Summary
우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.
Abstract
마이크로패턴 견인 현미경 검사는 단일 세포 및 세포 클러스터의 모양을 제어할 수 있게 해줍니다. 또한, 마이크로미터 길이 스케일로 패턴화하는 능력은 각 마이크로패턴화된 도트가 부드럽고 근본적인 하이드로겔을 변형시키는 단일 초점 접착의 형성을 허용하기 때문에 견인력의 측정을 위해 이러한 패턴화된 접촉 구역의 사용을 허용한다. 이러한 접근법은 내피 세포, 평활근 세포, 섬유아세포, 혈소판 및 상피 세포를 포함하는 광범위한 세포 유형에 사용되어 왔다.
이 리뷰는 미리 지정된 크기와 간격의 점들의 규칙적인 배열에서 폴리아크릴아미드 하이드로젤 상에 세포외 매트릭스 단백질을 인쇄할 수 있게 하는 기술의 진화를 설명한다. 마이크로 미터 크기의 패턴은 부드러운 기판에 직접 인쇄하기가 어렵 기 때문에 단단한 유리 커버 슬립에서 패턴이 먼저 생성 된 다음 겔화 중에 패턴을 하이드로 겔로 전달하는 데 사용됩니다. 먼저, 커버슬립 상에 작은 점들의 어레이를 생성하기 위한 원래의 마이크로컨택트 인쇄 접근법이 설명된다. 작은 점의 섬을 떠나기 위해 대부분의 패턴을 제거하는 두 번째 단계는 패턴화 된 점의 배열에서 셀과 셀 클러스터의 모양을 제어해야합니다.
다음으로, 단일 감산 패터닝 단계를 사용하여 점들의 섬들을 생성할 수 있게 하는 이러한 접근법의 진화가 설명된다. 이 접근법은 사용자를 위해 크게 단순화되었지만 패턴을 만드는 데 필요한 마스터 몰드의 수명이 감소하는 단점이 있습니다. 마지막으로, 변위된 점들의 이미지 분석과 후속 세포 생성 견인 필드의 분석을 위해 개발된 계산 접근법이 설명되고, 이러한 분석 패키지의 업데이트된 버전이 제공된다.
Introduction
대부분의 세포 표현형은 환경에 견인력을 발휘합니다. 이러한 견인력은 액틴과 미오신의 네트워크인 세포의 수축성 세포골격, 그리고 다른 필라멘트성 바이오폴리머 및 가교결합 단백질1,2,3,4에 의해 생성된다. 세포 내에서 생성된 힘은 주로 인테그린 및 카데린과 같은 막횡단 단백질을 통해 세포외 환경 또는 인접한 세포로 전달될 수 있으며, 각각 5,6. 세포가 어떻게 퍼지거나 수축하는지, 그리고 그 움직임과 관련된 견인력의 크기는 환경과의 친밀한 대화의 결과이며, 이는 주로 세포외 기질 (ECM)7,8에 존재하는 단백질의 유형과 양 및 ECM의 강성에 달려 있습니다. 실제로, 견인력 현미경 검사는 기질 강성, 부과 된 기계적 스트레스 및 균주 또는 다른 세포와의 접촉과 같은 국소 자극에 대한 세포 반응성을 이해하는 데 귀중한 도구가되었습니다. 이 정보는 암 및 천식 9,10,11,12와 같은 질병의 이해와 직접 관련이 있습니다.
견인력을 계산하기 위해 알려진 재료 특성의 기판의 힘 유도 변형을 측정하는 데 사용할 수있는 시스템이 필요합니다. 이러한 변경 사항은 시간이 지남에 따라 추적되어야 하며 이미징 및 이미지 처리 기술이 모두 필요합니다. 세포 견인력을 결정하는 데 사용 된 첫 번째 방법 중 하나는 세포와 함께 시드 된 콜라겐 하이드로 젤의 수축을 관찰하고 분석하는 것이었지만이 방법은 반 정량적인 13 개에 불과했습니다. 또 다른, 보다 정제된 방법은 실리콘14의 얇은 시트의 변형으로부터 기인하는 힘을 결정함으로써 단일 세포에 의해 가해지는 견인력을 측정하는 것이었다. 나중에보다 정량적 인 측정 기술이 개발되었으며, 이러한 방법은 폴리 아크릴 아미드 (PAA) 12,15,16과 같은 연질 하이드로 젤의 사용을 허용했습니다. 이러한 연질 재료를 사용할 때, 견인력은 하이드로겔에 매립된 랜덤하게 변위된 비드의 힘-유도된 변위 및 겔(16,17)의 기계적 특성으로부터 결정될 수 있었다. 또 다른 발전은 연질 폴리디메틸실록산 (PDMS)으로 만들어진 마이크로 포스트 어레이의 개발과 함께 이루어졌으며, 그래서 그들의 편향이 측정되고 빔 이론(18)을 사용하여 힘으로 변환 될 수있었습니다.
마지막으로, 소프트 하이드로젤을 마이크로패터닝하는 방법은 이러한 접근법이 세포 부착을 위한 접촉 영역의 제어를 허용함에 따라 개발되었다. 세포의 접촉 영역 내에서 마이크로패턴의 변형을 측정함으로써, 무힘 기준 이미지(19)가 요구되지 않기 때문에 견인력을 쉽게 계산할 수 있었다. 이 방법은 세포 견인력(20)의 측정을 위해 PAA 겔 상으로의 미크론 크기의 분리된 형광 단백질 부착 포인트의 규칙적인 어레이의 간접 패터닝을 허용하기 때문에 널리 채택되고 있다. 이러한 힘을 계산하기 위해, 사용자 입력을 요구하지 않고 각 마이크로 패턴화된 점의 움직임을 추적할 수 있는 이미지 처리 알고리즘(21)이 개발되었다.
이 방법은 도트 패턴의 전체 격자를 만드는 데는 간단하지만 도트의 격리 된 패치 (또는 섬) 패턴이 필요한 경우 더 복잡합니다. 마이크로 패턴화 된 섬은 세포 군집의 모양과 어느 정도의 크기 조절이 필요할 때 유용합니다. 이러한 섬을 만들기 위해 앞서 언급한 마이크로 접촉 인쇄 방법은 두 가지 별개의 단계를 필요로 합니다: i) 하나의 PDMS 스탬프를 사용하여 커버슬립에 점들의 고충실도 패턴을 생성한 다음, ii) 두 번째 다른 PDMS 스탬프를 사용하여 대부분의 점들을 제거하여 점들(21)의 고립된 섬들을 남겨 둡니다. 이 독창적 인 방법으로 섬을 만드는 어려움은 프로세스의 첫 번째 단계에서 일관된 그리드 패턴을 만드는 것이 그 자체로 어렵다는 사실에 의해 더욱 복잡해집니다. 마이크로 프린팅 스탬프는 원형 마이크로 포스트 배열로 구성되며, 직경은 원하는 도트 크기에 해당합니다. 그런 다음이 스탬프는 균일 한 단백질 층으로 코팅 된 다음 처리 된 커버 슬립에 정확한 양의 압력으로 스탬프되어 원하는 패턴을 만듭니다. 한편으로 스탬프에 너무 많은 압력을 가하면 기둥 좌굴 또는 기둥 사이의 처짐으로 인해 단백질 전달이 고르지 않고 패턴 충실도가 저하되어 유리와의 접촉이 발생할 수 있습니다. 반면에 너무 적은 압력을 가하면 단백질 전달이 거의 또는 전혀 이루어지지 않고 패턴 충실도가 떨어집니다. 이러한 이유로, 단 한 단계만으로 도트의 고립된 섬들의 고품질 마이크로패턴을 일관되게 생성하는 데 사용될 수 있는 전달 공정이 요구된다.
본원에서, 미크론 크기의 형광 단백질 부착 포인트가 PAA 겔 상으로의 점들의 간접적인 마이크로패터닝에 대해 기술되어 있으며, 이는 이전에 개발된 방법들보다 더 일관되고 다재다능하다. 오래된 간접 마이크로 패터닝 방법은 PDMS 스탬프에서 중간 기질로의 단백질 패턴 전달에 의존하는 반면, 여기에 도입 된 방법은 추가가 아닌 단백질 제거를위한 용기로 PDMS 스탬프를 사용합니다. 이것은 먼저 사용 된 PDMS 스탬프의 구조를 근본적으로 변경함으로써 수행됩니다. 균등하게 이격 된 원형 기둥의 패턴으로 구성된 우표를 만드는 대신,이 방법에서 균등하게 간격을 둔 원형 구멍의 패턴으로 구성됩니다.
이 새로운 구조로, 이러한 PDMS 스탬프의 표면은 이전에 기술된 바와 같이 글루타르알데히드로 처리될 수 있고, 20,29,30, 스탬프가 단백질과 공유적으로 결합할 수 있게 한다. 형광 단백질로 고르게 코팅된 유리 커버슬립에 사용될 때, 이러한 글루타르알데히드 처리된 PDMS 스탬프는 커버슬립의 표면에서 대부분의 단백질을 제거하기 위해 사용되며, 스탬프 상의 미크론 크기의 구멍의 위치에 의해 미리 결정된 원하는 도트 패턴만을 남긴다. 이러한 변화는 거의 연속적인 점 격자로 구성된 패턴을 생성하고 단 한 단계만 통해 격리된 도트 섬을 만드는 성공률을 높입니다.
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Protocol
1. 실리콘 마스터의 창조
참고: PDMS 스탬프의 반복 성형을 위한 실리콘 마스터의 설계, 생성 및 문제 해결 프로세스의 대부분은 이전에21에서 다루었으므로이 새로운 접근 방식의 주요 차이점 만 여기에 설명되어 있습니다.
- AutoCAD 또는 유사한 설계 소프트웨어를 사용하여 포토마스크에 대한 설계를 작성합니다. 얇은 유리 조각인 포토마스크의 한쪽면을 크롬의 얇은 층으로 코팅하여 UV 광 산란을 제어합니다. 포토마스크를 디자인하여 선택한 포토레지스트에 자외선을 비추면 최종 PDMS 스탬프에서 원하는 피쳐의 역으로 실리콘 마스터가 생성되도록 합니다. 이 마스크의 디자인에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.
참고: 원하는 피처 또는 외부 영역을 포토마스크에서 투명하게 만들어야 하는지 여부는 선택한 포토레지스트에 따라 다릅니다. 여기에 사용 된 포토레지스트는 SU-8 2005 (주의 : 가연성, 피부 및 눈 자극성, 열 / 화염 / 불꽃을 피하고 취급시 보호 장갑 및 안경 사용)입니다.- 네거티브 포토레지스트를 자외선에 노출시키고 경화되지 않은 SU-8을 화학 용매로 제거하여 치료하십시오. 따라서 마스크의 주변 영역이 불투명한 상태에서 마스크의 주요 특징을 투명하게 디자인하십시오.
- 이 새로운 제거 방법의 경우 포토마스크가 1.5 x 1.5cm의 두 정사각형(그림 1A), 하나는 중심에서 가운데로 6μm 간격으로 이격된 2μm 원의 짝수 격자로 가득 찬 것, 그리고 동일한 그리드 패턴의 더 작고 격리된 버전인 많은 정사각형 섬으로 구성된 포토마스크를 디자인합니다(그림 1B). 6 x 6 도트, 12 x 12 도트, 25 x 25 도트 및 42 x 42 도트 크기의 섬을 만듭니다.
참고: 접착점의 직경(2 μm)은 세포 견인력22,23을 측정한 이전 연구를 기반으로 선택되었습니다. 여기에 사용 된 마스크는 101.6 x 101.6mm이며 한쪽에 0.06 μm 두께의 크롬 층이 코팅되어 있으며 마스터의 작은 특징 때문에 권장됩니다. 여기에 사용 된 포토 마스크는 외부 포토 마스크 인쇄 회사에서 의뢰했습니다.
- 클린룸 내에서 선택한 실리콘 웨이퍼를 포토레지스트로 고르게 코팅하십시오. 선택적인 단계로서, 웨이퍼를 레지스트로 코팅하기 전에 플라즈마 애셔에서 표면-처리한다.
참고: 여기에서는 직경 100mm 웨이퍼가 사용됩니다. 플라즈마 애셔에서의 처리는 웨이퍼를 SU-8에 대한 결합에 더 적합하게 만들고 웨이퍼로부터 SU-8의 박리를 방지하는 것을 돕는다. - 포토레지스트 제조업체의 지침에 따라 다음 단계를 수행하십시오.
- 코팅된 웨이퍼를 스핀하여 원하는 특징 두께를 생성하고, 원하는 두께 및 레지스트의 유형에 따라 스핀 시간을 변화시킨다. 5μm 두께의 SU-8 2005의 경우 권장 스핀 프로그램을 다음 세 단계로 나눕니다.
- 웨이퍼를 포토레지스트로 코팅하여 100RPM에서 10초 동안 회전하여 100RPM/s의 램프로 코팅합니다.
- 웨이퍼를 30초 동안 300RPM/s의 램프로 3,000RPM으로 회전시켜 레지스트 두께를 약 5μm로 줄입니다.
- 회전 후 1초 동안 500RPM/s의 램프로 속도를 0RMP로 줄여 웨이퍼를 천천히 감속시킵니다.
- UV 노출을 위한 레지스트를 95°C 핫플레이트 상에서 간단히 베이킹하여 준비한다. 레지스트의 원하는 두께에 따라 핫플레이트에 소요된 시간을 수정하는 단계; 베이킹 시간은 5 μm 두께의 SU-8 2005의 경우 2분이다.
- 레지스트를 자외선에 노출시켜 원하는 기능을 완전히 치료하십시오. 과도한 노출은 SU-8을 부서지기 쉽고 결과 마스터의 전반적인 품질에 영향을 줄 수 있으므로 조심하십시오.
- 5 μm 두께의 SU-8 2005에 대해 105 mJ/cm2의 노출 에너지를 사용하십시오. 사용 가능한 UV 램프의 전력을 기준으로 노출 에너지를 램프의 전력으로 mW로 나누어 노출 시간을 계산합니다.
참고: 여기에 사용된 램프의 전력은 8mW이므로 노출 시간은 13.1초여야 합니다.
- 5 μm 두께의 SU-8 2005에 대해 105 mJ/cm2의 노출 에너지를 사용하십시오. 사용 가능한 UV 램프의 전력을 기준으로 노출 에너지를 램프의 전력으로 mW로 나누어 노출 시간을 계산합니다.
- 개발 후 SU-8 기능을 설정하려면 이번에는 95 °C 핫 플레이트에서 3 분 동안 다시 굽습니다. 레지스트가 제대로 노출된 경우 이 베이킹 단계 동안 마스터의 원하는 피쳐가 1분 이내에 나타날 때까지 기다립니다.
- SU-8 현상기를 사용하여 실리콘 웨이퍼에서 경화되지 않은 SU-8을 제거하십시오. 경화되지 않은 SU-8을 제거 할 때 웨이퍼의 미크론 크기와 간격이있는 기능 사이에 끼어들 수 있으므로 철저해야합니다.
주의: SU-8 현상제는 가연성 피부와 눈 자극제입니다. 열/화염/불꽃으로부터 멀리하고 취급 시 보호 장갑과 안경을 착용하십시오. - 현상 후 아세톤으로 헹구어 웨이퍼의 과도한 현상을 제거하고 질소 스프레이 건으로 완전히 건조시킵니다.
주의: 아세톤은 가연성 피부와 눈 자극제입니다. 화염 / 불꽃으로부터 멀리하고 취급 할 때 보호 장갑과 안경을 사용하십시오. - 선택적으로, SU-8 2005의 경우, 200°C 핫플레이트 상에서 10분 동안 베이킹한다.
참고: 이 하드 베이크는 포토레지스트에 기계적 강도를 더합니다.
- 코팅된 웨이퍼를 스핀하여 원하는 특징 두께를 생성하고, 원하는 두께 및 레지스트의 유형에 따라 스핀 시간을 변화시킨다. 5μm 두께의 SU-8 2005의 경우 권장 스핀 프로그램을 다음 세 단계로 나눕니다.
- 냉각시킨 후, 웨이퍼를 웨이퍼 캐리어 트레이에 넣은 다음 PDMS에 캐스팅한다. 먼저, 웨이퍼 상의 실란화 처리를 완료하여 실리콘 마스터의 SU-8 특징이 PDMS에 결합할 가능성을 낮추고 따라서 웨이퍼의 표면으로부터 제거될 가능성을 낮춘다.
- 실란화 표면 처리를 완료하려면 실란에만 사용하도록 지정된 데시케이터 안에 마스터와 작은 유리 커버슬립을 놓습니다. 트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란 1-2 방울을 커버 슬립에 넣고 데시케이터를 닫은 다음 4,500 Pa24의 압력으로 30 분 동안 진공 상태에서 실행하십시오.
주의: 트리클로로(1H,1H,2H,2H-퍼플루오로옥틸)실란은 가연성 피부 및 눈 자극제입니다. 열/화염/불꽃으로부터 멀리하고, 취급 시 보호 장갑과 안경을 사용하고, 흄 후드 아래에서 작업하십시오. - 진공을 끄고 마스터와 커버슬립을 데시케이터에 30분 더 둡니다.
참고: 이제 마스터가 PDMS에서 캐스팅할 준비가 되었습니다.
- 실란화 표면 처리를 완료하려면 실란에만 사용하도록 지정된 데시케이터 안에 마스터와 작은 유리 커버슬립을 놓습니다. 트리클로로 (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) 실란 1-2 방울을 커버 슬립에 넣고 데시케이터를 닫은 다음 4,500 Pa24의 압력으로 30 분 동안 진공 상태에서 실행하십시오.
2. 감산 마이크로 접촉 인쇄
- PDMS를 제조업체의 지침에 따라 경화제와 베이스의 올바른 비율로 혼합하십시오. 실온에서 15 분 동안 압력으로 앉히십시오. 그런 다음 진공 상태에서 15 분 동안 탈기하십시오.
- PDMS를 마스터에 붓고 이를 37°C로 설정된 인큐베이터에 넣고 밤새 경화시킨다.
- 인큐베이터에서 마스터를 제거하고 실온으로 식히십시오.
- 마스터가 식히는 동안, 초음파 처리 25mm 커버 슬립 에탄올에 10 분 동안 슬립. 준비 중인 스탬프의 수만큼 커버슬립을 사용하십시오.
- 탈이온화된(DI) 물로 25mm 커버슬립을 완전히 헹구고 여과된 에어건을 사용하여 건조시킵니다.
- 플라즈마는 높은 (30W의 무선 주파수 전력)에서 진공 상태에서 플라즈마 청소기를 사용하여 커버 슬립을 1 분 동안 처리합니다. 커버 슬립이 챔버 내부로 이동하는 것을 방지하기 위해 처리 후 진공을 천천히 해제하십시오.
참고 : 유리 표면의 플라즈마 처리는 두 가지 목적으로 사용됩니다 : 유리 표면을 청소하여 오염 물질을 제거하고 유리 표면에 산소 기반 극성 그룹을 생성하여 소수성25로 만듭니다. 이 소수성은 유리의 표면을 단백질 결합에 더 잘 적응하게 만듭니다. - 직사광선/오버헤드 조명이 없는 방에서는 각 커버슬립을 100μL 이상의 형광 표지 단백질 용액으로 최소 100μg/mL의 농도로 코팅하고 빛으로부터 추가로 보호하기 위해 덮개를 덮고 20분 동안 그대로 두십시오.
참고: 여기에서는 인간 혈장으로부터 분리하고 AlexaFluor 488로 염색된 피브로넥틴이 사용된다.- 피브로넥틴을 염색하기 위해, 공지된 농도 및 부피의 표지되지 않은 피브로넥틴을 1.5 mL 튜브에서 적절한 양의 형광 염료와 결합시킨다. 염료를 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 1 시간 동안 배양하고 튜브를 5-10 번 뒤집어 10 분마다 부드럽게 혼합하십시오.
참고 : 필요한 염료의 양은 사용되는 염료와 사용되는 단백질의 질량에 따라 다릅니다. Alexa 488로 표지된 피브로넥틴에 대한 적절한 염료의 양을 결정하는 데 사용되는 계산기에 대해서는 보충 파일 1 을 참조하십시오. 제조업체의 지침에 따라 과도한 염료는 탈염 컬럼을 사용하여 걸러 낼 수 있습니다 ( 재료 표 참조).
- 피브로넥틴을 염색하기 위해, 공지된 농도 및 부피의 표지되지 않은 피브로넥틴을 1.5 mL 튜브에서 적절한 양의 형광 염료와 결합시킨다. 염료를 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 1 시간 동안 배양하고 튜브를 5-10 번 뒤집어 10 분마다 부드럽게 혼합하십시오.
- 각 커버슬립을 DI 물로 완전히 헹구고 각 커버슬립의 측면을 종이 타월 또는 유사한 흡수성 재료에 부드럽게 두드려 표면에서 과도한 물을 제거합니다. 커버 슬립을 어둠 속에서 적어도 30 분 동안 방치하여 완전히 건조시킵니다.
- 단백질로 코팅된 커버슬립이 건조되는 동안, 메스 또는 다른 날카로운 칼날로 절단하여 마스터에서 PDMS 스탬프를 제거하십시오.
참고 : 첫 번째 시도에서 PDMS를 통해 절단하지 않는 것이 가장 좋습니다.이 압력을 많이 가하면 실리콘 웨이퍼가 깨지고 마스터가 손상 될 수 있습니다. - 플라즈마는 PDMS 스탬프를 고(30W의 무선 주파수 전력)에서 진공 상태에서 2분 동안 처리합니다.
- 흄 후드 내에서 뚜껑이 달린 용기에 스탬프를 넣고 각 스탬프를 100 % 에탄올에 희석 된 10 % (3- 아미노 프로필) 트리메톡시 실란 (3-APTMS)의 매우 얇은 층 (<100 μL)으로 코팅하십시오.
주의: 3-APTMS는 가연성 피부와 눈 자극제입니다. 화염 / 불꽃으로부터 멀리하고, 취급 할 때 보호 장갑과 안경을 사용하고, 흄 후드 아래에서 작업하십시오. 3-APTMS 용액의 과도한 코팅은 이 과정에서 나중에 오렌지색 필름을 형성하게 할 것이다. 이 3-APTMS 표면 처리는 아민 기능성을 PDMS 스탬프의 표면에 통합하여나중에 26에서 스탬프 표면을 추가로 유도체화 할 수 있습니다. - 우표로 용기를 덮고 실온에서 5 분 동안 앉을 수있게하십시오.
- DI 물을 사용하여 양쪽의 각 스탬프를 완전히 헹구십시오.
- 우표를 깨끗한 용기에 넣고 DI 물에 2.5 % 글루타르 알데히드로 자유롭게 코팅하십시오.
주의: 글루타르알데히드는 독성이 있습니다. 취급 및 흄 후드 아래에서 작업 할 때 보호 장갑과 안경을 사용하십시오). 이전의 3-APTMS 처리와 함께 이러한 글루타르알데히드 처리는 PDMS 스탬프의 표면에 알데히드 기능을 제공하며, 이는 단백질 내의 아민기와 반응하여 단백질 제거 공정(27)에 중요한 이차 아민 결합을 생성할 수 있다. - 우표를 덮고 실온에서 30 분 동안 앉은 다음 DI 물로 다시 완전히 헹구십시오. 커버 슬립과 동일한 방식으로 스탬프 표면에서 과도한 물을 제거하고 스탬프가 ~ 30 분 동안 덮이지 않고 건조되도록하십시오.
- 30분 후, 단백질 코팅 커버슬립과 스탬프가 모두 건조한지 확인합니다. 둘 중 하나가 완전히 건조되지 않은 경우 여과 된 에어 건을 사용하여 완전히 건조시켜 커버 슬립이 장기간 빛에 노출되지 않도록하십시오.
- 커버슬립과 스탬프가 모두 건조되면 스탬프 패턴을 충분한 압력으로 커버슬립 위로 밀어 넣어 스탬프가 커버슬립 표면과 완전히 닿도록 합니다. 스탬프를 커버 슬립과 접촉시켜 15 분 동안 그대로 두십시오.
참고: 글루타르알데히드 스탬프와 유리 커버슬립 상의 단백질 층 사이의 공유 아미드 결합으로 인해, 이는 단백질층과 유리 커버슬립 사이의 약한 소수성 상호작용보다 훨씬 강하기 때문에, 단백질은 일단 제거되면 PDMS 스탬프의 패턴에 따라 유리를 벗겨내야 한다. - 15분 후, PDMS 스탬프를 커버슬립에서 조심스럽게 벗겨냅니다.
참고: 제거 프로세스가 올바르게 작동하면 스탬프가 저항없이 커버 슬립에서 나오지 않아야하지만 커버 슬립에 너무 단단히 달라 붙어 과도한 힘없이 제거 할 수 없어야합니다. - 형광 현미경 상에서 적절한 필터를 사용하여 패턴화된 커버슬립의 충실도를 확인한다(단백질이 어떤 형광 염료로 표시되는지에 따라).
- 패턴화된 커버슬립을 즉시 사용하거나 직접 조명으로부터 멀리 떨어진 곳에 보관하십시오.
3. 활성화된 커버슬립
참고: PAA 젤용 실험 챔버에 사용하기 위한 하단 커버슬립은 이 단계에서 제조됩니다. 이 하단 커버슬립은 패터닝 공정 중에 상단 패턴화된 커버슬립이 제거될 때 PAA 겔이 단단히 접착되도록 특별히 처리됩니다. 유사한 기술들이 또한 다른 곳에서도 설명된다10,12,15,28.
- 초음파 처리 30mm 커버슬립을 100% 에탄올에 넣고 10분 동안 DI 물로 헹구고 여과된 에어건으로 완전히 건조시킵니다. 6웰 플레이트에서 배치당 한 번에 최대 6개의 커버슬립을 준비합니다.
- 플라즈마는 커버슬립을 높음(무선 주파수 전력 30W)에서 1분 동안 처리한 다음 각 커버슬립을 6웰 플레이트의 웰에 넣습니다.
- 각 커버슬립을 에탄올에 5% APTMS의 매우 얇은 층으로 흄 후드에 코팅합니다.
참고 :이 과정에서 과도한 코팅의 경우 주황색 잔류 물이 형성됩니다. - 6웰 플레이트를 덮고 커버슬립을 5분 동안 그대로 둡니다.
- 커버 슬립 (양쪽)과 각 웰 내부를 DI 물로 완전히 헹구고 우물 내부의 과도한 물을 제거하십시오.
- 커버슬립을 다시 6웰 플레이트에 넣고 DI 물에 약 2mL의 0.5% 글루타르알데히드를 첨가합니다.
- 6-웰 플레이트를 덮고 커버슬립을 글루타르알데히드 용액에 30분 동안 앉히십시오. 그런 다음 커버 슬립과 각 플레이트의 웰을 DI 물로 철저히 헹구십시오.
- 처리된 커버슬립을 6웰 플레이트 내의 DI 물에 최대 2주 동안 보관하거나 즉시 사용하십시오. 사용하기 전에 커버슬립이 완전히 건조되었는지 확인하십시오.
4. PAA 젤 제작 및 패턴 전달
참고: 일단 패턴화된 커버슬립이 만들어지면, 그들은 곧 PAA 하이드로젤로 단백질 패턴을 옮기는 데 사용되어야 합니다(<24 h)1,29,30. 다음 레시피는 영 모듈러스가 3.6kPa인 PAA 젤을 위한 것입니다. 비스-아크릴아미드, 아크릴아미드, 및 DI 물의 양은 PAA 겔(12)의 강성을 조정하기 위해 변화될 수 있다.
- PAA 하이드로겔 전구체를 만들기 시작하기 직전에, 아크릴산 N-하이드록시숙신이미드(NHS)-에스테르를 냉장고에서 제거하여 개봉하기 전에 실온에 도달할 수 있도록 한다. 70 % 에탄올로 살균하고 사용하기 전에 적어도 30 분 동안 생물 안전 캐비닛의 자외선 아래에 놓아 교체 가능한 커버 슬립 접시 세트를 준비하십시오.
주의: NHS는 독성 피부와 눈 자극제입니다. 취급 할 때 보호 장갑과 안경을 사용하고 흄 후드 아래에서 작업하십시오.- DI 물에 1.25 mL의 40% 아크릴아미드를 15 mL 코니컬 튜브에 첨가한다.
주의: 아크릴아미드는 독성 피부와 눈 자극제입니다. 취급 할 때 보호 장갑과 안경을 사용하고 흄 후드 아래에서 작업하십시오. - DI 물 중의 비스아크릴아미드 용액 175 μL를 동일한 튜브에 첨가한다(단계 4.1.1).
주의: 비스-아크릴아미드는 독성 피부와 눈 자극제입니다. 취급 할 때 보호 장갑과 안경을 사용하고 흄 후드 아래에서 작업하십시오. - 500 μL의 10x 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 첨가한다.
주의: PBS는 눈 자극제; 취급 할 때 보호 장갑과 안경을 사용하십시오. - DI 물 2.915 mL를 첨가하십시오.
- DI 물에 1.25 mL의 40% 아크릴아미드를 15 mL 코니컬 튜브에 첨가한다.
- 969 μL의 전구체를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣고, 나머지는 최대 2주 동안 4°C에서 보관한다.
- 다른 마이크로 원심분리 튜브에서 ~ 50-100mg의 과황산 암모늄 (APS)을 측정하고 DI 물에서 100mg / mL까지 희석하십시오. 나중에 사용할 수 있도록 따로 보관하십시오. 후드에서 NHS 에스테르 (현재 실온에서 열림)를 열고 마이크로 원심분리 튜브에서 최대 3mg의 NHS를 조심스럽게 측정하십시오. NHS 에스테르를 1x PBS에서 1 mg / mL로 희석하십시오.
주의: APS는 피부와 눈 자극제입니다. 취급 할 때 보호 장갑과 안경을 사용하고 흄 후드 아래에서 작업하십시오. APS와 NHS-에스테르 모두 시간이 지남에 따라 가수분해되어 원액 내의 화학 물질의 활성이 변합니다. 따라서이 두 용액 모두 매번 신선하게 준비되어야합니다 (나머지 전구체와 달리). - 흄 후드에서 다음 세 단계를 수행합니다.
- 2 μL의 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 PAA 전구체의 969 μL 분취량을 함유하는 마이크로원심분리 튜브에 첨가한다.
주의: TEMED는 가연성 피부와 눈 자극제입니다. 열/화염/불꽃으로부터 멀리하고, 취급 시 보호 장갑과 안경을 사용하고, 흄 후드 아래에서 작업하십시오. TEMED는 PAA 하이드로젤의 중합에 중요한 두 가교제 중 하나이고, 다른 하나는 APS이다. - 15 μL의 1 M 염산을 첨가하여 하이드로겔 용액의 pH를 감소시키고 NHS 에스테르의 가수분해를 피하십시오.
주의: 염산은 부식성 피부와 눈 자극제입니다. 취급 할 때 보호 장갑과 안경을 사용하고 흄 후드 아래에서 작업하십시오. - 10 μL의 NHS-에스테르 용액을 튜브에 첨가한다.
참고: NHS는 패터닝 프로세스에 매우 중요합니다. 패턴화된 커버슬립 상의 단백질에서 아민기와 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성할 것이며, 이는 패턴이 유리커버슬립으로부터 PAA 겔(31)의 표면으로 전달될 수 있게 할 것이다.
- 2 μL의 테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)을 PAA 전구체의 969 μL 분취량을 함유하는 마이크로원심분리 튜브에 첨가한다.
- 생물안전 캐비닛에서 다음 마지막 단계를 수행하십시오.
- 커버슬립 접시 세트(3-APTMS 및 글루타르알데히드 처리 측면 위쪽)의 금속 부분에 30mm 커버슬립을 조심스럽게 놓고 플라스틱 링을 위에 조이십시오. 패턴화된 커버슬립을 설정하여 다음 단계에서 쉽게 도달할 수 있도록 하면서 가능한 한 빛으로부터 보호합니다.
- 5 μL의 APS 용액을 마이크로원심분리 튜브에 나머지 PAA 전구체를 넣고, 이를 뒤집어 혼합한 다음, 그 용액 35 μL를 즉시 30 mm 커버슬립 상에 피펫팅한다.
- 패턴화된 커버슬립 단백질 측면을 용액 위에 떨어뜨리고, 하이드로겔에 기포가 생기지 않도록 주의한다. 하이드로겔을 빛으로부터 보호하고 90분 동안 중합할 수 있게 한다.
- 하이드로겔이 중합되면 면도날이나 메스를 사용하여 상부 커버슬립을 제거하고, 커버슬립이 겔에서 미끄러지지 않도록 하거나, 일단 제거되면 젤 표면의 패턴을 망칠 수 있으므로 젤 위로 다시 떨어지지 않도록 합니다.
주: 공기 흐름이 심한 부위(예: 생물 안전 캐비닛)에 젤을 덮지 않은 상태로 두지 마십시오. - 하이드로겔 중의 임의의 남아있는 NHS-에스테르를 부동태화시키기 위해, 2 mL의 멸균 PBS를 겔에 첨가하고, 37°C에서 45분 동안 인큐베이션한다. 즉시 실험을 위해 겔을 제조하거나 사용할 때까지 4°C에서 멸균 PBS에 밤새 보관한다.
5. 이미징
- 세포와의 실험을 준비하려면 현미경 챔버 내부의 장비가 더 높은 온도로 평형을 이룰 수 있도록 계획된 실험 전에 오후에 현미경에서 열 (37 °C)과 습도 (70 %)를 켜십시오.
참고: 이 단계에서는 온도 변동으로 인한 z-드리프트를 최소화합니다. - 실험 시작 직전에 챔버의CO2 소스를 켭니다.
- 실험 중 현미경 단계의 반복적 인 움직임으로 인한 xy 드리프트를 방지하려면 양면 테이프로 셀시드 된 하이드로 젤을 고정하는 교환 가능한 커버 슬립 접시 세트를 고정하십시오.
- 젤을 살펴보고 이미지에 관심 있는 프레임을 찾아 이미지화할 섹션의 각 단계 위치를 저장합니다.
- 표지된 단백질에 해당하는 밝은 필드 뷰와 형광도 둘 다에서, 현미경 소프트웨어를 설정하여 2시간 동안 5분마다 한 번씩 각 프레임을 이미지화합니다.
6. 이미지 분석
참고: 트랙션 포인트의 위치를 결정하고, 변형된 포인트의 초기 위치를 보간한 다음, 각 위치에서 세포 견인력을 계산하여 패턴화된 PAA 젤의 변형을 측정할 수 있는 시스템이 개발되었습니다. 이미지 처리 및 수치 계산을 수행할 수 있는 모든 소프트웨어 시스템을 사용할 수 있습니다. 이 프로그램은 견인력을 신속하게 결정하여 사용자 관련 오류에 기여할 수있는 사용자 입력 및 전처리 절차를 제거하는 것을 목표로합니다. 여기에 사용 된 코드는 보충 파일 2-10으로 사용할 수 있으며 이러한 파일은 한 쌍의 연습 이미지와 함께 www.bu.edu/mml/downloads 에서 액세스 할 수 있습니다.
- 이미지 처리 소프트웨어에서 타임랩스 실험 중에 촬영된 모든 개별 이미지를 첫 번째 이미지부터 마지막으로 캡처한 이미지까지 순서대로 사용된 각 현미경 뷰에서 열고 단일 이미지 스택으로 변환합니다( 이미지 클릭| 스택 | 스택 할 이미지). 두 개의 개별 이미지 스택이 있는지 확인하십시오: 셀의 밝은 필드 뷰 중 하나와 셀이 부착된 패턴의 형광 뷰 중 하나.
- 형광 이미지에 표류가 있는 경우(즉, 관심 섬이 >1-2μm만큼 각 프레임 사이에서 x- 및/또는 y 방향으로 이동), 먼저 StackReg 플러그인(P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne)으로 이미지 스택을 처리하여 첫 번째 위치에 따라 스택의 각 이미지의 중심을 재조정합니다( 플러그인 클릭| 스택레지 | 번역 | 확인).
참고: μm 이하 드리프트조차도 견인력의 최종 계산에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 특히 이 xy 드리프트가 예상 소음 범위를 벗어나는 더 뻣뻣한 젤에서는 더욱 그렇습니다. 이 코드는 드리프트가 제거된 후 이미지를 저장하며, 이 이미지를 분석할 새 이미지 스택으로 만들 수 있습니다.
- 형광 이미지에 표류가 있는 경우(즉, 관심 섬이 >1-2μm만큼 각 프레임 사이에서 x- 및/또는 y 방향으로 이동), 먼저 StackReg 플러그인(P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne)으로 이미지 스택을 처리하여 첫 번째 위치에 따라 스택의 각 이미지의 중심을 재조정합니다( 플러그인 클릭| 스택레지 | 번역 | 확인).
- 밝은 필드 및 형광 이미지 스택을 CTFTimelapse.m(보충 파일 2)에 입력합니다.
- 이미지 스택이 7행에 있는 파일 디렉토리를 지정합니다.
- 라인 8과 9에서 형광 이미지 스택과 해당 brightfield 형광 스택의 이름을 각각 지정합니다.
- PAA 젤 강성(Pa)을 지정합니다.
- 가장 자주 사용되는 PAA 하이드로젤의 몇 가지 상이한 탄성 모듈리를 포함하는 라인 11-14에서, 분석되는 이미지에서 겔의 탄성 모듈러스를 제외한 모든 것을 주석 처리(라인의 시작 부분에서 타입 %) 한다. 또는 아직 존재하지 않는 경우 탄성 계수를 추가하고 나머지는 주석 처리하십시오 (테스트 이미지의 경우 3658.19 Pa).
- 15행에 점 반경(m)을 지정합니다(테스트 이미지의 경우 1 × 10-6m ).
- 라인 16에서 가능한 최대 도트 직경(μm)을 지정합니다(테스트 이미지의 경우 2.5μm).
- 픽셀 비율(μm/픽셀)을 지정합니다.
- 이전에 사용된 이미징 설정에 따라 몇 가지 다른 이미지 픽셀 비율을 포함하는 17-20행에서는 분석 중인 이미지의 픽셀 비율을 제외한 모든 이미지를 주석 처리(줄 시작 부분에 % 입력 )합니다. 또는 아직 존재하지 않는 경우 사용된 픽셀 비율을 추가하고 나머지는 주석 처리하십시오(테스트 이미지의 경우 0.1613μm/픽셀).
- 35행과 87행에서 필요한 이미지 처리 파일이 있는 파일 디렉토리를 지정하십시오.
참고: 형광 이미지 스택으로부터, 코드는 각 형광 점의 위치를 결정하고 스택(20) 내의 각 이미지 사이의 각 점의 이동을 추적한다. 마이크로컨택트 인쇄점의 초기 위치는 하이드로겔(32)로 적절히 이송될 때 변형되지 않기 때문에 알려져 있다.
- 프로그램이 점을 찾으면 두 개의 그림과 하나의 대화 상자가 나타날 때까지 기다립니다. 그림 1 을 사용하여 프로그램이 올바른 점을 찾았고 없는 점을 많이 찾지 못했는지 확인합니다. 그림 2 를 사용하여 프로그램이 세포 견인력을 찾고 계산하는 데 도움이 되는 직사각형 격자를 선택합니다.
참고 : 그림 1 은 프로그램에 의해 발견 된 점 (빨간색이 될 것)이 그 위에 오버레이 된 셀의 밝은 필드 이미지 입니다 (그림 3A 참조). 도 2는 도 1 에 도시된 바와 동일한 점들을 표시하지만 배경에 밝은 필드 이미지가 없는 이미지이다.- 대화 상자가 지점을 선택한 후 Enter 키를 누르라는 메시지가 표시 될 때까지 기다리십시오.이 경우 각 점은 프로그램에서 찾은 빨간색 점 중 하나이며 그 안에는 Enter 라고 표시된 하나의 큰 단추가 있습니다.
- 그림 2에서 네 개의 서로 다른 점을 선택하여 해당 패턴에 셀/클러스터를 포함하여 사각형 격자를 만듭니다. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 각 점을 하나씩 선택하고 앞서 언급한 대화 상자의 단추에서 Enter 키를 눌러 확인합니다. 첫 번째와 두 번째 점뿐만 아니라 첫 번째와 세 번째 점 사이에 얼마나 많은 점이 있는지 카운트를 유지하십시오.네 모서리 점이 모두 선택되면 프로그램에서이 값을 묻습니다. 이 값을 명령 창에 입력합니다(점 수를 입력하고 메시지가 표시되면 키보드의 Enter 단추를 클릭합니다).
- 직사각형 격자가 선택되면 스크립트가 형광 점의 위치를 기반으로 그리드 내에서 찾은 견인력을 계산할 때까지 기다립니다. 스크립트는 먼저 각 점의 기하학적 중심의 변위 벡터 (u)를 찾은 다음 Eq (1)를 사용하여 해당 견인력 벡터 (F)를 계산합니다.
(1)
여기서 E 는 PAA 기판의 영 모듈러스이고, a 는 형광 도트 마커의 반지름이고, ν 는 PAA 기판(32)에 대한 푸아송의 비율이다. Eq(1)은 기판이 무한 탄성 반쪽 공간이고, 각 원형 도트 마커의 중앙에 견인력이 가해지고, 도트 마커 사이의 간격이 충분히 커서 각각의 변위가 서로 상호작용하지 않는다고 가정한다(23).
참고: 여기에 설명된 실험에서는 반지름 a = 1μm 및 6μm 중심간 간격의 점 마커가 사용됩니다. 셀/클러스터 내부의 트랙션 포스 화살표는 셀의 중심을 향해 안쪽을 향하여 존재해야 하며, 셀/클러스터 외부 영역에는 트랙션 화살표가 없어야 합니다(그림 3C-E 참조). 셀/클러스터 내부에서 바깥쪽을 가리키는 견인 화살표 또는 셀 외부에 존재하는 많은 큰 견인 화살표는 잘못 선택된 직사각형 격자를 나타냅니다. - 올바른 견인 필드가 발견되면 커서를 사용하여 셀 내의 모든 견인 화살표를 포함하는 셀/클러스터 주변의 적절한 관심 영역(ROI)을 선택합니다.
- ROI를 그리려면 필요한 만큼 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 원하는 만큼 많은 면을 가진 다각형 모양을 그리거나, 모서리 또는 가장자리를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 그린 후 모양을 조정하거나 ROI를 이동합니다. ROI가 그려지면 두 번 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 스택의 다음 이미지로 이동합니다. brightfield 스택의 모든 이미지에 대해 이 작업을 반복합니다.
참고: 이 코드는 원본 이미지 스택과 동일한 폴더에 있는 각 시점의 트랙션력 및 변위 데이터를 저장하므로 추가로 분석할 수 있습니다.
- ROI를 그리려면 필요한 만큼 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 원하는 만큼 많은 면을 가진 다각형 모양을 그리거나, 모서리 또는 가장자리를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 그린 후 모양을 조정하거나 ROI를 이동합니다. ROI가 그려지면 두 번 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 스택의 다음 이미지로 이동합니다. brightfield 스택의 모든 이미지에 대해 이 작업을 반복합니다.
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Representative Results
E = 3.6 kPa의 영 모듈러스와 ν = 0.445의 푸아송 비율을 갖는 PAA 하이드로젤은 이러한 감산 마이크로패터닝 방법에 의해 사용하기 위해 제조되었다. 하이드로젤은 두께가 ~100μm로 제작되어 여기에 사용된 이미징 설정으로 이미징할 수 있으며 셀이 젤 아래의 단단한 커버슬립을 감지하는 것을 방지하여 세포 강성 감지23,33에 초점을 맞춘 연구에서 문제를 일으킬 수 있습니다. 다른 많은 강성 수준(최대 30kPa)의 겔은 간접 마이크로패터닝 방법(34)을 사용하여 성공적으로 제조되고 이미징되었으므로, 이 방법은 단지 3.6 kPa 하이드로젤의 사용에만 국한되지 않는다. 커버슬립은 글루타르알데히드로 미리 처리되어 상단 패턴화된 커버슬립을 제거할 때 젤이 하부 커버슬립에 고정된 상태로 유지되도록 합니다(그림 2C,D).
클러스터 내의 세포 견인력을 시각화하고 측정하기 위해, 3.6 kPa 하이드로젤을 형광 피브로넥틴(도 2A-D)으로 간접적으로 패터닝하여 소정 크기 및 형상의 섬 패턴을 생성하였다(도 2E). 다른 유형의 단백질은 또한 이들 연질 하이드로젤(21,35,36,37,38) 상에 패터닝될 수 있다. 전사된 패턴의 품질은 PDMS 스탬프가 주조되는 마스터 몰드의 충실도와 직접 관련이 있습니다. SU-8 박리를 한 금형은 이러한 박리 된 금형에서 주조 된 우표로 만든 패턴의 품질이 저하되는 것을 볼 수 있습니다. 예를 들어, 디라미네이트된 SU-8을 갖는 몰드는 종종 소정의 섬 사이에 패턴화되지 않은 피브로넥틴의 섹션을 포함하는 마이크로패턴을 생성할 것이다. 젤에 캐스팅되는 경우, 이러한 패턴은 섬 미세 패턴 외부의 영역에서 젤에 세포 부착을 허용합니다. 이 때문에, 완전히 또는 대부분 손상되지 않은 섬 패턴에 부착된 세포 클러스터를 이미징하는 것이 우선순위였다.
소 혈관 평활근 세포 (BVSMCs)는 클러스터 형성을 촉진하기 위해 약 60-80 × 103 세포 / 젤의 밀도로이 하이드로 젤에 시딩되었으며 이미징 전에 18-24 시간 동안 부착되도록했습니다. 실험 직전에 세포를 살아있는 세포 핵 염색으로 염색하여 살아있는 세포를 확인하고 각 클러스터의 세포 수를 결정할 수있었습니다. 세포가 있거나없는 마이크로패턴 섬을 이미지화하고 분석하였다. 세포가 없는 섬을 이미징하면 3.6kPa 겔에 대한 견인력 계산에 존재하는 잡음의 계산이 가능해졌습니다. 그런 다음 이러한 가양성 변위 측정값을 사용하여 변위를 제외해야 하는 적절한 임계값을 결정할 수 있습니다.
0.3 μm는 일반적으로 위양성 변위 측정으로 이어지는 패턴 불륜을 제거하기에 충분하다는 것이 밝혀졌습니다. 그렇게하면 낮은 힘 트랙트가 손실 될 수 있지만 가양성 트랙트를 제거하는 데 필수적입니다. 이미징 할 때, 대부분 손상되지 않은 섬 패턴의 세포 클러스터가 우선 순위가 매겨졌고 (즉, 어떤 점이라도 많은 것을 놓치지 않는 것들) 세포가없는 패턴은 대부분 손상되지 않았습니다. 각 ROI는 2시간 동안 5분마다 한 번씩 이미지화되었습니다. 연장된 타임랩스 실험 동안 세포와 패터닝된 PAA 겔의 이미지를 캡처하는 데 사용된 현미경은 자동 스테이지, 형광 광원, 카메라 및 표준 현미경 소프트웨어를 사용한 형광 현미경이었다. 이 현미경에는 형광의 많은 다른 색깔을 관찰하는 관례 여과기의 세트가 있습니다. 세포 및 패터닝된 하이드로젤을 보기 위해 사용된 목적은 40x 수침 목표, NA = 1.15이다. 이 현미경은 또한 긴 실험 동안 세포를 생존 가능하게 유지하기 위해 맞춤형 온도 (37 °C), 습도 (70 %)- 및CO2 (5 %) 조절 시스템을 갖추고 있습니다.
마이크로패턴 섬의 이미지로부터 견인력을 계산하기 위해, 이미지 분석 소프트웨어는 시간에 따른 형광 피브로넥틴 점들의 변위를 추적하기 위해 사용되었다. 형광 점의 변위와 점들이 패턴화되는 PAA 겔의 강성을 알면, 프로그램은 PAA 기질 상의 개별 세포 및 클러스터 둘 다에 의해 부여되는 견인력의 값을 결정할 수 있다. 그러나 프로그램이 견인 값을 결정할 수 없게되는 두 가지 방법이 있습니다. 주어진 관심 프레임 내에 너무 많은 점이 변형되면 프로그램이 분석 된 이미지의 대부분의 점에 의존하여 변형되지 않기 때문에 프로그램은 힘을 계산하기 위해 고군분투합니다. 더욱이, 두 점이 서로 너무 가까우면(≤2μm20의 중심 간 거리), 개별 점들의 변위가 서로 간섭할 수 있고, 따라서 그들의 실제 변위 값과 그에 따른 트랙션 값의 정확한 결정을 방해할 수 있다. 마이크로 패턴이 잘 이격 된 점으로 설계되는 한, 세포는 점을 너무 많이 대체하여 부드러운 기판에서도 서로 가까워 질 수 없어야합니다.
그림 3은 제거 패터닝 방법의 기능을 보여줍니다. 여기서, 소정의 형상의 고립되고 잘 정의된 섬 패턴을 제작하는 이 방법의 능력은 도 3B-E에 도시되어 있으며, 여기서 피브로넥틴 부착 도트는 섬의 원하는 영역 내에만 존재한다. 접착 점들의 이러한 고립된 섬들은 도 3A에 도시된 바와 같이, 클러스터 형상의 더 나은 제어를 추가로 허용한다. 섬의 모양과 크기가 일정하기 때문에 섬 패턴이 클러스터 성장 영역을 제한하기 때문에 섬에 부착되고 자라는 세포 클러스터도 일관된 모양을 갖는 경향이 있습니다. 마지막으로, 도 3B-E는 또한 세포 견인력을 계산하는데 사용되는 이들 섬들의 능력과 이러한 견인력이 시간에 따라 변하는 경향을 보여준다. 여기서, 클러스터의 견인력은 섬의 가장자리 주변에서 가장 큽니다. 이는 클러스터의 가장자리에 있는 셀이 클러스터 내부에 있는 셀보다 클러스터의 다른 셀과의 상호 작용이 적기 때문에 예상됩니다. 따라서, 가장자리에 있는 이들 세포는 내부에 있는 세포보다 세포골격 수축에 반응하여 기질 상에 더 큰 힘을 발휘한다.
그림 1: 포토마스크 디자인. (A) 여기에 사용된 포토마스크 설계의 전반부를 표현한 것으로, 6μm 중앙에서 중앙으로 이격된 2μm 직경의 점들의 개별 격자입니다. 여기에 표시된 이미지는 디자인의 작은 부분 일 뿐이지만이 그리드는 포토 마스크의 총 1.5 x 1.5cm 공간을 채 웁니다. (B) 포토 마스크 디자인의 후반부의 표현; 여기에 6 x 6 점의 6 개의 작은 섬이 있습니다. 포토 마스크에는 6 x 6 (여기에 표시됨), 12 x 12, 25 x 25 및 42 x 42 도트와 같은 여러 가지 섬 크기가 있습니다. 각 섬 크기의 균등한 간격 (섬 사이에 50μm) 배열은 1.5 x 0.375cm의 공간을 차지하며 다른 섬의 배열은 50μm로 분리됩니다. 각 섬의 점들은 직경이 2μm이고 중심에서 중심까지 6μm 이격되어 있다. A와 B에 설명된 마스크의 두 섹션은 0.75cm로 구분됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 감산 마이크로 접점 인쇄. (A) PDMS 스탬프를 글루타르알데히드로 처리하고 형광 피브로넥틴 용액으로 골고루 코팅된 유리 커버슬립과 접촉시킨다. (b) 커버슬립으로부터 제거되면, PDMS 스탬프는 커버슬립의 표면에서 대부분의 형광 피브로넥틴을 제거하여, PDMS 스탬프의 설계에 의해 미리 결정된 위치에만 미크론 크기의 단백질 도트를 남긴다. (c) 패턴화된 커버슬립은 PAA 프레폴리머 및 NHS 용액과 접촉하여 배치된다. (d) 일단 PAA 겔이 완전히 중합되도록 허용되면, 상부 커버슬립이 제거되고, 피브로넥틴의 패턴이 PAA 겔 표면 상에 인쇄된다. (e) 영 모듈러스가 3.6 kPa인 PAA 하이드로젤 상에 고르게 이격된 점들로 구성된 이산 섬 패턴의 예. 스케일 바 = 20 μm. 약어: PDMS = 폴리디메틸실록산; PAA = 폴리아크릴아미드; NHS = N-하이드록시숙신이미드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 섬 마이크로패턴 상의 세포 분석. (A) 3.6 kPa의 영 모듈러스를 갖는 PAA 하이드로젤 상의 형광 피브로넥틴 섬 마이크로패턴 상에 오버레이된 3개의 BVSMCs 클러스터의 밝은 필드 이미지가 도시되어 있다. 도트는 직경이 2μm이고 중심에서 중심까지 6μm로 분리됩니다. (B) 형광 패턴은 섬의 다수의 피브로넥틴 포인트가 BVSMCs에 의한 힘의 적용으로 인해 변위되었음을 보여준다. (C) 시점 1에서의 접착 지점에 가해지는 견인력(2시간 실험의 시작). 이러한 힘 벡터의 방향은 착색된 화살표의 방향으로 표시된다. 그 크기는 화살표 색상과 색상 막대의 해당 값으로 표시됩니다 (모든 힘 값은 nN입니다). 벡터 길이는 각 시점에 대해 프로그램에 의해 계산된 최소 및 최대 힘에 기초하여 상대적이다. (d) 시점 13에서의 동일한 클러스터의 견인력(2시간 실험을 통한 중간) (E) 시점 25에서의 동일한 클러스터의 견인력(2시간 실험의 종료). 약어 = BVSMCs = 소 혈관 평활근 세포; PAA = 폴리아크릴아미드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 피브로넥틴 라벨링을위한 계산기 이것은 피브로넥틴을 표지할 때 사용할 Alexa488 형광 염료의 정확한 양을 계산하기 위한 도구입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: CTFTimelapse.m 이것은 섹션 5 (이미지 분석)에 설명 된대로 세포 견인력을 계산할 수있는 이미지 처리 파일입니다. 여기에는 원하는 점 격자를 선택하고(단계 6.3-6.3.2), CTF 계산을 위해 관심 영역을 선택하는 단계(단계 6.5 및 6.5.1)가 포함됩니다. 다음 모든 보충 파일은이 스크립트 또는 그 안에 사용 된 다른 함수 중 하나에 의해 직접 호출됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 3 : analyze_initial_image_4.m 이 함수는 CTFTimelapse.m에 의해 호출되며, 그 목적은 변형된 그리드 패턴의 이미지 스택의 첫 번째 프레임에서 그리드의 형광 점을 찾아 원래의 변형되지 않은 그리드 패턴과 일치하도록 정렬하는 것입니다. 이를 통해 이미지 스택의 첫 번째 프레임에 대한 견인력 계산이 가능합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 4 : analyze_subsequent_images.m 이 함수는 CTFTimelapse.m에 의해 호출되며, 그 목적은 첫 번째 이후에 변형 된 그리드 패턴의 이미지 스택의 모든 프레임에서 그리드의 형광 점을 찾아 정렬하는 것입니다. 이를 통해 첫 번째 이후 이미지 스택의 모든 프레임에 대한 트랙션력 계산이 가능합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 5: bpass.m 이 함수는 analyze_initial_image_4.m과 analyze subsequent_images.m에 의해 호출되며, 그 목적은 변형된 그리드 패턴의 이미지 스택을 처리하는 실제 공간 대역통과 필터를 구현하는 것입니다. 이 필터는 픽셀 노이즈 및 장파장 이미지 변화를 억제하면서 특성 크기의 정보를 유지합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 6: CellBoundary.m 이 함수는 CTFTimelapse.m에 의해 호출되며, 그 목적은 프로그램 사용자가 견인력을 계산할 셀 / 클러스터 주위에 관심 영역을 그릴 수있게하는 것입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 7: pkfnd.m 이 함수는 analyze_initial_image_4.m과 analyze_subsequent_images.m 모두에서 호출되며, 그 목적은 픽셀 수준의 정확도로 이미지에서 로컬 최대값을 찾는 것입니다. 이 피크는 cntrd.m에 의해 CTFTimelapse.m에 대한 형광 그리드 패턴을 찾는 데 사용됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 8: cntrd.m 이 함수는 analyze_initial_image_4.m과 analyze_subsequent_images.m 모두에 의해 호출되며, 그 목적은 이미지에서 밝은 점의 중심을 하위 픽셀 정확도로 찾는 것입니다. 이는 단계 6.3에 설명된 바와 같이 CTFTimelaspe.m에 의한 형광 격자 패턴의 위치를 허용한다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 9: FourCorners.m 이 함수는 analyze_initial_image_4.m과 analyze_subsequent_images.m 모두에 의해 호출되며, 그 목적은 사용자가 선택한 격자(단계 6.3-6.3.2)를 가져와 두 개의 직교 축에서 각 모서리 점 사이의 거리를 계산하는 것입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 10: track.m 이 함수는 analyze_initial_image_4.m과 analyze_subsequent_images.m 모두에 의해 호출되며, 그 목적은 프레임 사이의 형광 격자 패턴에서 점의 움직임을 추적하는 것이며, 이는 해당 견인력을 계산하는 데 필수적입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
PAA 하이드로젤을 간접적으로 패터닝하는 개선된 방법이 본 논문에 기재되어 있다. 이 접근법은 20,35,36,37,38,39,40,41,42 이전에 사용 된 메소드를 기반으로합니다. 주요 변화는 PDMS 스탬프가 이제 단백질을 제거하고 패턴을 직접 스탬핑하는 대신 중간 기질에 원하는 패턴을 남겨 두는 데 사용된다는 것입니다. 이를 통해 고충실도 마이크로 패턴을 훨씬 더 일관되게 만들고 이전에는 두 가지 생산 단계가 필요했던 격리 된 마이크로 패턴 섬을 만들 수 있습니다. 이 방법으로 만든 섬 패턴의 모양과 크기는 이전의 두 단계 방법으로 만든 것보다 더 쉽게 제어 할 수 있습니다. 새로운 기술은 이전 기술보다 마이크로 프린팅 중에 가해지는 압력의 양에 덜 민감합니다. 두 번째 장점은이 제거 방법이 한 단계만으로 통제 된 모양과 크기의 섬 패턴을 만들 수 있다는 것입니다. 대조적으로, 이전의 방법들은 섬을 만들기 위해 퇴적을위한 스탬핑과 제거를위한 후속 스탬핑을 포함하여 두 단계가 필요했으며,이 섬의 모양은 제거 방법으로 만든 것보다 덜 정확합니다.
이 방법의 가장 큰 단점은 새로운 스타일의 PDMS 스탬프를 성형하는 데 사용 된 마스터의 수명이 이전 스탬핑 방법에서 사용 된 것보다 짧아 보인다는 것입니다. 이것은 제거 방법에 사용 된 새 마스터의 모양에 기인 할 수 있습니다. 오래된 마스터는 동일한 간격의 5 μm 깊이의 원형 구멍으로 구성된 SU-8의 1.5 x 1.5cm 영역으로 구성되었으며, PDMS로 주조 할 때 동일한 높이의 균등하게 이격 된 원통형 포스트로 구성된 스탬프를 만듭니다. 반대로, 새로운 마스터는 1.5 x 1.5cm 높이의 5 μm 높이의 SU-8 원통형 포스트로 구성되며, PDMS로 주조 될 때 균일 한 간격의 구멍으로 구성된 스탬프를 만듭니다.
마스터의 구조의 이러한 변화로 인해 SU-8은 이전 방법보다 표면에서 훨씬 쉽게 박리되는 경향이 있음을 발견했습니다. 이를 방지하기 위해 실리콘 웨이퍼를 플라즈마 어셔에서 표면 처리하는 것과 같이 SU-8에 대한 결합에 더 적합하게 만드는 등의 예방 조치가 취해졌다. 웨이퍼의 표면은 또한 스탬프의 제거시 SU-8이 PDMS에 달라 붙는 것을 방지하기 위해 PDMS에서 첫 번째 주조 전에 실란화되었습니다. 그럼에도 불구하고, 실리콘 웨이퍼로부터의 SU-8 박리는 PDMS에서 반복 주조 후에 관찰되었으며, 현재 마스터가 손실되기 전에 새로운 실리콘 웨이퍼가 만들어지도록 주의해야 한다. 이러한 박리를 피하는 한 가지 가능한 방법은 앞서설명한 PDMS 이중 캐스트 방법(43)을 사용하는 것이지만, 이 다른 방법에는 한계가 있다.
이 방법(및 견인력(44)을 측정하기 위해 변형가능한 하이드로겔을 사용하는 다른 방법)의 또 다른 단점은 트랙션 필드가 실험 소음으로 인해 기계적 평형에 있지 않다는 것이다. 따라서, 견인력이 계산된 후에 평형화된 견인장을 얻기 위해서는 후처리 분석이 필요하다. 견인력의 균형을 맞추는 한 가지 방법은 최소 제곱 방법을 사용하여 평형을 만족시키는 측정에 가장 가까운 힘을 얻는 것입니다. 그 결과, 측정된 견인력의 크기 및 배향이 변화된다(45).
세포 견인력을 계산하는이 방법에는 한계가 있습니다. Eq. (1)을 사용하여 세포 견인력을 정확하게 결정하기 위해(단계 5.4), 패턴은 하나의 접착 점의 변위가 바로 인접한 점의 변위에 큰 영향을 미치지 않도록 설계되어야 한다. 이론적으로, 중심에서 작용하는 접선력으로 인해 무한 반쪽 공간의 표면 상의 원형 접착 영역의 변위는 원의 중심으로부터의 반경 거리가 증가함에 따라 감소한다(23). 구체적으로, 푸아송의 비율이 ~0.445인 기판(여기에 설명된 것과 같은)의 경우, 원형 영역의 가장자리에서의 변위는 영역의 중심에서의 변위가 대략 삼분의 일이다. 그러나 이론적 예측은 원형 영역을 넘어서지 않습니다. 따라서, 이론적으로 결정된 변위 크기의 감소 추세(이론적으로 도 23)는 접착 원의 가장자리를 넘어 계속된다고 가정한다. 여기에 설명된 마이크로패턴 설계에서, 6 μm 중심-중심 이격된 2 μm 원형 도트가 사용된다. 이 간격의 이유는 점의 중심에서 6μm 거리에서의 변위가 점의 중심에서의 변위의 약 1/12일로 추정되기 때문이며, 이는 인접한 점의 변위 값에 영향을 줄 정도로 충분히 작은 것으로 가정된다. 그러나, 세포에 의해 가해지는 견인력이 기판 상의 접착 점을 너무 많이 대체하여 이들 사이의 중심간 거리가 2 μm 미만이 될 수 있다. 이 경우, 서로 간섭하지 않는 인접한 접착점의 변위에 대한 가정은 유지되지 않으며, 견인력은 단계 6.4 ( Eq (1))에서 주어진 방정식으로 정확하게 계산할 수 없습니다.
제안 된 기술은 세포 견인력을 측정하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 이러한 힘은 개별 세포와 클러스터 모두의 기계적 환경에 대한 통찰력을 제공하고 다양한 유형의 세포가 기계적 안정성을 유지하는지 여부와 방법을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 항상성 수준의 세포 긴장을 유지하는 것은 많은 세포 과정에 필수적이며,이 긴장성 항상성의 상실은 죽상 동맥 경화증, 천식 및 암과 같은 다양한 질병과 관련이 있습니다 9,10,12. 장력 항상성은 설정점(46) 주위의 낮은 시간적 가변성으로 일관된 수준의 장력을 유지하는 세포 또는 세포 클러스터의 능력으로 정의된다.
이러한 간접 마이크로패터닝 방법은 개별 및 다세포 수준 모두에서 장력 항상성을 유지하는 다양한 세포 유형의 능력을 결정하는데 사용될 수 있다. 이것은 시간에 따른 세포 견인 필드의 값의 변화를 추적 한 다음 변동 계수 (CV)를 사용하여 견인 필드의 시간적 변동을 정량화함으로써 수행되며, 이는 견인 필드의 크기에 대한 표준 편차의 비율을 평균값으로 나타냅니다. 견인력의 크기 및 수축 모멘트의 크기(견인력의 첫 번째 모멘트)의 합은 트랙션 필드(46)의 크기에 대한 스칼라 메트릭으로서 사용된다. 트랙션 필드의 CV가 타임랩스 실험을 통해 0에 가깝게 유지된다면, 이는 세포/클러스터가 시간(46)에 걸쳐 긴장성 항상성을 유지한다는 것을 보여준다.
요약하면, 소프트 하이드로젤의 간접 마이크로패터닝을 위한 이 새로운 방법은 이전의 방법보다 패턴화된 하이드로젤을 생성하는 더 간단하고 효율적인 방법을 제공한다. 이 방법을 개선하고 확장하기 위해 취할 수있는 특정 단계가 있습니다. 주로 실리콘 마스터의 제조 공정을 수명을 연장하는 방식으로 개선하면이 마이크로 패터닝 방법의 주요 단점이 제거됩니다. 이 방법을 확장하는 방법에 관해서는, 여기에 설명 된 사각형 섬을 넘어 다른 섬 모양을 탐험하면이 방법의 다양성이 향상 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 데이터 분석에 대한 유용한 토론과 도움을 주신 Boston University Department of Mechanical Engineering의 Paul Barbone 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NSF 보조금 CMMI-1910401에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl)trimethoxysilane | Sigma Aldrich | #281778 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | #05-539-12 | |
| 4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask | Advance Reproductions Corporation | N/A | Custom-designed mask |
| 6 Well Plates | Fisher Scientific | #07-200-83 | |
| Acetone | Fisher Scientific | #A18P-4 | |
| Acrylamide Solution, 40% | Sigma Aldrich | #A4058 | |
| AlexaFluor 488 | Thermo Fisher | #A20000 | |
| Aminonium Persulfate | Fisher Scientific | #BP179-25 | |
| Bisacrylamide | Fisher Scientific | #PR-V3141 | |
| Ethanol | Greenfield Global | #111000200C1GL | |
| Glass Coverslips, 25 mm round | Fisher Scientifc | #12-545-102 | |
| Glass Coverslips, 30 mm round | Warner | #64-1499 | |
| Hamamatsu ORCA-R2 Camera | Hamamatsu | #C10600-10B | |
| Human Plasma | Valley Biomedical | #HP1051P | Used to isolate fibronectin |
| Hydrochloric Acid, 1.0 N | Millipore Sigma | #1.09057 | |
| ImageJ | Wayne Rasband | #1.53n | |
| Interchangeable Coverslip Dish Set | Bioptechs | #190310-35 | |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | #06-666-11C | |
| Mask Alinger | Karl Suss | #MA6 | |
| Matlab 2021 | Mathworks | #R2021a | |
| MetaMorph Basic | Molecular Devices | #v7.7.1.0 | |
| N-hydroxysuccinimide ester | Sigma Aldrich | #130672-5G | |
| NucBlue Live Cell Stain | Thermo Fisher | #R37605 | |
| Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope | Olympus | #IX81 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | #52-1308-00 | |
| Photoresist Spinner Hood | Headway Research | #PWM32 | |
| Plasma Cleaner | Harrick | #PDC-001 | |
| Plasma Etcher | TePla | #M4L | |
| Prior Lumen 200Pro Light Source | Prior Scientific | #L200 | |
| Silicon Wafers, 100 mm | University Wafer | #809 | |
| SU-8 2005 | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9463827 | |
| SU-8 Developer | Kayaku Advanced Materials Inc. | #NC9901158 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Essex Brownell | #DC-184-1.1 | |
| Tetramethylethylenediamine | Fisher Scientific | #BP150-20 | |
| Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | #448931 | |
| UAPON-40XW340 Objective | Olympus | #N2709300 | |
| UV Flood Exposure | Newport | #69910 | |
| Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm | Ted Pella, Inc. | #19395-40 |
References
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