Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mønstergenerering for mikropattern trekkraftmikroskopi

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/63628
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

Vi beskriver forbedringer av en standardmetode for måling av cellulære trekkraftkrefter, basert på mikrokontakttrykk med et enkelt subtraktivt mønstertrinn av punktmatriser av ekstracellulære matriseproteiner på myke hydrogeler. Denne metoden gir enklere og mer konsistent fabrikasjon av øymønstre, avgjørende for å kontrollere celleklyngeform.

Abstract

Micropattern trekkraft mikroskopi gir kontroll over formen på enkeltceller og celleklynger. Videre tillater evnen til å mønstre på mikrometerlengdeskalaen bruk av disse mønstrede kontaktsonene for måling av trekkraftkrefter, da hver mikropatterned prikk tillater dannelse av en enkelt fokal vedheft som deretter deformerer den myke, underliggende hydrogelen. Denne tilnærmingen har blitt brukt til et bredt spekter av celletyper, inkludert endotelceller, glatte muskelceller, fibroblaster, blodplater og epitelceller.

Denne gjennomgangen beskriver utviklingen av teknikker som tillater utskrift av ekstracellulære matriseproteiner på polyakrylamidhydrgeler i et vanlig utvalg av prikker av forhåndsspesifisert størrelse og avstand. Siden mikrometerskalamønstre er vanskelige å skrive ut direkte på myke substrater, genereres mønstre først på stive glassdeksler som deretter brukes til å overføre mønsteret til hydrogelen under gelering. For det første er den opprinnelige mikrokontaktutskriftsmetoden for å generere matriser med små prikker på dekslene beskrevet. Et annet trinn som fjerner det meste av mønsteret for å forlate øyer med små prikker, er nødvendig for å kontrollere formene til celler og celleklynger på slike matriser med mønstrede prikker.

Deretter beskrives en utvikling av denne tilnærmingen som gjør det mulig for generering av øyer med prikker ved hjelp av et enkelt subtraktivt mønstertrinn. Denne tilnærmingen er sterkt forenklet for brukeren, men har ulempen med en redusert levetid for mesterformen som trengs for å lage mønstrene. Til slutt beskrives beregningsmetodene som er utviklet for analyse av bilder av fordrevne prikker og etterfølgende cellegenererte trekkraftfelt, og oppdaterte versjoner av disse analysepakkene er gitt.

Introduction

De fleste celle fenotyper utøver trekkraft krefter på deres miljø. Disse trekkraft kreftene genereres av en celles kontraktile cytoskeleton, som er et nettverk av aktin og myosin, og andre filamentøse biopolymerer og krysskoblingsproteiner 1,2,3,4. Krefter generert i cellen kan overføres til det ekstracellulære miljøet eller tilstøtende celler, hovedsakelig via transmembranproteiner som integriner og kaderiner, henholdsvis 5,6. Hvordan en celle sprer seg eller trekker seg sammen - og størrelsen på trekkraftkreftene knyttet til disse bevegelsene - er resultatet av en intim samtale med miljøet, som i stor grad avhenger av type og mengde protein som er tilstede i den ekstracellulære matrisen (ECM) 7,8 og stivheten til ECM. Faktisk har trekkraftmikroskopi blitt et uvurderlig verktøy for å forstå cellerespons på lokale stimuli som substratstivhet, pålagt mekaniske belastninger og stammer, eller kontakt med andre celler. Denne informasjonen er direkte relevant for forståelsen av sykdommer som kreft og astma 9,10,11,12.

Et system som kan brukes til å måle kraftindusert deformasjon av et substrat av kjente materialegenskaper, er nødvendig for å beregne trekkraftkrefter. Disse endringene må spores over tid, noe som krever både bilde- og bildebehandlingsteknikker. En av de første metodene som ble brukt for å bestemme cellulære trekkraftkrefter var observasjon og analyse av sammentrekningen av kollagenhydrgeler frøet med celler, selv om denne metoden bare var semikantiv13. En annen, mer raffinert metode var å måle trekkraftkreftene som utøves av enkeltceller ved å bestemme kreftene som følge av deformasjon av et tynt ark silikon14. Senere ble det utviklet mer kvantitative måleteknikker, og disse metodene tillot også bruk av myke hydrogeler som polyakrylamid (PAA) 12,15,16. Ved bruk av disse myke materialene kan trekkraftkrefter bestemmes fra den kraftinduserte forskyvningen av tilfeldig fordrevne perler innebygd i hydrogelen og gelens mekaniske egenskaper16,17. Et annet fremskritt kom med utviklingen av mikropostmatriser laget av myk polydimetylsiloksan (PDMS) slik at deres avbøyning kunne måles og konverteres til kraft ved hjelp av stråleteorien18.

Til slutt ble metoder for mikropatterning av myke hydrogeler utviklet da disse tilnærmingene tillater kontroll av kontaktområdene for celleadhesjon. Ved å måle deformasjonen av mikropatternen i en celles kontaktområde, kan trekkraftkrefter enkelt beregnes fordi et kraftfritt referansebilde ikke er nødvendig19. Denne metoden har blitt allment vedtatt da den tillater indirekte mønster av et vanlig utvalg av mikron-størrelse, diskret fluorescerende proteinadhesjonspunkter på PAA geler for måling av cellulære trekkraftkrefter20. For å beregne disse kreftene erdet utviklet en bildebehandlingsalgoritme, som kan spore bevegelsene til hver mikropatterned prikk uten å kreve brukerinndata.

Selv om denne metoden er enkel for å lage hele rutenett med prikkmønstre, er det mer komplisert når mønstre av isolerte flekker (eller øyer) av prikker er ønsket. Mikropatterned øyer er nyttige når kontroll av form, og til en viss grad av størrelse, av klynger av celler er nødvendig. For å skape disse øyene, nødvendiggjør den nevnte metoden for mikrokontaktutskrift to forskjellige trinn: i) ved hjelp av ett PDMS-stempel for å lage et høygjengivelsesmønster av prikker på en coverlip, og deretter ii) ved hjelp av et annet annet PDMS-stempel for å fjerne de fleste av disse prikkene, og etterlater isolerte øyer med prikker21. Vanskeligheten med å skape øyer med denne opprinnelige metoden er sammensatt av det faktum at det er utfordrende å lage konsistente rutenettmønstre i det første trinnet i prosessen. Mikrotrykksstempler består av en rekke sirkulære mikroposter, hvis diameter tilsvarer ønsket punktstørrelse. Disse frimerkene er deretter belagt med et jevnt lag protein og deretter stemplet med en presis mengde trykk på behandlede deksler for å skape ønsket mønster. På den ene siden kan påføring av for mye trykk på stempelet føre til ujevn proteinoverføring og dårlig mønstergjengivelse på grunn av søylespenning eller sagging mellom søyler, noe som fører til kontakt med glasset. På den annen side resulterer det i lite eller ingen proteinoverføring og dårlig mønstergjengivelse å bruke for lite trykk. Av disse grunnene er det ønskelig med en overføringsprosess som konsekvent kan brukes til å lage mikropatterner av høy kvalitet av isolerte øyer med prikker på bare ett trinn.

Heri er en metode beskrevet for indirekte mikropattering av øyer av mikron-størrelse fluorescerende proteinadhesjonspunkter på en PAA gel som er mer konsistent og allsidig enn tidligere utviklede metoder. Mens eldre indirekte mikropatterningsmetoder er avhengige av overføring av proteinmønstre fra et PDMS-stempel til et mellomliggende substrat, bruker metoden som introduseres her PDMS-frimerker i stedet som et fartøy for proteinfjerning, ikke tillegg. Dette gjøres ved først å fundamentalt endre strukturen til PDMS-stemplene som brukes. I stedet for å lage frimerker som består av et mønster av jevnt fordelte sirkulære søyler, består frimerker av et mønster av jevnt fordelte sirkulære hull i denne metoden.

Med denne nye strukturen kan overflaten av disse PDMS-frimerkene deretter behandles med glutaraldehyd som beskrevet tidligere 20,29,30, noe som gjør stempelet i stand til å binde kovalent med protein. Når de brukes på et glassdeksler jevnt belagt med fluorescerende protein, brukes disse glutaraldehydbehandlede PDMS-frimerkene til å fjerne det meste av proteinet på overflaten av dekslene, og etterlater bare ønsket mønster av prikker forhåndsbestemt av plasseringen av mikronstore hull på stempelet. Denne endringen øker suksessraten for å generere mønstre som består av et nesten kontinuerlig rutenett av prikker og for å skape isolerte øyer med prikker gjennom bare ett trinn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opprettelse av silikonmestere

MERK: Det meste av prosessen med design, opprettelse og feilsøking av silisiummestere for gjentatt støping av PDMS-frimerker har blitt dekket tidligere21, så bare viktige forskjeller i denne nye tilnærmingen vil bli beskrevet her.

  1. Lag designet for fotomasken ved hjelp av AutoCAD eller lignende designprogramvare. Belegge den ene siden av fotomasken, et tynt stykke glass, med et tynt lag med krom for å kontrollere UV-lysspredning. Design fotomasken slik at skinnende UV-lys gjennom den på den valgte fotoresisten vil skape en silikonmester med det motsatte av funksjonene som er ønsket på de endelige PDMS-stemplene. Se figur 1 for utforming av denne masken.
    MERK: Om de ønskede funksjonene eller området utenfor skal gjøres gjennomsiktige på fotomasken, avhenger av den valgte fotoresisten. Fotoresisten som brukes her er SU-8 2005 (FORSIKTIG: brannfarlig, hud- og øyeirriterende; hold deg unna varme / flammer / gnister og bruk vernehansker og briller ved håndtering), en negativ fotoresist som er i stand til å lage 5 μm høye funksjoner med nesten vertikale sidevegger.
    1. Herd den negative fotoresisten ved å utsette den for UV-lys og fjerne den usikrede SU-8 med et kjemisk løsningsmiddel. Derfor utformer du de primære funksjonene i masken slik at de er gjennomsiktige mens maskens omkringliggende område er ugjennomsiktig.
    2. For denne nye fjerningsmetoden utformer du fotomasken slik at den består av to firkanter på 1,5 x 1,5 cm (figur 1A), en full av et jevnt rutenett på 2 μm sirkler fordelt på 6 μm senter til sentrum, og en annen består av mange firkantede øyer som er mindre, isolerte versjoner av det samme rutenettmønsteret (figur 1B). Lag øyer av følgende størrelser: 6 x 6 prikker, 12 x 12 prikker, 25 x 25 prikker og 42 x 42 prikker.
      MERK: Diameteren på vedheftspunktene (2 μm) ble valgt basert på tidligere studier som målte cellulære trekkraftkrefter22,23. Masken som brukes her er 101,6 x 101,6 mm og er belagt på den ene siden med et 0,06 μm tykt lag med krom, noe som anbefales på grunn av de små egenskapene til mesteren. Fotomasken som ble brukt her ble bestilt fra et eksternt fotomasketrykkfirma.
  2. I et rent rom, belegge den valgte silisiumskiven jevnt med fotoresist. Som et valgfritt trinn, behandle skiven i en plasmaskive før du belegger den med motstand.
    MERK: Her brukes skiver med 100 mm diameter. Behandling i plasma asher gjør waferen mer egnet til å binde seg til SU-8 og bidrar til å forhindre delaminering av SU-8 fra skiven.
  3. Utfør følgende trinn i henhold til fotoresistprodusentens instruksjoner:
    1. Snurr den belagte skiven for å skape ønsket funksjonstykkelse, variere spinntiden basert på ønsket tykkelse og typen motstand. For en 5 μm tykk SU-8 2005, del det anbefalte spinnprogrammet i følgende tre trinn:
      1. Belegge skiven med fotoresist ved å spinne ved 500 RPM i 10 s med en rampe på 100 RPM / s.
      2. Reduser motstandstykkelsen til omtrent 5 μm ved å spinne skiven ved 3000 RPM med en rampe på 300 RPM / s i 30 s.
      3. Retarder sakte skiven etter spinning ved å redusere hastigheten til 0 RMP med en rampe på 500 RPM / s i 1 s.
    2. Forbered motstanden for UV-eksponering ved å bake den kort på en 95 °C varm plate. Endre tiden som brukes på kokeplaten i henhold til ønsket tykkelse på motstanden; steketiden er 2 min for en 5 μm tykk SU-8 2005.
    3. Utsett motstanden mot UV-lys for å kurere de ønskede funksjonene fullt ut. Vær forsiktig med overeksponering, da dette kan gjøre SU-8 sprø og påvirke den generelle kvaliteten på den resulterende mesteren.
      1. Bruk eksponeringsenergi på 105 mJ/cm2 for en 5 μm tykk SU-8 2005. Basert på kraften til den tilgjengelige UV-lampen, beregn eksponeringstiden ved å dele eksponeringsenergien med lampens kraft i mW.
        MERK: Siden lampen som brukes her har en effekt på 8 mW, skal eksponeringstiden være 13,1 s.
    4. For å stille inn SU-8-funksjonene etter utvikling, bake igjen på en 95 ° C varmeplate, denne gangen i 3 min. Vent til de ønskede egenskapene til mesteren vises innen 1 min i løpet av dette baketrinnet hvis motstanden ble utsatt riktig.
    5. Fjern usikret SU-8 fra silisiumskiven ved hjelp av SU-8-utvikleren. Vær grundig når du fjerner den usikrede SU-8, da den kan sitte fast mellom mikronstørrelsen og de fordelte funksjonene på skiven.
      FORSIKTIG: SU-8 utvikler er en brannfarlig hud og øye irriterende; hold den borte fra varme/flammer/gnister og bruk vernehansker og briller når du håndterer den.
    6. Etter utvikling, skyll med aceton for å fjerne overflødig utvikler på skiven og tørk den helt med en nitrogenspraypistol.
      FORSIKTIG: Aceton er en brannfarlig hud og øyeirriterende; hold den unna flammer/gnister og bruk vernehansker og briller når du håndterer den.
    7. Eventuelt, for SU-8 2005, bake på en 200 ° C varmeplate i 10 min.
      MERK: Denne harde steken tilfører fotoresisten mekanisk styrke.
  4. Etter å ha fått lov til å avkjøle, legg skiven i en waferholderbrett og legg den deretter i PDMS. Først fullfører du en silaniseringsbehandling på waferen for å gjøre SU-8-egenskapene til silisiummesteren mindre sannsynlig å binde seg til PDMS og dermed mindre sannsynlig å bli fjernet fra overflaten av skiven.
    1. For å fullføre silaniseringsoverflatebehandlingen, plasser mesteren og en liten glassdekslerlip inne i en desiccator som bare er beregnet for bruk med silaner. Plasser 1-2 små dråper Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silan på dekslenelip, lukk tørkeapparatet og kjør det under vakuum i 30 minutter med et trykk på 4500 Pa24.
      FORSIKTIG: Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silan er en brannfarlig hud og øyeirriterende; hold den unna varme/flammer/gnister, bruk vernehansker og briller ved håndtering, og arbeid under en avtrekkshette.
    2. Slå av vakuumet og la mesteren og dekslene ligge i tørkeapparatet i ytterligere 30 minutter.
      MERK: Originalen er nå klar for støping i PDMS.

2. Subtraktiv mikrokontaktutskrift

  1. Bland PDMS i riktig forhold mellom herdemiddel og base basert på produsentens instruksjoner. La den sitte ved romtemperatur og trykk i 15 min; deretter degas under vakuum i 15 min.
  2. Hell PDMS i mesteren og legg den i en inkubator satt til 37 °C over natten for å kurere.
  3. Fjern mesteren fra inkubatoren og la den avkjøles til romtemperatur.
  4. Mens mesteren kjøler seg ned, sonikerer du 25 mm deksler i etanol i 10 minutter. Bruk så mange coverlips som antall frimerker som utarbeides.
  5. Skyll grundig 25 mm deksler med deionisert (DI) vann og tørk med en filtrert luftpistol.
  6. Plasma behandle dekslene i 1 min ved hjelp av en plasma støvsuger under støvsuger på høy (radiofrekvens effekt på 30 W). Sørg for å slippe vakuumet sakte etter behandling for å forhindre at dekslene beveger seg inne i kammeret.
    MERK: Plasmabehandling av glassoverflaten tjener to formål: den renser overflaten av glasset for å fjerne forurensninger og genererer oksygenbaserte polargrupper på overflaten av glasset for å gjøre det hydrofobt25. Denne hydrofobiciteten gjør overflaten av glasset mer mottagelig for proteinbinding.
  7. I et rom uten direkte sollys/overheadbelysning, strøk hver deksle med 100 μL fluorescerende proteinoppløsning i en konsentrasjon på minst 100 μg/ml, dekk for ekstra beskyttelse mot lys og la den sitte i 20 minutter.
    MERK: Her brukes fibronektin isolert fra humant plasma og farget med AlexaFluor 488.
    1. For å farge fibronectin, kombiner umerket fibronectin av kjent konsentrasjon og volum med riktig mengde fluorescerende fargestoff i et 1,5 ml rør. Dekk røret med aluminiumsfolie for å beskytte fargestoffet mot lys og inkubere det ved romtemperatur i 1 time, bland forsiktig hver 10 min ved å snu røret opp ned 5-10 ganger.
      MERK: Mengden fargestoff som kreves varierer avhengig av fargestoffet som brukes og massen av protein som brukes. Se Tilleggsfil 1 for kalkulatoren som brukes til å bestemme riktig mengde fargestoff for fibronectin merket med Alexa 488. I henhold til produsentens instruksjoner kan overflødig fargestoff filtreres ut ved bruk av avsaltingskolonner (se materialtabellen).
  8. Skyll hvert deksler grundig med DI-vann, og fjern overflødig vann fra overflaten ved å banke forsiktig på sidene av hvert deksle på et papirhåndkle eller tilsvarende absorberende materiale. La dekslene være avdekket i mørket i minst 30 minutter for å la dem tørke helt.
  9. Mens de proteinbelagte dekslene tørker, fjerner du PDMS-stempelet fra mesteren ved å kutte det med en skalpell eller et annet skarpt blad.
    MERK: Det er best å ikke prøve å skjære gjennom PDMS på første forsøk, da påføring av så mye trykk vil knekke silisiumskiven og skade mesteren.
  10. Plasma behandle PDMS-stemplene i 2 min under vakuum på høy (radiofrekvenseffekt på 30 W).
  11. I en avtrekkshette plasserer du frimerkene i en beholder med lokk og belegger hvert stempel med et veldig tynt lag (<100 μL) på 10% (3-aminopropyl)trimetoksysilane (3-APTMS) fortynnet i 100% etanol.
    FORSIKTIG: 3-APTMS er en brannfarlig hud og øyeirriterende; hold den unna flammer/gnister, bruk vernehansker og briller ved håndtering, og arbeid under en avtrekkshette. Overdreven belegg av 3-APTMS-løsning vil føre til at en oransje film dannes senere i denne prosessen. Denne 3-APTMS overflatebehandlingen inkorporerer aminfunksjonaliteten i overflaten av PDMS-stempelet, noe som vil tillate ytterligere avledning av overflaten av stempelet senerepå 26.
  12. Dekk beholderen med frimerkene og la dem sitte ved romtemperatur i 5 minutter.
  13. Bruk DI-vann til å skylle hvert stempel grundig på begge sider.
  14. Legg frimerkene i en ren beholder og belegge dem liberalt med 2,5% glutaraldehyd i DI-vann.
    FORSIKTIG: Glutaraldehyd er giftig; bruk vernehansker og briller ved håndtering og arbeid under en avtrekkshette). Denne glutaraldehydbehandlingen sammen med den forrige 3-APTMS-behandlingen gir aldehydfunksjoner på overflaten av PDMS-frimerkene, som kan reagere med amingruppene i proteinene for å skape en sekundær aminkobling, noe som er kritisk for proteinfjerningsprosessen27.
  15. Dekk frimerkene, la dem sitte ved romtemperatur i 30 minutter, og skyll deretter grundig med DI-vann igjen. Fjern overflødig vann fra overflaten av frimerker på samme måte som dekslene, og la frimerkene tørke avdekket i ~ 30 min.
  16. Etter 30 min, sjekk om både proteinbelagte deksler og frimerker er tørre. Hvis en av dem ikke er helt tørr, bruk en filtrert luftpistol for å tørke dem helt, og sørg for at dekslene ikke blir utsatt for lys i en lengre periode.
  17. Når både dekslene og frimerkene er tørre, skyver du stempelmønstersiden ned på dekslene med nok trykk slik at frimerkene kommer i full kontakt med overflaten på dekslene. La frimerkene være i kontakt med dekslene i 15 min.
    MERK: På grunn av den kovalente midtbindingen mellom glutaraldehydstempelet med proteinlaget på glassdekslene, som er mye sterkere enn de svake hydrofobe interaksjonene mellom proteinlaget og glassdekslene, bør proteinene skrelle av glasset i henhold til mønsteret på PDMS-stempelet når det er fjernet.
  18. Etter 15 min, skrell PDMS-stemplene forsiktig av dekslene.
    MERK: Hvis fjerningsprosessen fungerte som den skal, bør ikke frimerkene løsne dekslene uten motstand, men bør heller ikke sitte fast i dekslene at de ikke kan fjernes uten overdreven kraft.
  19. Kontroller gjengivelsen av de mønstrede dekslene ved hjelp av riktig filter på et fluorescerende mikroskop (avhengig av hvilket fluorescerende fargestoff proteinene er merket med).
  20. Bruk de mønstrede dekslene umiddelbart, eller lagre dem fra direkte lys.

3. Aktiverte deksler

MERK: Bunndekslene for bruk i det eksperimentelle kammeret for PAA geler er laget i dette trinnet. Denne bunndeksleslipen er spesielt behandlet slik at PAA gelen forblir sikkert festet til da den toppmønstrede dekslen fjernes under mønsterprosessen. Lignende teknikker er også beskrevet andre steder 10,12,15,28.

  1. Soniker 30 mm deksler i 100% etanol i 10 min, skyll med DI-vann, og tørk deretter grundig med en filtrert luftpistol. Forbered opptil 6 deksler om gangen per batch i en 6-brønns plate.
  2. Plasma behandle dekslene i 1 min på høy (radiofrekvens effekt på 30 W) og deretter plassere hver dekslelip i en brønn på en 6 brønn plate.
  3. Belegge hvert deksle med et veldig tynt lag på 5% APTMS i etanol i en avtrekkshette.
    MERK: En oransje rest vil dannes i tilfelle overdreven belegg i denne prosessen.
  4. Dekk til 6-brønnsplaten og la dekslene sitte i 5 min.
  5. Skyll dekslene (begge sider) og innsiden av hver brønn grundig med DI-vann og fjern overflødig vann inne i brønnene.
  6. Legg dekslene tilbake i 6-brønnsplaten og tilsett ca. 2 ml 0,5 % glutaraldehyd i DI-vann.
  7. Dekk 6-brønnsplaten og la dekslene sitte i glutaraldehydoppløsningen i 30 min; Skyll deretter dekslene og brønnene på hver plate grundig med DI-vann.
  8. Oppbevar de behandlede dekslene i DI-vann i de 6-brønnsplatene i opptil to uker, eller bruk dem umiddelbart. Pass på at dekslene er helt tørre før bruk.

4. PAA gel fabrikasjon og mønster overføring

MERK: Når mønstrede deksler er laget, må de brukes til å overføre disse proteinmønstrene til PAA-hydrogelen kort tid etterpå (<24 h)1,29,30. Følgende oppskrift er for en PAA gel med en Youngs modulus på 3,6 kPa. Mengden bis-akrylamid, akrylamid og DI-vann kan varieres for å justere stivheten til PAA gels12.

  1. Like før du begynner å lage PAA hydrogelforløperen, fjern akrylsyren N-hydroxysuccinimide (NHS)-ester fra kjøleskapet slik at den kan nå romtemperatur før den åpnes. Forbered en utskiftbar coverlip-tallerken ved å sterilisere den med 70% etanol og la den sitte under UV-lys i et biosikkerhetsskap i minst 30 minutter før bruk.
    FORSIKTIG: NHS er en giftig hud og øyeirriterende; bruk vernehansker og briller når du håndterer det, og arbeid under en avtrekkshette.
    1. Tilsett 1,25 ml 40 % akrylamid i DI-vann til et konisk rør på 15 ml.
      FORSIKTIG: Akrylamid er en giftig hud og øyeirriterende; bruk vernehansker og briller når du håndterer det, og arbeid under en avtrekkshette.
    2. Tilsett 175 μL bis-akrylamidoppløsning i DI-vann i samme rør (trinn 4.1.1).
      FORSIKTIG: Bis-akrylamid er en giftig hud og øyeirriterende; bruk vernehansker og briller når du håndterer det, og arbeid under en avtrekkshette.
    3. Tilsett 500 μL 10x fosfatbufret saltvann (PBS).
      FORSIKTIG: PBS er et øye irriterende; bruk vernehansker og briller ved håndtering.
    4. Tilsett 2,915 ml DI-vann.
  2. Pipette 969 μL av denne forløperen inn i et 1,5 ml mikrosenterrør, og oppbevar resten ved 4 °C i opptil to uker.
  3. Mål ut ~ 50-100 mg ammoniumpersulfat (APS) i et annet mikrocentrifugerør og fortynn det i DI-vann ned til 100 mg / ml; sett den til side for senere bruk. Åpne NHS-esteren (nå ved romtemperatur) i hetten og mål forsiktig opptil 3 mg NHS i et mikrosenterrør. Fortynn NHS-esteren til 1 mg/ml i 1x PBS.
    FORSIKTIG: APS er en hud- og øyeirriterende; bruk vernehansker og briller når du håndterer det, og arbeid under en avtrekkshette. Både APS og NHS-ester vil hydrolysere over tid, noe som fører til at aktiviteten til kjemikaliene i lagerløsningen varierer. Derfor må begge disse løsningene tilberedes frisk hver gang (i motsetning til resten av forløperen).
  4. Utfør de neste tre trinnene i en avtrekkshette:
    1. Tilsett 2 μL tetrametyletylendiamin (TEMED) i mikrocentrifugerøret som inneholder 969 μL aliquot av PAA forløper.
      FORSIKTIG: TEMED er en brannfarlig hud og øyeirriterende; hold den borte fra varme/flamme/gnister, bruk vernehansker og briller ved håndtering, og arbeid under en avtrekkshette. TEMED er ett av to krysskoblingsmidler som er kritiske for polymeriseringen av PAA-hydrogelen, den andre er APS.
    2. Tilsett 15 μL 1 M saltsyre for å redusere pH i hydrogeloppløsningen og unngå hydrolyse av NHS-ester.
      FORSIKTIG: Saltsyre er en etsende hud og øyeirriterende; bruk vernehansker og briller når du håndterer det, og arbeid under en avtrekkshette.
    3. Tilsett 10 μL av NHS-ester-løsningen på røret.
      MERK: NHS er kritisk for mønsterprosessen. Det vil reagere med amingrupper i proteinene på den mønstrede dekslen for å danne en stabil amidbinding, noe som gjør at mønsteret kan overføres fra glassdekslenelip til overflaten av PAA-gelen når den polymeriserer31.
  5. Utfør disse siste trinnene i et biosikkerhetsskap:
    1. Plasser forsiktig 30 mm dekslene i metalldelen av dekslene (3-APTMS og glutaraldehydbehandlet side opp) og skru plastringen på toppen. Sett opp mønstret dekslerlip slik at det lett kan nås i neste trinn, fortsatt beskytte den mot lys så mye som mulig.
    2. Pipette 5 μL APS-oppløsning i resten av PAA-forløperen i mikrocentrifugerøret, inverter den til å blande, og rør deretter umiddelbart 35 μL av den løsningen på 30 mm dekslene.
    3. Slipp de mønstrede dekslene på proteinsiden ned på løsningen, og vær forsiktig så du ikke lager luftbobler i hydrogelen. Beskytt hydrogelen mot lys og la den polymerisere i 90 min.
    4. Når hydrogelen er polymerisert, bruk et barberblad eller skalpell for å fjerne den øvre dekslen, og sørg for at dekslene ikke glir av gelen eller faller tilbake på gelen når den er fjernet, da dette vil ødelegge mønsteret på overflaten av gelen.
      MERK: Ikke la gelen være avdekket i et område med betydelig luftstrøm (for eksempel et biosikkerhetsskap).
    5. For å passivisere gjenværende NHS-ester i hydrogelen, tilsett 2 ml steril PBS til gelen og inkuber ved 37 °C i 45 minutter. Forbered straks gelene for eksperimenter eller oppbevar dem over natten i steril PBS ved 4 °C til bruk.

5. Bildebehandling

  1. For å forberede seg på eksperimenter med celler, slå på varmen (37 °C) og fuktigheten (70%) i mikroskopet ettermiddagen før et planlagt eksperiment for å la utstyret inne i mikroskopkammeret likevekte til høyere temperatur.
    MERK: Dette trinnet minimerer z-drift forårsaket av temperatursvingninger.
  2. Rett før eksperimentstart slår du på kammerets CO2-kilde .
  3. For å forhindre x-y drift forårsaket av gjentatt bevegelse av mikroskopstadiet under eksperimentet, fest det utskiftbare coverlip-parabolsettet som holder cellefrøhydrgelen til scenen med dobbeltsidig tape.
  4. Se over gelen for å finne rammer av interesse for bildet, og lagre hver faseposisjon av seksjonene som skal avbildes.
  5. I både brightfield-visningen og den fluorescerende visningen som tilsvarer det merkede proteinet, sett mikroskopprogramvaren til å avbilde hver ramme en gang hver 5 min i 2 timer.

6. Bildeanalyse

MERK: Det er utviklet et system som kan måle deformasjonen av de mønstrede PAA-gelene ved å bestemme plasseringen av trekkraftpunktene, interpolere de første plasseringene til de deformerte punktene og deretter beregne de cellulære trekkraftkreftene på hvert sted. Ethvert programvaresystem som er i stand til å utføre bildebehandling og numeriske beregninger kan brukes. Programmet tar sikte på å bestemme trekkraft krefter raskt, eliminere brukerinndata og preprosessering prosedyrer som vil bidra til brukerrelaterte feil. Koden som brukes her er tilgjengelig her som Supplemental Files 2-10, og disse filene, sammen med et par praksisbilder, kan nås på www.bu.edu/mml/downloads.

  1. I en bildebehandlingsprogramvare åpner du alle enkeltbilder som er tatt under et tidsforløpeksperiment fra hver mikroskopvisning som brukes i rekkefølge, fra det første til det siste bildet som er tatt, og gjør dem om til en enkelt bildestakk (ved å klikke på Bilde | Stabler | Bilder som skal stables). Forsikre deg om at det er to separate bildestakker: en av brightfield-visningen av cellene og en av den fluorescerende visningen av mønsteret de er festet til.
    1. Hvis det er drivende i fluorescerende bilder (dvs. øya av interesse beveger seg rundt i x- og / eller y-retning mellom hver ramme ved >1-2 μm), må du først behandle bildestakken med StackReg-plugin (P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne) for å nyere hvert bilde i stabelen basert på posisjonen til den første (klikke på Plugins | StackReg | Oversettelse | OK).
      MERK: Dette er kritisk fordi selv sub-μm drift kan påvirke den endelige beregningen av trekkraft krefter, spesielt på stivere geler der denne x-y drift er utenfor rekkevidden av forventet støy. Denne koden lagrer bildene etter at driften er fjernet, som deretter kan gjøres om til en ny bildestakk som skal analyseres.
  2. Skriv inn lysfeltet og fluorescerende bildestakker i CTFTimelapse.m (Tilleggsfil 2).
    1. Angi filkatalogen der bildestakkene er plassert på linje 7.
    2. På linje 8 og 9 angir du navnene på den fluorescerende bildestakken og den tilsvarende lyse feltfluorescerende stakken.
    3. Angi PAA gel stivhet (Pa):
      1. I linje 11-14, som inkluderer noen få forskjellige elastiske moduler av PAA-hydrogeler som brukes oftest, kommenterer du (type % ved starten av linjen) alle unntatt gelens elastiske modul i bildene som analyseres. Alternativt kan du legge til den elastiske modulusen hvis den ikke allerede er til stede og kommentere resten (3658.19 Pa for testbilder).
    4. Angi prikkradius (m) på linje 15 (1 × 10-6 m for testbilder).
    5. Angi maksimal mulig prikkdiameter (μm) på linje 16 (2,5 μm for testbilder).
    6. Angi pikselforhold (μm/piksel):
      1. I linje 17-20, som inkluderer noen få forskjellige bildepikselforhold basert på bildebehandlingsoppsett som ble brukt tidligere, kommenterer du (skriv inn % ved starten av linjen) alle unntatt pikselforholdet til bildene som analyseres. Alternativt kan du legge til pikselforholdet som brukes hvis det ikke allerede finnes, og kommentere resten (0,1613 μm/piksel for testbilder).
    7. På linje 35 og 87 angir du filkatalogen der de nødvendige bildebehandlingsfilene er plassert.
      MERK: Fra den fluorescerende bildestakken bestemmer koden plasseringen av hver fluorescerende prikk og sporer bevegelsen av hvert prikk mellom hvert bilde i stakken20. Den opprinnelige posisjonen til de mikrokontakterte trykte punktene er kjent fordi de ikke deformeres når de overføres riktig tilhydrogelen 32.
  3. Vent til to figurer og én dialogboks vises når programmet finner prikkene. Bruk figur 1 til å sikre at programmet har funnet de riktige prikkene og ikke fant mange prikker der det ikke var noen. Bruk figur 2 til å velge det rektangulære rutenettet som hjelper programmet med å finne og beregne cellulære trekkraftkrefter.
    MERK: Figur 1 er brightfield-bildet av cellen med prikkene som programmet finner (som vil være rødt) lagt over det (se figur 3A). Figur 2 er et bilde som viser de samme prikkene som vises i figur 1 , men uten brightfield-bildet i bakgrunnen.
    1. Vent til dialogboksen blir bedt om å trykke Enter etter at du har valgt Punkt-der hvert punkt er en av de røde prikkene som programmet finner, og har én stor knapp inni seg merket Enter.
    2. Velg fire forskjellige prikker i figur 2 for å opprette et rektangulært rutenett rundt og inkludere cellen/klyngen på dette mønsteret. Velg hver prikk en etter en med et venstre museklikk og bekreft det ved å trykke Enter på knappen i den nevnte dialogboksen. Hold oversikt over hvor mange prikker som er mellom første og andre prikk, i tillegg til første og tredje prikk, siden programmet vil be om disse verdiene når alle firehjørne prikkene er valgt. Skriv inn disse verdiene i kommandovinduet (skriv inn antall prikker, og klikk enter -knappen på tastaturet når du blir bedt om det).
  4. Når det rektangulære rutenettet er valgt, vent til skriptet beregner trekkraftkrefter som det finner i rutenettet basert på plasseringen av fluorescerende prikker. Legg merke til at skriptet først finner forskyvningsvektoren (u) i det geometriske senteret for hver prikk, og beregner deretter den tilsvarende trekkraftkraftvektoren (F) ved hjelp av Eq (1):
    Equation 1(1)
    Der E er Youngs modul av PAA-substratet, er a radiusen til fluorescerende prikkmarkører, og ν er Poissons forhold mellom PAA-substratet32. Eq (1) antar at substratet er et uendelig elastisk halvrom, at trekkraftkrefter påføres i midten av hver sirkulære prikkmarkør, og at avstanden mellom prikkmarkørene er tilstrekkelig stor slik at deres respektive forskyvninger ikke samhandler med hverandre23.
    MERK: I forsøkene som er beskrevet her, brukes prikkmarkører med radius a = 1 μm og 6 μm senter-til-senter-avstand. Trekkkraftpiler inne i cellen/klyngen som peker innover mot midten av cellen, bør være til stede, mens området utenfor cellen/klyngen ikke skal ha trekkpiler til stede (se figur 3C-E). Trekkpiler som peker utover fra innsiden av cellen/klyngen eller mange store trekkraftpiler som finnes utenfor cellen, indikerer et dårlig valgt rektangulært rutenett.
  5. Når riktig trekkraftfelt er funnet, velger du et passende område av interesse (ROI) rundt cellen / klyngen, som inkluderer alle trekkraftpiler i cellen ved hjelp av markøren.
    1. Hvis du vil tegne avkastningen, venstreklikker du så mange ganger som nødvendig for å tegne en polygonfigur med så mange sider som ønsket, justerer du figuren eller flytter avkastningen etter at den er tegnet ved å venstreklikke henholdsvis hjørnene eller kantene. Når avkastningen er tegnet, dobbeltklikker du for å gå videre til neste bilde i stakken. Gjenta dette for alle bilder i brightfield-stakken.
      MERK: Koden vil lagre trekkraft kraft og forskyvning data for hvert tidspunkt i samme mappe som de opprinnelige bildestakker, som deretter kan analyseres videre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PAA hydrogeler med Youngs modulus av E = 3,6 kPa og Poissons forhold på ν = 0,445 ble laget for bruk ved hjelp av denne subtraktive mikropatteringsmetoden. Hydrogelene ble laget for å være ~ 100 μm tykke, noe som gjør at de kan avbildes med bildeoppsettet som brukes her, samtidig som de forhindrer cellene i å føle den stive dekslen under gelen, noe som vil føre til problemer i studier fokusert på cellulær stivhet sensing23,33. Geler av mange andre stivhetsnivåer (opptil 30 kPa) har blitt vellykket laget og avbildet ved hjelp av den indirekte mikropatteringsmetoden34, slik at metoden ikke er begrenset til bruk av bare 3,6 kPa hydrogeler. Dekslene behandles på forhånd med glutaraldehyd slik at gelen forblir festet til nedre deksler når de øverste mønstrede dekslene fjernes (figur 2C,D).

For å visualisere og måle cellulære trekkraftkrefter i klynger, ble de 3,6 kPa hydrogelene indirekte mønstret med fluorescerende fibronektin (figur 2A-D) for å skape øymønstre av forhåndsbestemt størrelse og form (figur 2E). Andre typer proteiner kan også mønstres på disse myke hydrogelene 21,35,36,37,38. Kvaliteten på det overførte mønsteret er direkte relatert til gjengivelsen av mesterformen som PDMS-stempelet er støpt fra. Former som har hatt SU-8 delaminering vil se en forverring av kvaliteten på mønstrene laget av frimerker kastet fra disse delaminerte formene. For eksempel vil former med delaminert SU-8 ofte skape mikropatterner som inneholder deler av uberørt fibronectin mellom de forhåndsbestemte øyene. Hvis de kastes på en gel, tillater disse mønstrene cellefeste til gelen i områder utenfor øyas mikropattern. På grunn av dette var bildecelleklynger knyttet til helt eller for det meste intakte øymønstre prioriteten.

Bovine vaskulære glatte muskelceller (BVSMCs) ble sådd på disse hydrogelene med en tetthet på ca. 60-80 × 103 celler / gel for å fremme klyngedannelse og lov til å holde seg i 18-24 timer før avbildning. Like før forsøkene ble cellene farget med en levende cellekjerneflekk for å tillate at levende celler identifiseres og bestemme antall celler i hver klynge. Mikropatternøyer med og uten celler ble avbildet og analysert. Bildeøyer uten celler tillatt for beregning av støyen som er tilstede i trekkraft kraftberegninger for 3,6 kPa geler. Disse falske positive forskyvningsmålingene kan deretter brukes til å bestemme en passende terskelverdi under hvilke forskyvninger som skal utelates.

Det har blitt funnet at 0,3 μm vanligvis er tilstrekkelig til å eliminere mønster utroskap som fører til falske positive forskyvningsmålinger. Dette kan føre til tap av lavkraftsgrep, men er avgjørende for å fjerne falske positive trekkrafter. Ved avbildning ble celleklynger på for det meste intakte øymønstre prioritert (dvs. de som ikke mangler mange hvis noen prikker) og for det meste intakte mønstre uten celler. Hver avkastning ble avbildet en gang hver 5 min i 2 timer. Mikroskopet som ble brukt til å ta bilder av både celler og mønstrede PAA-geler under lengre tidsforløpeksperimenter, var et fluorescensmikroskop med et automatisk stadium, en fluorescenslyskilde, et kamera og standard mikroskopprogramvare. Dette mikroskopet har et tilpasset sett med filtre for å observere mange forskjellige farger av fluorescens. Målet som brukes til å se cellene og den mønstrede hydrogelen er et 40x vann nedsenkingsmål, NA = 1,15. Dette mikroskopet er også utstyrt med en tilpasset temperatur (37 °C)-, fuktighet (70%)-, og CO2 (5%)-regulert system for å holde cellene levedyktige under lange eksperimenter.

For å beregne trekkraftkreftene fra bildene av mikropatternøyene, ble bildeanalyseprogramvare brukt til å spore forskyvningene til de fluorescerende fibronectin prikkene over tid. Å vite forskyvningene av fluorescerende prikker og stivheten til PAA gel som prikkene er mønstret på, kan programmet bestemme verdiene til trekkraftkreftene som er gitt av både individuelle celler og klynger på PAA-substratet. Det er imidlertid to måter programmet ikke kan bestemme trekkraftverdier på. Hvis for mange prikker innenfor en gitt interesseramme deformeres, sliter programmet med å beregne krefter, ettersom programmet er avhengig av at de fleste prikkene i et analysert bilde ikke skal deformeres. Videre, hvis to prikker er for nær hverandre (sentrum-til-sentrum avstand på ≤2 μm20), kan forskyvningene av de enkelte prikkene forstyrre hverandre, noe som forhindrer nøyaktig bestemmelse av deres faktiske forskyvningsverdier og dermed deres trekkraftverdier. Så lenge mikropatternene er designet med prikker som er godt fordelt fra hverandre, bør cellene ikke kunne fortrenge prikkene så mye at de blir så tett sammen, selv på mykere substrater.

Figur 3 viser egenskapene til mønstermetoden for fjerning. Her er denne metodens evne til å fremstille isolerte, veldefinerte øymønstre av forhåndsbestemt form vist i figur 3B-E, hvor fibronectin adhesjonspunktene bare er til stede innenfor ønsket område av øya. Disse isolerte øyene med vedheftspunkt gir ytterligere bedre kontroll over klyngeformen, som vist i figur 3A. Fordi formen og størrelsen på øyene er konsistente, vil celleklyngene som fester seg og vokser på dem også ha en tendens til å ha konsistent form, da øymønstrene begrenser klyngevekstområdet. Til slutt viser figur 3B-E også disse øyenes evne til å bli brukt til å beregne cellulære trekkraftkrefter og tendensen til at disse trekkraftkreftene endres over tid. Her er trekkraftkreftene til klyngen de største rundt kantene på øya. Dette forventes fordi cellene i kantene av en klynge har færre interaksjoner med andre celler i klyngen enn cellene i det indre av klyngen. Dermed utøver disse cellene ved kantene større krefter på substratet som svar på cytoskeletal sammentrekning enn cellene i interiøret.

Figure 1
Figur 1: Design av fotomaske. (A) En representasjon av første halvdel av fotomaskedesignet som brukes her, et diskret rutenett med 2 μm diameter prikker fordelt på 6 μm senter-til-senter. Mens bildet som vises her bare er en liten del av designet, fyller dette rutenettet et mellomrom på 1,5 x 1,5 cm totalt på fotomasken. (B) En representasjon av andre halvdel av fotomaskedesignet; vist her er seks små øyer med 6 x 6 prikker. På fotomasken er det flere forskjellige øystørrelser: 6 x 6 (vist her), 12 x 12, 25 x 25 og 42 x 42 prikker. En like spredt (50 μm mellom øyene) matrise av hver øystørrelse tar opp et mellomrom på 1,5 x 0,375 cm, og rekkene av forskjellige øyer er skilt med 50 μm. Prikkene på hver øy er 2 μm i diameter og fordelt 6 μm sentrum-til-sentrum. De to delene av masken beskrevet i A og B er skilt med 0,75 cm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Subtraktiv mikrokontaktutskrift. (A) Et PDMS-stempel behandles med glutaraldehyd og settes i kontakt med et glassdeksle jevnt belagt med fluorescerende fibronektinoppløsning. (B) Ved fjerning fra dekslene, strips PDMS-stempelet bort det meste av fluorescerende fibronectin på overflaten av dekslene, og etterlater mikron-størrelse prikker av protein bare på steder som er forhåndsbestemt av utformingen av PDMS-stempelet. (C) Den mønstrede dekslen er plassert i kontakt med en PAA prepolymer og NHS-løsning. (D) Når PAA gelen har fått lov til å polymeriseres fullt ut, fjernes toppdekslene, og et mønster av fibronektin er trykt på PAA geloverflaten. (E) Et eksempel på et diskret øymønster som består av jevnt fordelte prikker på en PAA-hydrogel med en Youngs modulus på 3,6 kPa. Skalastang = 20 μm. Forkortelser: PDMS = polydimetylsiloksan; PAA = polyakrylamid; NHS = N-hydroksysuccinimid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Analyse av celler på øyas mikropatterner. (A) Et brightfield-bilde av en klynge på 3 BVSMCer lagt over på en fluorescerende fibronectin-øymikropattern på en PAA-hydrogel med en Youngs modulus på 3,6 kPa vises. Prikker er 2 μm i diameter og er skilt med 6 μm senter-til-senter. (B) Det fluorescerende mønsteret viser at en rekke av fibronektinpunktene på øya har blitt fordrevet på grunn av anvendelsen av krefter av BVSMCene. (C) Trekkraftkreftene som brukes på vedheftspunktene på tidspunkt 1 (starten på et 2 h eksperiment). Retningen til disse kraftvektorene er indikert ved retning av de fargede pilene. Deres størrelse angis av pilfargen og den tilsvarende verdien på fargelinjen (alle kraftverdier er i nN). Vektorlengden er relativ basert på minimums- og maksimumskreftene som beregnes av programmet for hvert tidspunkt. (D) Trekkraft krefter av samme klynge på tidspunktet punkt 13 (halvveis gjennom en 2 t eksperiment) (E) Trekkraft krefter av samme klynge på tidspunktet punkt 25 (slutten av en 2 h eksperiment). Forkortelser = BVSMCs = bovin vaskulære glatte muskelceller; PAA = polyakrylamid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Kalkulator for merking av fibronectin Dette er et verktøy for beregning av riktig mengde Alexa488 fluorescerende fargestoff som skal brukes ved merking av fibronectin. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: CTFTimelapse.m Dette er bildebehandlingsfilen, som gjør det mulig å regne ut cellulære trekkraftkrefter som beskrevet i avsnitt 5 (Bildeanalyse). Dette inkluderer å velge ønsket rutenett med prikker (trinn 6.3-6.3.2) og velge interesseområde for CTF-beregningene (trinn 6.5 og 6.5.1). Alle følgende tilleggsfiler kalles direkte av dette skriptet eller en av de andre funksjonene som brukes i det. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: analyze_initial_image_4.m Denne funksjonen kalles av CTFTimelapse.m, og formålet er å finne og justere fluorescerende prikker på et rutenett fra den første rammen i bildestakken i det deformerte rutenettmønsteret slik at det samsvarer med det opprinnelige undeformerte rutenettmønsteret. Dette gjør det mulig å utføre beregninger av trekkraft for den første rammen i bildestakken. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 4: analyze_subsequent_images.m Denne funksjonen kalles av CTFTimelapse.m, og formålet er å finne og justere fluorescerende prikker på et rutenett fra alle rammene i bildestakken til det deformerte rutenettmønsteret etter det første. Dette gjør det mulig å utføre beregninger av trekkraft for alle delbildene i bildestakken etter den første. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 5: bpass.m Denne funksjonen kalles av både analyze_initial_image_4.m og analyserer subsequent_images.m, og formålet er å implementere et bandpassfilter med ekte mellomrom som behandler bildestakken til det deformerte rutenettmønsteret. Dette filteret undertrykker bildepunktstøy og bildevariasjoner med lang bølgelengde samtidig som informasjon om en karakteristisk størrelse beholdes. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 6: CellBoundary.m Denne funksjonen kalles av CTFTimelapse.m, og formålet er at den lar programbrukeren tegne et interesseområde rundt cellen / klyngen som trekkraftkrefter skal beregnes for. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 7: pkfnd.m Denne funksjonen kalles av både analyze_initial_image_4.m og analyze_subsequent_images.m, og formålet er å finne lokal maxima i et bilde med nøyaktigheten på pikselnivå. Disse toppene brukes av cntrd.m for å finne det fluorescerende rutenettmønsteret for CTFTimelapse.m. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 8: cntrd.m Denne funksjonen kalles av både analyze_initial_image_4.m og analyze_subsequent_images.m, og formålet er å finne sentroiden av lyse flekker i et bilde til underpikselnøyaktighet. Dette gjør det mulig å lokalisere det fluorescerende rutenettmønsteret med CTFTimelaspe.m, som beskrevet i trinn 6.3. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 9: FourCorners.m Denne funksjonen kalles av både analyze_initial_image_4.m og analyze_subsequent_images.m, og formålet er å ta rutenettet valgt av brukeren (Trinn 6.3-6.3.2) og beregne avstanden mellom hvert hjørnepunkt i to ortogonale akser. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 10: track.m Denne funksjonen kalles av både analyze_initial_image_4.m og analyze_subsequent_images.m, og dens formål er å spore bevegelsen av prikkene i det fluorescerende rutenettmønsteret mellom rammer, noe som er viktig for å beregne de tilsvarende trekkraftkreftene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En forbedret metode for indirekte mønster av PAA-hydrogeler er beskrevet i dette dokumentet. Denne tilnærmingen bygger på metoder som har blitt brukt tidligere 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Den primære endringen er at PDMS-frimerker nå brukes til å fjerne protein og legge det ønskede mønsteret bak på mellomliggende substrat i stedet for å stemple mønsteret direkte ned på det. Dette gir mulighet for mye mer konsistent opprettelse av high-fidelity mikropatterns og etableringen av isolerte mikropatterned øyer som tidligere nødvendiggjorde to produksjonstrinn. Formen og størrelsen på øymønstrene som er laget med denne metoden, styres også lettere enn de som er laget med den forrige totrinnsmetoden. Den nye teknikken er mindre utsatt for mengden trykk som påføres under mikrotrykk enn den gamle teknikken. En annen fordel er at denne fjerningsmetoden kan gjøre øymønstre av kontrollert form og størrelse i bare ett trinn. I motsetning krevde tidligere metoder to trinn for å lage øyer, inkludert stempling for avsetning og påfølgende stempling for fjerning, og formene til disse øyene er mindre presise enn de som er laget med fjerningsmetoden.

Den største ulempen ved denne metoden er at levetiden til mesterne som brukes til å forme den nye stilen til PDMS-frimerker, ser ut til å være kortere enn de som brukes i den forrige stemplingsmetoden. Dette kan sannsynligvis tilskrives formen på de nye originalene som brukes i fjerningsmetoden. De gamle mesterne var sammensatt av et 1,5 x 1,5 cm areal av SU-8 sammensatt av like fordelte 5 μm dype sirkulære hull, som når de ble støpt i PDMS, ville skape frimerker som består av jevnt fordelte sylindriske stolper av samme høyde. Omvendt består de nye mesterne av et 1,5 x 1,5 cm areal på 5 μm høye SU-8 sylindriske stolper, som, når de kastes i PDMS, lager frimerker som består av jevnt fordelte hull.

Med denne endringen i mesternes struktur har det blitt funnet at SU-8 har en tendens til å bli delaminert fra overflaten mye lettere enn i den gamle metoden. Forholdsregler ble tatt for å forhindre dette, for eksempel overflatebehandling av silisiumskivene i en plasmaskive for å gjøre dem mer mottagelige for binding til SU-8. Overflaten på wafers ble også silanisert før den første støpingen i PDMS for å forhindre at SU-8 stakk til PDMS ved fjerning av frimerkene. Til tross for dette har SU-8-delaminering fra silisiumskivene blitt observert etter gjentatt støping i PDMS, og det bør utvises forsiktighet for å sikre at nye silisiumskiver blir laget før tap av den nåværende mesteren. En mulig måte å unngå denne delaminering er å bruke PDMS dobbeltstøpt metode, som har blitt beskrevet tidligere43, selv om denne andre metoden har sine begrensninger.

En annen mangel ved denne metoden (og andre metoder som bruker deformerbare hydrogeler for å måle trekkraftkrefter44) er at trekkraftfeltet ikke er i mekanisk likevekt på grunn av eksperimentell støy. Dermed er det nødvendig med en etterbehandlingsanalyse for å oppnå et likevektet trekkraftfelt etter at trekkraftkrefter er beregnet. En måte å balansere trekkraft krefter er å oppnå kreftene nærmest målingene som tilfredsstiller likevekt ved hjelp av en minst kvadratisk metode. Som et resultat blir størrelsen og orienteringen av målte trekkraftkrefter endret45.

Det er begrensninger i denne metoden for beregning av cellulære trekkraftkrefter. For å nøyaktig bestemme cellulære trekkraftkrefter ved hjelp av Eq. (1) (trinn 5.4), må mønsteret utformes slik at forskyvningen av en vedhefts prikk ikke påvirker forskyvningen av de som ligger rett ved siden av den, betydelig. Teoretisk sett reduseres forskyvningen av et sirkulært vedheftsområde på overflaten av et uendelig halvrom på grunn av en tangentiell kraft som virker i midten når en radial avstand fra midten av sirkelen øker23. Spesielt for et substrat hvis Poissons forhold er ~ 0,445 (for eksempel de som er beskrevet her), er forskyvning på kanten av den sirkulære regionen omtrent to tredjedeler av forskyvningen i sentrum av regionen. Teoretiske spådommer strekker seg imidlertid ikke utover den sirkulære regionen. Dermed antas det at den avtagende trenden i forskyvningsstørrelse, bestemt teoretisk23, fortsetter utover kanten av vedheftssirkelen. I mikropatterndesignet som er beskrevet her, brukes 2 μm sirkulære prikker fordelt 6 μm senter-til-senter. Årsaken til denne avstanden er at en forskyvning på 6 μm avstand fra midten av en prikk er anslått til å være ca 1/12th forskyvningen i midten av prikken, som antas å være liten nok til å påvirke forskyvningsverdier av tilstøtende prikker. Det er imidlertid mulig at trekkraftkreftene som utøves av celler, kan fortrenge vedheftspunktene på et substrat så mye at avstanden fra sentrum til midten mellom dem blir mindre enn 2 μm. I dette tilfellet holder ikke antagelsen om forskyvningen av tilstøtende vedhefts prikker som ikke forstyrrer hverandre, og trekkraftkrefter kan ikke beregnes nøyaktig med ligningen gitt i trinn 6.4 (Eq (1)).

Den foreslåtte teknikken gir et kraftig verktøy for måling av cellulære trekkraftkrefter. Disse kreftene gir innsikt i det mekaniske miljøet til både individuelle celler og klynger og kan bidra til å forstå om og hvordan ulike typer celler opprettholder mekanisk stabilitet. Å opprettholde et homeostatisk nivå av cellespenning er avgjørende for mange cellulære prosesser, og tap av denne spenningsmessige homeostase har vært knyttet til ulike sykdommer, for eksempel aterosklerose, astma og kreft 9,10,12. Spennings homeostase er definert som evnen til en celle eller en klynge av celler for å opprettholde et konsistent spenningsnivå, med lav temporal variasjon rundt et settpunkt46.

Denne indirekte mikropatteringsmetoden kan brukes til å bestemme evnen til ulike celletyper for å opprettholde spennings homeostase, både på individ- og multicellulære nivåer. Dette gjøres ved å spore endringer i verdiene i det cellulære trekkraftfeltet over tid og deretter kvantifisere temporale svingninger i trekkraftfeltet ved hjelp av variasjonskoeffisienten (CV), som representerer forholdet mellom standardavviket for trekkraftfeltets størrelse til gjennomsnittsverdien. Summen av størrelsene til trekkraftkrefter og omfanget av det kontraktile øyeblikket (det første øyeblikket av trekkraftkreftene) brukes som skalarmålinger av størrelsen på trekkraftfeltet46. Hvis CV-en til trekkraftfeltet forblir nær null gjennom et tidsforløpeksperiment, viser det at cellen / klyngen opprettholdt spennings homeostase over tid46.

Oppsummert tilbyr denne nye metoden for indirekte mikropattering av myke hydrogeler en enklere og mer effektiv metode for å skape mønstrede hydrogeler enn tidligere metoder. Det er visse trinn som kan tas for å forbedre og utvide denne metoden. Først og fremst vil forbedring av fabrikasjonsprosessen til silisiummesterne på en måte som forlenger levetiden, eliminere den primære ulempen ved denne mikropatterningsmetoden. Når det gjelder måter å utvide denne metoden på, vil det å utforske forskjellige øyformer utover bare de firkantede øyene som er beskrevet her, forbedre allsidigheten til denne metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Dr. Paul Barbone fra Boston University Department of Mechanical Engineering for nyttige diskusjoner og hjelp med dataanalyse. Denne studien ble støttet av NSF grant CMMI-1910401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma Aldrich #281778
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher Scientific #05-408-129
15 mL conical tube Fisher Scientific #05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask Advance Reproductions Corporation N/A Custom-designed mask
6 Well Plates Fisher Scientific #07-200-83
Acetone Fisher Scientific #A18P-4
Acrylamide Solution, 40% Sigma Aldrich #A4058
AlexaFluor 488 Thermo Fisher #A20000
Aminonium Persulfate Fisher Scientific #BP179-25
Bisacrylamide Fisher Scientific #PR-V3141
Ethanol Greenfield Global #111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round Fisher Scientifc #12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round Warner #64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera Hamamatsu #C10600-10B
Human Plasma Valley Biomedical #HP1051P Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N Millipore Sigma #1.09057
ImageJ Wayne Rasband #1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set Bioptechs #190310-35
Kim Wipes Fisher Scientific #06-666-11C
Mask Alinger Karl Suss #MA6
Matlab 2021 Mathworks #R2021a
MetaMorph Basic Molecular Devices #v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester Sigma Aldrich #130672-5G
NucBlue Live Cell Stain Thermo Fisher #R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope Olympus #IX81
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare #52-1308-00
Photoresist Spinner Hood Headway Research #PWM32
Plasma Cleaner Harrick #PDC-001
Plasma Etcher TePla #M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source Prior Scientific #L200
Silicon Wafers, 100 mm University Wafer #809
SU-8 2005 Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9463827
SU-8 Developer Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer Essex Brownell #DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine Fisher Scientific #BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich #448931
UAPON-40XW340 Objective Olympus #N2709300
UV Flood Exposure Newport #69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm Ted Pella, Inc. #19395-40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923 (2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Tags

Bioingeniør utgave 180
Mønstergenerering for mikropattern trekkraftmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bunde, K. A., Stamenović, D.,… More

Bunde, K. A., Stamenović, D., Smith, M. L. Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63628, doi:10.3791/63628 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter