Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Mönstergenerering för mikromönsterdragelektronkopi

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/63628
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Boston University

Summary

Vi beskriver förbättringar av en standardmetod för mätning av cellulära dragkrafter, baserad på mikrokontakttryck med ett enda subtraktivt mönstersteg av prickmatriser av extracellulära matrisproteiner på mjuka hydrogeler. Denna metod möjliggör enklare och mer konsekvent tillverkning av ömönster, vilket är viktigt för att kontrollera cellklusterformen.

Abstract

Mikromönsterdragmikroskopi möjliggör kontroll av formen på enskilda celler och cellkluster. Dessutom möjliggör förmågan att mönstra vid mikrometerlängdskalan användningen av dessa mönstrade kontaktzoner för mätning av dragkrafter, eftersom varje mikromönstrad prick möjliggör bildandet av en enda fokal vidhäftning som sedan deformerar den mjuka, underliggande hydrogelen. Detta tillvägagångssätt har använts för ett brett spektrum av celltyper, inklusive endotelceller, glattmuskelceller, fibroblaster, blodplättar och epitelceller.

Denna översyn beskriver utvecklingen av tekniker som möjliggör utskrift av extracellulära matrisproteiner på polyakrylamidhydrogeler i en regelbunden uppsättning prickar av förspecificerad storlek och avstånd. Eftersom mikrometerskalemönster är svåra att direkt skriva ut på mjuka underlag genereras mönster först på styva glasöverdrag som sedan används för att överföra mönstret till hydrogelen under gelering. Först beskrivs den ursprungliga mikrokontaktutskriftsmetoden för att generera matriser med små prickar på omslaget. Ett andra steg som tar bort det mesta av mönstret för att lämna öar av små prickar krävs för att kontrollera formerna på celler och cellkluster på sådana arrays av mönstrade prickar.

Därefter beskrivs en utveckling av detta tillvägagångssätt som möjliggör generering av öar av prickar med hjälp av ett enda subtraktivt mönstersteg. Detta tillvägagångssätt är mycket förenklat för användaren men har nackdelen med en minskad livslängd för huvudformen som behövs för att göra mönstren. Slutligen beskrivs de beräkningsmetoder som har utvecklats för analys av bilder av förskjutna prickar och efterföljande cellgenererade dragfält, och uppdaterade versioner av dessa analyspaket tillhandahålls.

Introduction

De flesta cellfenotyper utövar dragkrafter på sin miljö. Dessa dragkrafter genereras av en cells kontraktila cytoskelett, som är ett nätverk av aktin och myosin, och andra trådformiga biopolymerer och tvärbindningsproteiner 1,2,3,4. Krafter som genereras i cellen kan överföras till den extracellulära miljön eller intilliggande celler, främst via transmembranproteiner såsom integriner respektive kadheriner, 5,6. Hur en cell sprider sig eller kontraherar - och storleken på dragkrafterna i samband med dessa rörelser - är resultatet av en intim konversation med sin miljö, som till stor del beror på typen och mängden protein som finns i den extracellulära matrisen (ECM)7,8 och STYVHETEN HOS ECM. Faktum är att dragkraftmikroskopi har blivit ett ovärderligt verktyg för att förstå cellens lyhördhet för lokala stimuli som substratstyvhet, pålagda mekaniska spänningar och stammar eller kontakt med andra celler. Denna information är direkt relevant för förståelsen av sjukdomar som cancer och astma 9,10,11,12.

Ett system som kan användas för att mäta kraftinducerad deformation av ett substrat med kända materialegenskaper krävs för att beräkna dragkrafter. Dessa förändringar måste spåras över tid, vilket kräver både bildbehandling och bildbehandlingsteknik. En av de första metoderna som användes för att bestämma cellulära dragkrafter var observation och analys av sammandragningen av kollagenhydrogeler sådda med celler, även om denna metod endast var semikvantitativ13. En annan, mer förfinad metod var att mäta dragkrafterna som utövades av enskilda celler genom att bestämma krafterna som härrör från deformationen av ett tunt ark silikon14. Senare utvecklades mer kvantitativa mättekniker, och dessa metoder möjliggjorde också användning av mjuka hydrogeler såsom polyakrylamid (PAA)12,15,16. Vid användning av dessa mjuka material kunde dragkrafter bestämmas från den kraftinducerade förskjutningen av slumpmässigt förskjutna pärlor inbäddade i hydrogelen och gelens mekaniska egenskaper16,17. Ett annat framsteg kom med utvecklingen av mikropostmatriser gjorda av mjuk polydimetylsiloxan (PDMS) så att deras avböjning kunde mätas och omvandlas till kraft med hjälp av strålteorin18.

Slutligen utvecklades metoder för mikromönstering av mjuka hydrogeler eftersom dessa metoder möjliggör kontroll av kontaktytorna för cellvidhäftning. Genom att mäta deformationen av mikromönstret inom en cells kontaktyta kan dragkrafter enkelt beräknas eftersom en kraftfri referensbild inte krävs19. Denna metod har antagits i stor utsträckning eftersom den möjliggör indirekt mönstran av en regelbunden uppsättning mikronstora, diskreta fluorescerande proteinvidhäftningspunkter på PAA-geler för mätning av cellulära dragkrafter20. För att beräkna dessa krafter har en bildbehandlingsalgoritm, som kan spåra rörelserna för varje mikroförtunnad prick utan att kräva användarinmatning, utvecklats21.

Även om denna metod är enkel för att skapa hela rutnät av punktmönster, är det mer komplicerat när mönster av isolerade fläckar (eller öar) av prickar önskas. Mikromönsrade öar är användbara när kontroll av form, och till viss del av storlek, av kluster av celler behövs. För att skapa dessa öar kräver den ovannämnda metoden för mikrokontaktutskrift två distinkta steg: i) att använda en PDMS-stämpel för att skapa ett högkvalitativt mönster av prickar på en täckglas, och sedan ii) använda en andra annan PDMS-stämpel för att ta bort de flesta av dessa prickar och lämna isolerade öar av prickar21. Svårigheten att skapa öar med denna ursprungliga metod förvärras av det faktum att det är utmanande på egen hand att göra konsekventa rutmönster i processens första steg. Mikroutskriftsfrimärken består av en rad cirkulära mikrostolpar, vars diameter motsvarar önskad prickstorlek. Dessa frimärken beläggs sedan med ett jämnt lager protein och stämplas sedan med en exakt mängd tryck på behandlade täckglas för att skapa önskat mönster. Å ena sidan kan applicering av för mycket tryck på stämpeln resultera i ojämn proteinöverföring och dålig mönstertrohet på grund av pelarspännning eller sjunkande mellan pelare, vilket leder till kontakt med glaset. Å andra sidan resulterar applicering av för lite tryck i liten eller ingen proteinöverföring och dålig mönstertrohet. Av dessa skäl önskas en överföringsprocess som kan användas för att konsekvent skapa högkvalitativa mikromönster av isolerade öar av prickar i bara ett steg.

Här beskrivs en metod för indirekt mikromönstran av öar av mikronstora fluorescerande proteinvidhäftningspunkter på en PAA-gel som är mer konsekvent och mångsidig än tidigare utvecklade metoder. Medan äldre indirekta mikromönstranmetoder bygger på överföring av proteinmönster från en PDMS-stämpel till ett mellanliggande substrat, använder metoden som introduceras här PDMS-stämplar istället som ett kärl för proteinavlägsnande, inte tillsats. Detta görs genom att först fundamentalt ändra strukturen hos de PDMS-stämplar som används. I stället för att göra frimärken som består av ett mönster av jämnt fördelade cirkulära pelare, består frimärken av ett mönster av jämnt fördelade cirkulära hål i denna metod.

Med denna nya struktur kan ytan på dessa PDMS-stämplar sedan behandlas med glutaraldehyd som beskrivits tidigare 20,29,30, vilket gör att stämpeln kan binda kovalent med protein. När de används på en glasöverdragslip jämnt belagd med fluorescerande protein används dessa glutaraldehydbehandlade PDMS-stämplar för att avlägsna det mesta av proteinet på ytan av täckglaset, vilket endast lämnar det önskade mönstret av prickar förutbestämda av placeringen av mikronstora hål på stämpeln. Denna förändring ökar framgångsgraden för att generera mönster som består av ett nästan kontinuerligt rutnät av prickar och för att skapa isolerade öar av prickar genom bara ett steg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Skapande av silikonmästare

OBS: Det mesta av processen med design, skapande och felsökning av kiselmästare för upprepad gjutning av PDMS-stämplar har täckts tidigare21, så endast viktiga skillnader i detta nya tillvägagångssätt kommer att beskrivas här.

  1. Skapa designen för fotomasken med AutoCAD eller liknande designprogramvara. Täck ena sidan av fotomasken, en tunn glasbit, med ett tunt lager krom för att kontrollera UV-ljusspridning. Designa fotomasken så att lysande UV-ljus genom den på den valda fotoresisten kommer att skapa en silikonmästare med inversen av de funktioner som önskas på de slutliga PDMS-frimärkena. Se figur 1 för utformningen av denna mask.
    OBS: Huruvida de önskade funktionerna eller området utanför dem ska göras transparenta på fotomasken beror på det valda fotoresisten. Fotoresisten som används här är SU-8 2005 (VARNING: brandfarlig, hud- och ögonirriterande; håll dig borta från värme / lågor / gnistor och använd skyddshandskar och glasögon vid hantering), en negativ fotoresist som kan göra 5 μm långa funktioner med nästan vertikala sidoväggar.
    1. Bota den negativa fotoresisten genom att utsätta den för UV-ljus och ta bort den ohärdade SU-8 med ett kemiskt lösningsmedel. Utforma därför maskens primära egenskaper så att den är transparent medan maskens omgivning är ogenomskinlig.
    2. För denna nya borttagningsmetod, utforma fotomasken så att den består av två rutor på 1,5 x 1,5 cm (figur 1A), en full av ett jämnt rutnät med 2 μm cirklar fördelade 6 μm centrum till mitten och en annan som består av många fyrkantiga öar som är mindre, isolerade versioner av samma rutmönster (figur 1B). Gör öar i följande storlekar: 6 x 6 prickar, 12 x 12 prickar, 25 x 25 prickar och 42 x 42 prickar.
      OBS: Diametern på vidhäftningspunkterna (2 μm) valdes baserat på tidigare studier som mätte cellulära dragkrafter 22,23. Masken som används här är 101,6 x 101,6 mm och är belagd på ena sidan med ett 0,06 μm tjockt lager krom, vilket rekommenderas på grund av befälhavarens små egenskaper. Fotomasken som används här beställdes från ett externt fotomasktryckeri.
  2. Inom ett renrum, täck den valda kiselskivan jämnt med fotoresist. Som ett valfritt steg ytbehandlar du skivan i en plasmaskar innan du belägger den med motstånd.
    OBS: Här används skivor med en diameter på 100 mm. Behandling i en plasma asher gör skivan mer mottaglig för bindning till SU-8 och hjälper till att förhindra delaminering av SU-8 från skivan.
  3. Utför följande steg enligt fotoresisttillverkarens instruktioner:
    1. Snurra den belagda skivan för att skapa önskad funktionstjocklek, variera rotationstiden baserat på önskad tjocklek och typ av motstånd. För en 5 μm tjock SU-8 2005, dela upp det rekommenderade spinnprogrammet i följande tre steg:
      1. Belägg skivan med fotoresist genom att snurra vid 500 RPM i 10 s med en ramp på 100 RPM / s.
      2. Minska motståndstjockleken till ungefär 5 μm genom att snurra skivan vid 3 000 varv / min med en ramp på 300 varv / s i 30 s.
      3. Bromsa skivan långsamt efter att ha snurrat genom att minska hastigheten till 0 RMP med en ramp på 500 varv / s i 1 s.
    2. Förbered motståndet för UV-exponering genom att baka det kort på en 95 ° C varm tallrik. Ändra tiden som spenderas på kokplattan enligt önskad tjocklek på motståndet; bakningstiden är 2 min för en 5 μm tjock SU-8 2005.
    3. Utsätt motståndet för UV-ljus för att helt bota de önskade funktionerna. Var försiktig med överexponering, eftersom detta kan göra SU-8 spröd och påverka den resulterande mästarens övergripande kvalitet.
      1. Använd exponeringsenergi på 105 mJ/cm2 för en 5 μm tjock SU-8 2005. Baserat på effekten hos den tillgängliga UV-lampan, beräkna exponeringstiden genom att dividera exponeringsenergin med lampans effekt i mW.
        OBS: Eftersom lampan som används här har en effekt på 8 mW bör exponeringstiden vara 13,1 s.
    4. För att ställa in SU-8-funktionerna efter utveckling, baka igen på en 95 ° C kokplatta, den här gången i 3 minuter. Vänta tills de önskade funktionerna hos befälhavaren visas inom 1 minut under detta bakningssteg om motståndet exponerades ordentligt.
    5. Ta bort ohärdad SU-8 från kiselskivan med SU-8-utvecklaren. Var försiktig när du tar bort den ohärdade SU-8, eftersom den kan fastna mellan mikronstorlek och åtskilda funktioner på skivan.
      VARNING: SU-8-utvecklare är en brandfarlig hud och ögonirriterande; håll den borta från värme/ lågor/gnistor och använd skyddshandskar och glasögon när du hanterar den.
    6. Skölj med aceton efter utveckling för att avlägsna överskott av utvecklare på skivan och torka den helt med en kvävesprutpistol.
      VARNING: Aceton är en brandfarlig hud och ögonirriterande; håll den borta från lågor/gnistor och använd skyddshandskar och glasögon när du hanterar den.
    7. Valfritt, för SU-8 2005, baka på en 200 ° C kokplatta i 10 min.
      OBS: Denna hårda bakning ger mekanisk styrka till fotoresisten.
  4. Efter att ha fått svalna, lägg skivan i en skivbärarbricka och gjut den sedan i PDMS. Slutför först en silaniseringsbehandling på skivan för att göra SU-8-egenskaperna hos kiselmästaren mindre benägna att binda till PDMS och därmed mindre benägna att tas bort från skivans yta.
    1. För att slutföra silaniseringsytbehandlingen, placera mastern och en liten glasöverdragslip inuti en torksekator avsedd för användning endast med silaner. Placera 1-2 små droppar Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroktal)silan på täckglaset, stäng torksekatorn och kör den under vakuum i 30 min vid ett tryck av 4 500 Pa24.
      VARNING: Triklor(1H,1H,2H,2H-perfluoroktatyl)silan är en brandfarlig hud och ögonirriterande; håll den borta från värme / lågor / gnistor, använd skyddshandskar och glasögon vid hantering och arbeta under en draghuva.
    2. Stäng av vakuumet och låt mastern och täckglaset i uttorkaren i ytterligare 30 minuter.
      OBS: Befälhavaren är nu redo för gjutning i PDMS.

2. Subtraktiv mikrokontaktutskrift

  1. Blanda PDMS i rätt förhållande mellan härdningsmedel och bas baserat på tillverkarens instruktioner. Låt den sitta vid rumstemperatur och tryck i 15 minuter; sedan avgas under vakuum i 15 min.
  2. Häll PDMS i mastern och lägg den i en inkubator inställd på 37 ° C över natten för att bota.
  3. Ta bort befälhavaren från inkubatorn och låt den svalna till rumstemperatur.
  4. Medan befälhavaren svalnar, sonicate 25 mm täcker läppar i etanol i 10 min. Använd så många omslagsglas som antalet frimärken som förbereds.
  5. Skölj noggrant 25 mm täckglas med avjoniserat (DI) vatten och torka med en filtrerad luftpistol.
  6. Plasmabehandla täckglasen i 1 min med en plasmarengörare under vakuum på hög (radiofrekvenseffekt på 30 W). Var noga med att släppa vakuumet långsamt efter behandlingen för att förhindra att täckglasen rör sig inuti kammaren.
    OBS: Plasmabehandling av glasytan tjänar två syften: det rengör glasets yta för att avlägsna föroreningar och genererar syrebaserade polära grupper på glasets yta för att göra dethydrofobt 25. Denna hydrofobicitet gör glasets yta mer mottaglig för proteinbindning.
  7. I ett rum utan direkt solljus / takbelysning, täck varje täckglas med 100 μL fluorescerande märkt proteinlösning i en koncentration av minst 100 μg / ml, täck för extra skydd mot ljus och låt det sitta i 20 minuter.
    OBS: Här används fibronektin isolerat från human plasma och färgat med AlexaFluor 488.
    1. För att färga fibronektin, kombinera omärkt fibronektin med känd koncentration och volym med lämplig mängd fluorescerande färgämne i ett 1,5 ml rör. Täck röret med aluminiumfolie för att skydda färgämnet från ljus och inkubera det vid rumstemperatur i 1 timme, blanda försiktigt var 10: e minut genom att vända röret upp och ner 5-10 gånger.
      OBS: Mängden färgämne som krävs varierar beroende på vilket färgämne som används och massan av protein som används. Se tilläggsfil 1 för kalkylatorn som används för att bestämma lämplig mängd färgämne för fibronektin märkt med Alexa 488. Enligt tillverkarens instruktioner kan överskott av färgämne filtreras bort med hjälp av avsaltningskolonner (se materialförteckningen).
  8. Skölj varje täckglas noggrant med DI-vatten och ta bort överflödigt vatten från ytan genom att försiktigt knacka på sidorna på varje täckglas på en pappershandduk eller liknande absorberande material. Låt täckglasen vara avtäckta i mörkret i minst 30 minuter så att de kan torka helt.
  9. Medan de proteinbelagda täckglasen torkar, ta bort PDMS-stämpeln från befälhavaren genom att skära den med en skalpell eller annat vasst blad.
    OBS: Det är bäst att inte försöka skära igenom PDMS vid första försöket, eftersom applicering av så mycket tryck kommer att spricka kiselskivan och skada befälhavaren.
  10. Plasmabehandla PDMS-stämplarna i 2 min under vakuum på hög (radiofrekvenseffekt på 30 W).
  11. Placera stämplarna i en behållare med lock i en motorhuv och täck varje stämpel med ett mycket tunt skikt (<100 μL) av 10% (3-aminopropyl)trimetoxisilan (3-APTMS) utspätt i 100% etanol.
    VARNING: 3-APTMS är en brandfarlig hud och ögon irriterande; håll den borta från lågor / gnistor, använd skyddshandskar och glasögon vid hantering och arbeta under en draghuva. Överdriven beläggning av 3-APTMS-lösning kommer att orsaka att en orange film bildas senare i denna process. Denna 3-APTMS ytbehandling införlivar aminfunktionaliteten i ytan av PDMS-stämpeln, vilket möjliggör ytterligare derivatisering av stämpelns yta senare den26.
  12. Täck behållaren med stämplarna och låt dem sitta i rumstemperatur i 5 minuter.
  13. Skölj noggrant varje stämpel på båda sidor med DI-vatten.
  14. Placera frimärkena i en ren behållare och belägg dem rikligt med 2,5% glutaraldehyd i DI-vatten.
    VARNING: Glutaraldehyd är giftigt; Använd skyddshandskar och glasögon vid hantering och arbete under en dragskåpa). Denna glutaraldehydbehandling tillsammans med den tidigare 3-APTMS-behandlingen ger aldehydfunktioner på ytan av PDMS-stämplarna, som kan reagera med amingrupperna i proteinerna för att skapa en sekundär aminkoppling, vilket är avgörande för proteinavlägsnandeprocessen27.
  15. Täck frimärkena, låt dem sitta i rumstemperatur i 30 minuter och skölj sedan noggrant med DI-vatten igen. Ta bort överflödigt vatten från ytan på frimärken på samma sätt som täckglasen och låt stämplarna torka utan lock i ~ 30 minuter.
  16. Efter 30 min, kontrollera om både de proteinbelagda täckglasen och stämplarna är torra. Om någon av dem inte är helt torr, använd en filtrerad luftpistol för att torka dem helt, så att täckglasen inte utsätts för ljus under en längre period.
  17. När både täckglasen och frimärkena är torra, tryck frimärkena mönstersidan nedåt på täckglasen med tillräckligt tryck så att stämplarna kommer i full kontakt med täckglasets yta. Låt frimärkena stå i kontakt med täckglasen i 15 min.
    OBS: På grund av den kovalenta amidbindningen mellan glutaraldehydstämpeln och proteinskiktet på glasöverdraget - vilket är mycket starkare än de svaga hydrofoba interaktionerna mellan proteinskiktet och glasöverdraget - bör proteinerna skala av glaset enligt mönstret på PDMS-stämpeln när det har tagits bort.
  18. Efter 15 min skalar du försiktigt av PDMS-stämplarna från täckglasen.
    OBS: Om borttagningsprocessen fungerade korrekt bör stämplarna inte lossna från täckglasen utan motstånd utan motstånd utan att de inte heller ska vara så fast fast vid täckglasen att de inte kan tas bort utan överdriven kraft.
  19. Kontrollera troheten hos de mönstrade täckglasen med lämpligt filter på ett fluorescerande mikroskop (beroende på vilket fluorescerande färgämne proteinerna är märkta med).
  20. Använd de mönstrade täckglasen omedelbart eller spara och förvara dem borta från direkt ljus.

3. Aktiverade täckglas

OBS: Bottenöverdragen för användning i experimentkammaren för PAA-geler tillverkas i detta steg. Denna bottenöverdragslip är speciellt behandlad så att PAA-gelén kan förbli säkert vidhäftad när den övre mönstrade täckglaset avlägsnas under mönstrade processen. Liknande tekniker beskrivs också på andra håll 10,12,15,28.

  1. Sonicate 30 mm täckglas i 100% etanol i 10 min, skölj med DI-vatten och torka sedan noggrant med en filtrerad luftpistol. Förbered upp till 6 täckglas åt gången per sats i en 6-brunnsplatta.
  2. Plasmabehandla täckglasen i 1 min på hög (radiofrekvenseffekt på 30 W) och placera sedan varje täckglas i en brunn på en 6 brunnsplatta.
  3. Täck varje täckglas med ett mycket tunt lager av 5% APTMS i etanol i en dragskåpa.
    OBS: En orange rest kommer att bildas vid överdriven beläggning i denna process.
  4. Täck över 6-brunnsplattan och låt täckglasen sitta i 5 min.
  5. Skölj täckglasen (båda sidor) och insidan av varje brunn noggrant med DI-vatten och ta bort överflödigt vatten inuti brunnarna.
  6. Placera täckglasen tillbaka i 6-brunnsplattan och tillsätt cirka 2 ml 0,5% glutaraldehyd i DI-vatten.
  7. Täck över 6-brunnsplattan och låt täckglasen sitta i glutaraldehydlösningen i 30 minuter; Skölj sedan noggrant både täckglasen och brunnarna på varje platta med DI-vatten.
  8. Förvara de behandlade täckglasen i DI-vatten i 6-brunnsplattorna i upp till två veckor eller använd dem omedelbart. Se till att täckglasen är helt torra före användning.

4. PAA-geltillverkning och mönsteröverföring

OBS: När mönstrade täckglas har gjorts måste de användas för att överföra dessa proteinmönster till PAA-hydrogelen strax därefter (<24 h) 1,29,30. Följande recept är för en PAA-gel med en Youngs modul på 3,6 kPa. Mängderna bis-akrylamid, akrylamid och DI-vatten kan varieras för att justera styvheten hos PAA-gelerna12.

  1. Strax innan du börjar göra PAA-hydrogelprekursorn, ta bort akrylsyran N-hydroxisuccinimid (NHS) -ester från kylskåpet så att den kan nå rumstemperatur innan den öppnas. Förbered en utbytbar täckglasskål genom att sterilisera den med 70% etanol och låta den sitta under UV-ljus i ett biosäkerhetsskåp i minst 30 minuter före användning.
    VARNING: NHS är en giftig hud och ögonirriterande; Använd skyddshandskar och glasögon när du hanterar det och arbeta under en draghuva.
    1. Tillsätt 1,25 ml 40% akrylamid i DI-vatten till ett 15 ml koniskt rör.
      VARNING: Akrylamid är en giftig hud och ögonirriterande; Använd skyddshandskar och glasögon när du hanterar det och arbeta under en draghuva.
    2. Tillsätt 175 μL bis-akrylamidlösning i DI-vatten till samma rör (steg 4.1.1).
      VARNING: Bis-akrylamid är en giftig hud och ögonirriterande; Använd skyddshandskar och glasögon när du hanterar det och arbeta under en draghuva.
    3. Tillsätt 500 μL 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
      VARNING: PBS är irriterande för ögonen; Använd skyddshandskar och glasögon vid hantering.
    4. Tillsätt 2,915 ml DI-vatten.
  2. Pipettera 969 μL av denna prekursor i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och förvara resten vid 4 °C i upp till två veckor.
  3. Mät upp ~ 50-100 mg ammoniumpersulfat (APS) i ett annat mikrocentrifugrör och späd det i DI-vatten ner till 100 mg / ml; lägg den åt sidan för användning senare. Öppna NHS-estern (nu vid rumstemperatur) i huven och mät försiktigt upp till 3 mg NHS i ett mikrocentrifugrör. Späd NHS-estern till 1 mg/ml i 1x PBS.
    VARNING: APS är irriterande för hud och ögon; Använd skyddshandskar och glasögon när du hanterar det och arbeta under en draghuva. Både APS och NHS-ester kommer att hydrolysera över tiden, vilket gör att kemikaliernas aktivitet i stamlösningen varierar. Därför måste båda dessa lösningar beredas färska varje gång (till skillnad från resten av föregångaren).
  4. Utför de följande tre stegen i en dragskåpa:
    1. Tillsätt 2 μL tetrametyletylendiamin (TEMED) till mikrocentrifugröret innehållande 969 μL alikvot av PAA-prekursor.
      VARNING: TEMED är en brandfarlig hud och ögonirriterande; håll den borta från värme / flamma / gnistor, använd skyddshandskar och glasögon vid hantering och arbeta under en draghuva. TEMED är ett av två tvärbindningsmedel som är kritiska för polymerisationen av PAA-hydrogelen, den andra är APS.
    2. Tillsätt 15 μL 1 M saltsyra för att minska hydrogellösningens pH och undvika hydrolys av NHS-estern.
      VARNING: Saltsyra är en frätande hud och ögonirriterande; Använd skyddshandskar och glasögon när du hanterar det och arbeta under en draghuva.
    3. Tillsätt 10 μL av NHS-esterlösningen till röret.
      OBS: NHS är avgörande för mönstringsprocessen. Det kommer att reagera med amingrupper i proteinerna på den mönstrade täckglaset för att bilda en stabil amidbindning, vilket gör att mönstret kan överföras från glasöverdraget till ytan av PAA-gelén när det polymeriserar31.
  5. Utför dessa sista steg i ett biosäkerhetsskåp:
    1. Placera försiktigt 30 mm täckglaset i metalldelen av täckglasskålen (3-APTMS och glutaraldehydbehandlad sida uppåt) och skruva fast plastringen ovanpå. Ställ in den mönstrade täckglaset så att det lätt kan nås i nästa steg, men skydda det fortfarande från ljus så mycket som möjligt.
    2. Pipettera 5 μL APS-lösning i resten av PAA-prekursorn i mikrocentrifugröret, invertera den för att blanda och pipettera sedan omedelbart 35 μL av den lösningen på 30 mm täckglaset.
    3. Släpp den mönstrade täckproteinsidan ner på lösningen, var försiktig så att du inte skapar luftbubblor i hydrogelen. Skydda hydrogelen från ljus och låt den polymerisera i 90 min.
    4. När hydrogelen har polymeriserats, använd ett rakblad eller skalpell för att ta bort den övre täckglaset, så att täckglaset inte glider av gelén eller faller tillbaka på gelén när den har tagits bort, eftersom detta kommer att förstöra mönstret på gelens yta.
      OBS: Lämna inte gelén utan lock i ett område med betydande luftflöde (t.ex. ett biosäkerhetsskåp).
    5. För att passivera eventuell kvarvarande NHS-ester i hydrogelen, tillsätt 2 ml steril PBS till gelén och inkubera vid 37 ° C i 45 min. Förbered omedelbart gelerna för experiment eller förvara dem över natten i steril PBS vid 4 °C tills de används.

5. Avbildning

  1. För att förbereda dig för experiment med celler, slå på värmen (37 ° C) och fuktigheten (70%) i mikroskopet på eftermiddagen före ett planerat experiment för att låta utrustningen inuti mikroskopkammaren balansera till den högre temperaturen.
    OBS: Detta steg minimerar z-driften som orsakas av temperaturfluktuationer.
  2. Strax före experimentets början, slå på kammarens CO2-källa .
  3. För att förhindra x-y-drift orsakad av mikroskopstegets upprepade rörelse under experimentet, fixera den utbytbara täckglasskålen som håller den cellfröade hydrogelen till scenen med dubbelsidig tejp.
  4. Titta över gelén för att hitta ramar av intresse för bilden, vilket sparar varje stegposition för sektionerna som ska avbildas.
  5. I både ljusfältsvyn och den fluorescerande vyn som motsvarar det märkta proteinet ställer du in mikroskopprogramvaran för att avbilda varje ram en gång var 5: e minut i 2 timmar.

6. Bildanalys

OBS: Ett system har utvecklats som kan mäta deformationen av de mönstrade PAA-gelerna genom att bestämma placeringen av dragpunkterna, interpolera de ursprungliga platserna för de deformerade punkterna och sedan beräkna de cellulära dragkrafterna på varje plats. Alla programvarusystem som kan utföra bildbehandling och numeriska beräkningar kan användas. Programmet syftar till att snabbt bestämma dragkrafter, vilket eliminerar användarinmatning och förbehandlingsprocedurer som skulle bidra till användarrelaterade fel. Koden som används här finns här som tilläggsfiler 2-10, och dessa filer, tillsammans med ett par övningsbilder, kan nås på www.bu.edu/mml/downloads.

  1. I en bildbehandlingsprogramvara öppnar du alla enskilda bilder som tagits under ett timelapse-experiment från varje mikroskopvy som används i ordning, från den första till den sista bilden som tagits, och förvandlar dem till en enda bildstack (klicka på Bild | Staplar | Bilder att stapla). Se till att det finns två separata bildstaplar: en av cellernas ljusfältsvy och en av den fluorescerande vyn av mönstret som de är fästa vid.
    1. Om det finns drivande i de fluorescerande bilderna (dvs. ön av intresse rör sig i x- och / eller y-riktningen mellan varje ram med >1-2 μm), bearbeta först bildstacken med StackReg-plugin (P. Thévenaz, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne) för att ta bort varje bild i stacken baserat på positionen för den första (klicka på Plugins | StackReg | Översättning | Okej).
      OBS: Detta är kritiskt eftersom även drift under μm kan påverka den slutliga beräkningen av dragkrafter avsevärt, särskilt på styvare geler där denna x-y-drift ligger utanför det förväntade brusområdet. Den här koden sparar bilderna efter att drift har tagits bort, som sedan kan göras till en ny bildstack som ska analyseras.
  2. Mata in ljusfältet och fluorescerande bildstackar i CTFTimelapse.m (tilläggsfil 2).
    1. Ange filkatalogen där bildstackarna finns på rad 7.
    2. På raderna 8 och 9 anger du namnen på den fluorescerande bildstacken respektive motsvarande lysrörsstack med ljusfält.
    3. Ange PAA-gelstyvhet (Pa):
      1. I raderna 11-14, som innehåller några olika elastiska moduler av PAA-hydrogeler som används oftast, kommenterar ut (typ % i början av linjen) allt utom gelens elastiska modul i bilderna som analyseras. Alternativt kan du lägga till den elastiska modulen om den inte redan finns och kommentera resten (3658.19 Pa för testbilder).
    4. Ange punktradie (m) på rad 15 (1 × 10–6 m för testbilder).
    5. Ange maximal möjlig punktdiameter (μm) på linje 16 (2,5 μm för testbilder).
    6. Ange pixelförhållande (μm/pixel):
      1. I raderna 17-20, som innehåller några olika bildpixelförhållanden baserade på bildinställningar som använts tidigare, kommentera ut (skriv % i början av raden) allt utom pixelförhållandet för de bilder som analyseras. Alternativt kan du lägga till pixelförhållandet som används om det inte redan finns och kommentera resten (0,1613 μm/pixel för testbilder).
    7. På raderna 35 och 87 anger du filkatalogen där de nödvändiga bildbehandlingsfilerna finns.
      OBS: Från den fluorescerande bildstacken bestämmer koden platsen för varje fluorescerande prick och spårar rörelsen för varje prick mellan varje bild i stacken20. Den ursprungliga positionen för de mikrokontakttryckta punkterna är känd eftersom de inte deformeras när de överförs korrekt till hydrogelen32.
  3. Vänta tills två figurer och en dialogruta visas när programmet hittar prickarna. Använd figur 1 för att säkerställa att programmet har hittat rätt prickar och inte hittat många prickar där det inte fanns några. Använd figur 2 för att välja det rektangulära rutnätet som hjälper programmet att lokalisera och beräkna cellulära dragkrafter.
    OBS: Figur 1 är ljusfältsbilden av cellen med prickarna som finns av programmet (som kommer att vara röda) överlagda över den (se figur 3A). Figur 2 är en bild som visar samma prickar som visas i figur 1 men utan ljusfältsbilden i bakgrunden.
    1. Vänta tills dialogrutan uppmanar att trycka på Enter efter att ha valt punkt - där varje punkt är en av de röda prickarna som finns i programmet - och har en stor knapp inuti den märkt Enter.
    2. Välj fyra olika prickar i figur 2 för att skapa ett rektangulärt rutnät runt och inkludera cellen/klustret i det mönstret. Välj varje prick en efter en med ett vänsterklick på musen och bekräfta det genom att trycka på Enter på knappen i ovannämnda dialogruta. Håll räkningen på hur många punkter som finns mellan den första och andra punkten samt den första och tredje punkten, eftersom programmet kommer att be om dessa värden när alla fyra hörnpunktarna har valts. Ange dessa värden i kommandofönstret (skriv antalet prickar och klicka på enter-knappen på tangentbordet när du uppmanas till det).
  4. När det rektangulära rutnätet har valts väntar du på att skriptet beräknar dragkrafter som det hittar i rutnätet baserat på placeringen av de fluorescerande prickarna. Observera att skriptet först hittar förskjutningsvektorn (u) för det geometriska centrumet för varje punkt och sedan beräknar motsvarande dragkraftsvektor (F) med Eq (1):
    Equation 1(1)
    Där E är Youngs modul av PAA-substratet , a är radien för de fluorescerande punktmarkörerna och ν är Poissons förhållande mellan PAA-substratet32. Eq (1) förutsätter att substratet är ett oändligt elastiskt halvrum, att dragkrafter appliceras i mitten av varje cirkulär punktmarkör och att avståndet mellan punktmarkörerna är tillräckligt stort så att deras respektive förskjutningar inte interagerar med varandra23.
    OBS: I de experiment som beskrivs här används prickmarkörer med radie a = 1 μm och 6 μm centrum-till-centrum-avstånd. Traktionskraftspilar inuti cellen/klustret som pekar inåt mot mitten av cellen bör vara närvarande, medan området utanför cellen/klustret inte bör ha dragpilar närvarande (se figur 3C-E). Dragpilar som pekar utåt inifrån cellen / klustret eller många stora dragpilar som finns utanför cellen är ett tecken på ett dåligt valt rektangulärt rutnät.
  5. När rätt dragfält har hittats väljer du en lämplig region av intresse (ROI) som omger cellen / klustret, som inkluderar alla dragpilar i cellen med markören.
    1. För att rita ROI, vänsterklicka så många gånger som behövs för att rita en polygonform med så många sidor som önskas, justera formen eller flytta ROI efter att den har ritats genom att vänsterklicka på hörnen respektive kanterna. När avkastningen har ritats dubbelklickar du för att gå vidare till nästa bild i stacken. Upprepa detta för alla bilder i ljusfältsstacken.
      OBS: Koden sparar dragkraft och förskjutningsdata för varje tidpunkt i samma mapp som de ursprungliga bildstackarna, som sedan kan analyseras ytterligare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PAA-hydrogeler med Youngs modul E = 3,6 kPa och Poissons förhållande ν = 0,445 gjordes för användning med denna subtraktiva mikromönstermetod. Hydrogelerna gjordes för att vara ~ 100 μm tjocka, vilket gör att de kan avbildas med den bildinställning som används här samtidigt som cellerna förhindras från att känna av den styva täckglaset under gelén, vilket skulle orsaka problem i studier fokuserade på cellulär styvhet som avkännar23,33. Geler med många andra styvhetsnivåer (upp till 30 kPa) har framgångsrikt tillverkats och avbildats med hjälp av den indirekta mikromönstermetoden34, så metoden är inte begränsad till användning av endast 3,6 kPa hydrogeler. Täckglasen behandlas i förväg med glutaraldehyd så att gelén kan förbli fixerad på den nedre täckglaset när den toppmönstrade täckglaset avlägsnas (figur 2C,D).

För att visualisera och mäta cellulära dragkrafter i kluster mönstrades 3,6 kPa-hydrogelerna indirekt med fluorescerande fibronektin (figur 2A-D) för att skapa ömönster av förutbestämd storlek och form (figur 2E). Andra typer av proteiner kan också mönstras på dessa mjuka hydrogeler 21,35,36,37,38. Kvaliteten på det överförda mönstret är direkt relaterat till troheten hos huvudformen från vilken PDMS-stämpeln är gjuten. Formar som har haft SU-8-delaminering kommer att se en försämring av kvaliteten på mönstren gjorda av frimärken gjutna från dessa delaminerade formar. Till exempel kommer mögel med delaminerad SU-8 ofta att skapa mikromönster som innehåller sektioner av omönstrat fibronektin mellan de förutbestämda öarna. Om de gjuts på en gel tillåter dessa mönster cellfästning på gelén i områden utanför öns mikromönster. På grund av detta var avbildning av cellkluster kopplade till helt eller mestadels intakta ömönster prioriteten.

Bovin vaskulära glatta muskelceller (BVSMC) såddes på dessa hydrogeler med en densitet av cirka 60-80 × 103 celler / gel för att främja klusterbildning och fick fästa i 18-24 timmar före avbildning. Strax före experimenten färgades celler med en levande cellkärnfläck för att tillåta levande celler att identifieras och bestämma antalet celler i varje kluster. Mikromörmar med och utan celler avbildades och analyserades. Avbildning av öar utan celler möjliggjorde beräkning av bullret som finns i dragkraftsberäkningar för 3,6 kPa-geler. Dessa falskt positiva förskjutningsmätningar kan sedan användas för att bestämma ett lämpligt tröskelvärde under vilket förskjutningar bör uteslutas.

Det har visat sig att 0,3 μm vanligtvis är tillräckligt för att eliminera mönsterotrohet som leder till falskt positiva förskjutningsmätningar. Om du gör det kan det leda till förlust av dragkrafter med låg kraft, men det är viktigt för att ta bort falskt positiva dragkrafter. Vid avbildning prioriterades cellkluster på mestadels intakta ömönster (dvs de som inte saknade många om några prickar) och mestadels intakta mönster utan celler. Varje ROI avbildades en gång var 5: e minut i 2 timmar. Mikroskopet som användes för att fånga bilder av både celler och de mönstrade PAA-gelerna under utökade timelapse-experiment var ett fluorescensmikroskop med ett automatiskt stadium, en fluorescensljuskälla, en kamera och standardmikroskopprogramvara. Detta mikroskop har en anpassad uppsättning filter för att observera många olika färger av fluorescens. Målet som används för att se cellerna och den mönstrade hydrogelen är ett 40x vattennedsänkningsmål, NA = 1,15. Detta mikroskop är också utrustat med ett anpassat temperatur (37 ° C) -, fuktighet (70%) och CO2 (5%) -reglerat system för att hålla cellerna livskraftiga under långa experiment.

För att beräkna dragkrafterna från bilderna av mikromönsteröarna användes bildanalysprogramvara för att spåra förskjutningarna av de fluorescerande fibronektinprickarna över tiden. Genom att känna till förskjutningarna hos de fluorescerande prickarna och styvheten hos PAA-gelén på vilken prickarna är mönstrade kan programmet bestämma värdena för dragkrafterna som förmedlas av både enskilda celler och kluster på PAA-substratet. Det finns emellertid två sätt på vilka programmet blir oförmöget att bestämma dragvärden. Om för många prickar inom en given ram av intresse deformeras, kämpar programmet för att beräkna krafter, eftersom programmet förlitar sig på att de flesta prickarna i en analyserad bild ska vara odeformerade. Dessutom, om två prickar är för nära varandra (centrum-till-centrum-avstånd på ≤2 μm20), kan förskjutningarna av de enskilda prickarna störa varandra, vilket förhindrar noggrann bestämning av deras faktiska förskjutningsvärden och därmed deras dragvärden. Så länge mikromönster är utformade med prickar som är väl åtskilda från varandra, bör cellerna inte kunna förskjuta prickarna så mycket att de blir så nära varandra, även på mjukare underlag.

Figur 3 visar funktionerna i borttagningsmönstermetoden. Här visas denna metods förmåga att tillverka isolerade, väldefinierade ömönster av förutbestämd form i figur 3B-E, där fibronektinvidhäftningspunkterna endast finns inom det önskade området på ön. Dessa isolerade öar av vidhäftningstecken möjliggör ytterligare bättre kontroll av klusterformen, som visas i figur 3A. Eftersom öarnas form och storlek är konsekventa tenderar cellklusterna som fäster och växer på dem också att ha konsekvent form, eftersom ömönstren begränsar klustrets tillväxtområde. Slutligen visar figur 3B-E också förmågan hos dessa öar att användas för att beräkna cellulära dragkrafter och tendensen hos dessa dragkrafter att förändras över tiden. Här är klustrets dragkrafter de största runt öns kanter. Detta förväntas eftersom cellerna vid kanterna av ett kluster har färre interaktioner med andra celler i klustret än de i klustrets inre. Således utövar dessa celler vid kanterna större krafter på substratet som svar på cytoskelettkontraktion än cellerna i det inre.

Figure 1
Figur 1: Design av fotomask. (A) En representation av den första halvan av fotomaskdesignen som används här, ett diskret rutnät med 2 μm diameter prickar fördelade vid 6 μm centrum-till-centrum. Medan bilden som visas här bara är en liten del av designen, fyller detta rutnät ett utrymme på 1,5 x 1,5 cm totalt på fotomasken. (B) En återgivning av den andra halvan av fotomaskens utformning. här visas sex små öar med 6 x 6 prickar. På fotomasken finns det flera olika östorlekar: 6 x 6 (visas här), 12 x 12, 25 x 25 och 42 x 42 prickar. En lika åtskild (50 μm mellan öar) matris av varje östorlek tar upp ett utrymme på 1,5 x 0,375 cm, och matriserna på olika öar är åtskilda med 50 μm. Prickarna på varje ö är 2 μm i diameter och åtskilda 6 μm centrum-till-centrum. De två delarna av masken som beskrivs i A och B är åtskilda med 0,75 cm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Bild 2: Utskrift av subtraktiv mikrokontakt. (A) En PDMS-stämpel behandlas med glutaraldehyd och sätts i kontakt med en glasskiva jämnt belagd med fluorescerande fibronektinlösning. (B) Vid avlägsnande från täckglaset avlägsnar PDMS-stämpeln det mesta av det fluorescerande fibronektin på ytan av täckglaset och lämnar mikronstora prickar av protein endast på platser som förutbestämts av PDMS-stämpelns utformning. (C) Den mönstrade täckglaset placeras i kontakt med en PAA-prepolymer och NHS-lösning. (D) När PAA-gelén har tillåtits att polymeriseras helt, avlägsnas toppöverdragslipen och ett mönster av fibronektin skrivs ut på PAA-gelytan. (E) Ett exempel på ett diskret ömönster som består av jämnt fördelade prickar på en PAA-hydrogel med en Youngs modul på 3,6 kPa. Skalstång = 20 μm. Förkortningar: PDMS = polydimetylsiloxan; PAA = polyakrylamid; NHS = N-hydroxisuccinimid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Analys av celler på ömikromönster. (A) En ljusfältsbild av ett kluster av 3 BVSMC överlagrade på ett fluorescerande fibronektinömikromönster på en PAA-hydrogel med en Youngs modul på 3,6 kPa visas. Prickar är 2 μm i diameter och separeras med 6 μm centrum-till-centrum. (B) Det fluorescerande mönstret visar att ett antal av fibronektinpunkterna på ön har förskjutits på grund av BVSMC: s tillämpning av krafter. (C) De dragkrafter som appliceras på vidhäftningspunkterna vid tidpunkten punkt 1 (början av ett 2 timmars experiment). Riktningen för dessa kraftvektorer indikeras av riktningen för de färgade pilarna. Deras storlek indikeras av pilfärgen och dess motsvarande värde på färgfältet (alla kraftvärden är i nN). Vektorlängden är relativ baserat på de minsta och maximala krafter som beräknas av programmet för varje tidpunkt. (D) Traktionskrafter för samma kluster vid tidpunkten 13 (halvvägs genom ett 2 timmars experiment) (E) Traktionskrafter för samma kluster vid tidpunkten 25 (slutet av ett 2 timmars experiment). Förkortningar = BVSMC = bovin vaskulära glatta muskelceller; PAA = polyakrylamid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: Kalkylator för märkning av fibronektin Detta är ett verktyg för att beräkna rätt mängd Alexa488 fluorescerande färgämne att använda vid märkning av fibronektin. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: CTFTimelapse.m Detta är bildbehandlingsfilen, som möjliggör beräkning av cellulära dragkrafter enligt beskrivningen i avsnitt 5 (Bildanalys). Detta inkluderar att välja ett önskat rutnät med prickar (steg 6.3-6.3.2) och välja region av intresse för CTF-beräkningarna (steg 6.5 och 6.5.1). Alla följande tilläggsfiler anropas direkt av det här skriptet eller någon av de andra funktionerna som används i det. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 3: analyze_initial_image_4.m Denna funktion anropas av CTFTimelapse.m, och dess syfte är att lokalisera och justera de fluorescerande prickarna på ett rutnät från den första ramen i bildstacken i det deformerade rutmönstret för att matcha det ursprungliga odeformerade rutmönstret. Detta möjliggör beräkningar av dragkraft för den första bildrutan i bildstacken. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 4: analyze_subsequent_images.m Denna funktion kallas av CTFTimelapse.m, och dess syfte är att lokalisera och justera de fluorescerande prickarna på ett rutnät från alla ramar i bildstacken i det deformerade rutmönstret efter det första. Detta möjliggör beräkningar av dragkraft för alla bildrutor i bildstacken efter den första. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 5: bpass.m Denna funktion anropas av både analyze_initial_image_4.m och analysera subsequent_images.m, och dess syfte är att implementera ett verkligt rymdbandpassfilter som bearbetar bildstacken för det deformerade rutmönstret. Det här filtret undertrycker pixelbrus och bildvariationer med lång våglängd samtidigt som information av karakteristisk storlek behålls. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 6: CellBoundary.m Denna funktion kallas av CTFTimelapse.m, och dess syfte är att den gör det möjligt för programanvändaren att rita en region av intresse runt cellen / klustret för vilket dragkrafter ska beräknas. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 7: pkfnd.m Denna funktion anropas av både analyze_initial_image_4.m och analyze_subsequent_images.m, och dess syfte är att hitta lokala maxima i en bild med noggrannhet på pixelnivå. Dessa toppar används av cntrd.m för att lokalisera det fluorescerande rutmönstret för CTFTimelapse.m. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 8: cntrd.m Denna funktion kallas av både analyze_initial_image_4.m och analyze_subsequent_images.m, och dess syfte är att lokalisera centroiden av ljusa fläckar i en bild till subpixelnoggrannhet. Detta möjliggör placering av det fluorescerande rutmönstret med CTFTimelaspe.m, enligt beskrivningen i steg 6.3. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 9: FourCorners.m Denna funktion kallas av både analyze_initial_image_4.m och analyze_subsequent_images.m, och dess syfte är att ta det rutnät som användaren valt (steg 6.3-6.3.2) och beräkna avståndet mellan varje hörnpjäs i två ortogonala axlar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 10: track.m Denna funktion kallas av både analyze_initial_image_4.m och analyze_subsequent_images.m, och dess syfte är att spåra rörelsen av prickarna i det fluorescerande rutnätmönstret mellan ramar, vilket är viktigt för att beräkna motsvarande dragkrafter. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En förbättrad metod för indirekt mönstrande PAA-hydrogeler beskrivs i detta dokument. Den här metoden bygger på metoder som har använts tidigare, dvs. 20,35,36,37,38,39,40,41,42. Den primära förändringen är att PDMS-stämplar nu används för att ta bort protein och lämna det önskade mönstret bakom sig på det mellanliggande substratet snarare än att direkt stämpla mönstret ner på det. Detta möjliggör mycket mer konsekvent skapande av högkvalitativa mikromönster och skapandet av isolerade mikromönstade öar som tidigare krävde två produktionssteg. Formen och storleken på ömönstren som gjorts med denna metod är också lättare att kontrollera än de som gjordes med den tidigare tvåstegsmetoden. Den nya tekniken är mindre mottaglig för mängden tryck som appliceras under mikroutskrifter än den gamla tekniken. En andra fördel är att denna borttagningsmetod kan göra ömönster av kontrollerad form och storlek i endast ett steg. Däremot krävde tidigare metoder två steg för att göra öar, inklusive stämpling för deponering och efterföljande stämpling för borttagning, och formerna på dessa öar är mindre exakta än de som gjordes med borttagningsmetoden.

Den största nackdelen med denna metod är att livslängden för de mästare som används för att forma den nya stilen av PDMS-frimärken verkar vara kortare än de som användes i den tidigare stämplingsmetoden. Detta kan sannolikt hänföras till formen på de nya mästarna som används i borttagningsmetoden. De gamla mästarna bestod av en 1,5 x 1,5 cm yta av SU-8 bestående av lika fördelade 5 μm djupa cirkulära hål, som när de gjuts i PDMS skulle skapa frimärken som bestod av jämnt fördelade cylindriska stolpar av samma höjd. Omvänt består de nya mästarna av en 1,5 x 1,5 cm yta på 5 μm långa SU-8 cylindriska stolpar, som, när de gjuts i PDMS, gör frimärken som består av jämnt fördelade hål.

Med denna förändring i mästarnas struktur har det visat sig att SU-8 tenderar att bli delaminerad från ytan mycket lättare än i den gamla metoden. Försiktighetsåtgärder vidtogs för att förhindra detta, såsom ytbehandling av kiselskivorna i en plasmaaska för att göra dem mer mottagliga för bindning till SU-8. Skivans yta silaniserades också före den första gjutningen i PDMS för att förhindra att SU-8 fastnade på PDMS vid borttagning av stämplarna. Trots detta har SU-8-delaminering från kiselskivorna observerats efter upprepad gjutning i PDMS, och försiktighet bör vidtas för att säkerställa att nya kiselskivor tillverkas före förlust av den nuvarande mastern. Ett möjligt sätt att undvika denna delaminering är att använda PDMS dubbelgjutningsmetod, som tidigare har beskrivits43, även om denna andra metod har sina begränsningar.

En annan brist i denna metod (och andra metoder som använder deformerbara hydrogeler för att mäta dragkrafter44) är att dragfältet inte är i mekanisk jämvikt på grund av experimentellt brus. Således behövs en efterbehandlingsanalys för att erhålla ett balanserat dragfält efter att dragkrafterna har beräknats. Ett sätt att balansera dragkrafterna är att erhålla de krafter som ligger närmast de mätningar som uppfyller jämvikten med hjälp av en minsta kvadratmetod. Som ett resultat förändras storleken och orienteringen av uppmätta dragkrafter45.

Det finns begränsningar för denna metod för beräkning av cellulära dragkrafter. För att exakt bestämma cellulära dragkrafter med hjälp av Eq. (1) (steg 5.4) måste mönstret utformas så att förskjutningen av en vidhäftningspunkter inte signifikant påverkar förskjutningen av dem som ligger direkt intill den. Teoretiskt sett minskar förskjutningen av en cirkulär vidhäftningsregion på ytan av ett oändligt halvutrymme på grund av en tangentiell kraft som verkar i mitten när ett radiellt avstånd från cirkelns mitt ökar23. Specifikt, för ett substrat vars Poissons förhållande är ~ 0,445 (såsom de som beskrivs här), är förskjutningen vid kanten av det cirkulära området ungefär två tredjedelar förskjutningen i mitten av regionen. Teoretiska förutsägelser sträcker sig emellertid inte bortom den cirkulära regionen. Således antas det att den minskande trenden i förskjutningsstorlek, bestämd teoretiskt23, fortsätter bortom kanten av vidhäftningscirkeln. I mikromönsterdesignen som beskrivs här används 2 μm cirkulära prickar fördelade 6 μm centrum-till-centrum. Anledningen till detta avstånd är att en förskjutning på 6 μm avstånd från mitten av en prick uppskattas vara ungefär 1/12av förskjutningen i mitten av pricken, vilket antas vara tillräckligt litet för att påverka förskjutningsvärdena för intilliggande prickar. Det är emellertid möjligt att dragkrafterna som utövas av celler kan förskjuta vidhäftningsp prickarna på ett substrat så mycket att centrum-till-centrum-avståndet mellan dem blir mindre än 2 μm. I detta fall håller inte antagandet om förskjutningen av intilliggande vidhäftningsp prickar som inte stör varandra, och dragkrafterna kan inte beräknas exakt med ekvationen som ges i steg 6.4 (Eq (1)).

Den föreslagna tekniken ger ett kraftfullt verktyg för att mäta cellulära dragkrafter. Dessa krafter ger insikt i den mekaniska miljön hos både enskilda celler och kluster och kan hjälpa till att förstå om och hur olika typer av celler upprätthåller mekanisk stabilitet. Att upprätthålla en homeostatisk nivå av cellspänning är avgörande för många cellulära processer, och förlust av denna spänningshomeostas har kopplats till olika sjukdomar, såsom ateroskleros, astma och cancer 9,10,12. Spänningshomeostas definieras som förmågan hos en cell eller ett kluster av celler att upprätthålla en konsekvent spänningsnivå, med en låg tidsmässig variation runt ett börvtal46.

Denna indirekta mikromönstermetod kan användas för att bestämma förmågan hos olika celltyper att upprätthålla spänningshomeostas, både på individuell och multicellulär nivå. Detta görs genom att spåra förändringar i värdena för det cellulära dragfältet över tiden och sedan kvantifiera tidsmässiga fluktuationer i dragfältet med hjälp av variationskoefficienten (CV), vilket representerar det förhållandet mellan standardavvikelsen för traktionsfältets storlek och dess medelvärde. Summan av storleken på dragkrafterna och storleken på det kontraktila momentet (det första ögonblicket av dragkrafterna) används som skalärmått av storleken på dragfältet46. Om dragfältets CV förblir nära noll under ett timelapse-experiment visar det att cellen / klustret upprätthöll spänningshomeostas över tiden46.

Sammanfattningsvis erbjuder denna nya metod för indirekt mikromönstran av mjuka hydrogeler en enklare och effektivare metod för att skapa mönstrade hydrogeler än tidigare metoder. Det finns vissa steg som kan vidtas för att förbättra och utöka denna metod. I första hand skulle förbättring av kiselmästarnas tillverkningsprocess på ett sätt som förlänger deras livslängd eliminera den primära nackdelen med denna mikromönstermetod. När det gäller sätt att utöka denna metod skulle utforska olika öformer utöver bara de fyrkantiga öarna som beskrivs här förbättra mångsidigheten i denna metod.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Dr. Paul Barbone från Boston University Department of Mechanical Engineering för hjälpsamma diskussioner och hjälp med dataanalys. Denna studie stöddes av NSF-anslaget CMMI-1910401.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-aminopropyl)trimethoxysilane Sigma Aldrich #281778
1.5 mL Microcentrifuge tube Fisher Scientific #05-408-129
15 mL conical tube Fisher Scientific #05-539-12
4 x 4 in 0.060 Quartz LR Chrome Photomask Advance Reproductions Corporation N/A Custom-designed mask
6 Well Plates Fisher Scientific #07-200-83
Acetone Fisher Scientific #A18P-4
Acrylamide Solution, 40% Sigma Aldrich #A4058
AlexaFluor 488 Thermo Fisher #A20000
Aminonium Persulfate Fisher Scientific #BP179-25
Bisacrylamide Fisher Scientific #PR-V3141
Ethanol Greenfield Global #111000200C1GL
Glass Coverslips, 25 mm round Fisher Scientifc #12-545-102
Glass Coverslips, 30 mm round Warner #64-1499
Hamamatsu ORCA-R2 Camera Hamamatsu #C10600-10B
Human Plasma Valley Biomedical #HP1051P Used to isolate fibronectin
Hydrochloric Acid, 1.0 N Millipore Sigma #1.09057
ImageJ Wayne Rasband #1.53n
Interchangeable Coverslip Dish Set Bioptechs #190310-35
Kim Wipes Fisher Scientific #06-666-11C
Mask Alinger Karl Suss #MA6
Matlab 2021 Mathworks #R2021a
MetaMorph Basic Molecular Devices #v7.7.1.0
N-hydroxysuccinimide ester Sigma Aldrich #130672-5G
NucBlue Live Cell Stain Thermo Fisher #R37605
Olympus IX2-ZDC Inverted Microscope Olympus #IX81
PD-10 Desalting Columns GE Healthcare #52-1308-00
Photoresist Spinner Hood Headway Research #PWM32
Plasma Cleaner Harrick #PDC-001
Plasma Etcher TePla #M4L
Prior Lumen 200Pro Light Source Prior Scientific #L200
Silicon Wafers, 100 mm University Wafer #809
SU-8 2005 Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9463827
SU-8 Developer Kayaku Advanced Materials Inc. #NC9901158
Sylgard 184 Silicone Elastomer Essex Brownell #DC-184-1.1
Tetramethylethylenediamine Fisher Scientific #BP150-20
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma Aldrich #448931
UAPON-40XW340 Objective Olympus #N2709300
UV Flood Exposure Newport #69910
Wafer Carrier Tray, 110 x 11 mm Ted Pella, Inc. #19395-40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  2. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  3. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS One. 8 (2), 55172 (2013).
  4. Bhadriraju, K., et al. Activation of ROCK by RhoA is regulated by cell adhesion, shape, and cytoskeletal tension. Experimental Cell Research. 313 (16), 3616-3623 (2007).
  5. Stricker, J., Falzone, T., Gardel, M. L. Mechanics of the F-actin cytoskeleton. Journal of Biomechanics. 43 (1), 9-14 (2010).
  6. Ganz, A., et al. Traction forces exerted through N-cadherin contacts. Biology of the Cell. 98 (12), 721-730 (2006).
  7. Chopra, A., et al. Reprogramming cardiomyocyte mechanosensing by crosstalk between integrins and hyaluronic acid receptors. Journal of Biomechanics. 45 (5), 824-831 (2012).
  8. Winer, J. P., Chopra, A., Kresh, J. Y., Janmey, P. A. Substrate elasticity as a probe to measure mechanosensing at cell-cell and cell-matrix junctions. Mechanobiology of cell-cell and cell-matrix interactions. , Springer. Boston, MA. 11-22 (2011).
  9. Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts. Biophysical Journal. 80 (4), 1744-1757 (2001).
  10. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), 32572 (2012).
  11. Lavoie, T. L., et al. Disrupting actin-myosin-actin connectivity in airway smooth muscle as a treatment for asthma. Proceedings of the American Thoracic Society. 6 (3), 295-300 (2009).
  12. Kraning-Rush, C. M., et al. Quantifying traction stresses in adherent cells. Methods in Cell Biology. 110, 139-178 (2012).
  13. Halliday, N. L., Tomasek, J. J. Mechanical properties of the extracellular matrix influence fibronectin fibril assembly in vitro. Experimental Cell Research. 217 (1), 109-117 (1995).
  14. Harris, A. K., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
  15. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (46), e2173 (2010).
  16. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  17. Sniadecki, N. J., Chen, C. S. Microfabricated silicone elastomeric post arrays for measuring traction forces of adherent cells. Methods in Cell Biology. 83, 313-328 (2007).
  18. Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (4), 1484-1489 (2003).
  19. Tseng, Q., et al. A new micropatterning method of soft substrates reveals that different tumorigenic signals can promote or reduce cell contraction levels. Lab on a Chip. 11 (13), 2231-2240 (2011).
  20. Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
  21. Polio, S. R., et al. Topographical control of multiple cell adhesion molecules for traction force microscopy. Integrative Biology. 6 (3), 357-365 (2014).
  22. Balaban, N. Q., et al. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates. Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).
  23. Maloney, J. M., et al. Influence of finite thickness and stiffness on cellular adhesion-induced deformation of compliant substrata. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear, and Soft Matter Physics. 78 (1), Pt 1 041923 (2008).
  24. Gilles, S. Chemical modification of silicon surfaces for the application in soft lithography. Technical Report Juel-4249. , Available from: https://www.osti.gov/etdeweb/biblio/21084355 (2007).
  25. Lim, K. B., Lee, D. C. Surface modification of glass and glass fibers by plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis. 36, 254-258 (2004).
  26. Beal, J. H. L., Bubendorfer, A., Kemmitt, T., Hoek, I., Arnold, W. M. A rapid, inexpensive surface treatment for enhanced functionality of polydimethylsiloxane microfluidic channels. Biomicrifluidics. 6 (3), 36503 (2012).
  27. Goddard, J. M., Erickson, D. Bioconjugation techniques for microfluidic biosensors. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 394 (2), 469-479 (2009).
  28. Rajagopalan, P., et al. Direct comparison of the spread area, contractility, and migration of balb/c 3T3 fibroblasts adhered to fibronectin- and RGD-modified substrata. Biophysical Journal. 87 (4), 2818-2827 (2004).
  29. Tang, X., Yakut Ali, M., Saif, M. T. A. A novel technique for micro-patterning proteins and cells on polyacrylamide gels. Soft Matter. 8 (27), 3197-3206 (2012).
  30. Rape, A. D., Guo, W. H., Wang, Y. L. The regulation of traction force in relation to cell shape and focal adhesions. Biomaterials. 32 (8), 2043-2051 (2010).
  31. Rusmini, F., Zhong, Z., Feijen, J. Protein immobilization strategies for protein biochips. Biomacromolecules. 8 (6), 1775-1789 (2007).
  32. Polio, S. R., et al. A micropatterning and image processing approach to simplify measurement of cellular traction forces. Acta Biomaterialia. 8 (1), 82-88 (2012).
  33. Buxboim, A., et al. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
  34. Xu, H., et al. Focal adhesion displacement magnitude is a unifying feature of tensional homeostasis. Acta Biomaterialia. 113, 327-379 (2020).
  35. Shen, K., et al. Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (22), 7791-7796 (2008).
  36. Eichinger, C. D., Hsiao, T. W., Hlady, V. Multiprotein microcontact printing with micrometer resolution. Langmuir. 28 (4), 2238-2243 (2012).
  37. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (22), e1065 (2008).
  38. Zollinger, A. J., et al. Dependence of tensional homeostasis on cell type and on cell-cell interactions. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (3), 175-184 (2018).
  39. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. 13 (7), 2059-2067 (1997).
  40. Ruiz, S. A., Chen, C. S. Microcontact printing: A tool to pattern. Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).
  41. Rottmar, M., et al. Stem cell plasticity, osteogenic differentiation and the third dimension. Journal of Materials Science-Materials in Medicine. 21 (3), 999-1004 (2010).
  42. Desai, R. A., et al. Subcellular spatial segregation of integrin subtypes by patterned multicomponent surfaces. Integrative Biology. 3 (5), 560-567 (2011).
  43. Kim, S. H., Lee, S., Ahn, D., Park, J. Y. PDMS double casting method enabled by plasma treatment and alcohol passivation. Sensors and Actuators B: Chemical. 293, 115-121 (2019).
  44. Butler, J. P., Tolić-Nǿrrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  45. Canović, E. P., et al. Biomechanical imaging of cell stiffness and prestress with subcellular resolution. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 665-678 (2014).
  46. Stamenović, D., Smith, M. L. Tensional homeostasis at different length scales. Soft Matter. 16 (30), 6946-6963 (2020).

Tags

Bioteknik utgåva 180
Mönstergenerering för mikromönsterdragelektronkopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bunde, K. A., Stamenović, D.,… More

Bunde, K. A., Stamenović, D., Smith, M. L. Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63628, doi:10.3791/63628 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter