונות בדיקה).
    4. ציין רדיוס נקודה (m) בשורה 15 (1 × 10-6 מ' עבור תמונות בדיקה).
    5. ציין את קוטר הנקודות המרבי האפשרי (μm) בשורה 16 (2.5 מיקרומטר לתמונות בדיקה).
    6. ציון יחס פיקסלים (μm/pixel):
      1. בשורות 17-20, הכוללות כמה יחסי פיקסלים שונים בתמונה המבוססים על הגדרות הדמיה ששימשו בעבר, ציין (type % בתחילת השורה) את כל התמונות המנותחות מלבד יחס הפיקסלים. לחלופין, הוסף את יחס הפיקסלים שבו נעשה שימוש אם עדיין לא קיים וציין את השאר (0.1613 μm/pixel עבור תמונות בדיקה).
    7. בשורות 35 ו- 87, ציין את ספריית הקבצים היכן נמצאים קבצי עיבוד התמונה הדרושים.
      הערה: מתוך ערימת התמונות הפלואורסצנטיות, הקוד קובע את המיקום של כל נקודה פלואורסצנטית ועוקב אחר התנועה של כל נקודה בין כל תמונה בערימה20. המיקום הראשוני של הנקודות המודפסות במיקרו-קונטיקט ידוע משום שהן אינן מתעוותות כאשר הן מועברות כראוי להידרוג'ל32.
  3. המתן עד ששתי דמויות ותיבת דו-שיח אחת יופיעו ברגע שהתוכנית תמצא את הנקודות. השתמש באיור 1 כדי לוודא שהתוכנית מצאה את הנקודות הנכונות ולא מצאה נקודות רבות שבהן לא היו כאלה. השתמשו באיור 2 כדי לבחור את הרשת המלבנית שעוזרת לתוכנית לאתר ולחשב את כוחות המתיחה של התאים.
    הערה: איור 1 הוא תמונת השדה הבהיר של התא, כאשר הנקודות שנמצאו על-ידי התוכנה (שיהיו אדומות) מכוסות מעליו (ראו איור 3A). איור 2 הוא תמונה המציגה את אותן נקודות המוצגות באיור 1 , אך ללא תמונת השדה הבהיר ברקע.
    1. המתן עד שתיבת הדו-שיח תבקש ללחוץ על Enter לאחר בחירת נקודה - כאשר כל נקודה היא אחת מהנקודות האדומות שנמצאו על-ידי התוכנית - ובתוכו יש לחצן אחד גדול שכותרתו Enter.
    2. בחרו ארבע נקודות שונות באיור 2 כדי ליצור רשת מלבנית מסביב ולכלול את התא/אשכול בתבנית זו. בחר כל נקודה בזו אחר נקודה בלחיצה שמאלית על העכבר ואשר אותה על-ידי לחיצה על Enter בכפתור בתיבת הדו-שיח הנ"ל. תספור כמה נקודות נמצאות בין הנקודה הראשונה לשנייה, כמו גם הנקודה הראשונה והשלישית, מכיוון שהתוכנית תבקש ערכים אלה לאחר שכל הנקודות בארבע הפינות נבחרו. הזן ערכים אלה בחלון הפקודה (הקלד את מספר הנקודות ולחץ על לחצן Enter במקלדת כאשר תתבקש לעשות זאת).
  4. לאחר בחירת הרשת המלבנית, המתן עד שהסקריפט יחשב את כוחות המתיחה שהוא מוצא ברשת בהתבסס על מיקומי הנקודות הפלורסנטיות. שים לב שהסקריפט מוצא תחילה את וקטור התזוזה (u) של המרכז הגיאומטרי של כל נקודה ולאחר מכן מחשב את וקטור כוח המתיחה המתאים (F) באמצעות Eq (1):
    Equation 1(1)
    כאשר E הוא מודולוס יאנג של מצע PAA, a הוא הרדיוס של סמני הנקודות הפלואורסצנטיות, ו-ν הוא היחס של פואסון למצע PAA32. Eq (1) מניח שהמצע הוא חצי מרחב אלסטי אינסופי, שכוחות המתיחה מופעלים במרכז כל סמן נקודה עגול, ושהריווח בין סמני הנקודות גדול מספיק כדי שהתזוזות שלהם לא יתקשרו זו עם זו23.
    הערה: בניסויים המתוארים כאן, נעשה שימוש בסמני נקודות של רדיוס a = 1 μm ו- 6 μm מרכז למרכז ריווח. חצים של כוח מתיחה בתוך התא/צביר המצביעים פנימה לכיוון מרכז התא צריכים להיות נוכחים, בעוד שבאזור שמחוץ לתא/צביר לא אמורים להיות חצי מתיחה נוכחים (ראו איור 3C-E). חצי מתיחה המצביעים החוצה מתוך התא/אשכול או חצים גדולים רבים הנמצאים מחוץ לתא מעידים על רשת מלבנית שנבחרה בצורה גרועה.
  5. לאחר מציאת שדה המתיחה הנכון, בחר אזור עניין מתאים (ROI) המקיף את התא/אשכול, הכולל את כל חצי המתיחה בתוך התא באמצעות הסמן.
    1. כדי למשוך את ההחזר על ההשקעה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כמה פעמים שצריך כדי לצייר צורת מצולע עם כמה צדדים רצויים, התאם את הצורה או הזז את ההחזר על ההשקעה לאחר שצויר על-ידי לחיצה שמאלית על הפינות או הקצוות, בהתאמה. לאחר ציור ההחזר על ההשקעה, לחץ פעמיים באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לעבור לתמונה הבאה בערימה. חזור על פעולה זו עבור כל התמונות בערימת Brightfield.
      הערה: הקוד יחסוך נתוני כוח מתיחה ותזוזה עבור כל נקודת זמן באותה תיקיה כמו ערימות התמונות המקוריות, ולאחר מכן ניתן לנתח אותם עוד יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הידרוג'לים של PAA עם המודולוס של יאנג של E = 3.6 kPa והיחס של פואסון של ν = 0.445 נעשו לשימוש על ידי שיטת מיקרו-פטרינג תת-קרקעית זו. ההידרוג'לים יוצרו בעובי של כ-100 מיקרומטר, מה שמאפשר להם להיות מצטלם עם מערך ההדמיה שבו נעשה שימוש כאן, תוך מניעת חדירת התאים לכיסוי הנוקשה שמתחת לג'ל, מה שיגרום לבעיות במחקרים המתמקדים בחישת קשיחות תאית23,33. ג'לים של רמות נוקשות רבות אחרות (עד 30 kPa) נעשו בהצלחה והצטלמו באמצעות שיטת המיקרו-פטרנינג העקיפה34, כך שהשיטה אינה מוגבלת לשימוש בהידרוג'לים של 3.6 kPa בלבד. הכיסויים מטופלים מראש עם גלוטראלדהיד כדי לאפשר לג'ל להישאר מקובע לכיסוי התחתון כאשר מסירים את הכיסויים המעוצבים העליונים (איור 2C,D).

כדי לדמיין ולמדוד את כוחות המתיחה התאית בתוך אשכולות, ההידרוג'לים של 3.6 kPa עוצבו בעקיפין עם פיברונקטין פלואורסצנטי (איור 2A-D) כדי ליצור תבניות איים בגודל ובצורה שנקבעו מראש (איור 2E). ניתן גם לדפוס סוגים אחרים של חלבונים על ההידרוג'לים הרכים האלה 21,35,36,37,38. איכות התבנית המועברת קשורה ישירות לנאמנות של התבנית הראשית שממנה יצוקה חותמת PDMS. עובשים שעברו דלמינציה של SU-8 יראו הידרדרות באיכות התבניות העשויות מבלמים יצוקים מתבניות דלמינציה אלה. לדוגמה, תבניות עם SU-8 שעבר דלמינציה ייצרו לעתים קרובות מיקרו-פטרנים המכילים חלקים של פיברונקטין לא מפוטר בין האיים שנקבעו מראש. אם יצוקים על ג'ל, תבניות אלה מאפשרות חיבור תאים לג'ל באזורים שמחוץ למיקרופטרן האי. מסיבה זו, צבירי תאי הדמיה המחוברים לדפוסי איים שלמים באופן מלא או בעיקר היו בראש סדר העדיפויות.

תאי שריר חלקים של כלי דם בקר (BVSMCs) נזרעו על הידרוג'לים אלה בצפיפות של כ-60-80 ×-103 תאים/ג'ל כדי לקדם היווצרות אשכולות והותר להם להיצמד במשך 18-24 שעות לפני ההדמיה. רגע לפני הניסויים, התאים הוכתמו בכתם גרעין של תאים חיים כדי לאפשר זיהוי של תאים חיים ולקבוע את מספר התאים בכל אשכול. איי מיקרופטרן עם ובלי תאים צולמו ונותחו. הדמיה של איים ללא תאים אפשרה את חישוב הרעש הקיים בחישובי כוח המתיחה עבור ג'לים של 3.6 kPa. לאחר מכן ניתן להשתמש במדידות תזוזה חיוביות כוזבות אלה כדי לקבוע ערך סף מתאים שמתחתיו יש לכלול תזוזות.

נמצא כי 0.3 מיקרומטר מספיק בדרך כלל כדי למנוע בגידה בדפוסים שמובילה למדידות תזוזה חיוביות כוזבות. פעולה זו עלולה לגרום לאובדן אחיזות בעוצמה נמוכה, אך היא חיונית להסרת מתיחה חיובית כוזבת. בעת ההדמיה, צבירי תאים על תבניות איים שלמות ברובן קיבלו עדיפות (כלומר, כאלה שלא חסרות הרבה נקודות אם בכלל) ובעיקר תבניות שלמות ללא תאים. כל החזר השקעה צולם פעם ב-5 דקות למשך שעתיים. המיקרוסקופ ששימש ללכידת תמונות של שני התאים ושל ג'ל ה-PAA המעוצב במהלך ניסויי חלוף זמן ממושכים היה מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם שלב אוטומטי, מקור אור פלואורסצנטי, מצלמה ותוכנת מיקרוסקופ סטנדרטית. למיקרוסקופ זה יש מערכת מסננים מותאמת אישית לצפייה בצבעים רבים ושונים של פלואורסצנציה. המטרה המשמשת להצגת התאים וההידרוג'ל המעוצב היא מטרת טבילת מים פי 40, NA = 1.15. מיקרוסקופ זה מצויד גם בטמפרטורה מותאמת אישית (37 מעלות צלזיוס) - לחות (70%)- ומערכת CO2 (5%) מווסתת כדי לשמור על תאים בני קיימא במהלך ניסויים ארוכים.

כדי לחשב את כוחות המתיחה מהתמונות של איי המיקרו-פטרן, נעשה שימוש בתוכנת ניתוח תמונות כדי לעקוב אחר התזוזות של נקודות הפיברונקטין הפלואורסצנטיות לאורך זמן. בהכירה את התזוזות של הנקודות הפלורסנטיות ואת הנוקשות של ג'ל ה-PAA שעליו מעוצבות הנקודות, התוכנית יכולה לקבוע את הערכים של כוחות המתיחה המוקנים הן על ידי תאים בודדים והן על ידי אשכולות על מצע ה-PAA. עם זאת, ישנן שתי דרכים שבהן התוכנית הופכת להיות מסוגלת לקבוע ערכי אחיזה. אם יותר מדי נקודות בתוך מסגרת עניין נתונה מעוותות, התוכנית מתקשה לחשב כוחות, מכיוון שהתוכנית מסתמכת על רוב הנקודות בתמונה מנותחת כדי להיות לא מעוותות. יתר על כן, אם שתי נקודות קרובות מדי זו לזו (מרחק ממרכז למרכז של ≤2 מיקרומטר20), התזוזות של הנקודות הבודדות עלולות להפריע זו לזו, מה שמונע קביעה מדויקת של ערכי התזוזה האמיתיים שלהן ובכך את ערכי המתיחה שלהן. כל עוד המיקרו-פטרנים מתוכננים עם נקודות מרווחות היטב זו מזו, תאים לא אמורים להיות מסוגלים לעקור את הנקודות עד כדי כך שהם הופכים להיות קרובים כל כך זה לזה, אפילו על מצעים רכים יותר.

איור 3 מציג את היכולות של שיטת דפוס ההסרה. כאן, היכולת של שיטה זו לייצר תבניות אי מבודדות ומוגדרות היטב של צורה קבועה מראש מוצגת באיור 3B-E, שם נקודות הידבקות הפיברונקטין נמצאות רק באזור הרצוי של האי. האיים המבודדים האלה של נקודות הידבקות מאפשרים עוד יותר שליטה טובה יותר על צורת האשכול, כפי שמוצג באיור 3A. מאחר שצורתם וגודלם של האיים עקביים, צבירי התאים שמתחברים אליהם וגדלים עליהם נוטים גם הם להיות בעלי צורה עקבית, שכן תבניות האיים מגבילות את אזור גידול הצביר. לבסוף, איור 3B-E גם מראה את היכולת של האיים האלה לשמש לחישוב כוחות המתיחה התאיים ואת הנטייה של כוחות המתיחה האלה להשתנות עם הזמן. כאן, כוחות המתיחה של הצביר הם הגדולים ביותר בשולי האי. הסיבה לכך היא שלתאים בשולי אשכול יש פחות אינטראקציות עם תאים אחרים באשכול מאשר אלה שבחלק הפנימי של האשכול. לפיכך, תאים אלה בקצוות מפעילים כוחות גדולים יותר על המצע בתגובה להתכווצות השלד הציטוסקי מאשר התאים בפנים.

Figure 1
איור 1: עיצוב של מסכת צילום. (A) ייצוג של המחצית הראשונה של עיצוב מסכת הצילום המשמשת כאן, רשת בדידה של נקודות בקוטר 2 מיקרומטר במרווחים של 6 מיקרומטר ממרכז למרכז. בעוד שהתמונה המוצגת כאן היא רק חלק קטן מהעיצוב, רשת זו ממלאת רווח של 1.5 x 1.5 ס"מ בסך הכל במסכת הצילום. (ב) ייצוג של המחצית השנייה של עיצוב מסכת הצילום; מוצגים כאן שישה איים קטנים של 6 x 6 נקודות. במסכת הצילום ישנם מספר גדלי איים שונים: 6 x 6 (מוצג כאן), 12 x 12, 25 x 25 ו- 42 x 42 נקודות. מערך במרווחים שווים (50 מיקרומטר בין איים) בכל גודל אי תופס שטח של 1.5 x 0.375 ס"מ, ומערכים של איים שונים מופרדים על ידי 50 מיקרומטר. הנקודות בכל אי הן בקוטר של 2 מיקרומטר וברווחים של 6 מיקרומטר ממרכז למרכז. שני החלקים של המסכה המתוארים ב-A וב-B מופרדים ב-0.75 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הדפסה זעירה תת-קרקעית. (A) חותמת PDMS מטופלת בגלוטרלדהיד ומועברת במגע עם כיסוי זכוכית המצופה באופן שווה בתמיסת פיברונקטין פלואורסצנטית. (B) עם הסרת הכיסוי מהכיסוי, חותמת ה-PDMS מסירה את רוב הפיברונקטין הפלואורסצנטי על פני השטח של הכיסוי, ומשאירה נקודות חלבון בגודל מיקרון רק במקומות שנקבעו מראש על ידי העיצוב של חותמת ה-PDMS. (C) הכיסוי המעוצב ממוקם במגע עם פרה-פולימר PAA ופתרון NHS. (D) לאחר שהג'ל PAA הורשה לבצע פולימרזציה מלאה, מסירים את הכיסוי העליון, ותבנית של פיברונקטין מודפסת על משטח הג'ל PAA. (E) דוגמה לתבנית אי בדידה המורכבת מנקודות במרווחים שווים על הידרוג'ל PAA עם מודולוס יאנג של 3.6 kPa. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצורים: PDMS = פולידימתילסילוקסן; PAA = פוליאקרילאמיד; NHS = N-הידרוקסיסוצ'ינימיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח של תאים במיקרו-פטרנים של איים (A) מוצגת תמונה בשדה בהיר של אשכול של 3 BVSMCs על גבי מיקרו-פטרן של אי פיברונקטין פלואורסצנטי על הידרוג'ל PAA עם מודולוס יאנג של 3.6 kPa. הנקודות הן בקוטר 2 מיקרומטר ומופרדות על ידי 6 מיקרומטר מרכז למרכז. (B) התבנית הפלואורסצנטית מראה כי מספר נקודות פיברונקטין באי נעקרו עקב הפעלת כוחות על ידי ה-BVSMCs. (C) כוחות המתיחה המופעלים על נקודות ההדבקה בנקודת הזמן 1 (תחילתו של ניסוי של שעתיים). הכיוון של וקטורי כוח אלה מסומן על ידי כיוון החצים הצבעוניים. גודלם מסומן על ידי צבע החץ והערך המתאים לו בסרגל הצבע (כל ערכי הכוח הם ב-nN). האורך הווקטורי הוא יחסי בהתבסס על הכוחות המינימליים והמקסימליים המחושבים על ידי התוכנית עבור כל נקודת זמן. (D) כוחות המתיחה של אותו צביר בנקודת זמן 13 (באמצע ניסוי של 2 שעות) (E) כוחות המתיחה של אותו צביר בנקודת זמן 25 (סוף ניסוי של 2 שעות). קיצורים = BVSMCs = תאי שריר חלקים של כלי הדם בקר; PAA = פוליאקרילאמיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

קובץ משלים 1: מחשבון לסימון פיברונקטין זהו כלי לחישוב הכמות הנכונה של צבע פלואורסצנטי Alexa488 לשימוש בעת תיוג פיברונקטין. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: CTFTimelapse.m זהו קובץ עיבוד התמונה, המאפשר חישוב של כוחות המתיחה הסלולרית כמתואר בסעיף 5 (ניתוח תמונה). זה כולל בחירת רשת רצויה של נקודות (שלבים 6.3-6.3.2) ובחירת אזור העניין עבור חישובי CTF (שלבים 6.5 ו- 6.5.1). כל הקבצים המשלימים הבאים נקראים ישירות על-ידי סקריפט זה או על-ידי אחת מהפונקציות האחרות המשמשות בו. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: analyze_initial_image_4 פונקציה זו נקראת על ידי CTFTimelapse.m, ומטרתה היא לאתר וליישר את הנקודות הפלורסנטיות ברשת מהמסגרת הראשונה של ערימת התמונות של תבנית הרשת המעוותת כך שתתאים לתבנית הרשת הלא מעוותת המקורית. הדבר מאפשר חישובי כוח משיכה עבור המסגרת הראשונה במחסנית התמונות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 4: analyze_subsequent_images.מ. פונקציה זו נקראת על ידי CTFTimelapse.m, ומטרתה היא לאתר וליישר את הנקודות הפלואורסצנטיות ברשת מכל המסגרות של ערימת התמונות של תבנית הרשת המעוותת לאחר הראשונה. הדבר מאפשר חישובי כוח משיכה עבור כל המסגרות בערימת התמונות לאחר הראשונה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 5: bpass.m פונקציה זו נקראת הן על ידי analyze_initial_image_4.m והן על ידי ניתוח subsequent_images.m, ומטרתה היא ליישם מסנן bandpass בחלל אמיתי המעבד את ערימת התמונות של תבנית הרשת המעוותת. מסנן זה מדכא רעשי פיקסלים ושינויים בתמונה באורך גל ארוך תוך שמירה על מידע בגודל אופייני. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 6: CellBoundary.m פונקציה זו נקראת על ידי CTFTimelapse.m, ומטרתה היא שהיא מאפשרת למשתמש התוכנית לצייר אזור מעניין סביב התא/אשכול שעבורו יש לחשב את כוחות המתיחה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 7: pkfnd.m פונקציה זו נקראת הן על ידי analyze_initial_image_4.m והן על ידי analyze_subsequent_images.m, ומטרתה היא למצוא מקסימה מקומית בתמונה עם דיוק ברמת הפיקסל. פסגות אלה משמשות את cntrd.m כדי לאתר את תבנית הרשת הפלואורסצנטית עבור CTFTimelapse.m. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 8: cntrd.m פונקציה זו נקראת הן על ידי analyze_initial_image_4.m והן על ידי analyze_subsequent_images.m, ומטרתה היא לאתר את המרכז של נקודות בהירות בתמונה לדיוק תת-פיקסלים. זה מאפשר מיקום של תבנית הרשת הפלואורסצנטית על ידי CTFTimelaspe.m, כמתואר בשלב 6.3. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 9: FourCorners.m פונקציה זו נקראת הן על ידי analyze_initial_image_4.m והן על ידי analyze_subsequent_images.m, ומטרתה היא לקחת את הרשת שנבחרה על ידי המשתמש (שלבים 6.3-6.3.2) ולחשב את המרחק בין כל נקודה בפינה בשני צירים אורתוגונליים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 10: track.m פונקציה זו נקראת הן על ידי analyze_initial_image_4.m והן על ידי analyze_subsequent_images.m, ומטרתה היא לעקוב אחר תנועת הנקודות בתבנית הרשת הפלואורסצנטית בין המסגרות, החיונית לחישוב כוחות המתיחה המתאימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטה משופרת לדפוס עקיף של הידרוג'לים של PAA מתוארת במאמר זה. גישה זו מתבססת על שיטות ששימשו בעבר 20,35,36,37,38,39,40,41,42. השינוי העיקרי הוא שחותמות PDMS משמשות כיום להסרת חלבון ולהשארת התבנית הרצויה מאחור על מצע הביניים במקום להטביע את התבנית ישירות עליהן. זה מאפשר יצירה הרבה יותר עקבית של מיקרו-פטרנים בעלי נאמנות גבוהה ויצירת איים מיקרו-פטריים מבודדים שבעבר הצריכו שני שלבי ייצור. הצורה והגודל של תבניות האי שנעשו בשיטה זו נשלטים בקלות רבה יותר מאלו שנעשו בשיטת שני השלבים הקודמת. הטכניקה החדשה פחות רגישה לכמות הלחץ המופעלת במהלך מיקרו-הדפסה מאשר הטכניקה הישנה. יתרון שני הוא ששיטת הסרה זו יכולה להפוך את תבניות האי לצורה וגודל מבוקרים בצעד אחד בלבד. לעומת זאת, שיטות קודמות דרשו שני שלבים ליצירת איים, כולל הטבעה לתצהיר והחתמה לאחר מכן להסרה, וצורותיהם של איים אלה פחות מדויקות מאלו שנעשו בשיטת ההסרה.

החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא שאורך החיים של המאסטרים ששימשו לעיצוב הסגנון החדש של בולי PDMS נראה קצר יותר מאלו ששימשו בשיטת ההחתמה הקודמת. סביר להניח שניתן לייחס זאת לצורה של המאסטרים החדשים המשמשים בשיטת ההסרה. המאסטרים הישנים הורכבו משטח של 1.5 x 1.5 ס"מ של SU-8 המורכב מחורים עגולים במרווחים שווים בעומק 5 מיקרומטר, שכאשר הם יצוקים ב- PDMS, היו יוצרים בולים המורכבים מעמודים גליליים במרווחים שווים באותו גובה. לעומת זאת, המאסטרים החדשים מורכבים משטח של 1.5 x 1.5 ס"מ של עמודים גליליים בגובה 5 מיקרומטר SU-8, אשר, כאשר הם יצוקים ב- PDMS, יוצרים בולים המורכבים מחורים במרווחים שווים.

עם שינוי זה במבנה של המאסטרים, נמצא כי SU-8 נוטה להיות delaminated מן פני השטח הרבה יותר בקלות מאשר בשיטה הישנה. אמצעי זהירות ננקטו כדי למנוע זאת, כגון טיפול בפני השטח של פרוסות הסיליקון בפלזמה אשר כדי להפוך אותם לנוחים יותר לקשירת SU-8. גם פני השטח של הוופלים סילאנו לפני היציקה הראשונה ב-PDMS כדי למנוע מה-SU-8 להיצמד ל-PDMS עם הסרת הבולים. למרות זאת, SU-8 delamination מן פרוסות הסיליקון נצפתה לאחר יציקה חוזרת ונשנית ב- PDMS, ויש לנקוט משנה זהירות כדי להבטיח כי פרוסות סיליקון חדשות ייעשו לפני אובדן המאסטר הנוכחי. אחת הדרכים האפשריות להימנע מההדחה הזו היא להשתמש בשיטת היציקה הכפולה של PDMS, שתוארה בעבר43, אם כי לשיטה אחרת זו יש מגבלות.

חסרון נוסף של שיטה זו (ושיטות אחרות המשתמשות בהידרוג'לים מעוותים כדי למדוד את כוחות המתיחה44) הוא ששדה המתיחה אינו נמצא בשיווי משקל מכני עקב רעש ניסיוני. לפיכך, יש צורך בניתוח לאחר העיבוד כדי לקבל שדה מתיחה שיווי משקל לאחר חישוב כוחות המתיחה. אחת הדרכים לאזן את כוחות המתיחה היא להשיג את הכוחות הקרובים ביותר למדידות המספקות את שיווי המשקל בשיטת הפחות ריבועים. כתוצאה מכך, הגודל והכיוון של כוחות המתיחה הנמדדים משתנים45.

ישנן מגבלות לשיטה זו של חישוב כוחות המתיחה התאית. כדי לקבוע במדויק את כוחות המתיחה התאית באמצעות Eq. (1) (שלב 5.4), יש לתכנן את התבנית כך שתזוזה של נקודת הידבקות אחת לא תשפיע באופן משמעותי על התזוזה של אלה הסמוכים לה ישירות. באופן תיאורטי, התזוזה של אזור הידבקות מעגלי על פני השטח של חצי מרחב אינסופי עקב כוח משיק הפועל במרכז פוחתת ככל שהמרחק הרדיאלי ממרכז המעגל גדלב-23. באופן ספציפי, עבור מצע שיחס הפואסון שלו הוא ~0.445 (כמו אלה שתוארו כאן), התזוזה בקצה האזור המעגלי היא כשני שלישים מהתזוזה במרכז האזור. עם זאת, תחזיות תיאורטיות אינן חורגות מעבר לאזור המעגלי. לפיכך, ההנחה היא כי מגמת הירידה בגודל התזוזה, שנקבעה באופן תיאורטי23, נמשכת מעבר לקצה מעגל ההידבקות. בתכנון המיקרו-פטרן המתואר כאן, נעשה שימוש ב-2 נקודות עגולות של μm במרווחים של 6 מיקרומטר ממרכז למרכז. הסיבה למרווח זה היא שתזוזה במרחק של 6 מיקרומטר ממרכז נקודה מוערכת בכ-1/12מהתזוזה במרכז הנקודה, אשר מניחים שהיא קטנה מספיק כדי להשפיע על ערכי תזוזה של נקודות סמוכות. עם זאת, ייתכן שכוחות המתיחה המופעלים על ידי תאים יכולים לעקור את נקודות ההדבקה על מצע עד כדי כך שהמרחק בין מרכז למרכז ביניהם הופך לפחות מ-2 מיקרומטר. במקרה זה, ההנחה לגבי תזוזה של נקודות הדבקה סמוכות שאינן מפריעות זו לזו אינה מחזיקה מעמד, ולא ניתן לחשב במדויק את כוחות המתיחה עם המשוואה הנתונה בשלב 6.4 (Eq (1))).

הטכניקה המוצעת מספקת כלי רב עוצמה למדידת כוחות המתיחה התאית. כוחות אלה מספקים תובנה לגבי הסביבה המכנית של תאים בודדים ושל אשכולות ויכולים לסייע בהבנת השאלה אם וכיצד סוגים שונים של תאים שומרים על יציבות מכנית. שמירה על רמה הומאוסטטית של מתח תאי חיונית לתהליכים תאיים רבים, ואובדן הומאוסטזיס מתחי זה נקשר למחלות שונות, כגון טרשת עורקים, אסתמה וסרטן 9,10,12. הומאוסטזיס מתחי מוגדר כיכולת של תא או אשכול תאים לשמור על רמה עקבית של מתח, עם שונות טמפורלית נמוכה סביב נקודה מוגדרת46.

ניתן להשתמש בשיטת מיקרו-פטרינג עקיפה זו כדי לקבוע את יכולתם של סוגי תאים שונים לשמור על הומאוסטזיס מתחי, הן ברמה האישית והן ברמה הרב-תאית. זה נעשה על ידי מעקב אחר שינויים בערכים של שדה המתיחה התאי לאורך זמן ולאחר מכן כימות תנודה טמפורלית של שדה המתיחה באמצעות מקדם השונות (CV), המייצג את היחס של סטיית התקן של גודל שדה המתיחה לערך הממוצע שלה. סכום סדרי הגודל של כוחות המתיחה וגודל מומנט ההתכווצות (הרגע הראשון של כוחות המתיחה) משמשים כמדדים סקלריים של גודל שדה המתיחה46. אם קורות החיים של שדה המתיחה נשארים קרוב לאפס לאורך כל הניסוי בזמן, זה מראה שהתא/צביר שמר על הומאוסטזיס מותח לאורך זמן46.

לסיכום, שיטה חדשה זו למיקרו-פטרציה עקיפה של הידרוג'לים רכים מציעה שיטה פשוטה ויעילה יותר ליצירת הידרוג'לים מעוצבים מאשר שיטות קודמות. ישנם צעדים מסוימים שניתן לנקוט כדי לשפר ולהרחיב את השיטה הזו. בראש ובראשונה, שיפור תהליך הייצור של מאסטרי הסיליקון באופן שמאריך את אורך חייהם יבטל את החיסרון העיקרי של שיטת המיקרו-פטרינג הזו. באשר לדרכים להרחיב על שיטה זו, חקר צורות איים שונות מעבר לאיים המרובעים המתוארים כאן רק ישפר את הרבגוניות של שיטה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

המחברים רוצים להודות לד"ר פול ברבון מהמחלקה להנדסת מכונות באוניברסיטת בוסטון על דיונים מועילים וסיוע בניתוח נתונים. מחקר זה נתמך על ידי מענק NSF CMMI-1910401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma Aldrich #281778
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher Scientific #05-408-129
15 mL conical tube Fisher Scientific #05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask Advance Reproductions Corporation N/A Custom-designed mask
6 Well Plates Fisher Scientific #07-200-83
Acetone Fisher Scientific #A18P-4
Acrylamide Solution, 40% Sigma Aldrich #A4058
AlexaFluor 488 Thermo Fisher #A20000
Aminonium Persulfate Fisher Scientific #BP179-25
Bisacrylamide Fisher Scientific #PR-V3141
Ethanol Greenfield Global #111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round Fisher Scientifc #12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round Warner #64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera Hamamatsu #C10600-10B
Human Plasma Valley Biomedical #HP1051P Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N Millipore Sigma #1.09057
ImageJ Wayne Rasband #1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set Bioptechs #190310-35
Kim Wipes Fisher Scientific #06-666-11C
Mask Alinger Karl Suss #MA6
Matlab 2021 Mathworks #R2021a
MetaMorph Basic Molecular Devices #v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester Sigma Aldrich #130672-5G
NucBlue Live Cell Stain Thermo Fisher #R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope Olympus #IX81
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare #52-1308-00
Photoresist Spinner Hood Headway Research #PWM32
Plasma Cleaner Harrick #PDC-001
Plasma Etcher TePla #M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source Prior Scientific #L200
Silicon Wafers, 100 mm University Wafer #809
SU-8 2005 Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9463827
SU-8 Developer Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer Essex Brownell #DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine Fisher Scientific #BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich #448931
UAPON-40XW340 Objective Olympus #N2709300
UV Flood Exposure Newport #69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm Ted Pella, Inc. #19395-40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923 (2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 180
יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bunde, K. A., Stamenović, D.,… More

Bunde, K. A., Stamenović, D., Smith, M. L. Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63628, doi:10.3791/63628 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter