Summary
يصف البروتوكول هنا قياس التنظيم المكاني للمحاور البصرية لعيون الذبابة المنزلية ، التي تم تعيينها بواسطة جهاز أوتوماتيكي ، باستخدام ظاهرة التلميذ الزائف وآلية التلميذ لخلايا المستقبلات الضوئية.
Abstract
تصف هذه الورقة القياس التلقائي للتنظيم المكاني للمحاور البصرية للعيون المركبة الحشرية ، والتي تتكون من عدة آلاف من الوحدات البصرية تسمى ommatidia. يقوم كل أوماتيديوم بأخذ عينات من المعلومات البصرية من زاوية صلبة صغيرة ، مع حساسية تقريبية موزعة على Gaussian (نصف عرض بترتيب 1 درجة) تتمحور حول محور بصري. معا ، تجمع ommatidia المعلومات المرئية من مجال رؤية بانورامي تقريبا. وبالتالي فإن التوزيع المكاني للمحاور البصرية يحدد الدقة المكانية للعين. تعد معرفة التنظيم البصري للعين المركبة وحدة البصر أمرا بالغ الأهمية للدراسات الكمية للمعالجة العصبية للمعلومات البصرية. نقدم هنا إجراء آليا لرسم خرائط للمحاور البصرية للعين المركبة ، باستخدام ظاهرة بصرية جوهرية في الجسم الحي ، والبؤبؤ الكاذب ، وآلية البؤبؤ للخلايا المستقبلة للضوء. نحن نحدد الإعداد البصري الميكانيكي لمسح عيون الحشرات ونستخدم النتائج التجريبية التي تم الحصول عليها من ذبابة منزلية ، Musca domestica ، لتوضيح الخطوات في إجراء القياس.
Introduction
إن انضغاط الأنظمة البصرية للحشرات وخفة حركة أصحابها ، مما يدل على معالجة المعلومات البصرية المتطورة للغاية ، قد أثار اهتمام الناس من خلفيات علمية وغير علمية. تم التعرف على العيون المركبة الحشرية كأجهزة بصرية قوية تتيح قدرات بصرية حادة ومتعددة الاستخدامات 1,2. الذباب ، على سبيل المثال ، معروف جيدا باستجاباته السريعة للأجسام المتحركة ، ويشتهر النحل بامتلاكه رؤية الألوان ورؤية الاستقطاب2.
تتكون العيون المركبة للمفصليات من العديد من الوحدات المتشابهة تشريحيا ، وهي ommatidia ، كل منها مغطى بعدسة وجهية. في Diptera (الذباب) ، غالبا ما يقترب تجميع العدسات الوجهية ، والمعروفة مجتمعة باسم القرنية ، من نصف الكرة الأرضية. كل ommatidium عينات الضوء الساقط من زاوية صلبة صغيرة مع نصف العرض على ترتيب 1 درجة. تقوم أوماتيديا العينين معا بأخذ عينات من الزاوية الصلبة الكاملة تقريبا ، ولكن لا يتم توزيع المحاور البصرية للأوماتيديا بالتساوي. تحتوي بعض مناطق العين على كثافة عالية من المحاور البصرية ، مما يخلق منطقة ذات حدة مكانية عالية ، تسمى بالعامية fovea. الجزء المتبقي من العين لديه بعد ذلك دقة مكانية أكثر خشونة3،4،5،6،7،8،9.
يعد التحليل الكمي للتنظيم البصري للعيون المركبة أمرا بالغ الأهمية للدراسات التفصيلية للمعالجة العصبية للمعلومات البصرية. غالبا ما تتطلب دراسات الشبكات العصبية لدماغ الحشرة10 معرفة التوزيع المكاني للمحاور الأوماتيدية. علاوة على ذلك ، ألهمت العيون المركبة العديد من الابتكارات التقنية. تم بناء العديد من المبادرات لإنتاج عيون اصطناعية مستوحاة من البيولوجيا على الدراسات الكمية الحالية للعيون المركبة الحقيقية11،12،13. على سبيل المثال ، تم تصميم مستشعر قائم على أشباه الموصلات بدقة مكانية عالية بناء على نموذج عيون الحشرات المركبة 11،14،15،16،17. ومع ذلك ، فإن الأجهزة التي تم تطويرها حتى الآن لم تنفذ الخصائص الفعلية لعيون الحشرات الموجودة. تتطلب التمثيلات الدقيقة للعيون المركبة للحشرات وتنظيمها المكاني بيانات مفصلة وموثوقة من العيون الطبيعية ، والتي لا تتوفر على نطاق واسع.
السبب الرئيسي لندرة البيانات هو الملل الشديد للإجراءات المتاحة لرسم الخصائص المكانية للعينين. وقد حفز هذا محاولات لإنشاء إجراء أكثر آلية لرسم خرائط العين. في محاولة أولى للتحليلات الآلية للعيون المركبة للحشرات، طور دوغلاس وويلينغ18 إجراء مسح ضوئي لرسم خرائط لأحجام الأوجه في القرنية وأظهرا جدواه لعدد قليل من أنواع الذباب. هنا نقوم بتوسيع نهجهم من خلال تطوير طرق ليس فقط لمسح جوانب القرنية ولكن أيضا لتقييم المحاور البصرية للأوماتيديا التي تنتمي إليها الجوانب. نقدم حالة عيون الذبابة المنزلية لتجسيد الإجراءات المعنية.
الإعداد التجريبي لمسح عيون الحشرات هو: بصري جزئيا ، أي مجهر مع بصريات الكاميرا والإضاءة. ميكانيكي جزئيا ، أي نظام goniometer لتدوير الحشرة التي تم التحقيق فيها ؛ وحسابية جزئيا، أي استخدام برامج تشغيل البرمجيات للأدوات والبرامج لتنفيذ القياسات والتحليلات. تشمل الطرق المطورة مجموعة من الإجراءات الحسابية ، من التقاط الصور ، واختيار قنوات الكاميرا ، ووضع عتبات معالجة الصور إلى التعرف على مواقع الأوجه الفردية عبر النقاط المضيئة للضوء المنعكس من أسطحها المحدبة. كانت طرق تحويل فورييه حاسمة في تحليل الصورة ، سواء للكشف عن الجوانب الفردية أو لتحليل أنماط الأوجه.
تم تنظيم الورقة على النحو التالي. نقدم أولا الإعداد التجريبي وظاهرة التلميذ الزائف - العلامة البصرية المستخدمة لتحديد المحاور البصرية للمستقبلات الضوئية في العيون الحية19،20،21. في وقت لاحق ، يتم تحديد الخوارزميات المستخدمة في إجراء المسح الضوئي وتحليل الصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البروتوكول يتوافق مع إرشادات رعاية الحشرات في الجامعة.
1. إعداد ذبابة منزلية ، Musca domestica
- جمع الذبابة من السكان الذين تربوا في المختبر. ضع الذبابة في حامل النحاس (الشكل 1).
- قطع 6 مم من الجزء العلوي من أنبوب التقييد (انظر جدول المواد). يبلغ قطر الجزء العلوي الجديد من الأنبوب الخارجي 4 مم وقطره الداخلي 2.5 مم (الشكل 1A). ضع الذبابة الحية داخل الأنبوب ، وأغلق الأنبوب بالقطن لمنع إتلاف الذبابة ، وادفع الذبابة بحيث يبرز الرأس من الأنبوب ويتم تقييد جسمه (الشكل 1B). شل حركة الرأس بشمع العسل بحيث تظل العينان مكشوفتين (الشكل 1C-E).
- اقطع الأنبوب مرة أخرى بحيث يكون طول الأنبوب 10 مم (الشكل 1C). ضع الأنبوب البلاستيكي مع الذبابة في حامل النحاس ، بحيث تشير إحدى عين الذبابة إلى الأعلى عندما يستقر الحامل على سطح الطاولة (الشكل 1D ، E).
- اضبط اتجاه الأنبوب بحيث يكون شعاع الإضاءة الرأسي للمجهر عموديا على سطح العين في منطقة مركزية ، بين البطني والظهري ، وبين الحواف الأمامية والخلفية للعين ، بحيث يمكن مسح العين بالكامل ضمن نطاق السمت والارتفاع الذي يسمح به الإعداد.
2. محاذاة محور السمت الدوار لمقياس التناضح مع المحور البصري المجهري
- قم بتركيب دبوس محاذاة على مرحلة دوران السمت بحيث يمكن ضبط موضع x-y للطرف ليتزامن مع محور السمت على المرحلة الآلية. أثناء المشاهدة باستخدام المجهر ، المجهز بهدف 5x ، ركز على الطرف باستخدام عصا التحكم z-axis (الشكل 2).
- قم بمحاذاة الضبط x-y لمحور السمت مع المحور البصري للمجهر وتأكد من محاذاة المحاور الدوارة للارتفاع والسمت مسبقا مع الدبوس المتمركز ، باستخدام عصي التحكم ذات المحورين x و y.
- تلاعب بعصي التحكم السمت والارتفاع للتحقق مما إذا كان الدبوس متمركزا فيما يتعلق بكلتا درجتي الحرية. عندما يكون مركز جيد ، يبقى طرف الدبوس في نفس الموضع تقريبا أثناء دوران السمت والارتفاع.
3. محاذاة عين الذبابة مع المراحل الآلية
- مع مرحلة الارتفاع عند 0 درجة ، قم بتركيب الذبابة وحاملها على مرحلة السمت. راقب عين الذبابة باستخدام المجهر.
- مع تشغيل مصباح LED للإضاءة ، اضبط الوضع الأفقي للذبابة بحيث يتم محاذاة مركز التلميذ الزائف مع المجهر. اضبط الوضع الرأسي للذبابة باستخدام المسمار الدوار للحامل (الشكل 1D) ، بحيث يكون التلميذ الزائف العميق (DPP; الشكل 3) يتم التركيز على 19،20،21 على مستوى محور الارتفاع.
- قم بمحاذاة DPP فيما يتعلق بمحاور السمت والارتفاع من خلال تمركزه في مجال الرؤية (انظر الشكل 2). استخدم المغناطيس الملصق في الجزء السفلي من حامل الذبابة لتثبيته بإحكام على صفيحة حديدية مثبتة على مرحلة السمت ، مع السماح بتعديلات الانزلاق اليدوية.
- قم بتبديل العرض إلى الكاميرا الرقمية المثبتة في المجهر. قم بتشغيل تهيئة برنامج نظام GRACE ، والذي يتضمن تهيئة وحدات التحكم في المحرك ووحدة تحكم Arduino LED (الشكل 4). لذلك، افتح MATLAB R2020a أو إصدار أحدث. قم بتشغيل البرنامج النصي MATLAB Initialize_All_Systems (الملف التكميلي 1).
- تأكد مما إذا كان التلميذ الزائف للذبابة (الشكل 3B ، C) في وسط الصورة المسقطة على شاشة الكمبيوتر.
4. التركيز البؤري التلقائي والتمركز التلقائي
- جلب التركيز إلى مستوى التلميذ الكاذب القرنية (CPP; الشكل 3 باء) 19,20,21 يدويا باستخدام عصا التحكم z-axis.
- قم بتشغيل خوارزمية التركيز البؤري التلقائي (الملف التكميلي 1، التركيز البؤري التلقائي النصي) للحصول على صورة حادة على مستوى القرنية. تحقق من ذلك عن طريق إعادة التركيز إلى مستوى DPP عن طريق ضبط مرحلة المحور z الآلية. قم بتخزين المسافة بين DPP و CPP (في خطوات المحرك).
- قم بضبط تمركز التلميذ الزائف عن طريق تشغيل خوارزمية التوسيط التلقائي (الملف التكميلي 1 ، البرنامج النصي AC). أعد التركيز إلى مستوى CPP.
- أعد تشغيل خوارزمية التركيز البؤري التلقائي. صفر المراحل الآلية في مواقعها الحالية (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), حيث E هو الارتفاع و A هو السمت.
- قم بتشغيل خوارزمية المسح الضوئي (الملف التكميلي 1 ، البرنامج النصي Scan_Begin) ، والتي تقوم بأخذ عينات من صور العين على طول المسارات في خطوات 5 درجات ، أثناء إجراء خوارزميات التمركز التلقائي والتركيز البؤري التلقائي.
- في نهاية أخذ العينات ، قم بإيقاف تشغيل وحدة تحكم LED وأجهزة التحكم في المحرك.
- معالجة الصور من خلال تطبيق خوارزميات معالجة الصور (الملف التكميلي 1 ، البرنامج النصي ImProcFacets).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الحيوانات والتحفيز البصري
يتم إجراء التجارب على الذباب المنزلي (Musca domestica) التي تم الحصول عليها من ثقافة يحتفظ بها قسم علم الوراثة التطوري في جامعة جرونينجن. قبل القياسات ، يتم تجميد الذبابة عن طريق لصقها بشمع منخفض درجة الانصهار في أنبوب مناسب جيدا. يتم تركيب الذبابة لاحقا على مرحلة مقياس goniometer بمحرك. يتزامن مركز المرحلتين الدوارتين مع النقطة البؤرية للإعداد المجهري24. يتم توفير شعاع ضوء الإضاءة epi-lumination بواسطة مصدر ضوء ، والذي يركز الضوء على الحجاب الحاجز الذي يتم تصويره في عين الذبابة عبر نصف مرآة. وبالتالي ، فإنه ينشط آلية حدقة العين لمجموعة مقيدة من خلايا المستقبلات الضوئية (الشكل 3). يتم تقييم المحاور البصرية للأوماتيديا التي تؤوي هذه المستقبلات الضوئية عن طريق تدوير الذبابة في خطوات صغيرة والتقاط صور فوتوغرافية بعد كل خطوة باستخدام كاميرا رقمية ملونة متصلة بالمجهر (الشكل 2). نظرا لأن حبيبات الصباغ الحدقة تنعكس في الغالب في نطاق الطول الموجي الطويل ، يتم استخدام القناة الحمراء للكاميرا الرقمية لتمييز التلميذ الزائف عن انعكاسات العدسة الجانبية. من الأفضل عزل الانعكاسات الأخيرة عن التلميذ الزائف باستخدام القناة الزرقاء للكاميرا.
التركيز البؤري التلقائي وخوارزميات التمركز التلقائي
الخوارزميات الإضافية الرئيسية المستخدمة أثناء مسح عين الحشرة هي التركيز البؤري التلقائي والتمركز التلقائي (الملف التكميلي 1 ، البرامج النصية AF و AC). الهدف من التركيز البؤري التلقائي هو جلب مستوى القرنية إلى تركيز الكاميرا ، من أجل اكتشاف انعكاسات الوجه الضرورية لتحديد ommatidia الفردية (الشكل 3B). يتمثل إجراء الكشف عن مستوى القرنية في تغيير الوضع الرأسي (Z) للذبابة في خطوات عن طريق تطبيق تحويل فورييه السريع (FFT) على الصورة الملتقطة في كل مستوى لتحديد محتوى التردد المكاني. معيار التركيز البؤري الأمثل هو المستوى الذي يحتوي على أكبر قدر من الطاقة المجمعة فوق الحد الأدنى للتردد.
مدخلات التركيز البؤري التلقائي هي مواضع Z ودفق الفيديو من الكاميرا. تعد المخرجات جزءا لا يتجزأ من المحتوى عالي التردد للصورة SF ومستوى التركيز البؤري Z حيث يكون SF هو الحد الأقصى. في الخطوة الأولى، يتم ضبط موضع Z لصورة الكاميرا إلى ما دون عدسات وجه القرنية بقليل، ويتم تعيين المنطقة ذات الأهمية لتحديد محتوى تردد الصورة. تبدأ الحلقة for التقاط الصورة وتحسب مجموع SF تحويل فورييه المصفى عالي التمرير. من خلال خطوة محرك المحور z لأعلى إلى مستوى صورة أعلى القرنية ، يتم العثور على المستوى الذي يحتوي على أعلى ترددات ، أي حيث يكون SF هو الحد الأقصى ، والذي يؤخذ على أنه مستوى القرنية. ثم يتم ضبط محرك المحور z إلى هذا المستوى ويتم التقاط صورة.
عند التركيز لأسفل من القرنية نحو مستوى مركز انحناء العين ، تتلاشى انعكاسات وجه القرنية ، وتتحد انعكاسات التلميذ الكاذب في نمط نموذجي من سبع نقاط ، وهو سمة لتنظيم المستقبلات الضوئية داخل الذبابة الأوماتيدية (الشكل 3C ؛ لاحظ أن النمط متميز فقط في مناطق العين الكروية تقريبا). يسمى النمط الموجود في مركز العين لمستوى الانحناء بالبؤبؤ الكاذب العميق (DPP)19,21.
يسمى تحريك الذبابة الموضوعة في المسرح باستخدام المحركين X و Y بحيث يتزامن مركز بقعة الضوء مع مركز صورة الكاميرا بالتمركز التلقائي. يقوم هذا الإجراء بمحاذاة وجه الأوماتيديوم الذي يقع محوره البصري في وسط DPP مع شعاع الإضاءة والمحور البصري للمجهر والكاميرا. الصورة هي Gaussian مصفاة وثنائية ، ثم يتم تحديد مركز التلميذ الزائف باستخدام وظيفة MATLAB regionprops . المدخلات هي مواضع المحركات X و Y والفيديو المتدفق من الكاميرا. الناتج هو المسافة بين مراكز الصورة والتلميذ الزائف ، والتي يتم ترجمتها بعد ذلك إلى تحول مرحلي.
ربط الصور
يتم مسح العين عن طريق التقاط وتخزين الصور الفوتوغرافية بقيم مختلفة من ارتفاع مقياس الغدد التناسلية θ والسمت φ بعد إجراءات التركيز البؤري التلقائي والتمركز التلقائي. يستخدم الارتباط ثنائي الأبعاد لتحديد التحولات x-y بين الصور المتتالية. لربط الصور التي تم الحصول عليها في مواضع زاوية مختلفة ، من الضروري إدراك أن هذا يؤدي عموما إلى دوران الصورة الحالية فيما يتعلق بالصورة السابقة. على سبيل المثال، لنفترض أن مركز الصورة الأولية يتوافق مع النقطة C من الكرة (الشكل 5) وأن تغييرا في السمت يحدث بحيث يتم تدوير OAB المستوي فوق زاوية صغيرة Δφ، ليصبح مستوى OA'B. ثم يتغير مركز الصورة من النقطة C إلى النقطة C ' (الشكل 5). إذا كان مستوى صورة الكاميرا عموديا على المتجه OC ، فإن دوران المستوى OAB إلى OA'B يؤدي إلى دوران الصورة فوق زاوية β = Δφ cosθ ، كما β = CC'⁄BC ، مع CC' = CDΔφ ، و cosθ = CD⁄BC (الشكل 5). هذا يعني أنه في الجزء العلوي من الكرة (θ = 0 °) ، β = Δφ ، وعند خط الاستواء (θ = 90 درجة) ، β = 0 °. عندما يكون Δφ = 0 ° ، أي عندما يتم تغيير الارتفاع θ فقط ، لا يتم تدوير الصور فيما يتعلق ببعضها البعض ، لذلك β = 0 °.
أثناء إجراء المسح الضوئي ، يقوم إجراء التمركز التلقائي بتركيز ommatidium الذي يتم محاذاة محوره البصري مع المحور البصري لنظام القياس. يؤدي دوران السمت إلى دوران بزاوية β وترجمة نمط الوجه. لتحديد التحول الأخير ، ترتبط صورتان متتاليتان (بعد تدوير الصورة الأولى أولا بزاوية الدوران β) ، كما هو موضح في الشكل 6.
في خوارزمية إزاحة الصورة (الملف التكميلي 1 ، البرنامج النصي ImProcFacets) ، يتم تحديد الجوانب الفردية بواسطة سنترويدات انعكاساتها في كل صورة. مدخلات الخوارزمية هي زاوية الارتفاع والسمت ، ومجموعة الصور التي سيتم تقييمها ، وقناة الصورة ، والمنطقة محل الاهتمام. تنتج الخوارزمية مجموعة من السنترويدات وصورة نهائية تحتوي على جميع الصور المرتبطة التي تم التقاطها أثناء إجراء المسح.
نظام القياس الجغرافي
من أجل تحقيق التوافق مع الإضاءة ، يجب تصوير عين الذبابة مع عدسات وجه القرنية في التركيز البؤري ، ويجب إعادة إدخال التلميذ الكاذب بشكل متكرر (هنا ، بعد كل 5 درجات من الدوران). يتم تحقيق هذه العملية التلقائية باستخدام نظام GRACE (جهاز أبحاث Goniometric للعيون المركبة) ، كما هو موضح تخطيطيا في الشكل 4. وهو يتألف من ثلاثة أنظمة فرعية رئيسية: المراحل الدنيا والعليا مع الإلكترونيات الخاصة بها مثل الأجهزة الكهروميكانيكية ، والبرامج الثابتة المضمنة في وحدات التحكم المادية ، والكمبيوتر الشخصي المستخدم لتشغيل البرنامج الذي ينفذ الخوارزميات. تتكون الأجهزة من المراحل الآلية والبصرية ، والكاميرا الرقمية ، ومتحكم دقيق لبرمجة كثافة LED ، ومصدر ضوء LED أبيض. يتم توفير إجراءات البرامج الثابتة مع وحدات التحكم في المحرك ووحدة تحكم LED وفي الكاميرا الرقمية. يتكون البرنامج من خوارزميات للتحكم في مواقع المحرك وسرعته ، وضبط LED ، والحصول على الصور وتحليلها. تمثل الخوارزميات التي نوقشت بعد ذلك المعالم الرئيسية التي تمكن نظام GRACE من مسح عيون الحشرات.
عيون الذباب والتلاميذ الزائفين
عندما تضيء عين الذبابة المنزلية ، ينشط الضوء الساقط آلية حدقة العين لخلايا المستقبلات الضوئية ، وهو نظام من حبيبات الصباغ المتنقلة ذات اللون الأصفر داخل جسم الخلية. يتحكم النظام في تدفق الضوء الذي يؤدي إلى عملية النقل الضوئي للمستقبلات الضوئية ، وبالتالي لديه نفس وظيفة التلميذ في العين البشرية19,20. يؤدي تنشيط آلية البؤبؤ إلى انعكاس معزز محليا في منطقة العين التي تواجه فتحة هدف المجهر (الشكل 3). يتغير موضع منطقة العين العاكسة بشكل ساطع ، التلميذ الزائف19،20،21 ، عند دوران العين لأن الضوء الساقط ينشط بعد ذلك آلية البؤبؤ في مجموعة مختلفة من خلايا المستقبلات الضوئية (انظر الشكل 6). وبالتالي يعمل التلميذ الزائف كعلامة على المحور البصري للأوماتيديا التي تتماشى مع المجهر. وهذا يسمح برسم خرائط للتوزيع المكاني للمحاور البصرية للعين 4،20،21،22،23.
ملء الجوانب المفقودة
لا يتم تحديد جميع الجوانب من خلال الإجراء المركزي ، على سبيل المثال ، بسبب انخفاض الانعكاس المحلي الناجم عن مخالفات سطحية طفيفة أو بقع من الغبار. هذا الأخير يمكن أن يؤدي أيضا إلى سنترويدات خاطئة (الشكل 7A). يتم حل هذه المشكلة أولا عن طريق غسل العينين تحت صنبور الماء وثانيا عن طريق تطبيق إجراء التعبئة (البرنامج النصي ImProcFacets). لذلك ، يتم تحديد المراكز في منطقة ما أولا (الشكل 7A) ، ثم يتم حساب FFT (الشكل 7B). تحدد الحلقة الأولى من التوافقيات (النجوم الصفراء في الشكل 7B) ثلاثة اتجاهات ، يشار إليها بالخطوط الزرقاء والحمراء والخضراء (الشكل 7B). ينتج عن التحول العكسي للتوافقيات على طول الاتجاهات الثلاثة النطاقات الرمادية في الشكل 7C-E. يؤدي تركيب متعدد حدود من الدرجة الثانية إلى النطاقات الرمادية إلى خطوط تربط بين السنترويدات الوجهية على طول المحاور الشبكية الثلاثة. وبالتالي ، فإن نقاط عبور خطوط الشبكة تتوافق مع مراكز الوجه الحقيقية. وبما أن مثال الشكل 7 هو حالة متطرفة ، فإنه يوضح أن الإجراء قوي. في معظم المناطق ، من النادر أن تكون الجوانب المفقودة والمراكز الخاطئة.
مسح عين ذبابة
يوضح الشكل 8 مجموعة من الأوماتيديا التي تم مسحها ضوئيا عبر العين عن طريق إجراء سلسلة من التغييرات السمتية التدريجية باستخدام Δφ = 5 درجات. تم المسح الضوئي من الجانب الأمامي للعين (الشكل 8A ، اليمين) إلى الجانب الجانبي (الشكل 8A ، اليسار) في 24 خطوة. تم تدوير سنترويدات أنماط الأوجه المتداخلة إلى حد كبير في وقت لاحق بواسطة β = Δφcosθ. بعد ذلك ، بعد تحويل السنترويدات لكل صورة وملء الجوانب المفقودة (مع البرنامج النصي ImProcFacets) ، تم حساب متوسط السنترويدات الموضعية. ويبين الشكل 8 ألف الصور المجمعة، إلى جانب مراكز الصور والمراكز الوجهية. يوضح الشكل 8B تجميع الجوانب كمخطط فورونوي.
الشكل 1: تركيب الذبابة في حامل النحاس . (أ) طرف مع ذبابة منزلية ليتم التحقيق فيها. (ب) يتم دفع الطرف المقطوع مع الذبابة بلطف إلى النهاية باستخدام قطعة من القطن وعيدان تناول الطعام. (ج) الطرف مع الذبابة يقطع إلى طول إجمالي قدره 10 مم. (د) حامل النحاس مع الذبابة التي سيتم وضعها على مرحلة goniometer ؛ يشير السهم إلى برغي ضبط الارتفاع. (ه) صورة مقربة للذبابة مع شل حركة الرأس بواسطة قطعة من الشمع الذائب في درجة حرارة منخفضة (#) إلى الطرف (*). قامت Epi-illumination بتنشيط آلية حدقة العين للمستقبلات الضوئية للعين ، كما كشف عنها التلميذ الكاذب الأصفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: GRACE ، جهاز البحث goniometric للعيون المركبة. يتم تركيب الحشرة التي تم التحقيق فيها (ذبابة) في المرحلة الآلية التي تتكون من ثلاث مراحل ترجمة (X ، Y ، Z) ومرحلتين دوران (الارتفاع والسمت). تركز العدسة الضوء من مصباح LED أبيض عند الحجاب الحاجز، ويتم تركيزه عبر نصف مرآة في عين الذبابة. يتم تصوير العين بكاميرا متصلة بالمجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: بصريات عيون الذبابة. (أ) رسم تخطيطي لثلاثة أوماتيديا لعين ذبابة ، كل منها مغطى بعدسة ذات وجه محدبة ، والتي تركز الضوء الساقط على مجموعة من خلايا المستقبلات الضوئية (الصفراء) ، محاطة بخلايا الصباغ الأولية (البنية) والثانوية (الحمراء). تؤدي الإضاءة الشديدة للمستقبلات الضوئية المتكيفة مع الظلام (DA) إلى هجرة حبيبات الصباغ الأصفر (المشار إليها بالنقاط السوداء) ، والتي توجد داخل خلايا المستقبلات الضوئية. تتراكم نحو طرف المستقبلات الضوئية ، بالقرب من العضيات الحساسة للضوء ، الرابدوميرات ، فهي تمتص الضوء وتبعثره في حالة التكيف مع الضوء (LA). (ب) صورة على مستوى سطح العين، تظهر انعكاسات الوجه (النقاط الساطعة) وكذلك انعكاس حبيبات الصباغ في الحالة المنشطة (التلميذ الكاذب القرنية، CPP). (ج) صورة مأخوذة على مستوى مركز انحناء العين (التلميذ الكاذب العميق، DPP)، تعكس ترتيب خلايا المستقبلات الضوئية في نمط شبه منحرف، مع وضع نهاياتها البعيدة عند المستوى البؤري للعدسات الوجهية. وبالتالي ، توجد صورة افتراضية متراكبة لنصائح المستقبلات الضوئية في مستوى مركز انحناء العين. ينطبق شريط المقياس 100 ميكرومتر على اللوحات B و C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: رسم تخطيطي لنظام RACE. يتحكم برنامج الكمبيوتر الشخصي في البرامج الثابتة ، التي تقود الأجهزة الكهروميكانيكية. تلتقط الكاميرا الرقمية ، عبر مرحلة بصرية ، صورا لعين العينة. يضيء مصدر ضوء LED العينة ، وتقوم محركات المرحلة الآلية بتشغيل ترجمات X و Y و Z بالإضافة إلى دوران السمت (A) والارتفاع (E). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: رسم تخطيطي لاشتقاق دوران الصورة عند مسح عين الذبابة. إذا كان مركز الصورة الأولية يتوافق مع النقطة C من الكرة وحدث تغيير في السمت ، يتم تدوير OAB المستوي فوق زاوية صغيرة Δφ ، ليصبح مستوى OA'B. ثم يتغير مركز الصورة من النقطة C إلى النقطة C. يؤدي دوران OAB المستوي إلى OA'B إلى دوران الصورة على زاوية β = Δφ cosθ (انظر النص ، قسم الصور المترابطة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: إجراء معالجة الصور لتحديد الزاوية البينية . (أ) صورة تم التقاطها أثناء المسح الضوئي عبر العين ، مع تمييز سنترويدات الوجه بدوائر خضراء ومربعات حمراء ، ونقطة خضراء في مركز الصورة. (ب) صورة لاحقة بعد دوران سمتي قدره 5 درجات، مع تمييز السنترويدات الوجهية بمربعات حمراء ونقطة حمراء في مركز الصورة. (ج) مخطط كوريلوجرام للمنطقة الواقعة داخل المربع الأخضر من ألف مرتبط بالصورة باء. يمثل المتجه من مركز C (النقطة الخضراء) إلى القيمة القصوى لل correlogram التحول النسبي للصورتين A و B. باستخدام هذا المتجه ، يتم رسم مربع A ومركزه في B وتضاف السنترويدات الجانبية (المربعات الحمراء) من B في A. ينطبق شريط المقياس 100 ميكرومتر على الألواح A-C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: اشتقاق سنترويدات الوجه المفقودة عن طريق تطبيق تحويلات فورييه. (أ) صورة RGB محلية مع سنترويدات جانبية (نقاط حمراء). تشير رؤوس الأسهم البيضاء إلى الجوانب المفقودة ، ويشير رأس السهم الأحمر إلى سنترويد خاطئ. (ب) FFT من سنترويدات A مع الحلقة الأولى من التوافقيات المميزة بالنجوم الصفراء. (ج-هاء) عكس FFT للسنترويدات على طول الاتجاهات الثلاثة المشار إليها بالخطوط الملونة في B ، مما ينتج عنه النطاقات الرمادية. الخطوط الزرقاء (C) والحمراء (D) والخضراء (E) هي خطوط متعددة الحدود تربيعية تناسب النطاقات الرمادية ، و centroids (الدوائر الحمراء) هي تلك التي تم الحصول عليها قبل تحويلات فورييه. (و) الخطوط المجهزة من C-E مجتمعة، جنبا إلى جنب مع سنترويدات A. ثم يتم اشتقاق السنترويدات المفقودة من نقاط العبور. ينطبق شريط المقياس 100 ميكرومتر على الألواح A و C-F. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: العين اليمنى للذبابة المنزلية الممسوحة ضوئيا من جانب إلى آخر (أ) صور مجمعة ومتداخلة لسلسلة صور تم فيها تغيير السمت تدريجيا بمقدار 5 درجات ، جنبا إلى جنب مع مراكز الصور (الصلبان الخضراء) وسنترويدات الوجه (الدوائر الحمراء). (ب) مخطط فورونوي للسنترويدات الجانبية، مع مراكز الصور كما في A. شريط المقياس 100 ميكرومتر ينطبق على اللوحتين A و B. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي 1: يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن رسم التوزيع المكاني للمحاور البصرية لعيون الذبابة المنزلية باستخدام ظاهرة البؤبؤ الكاذب للعيون المركبة وتغيرات الانعكاس الناجمة عن آلية حدقة العين المعتمدة على الضوء. لذلك ، يتم تركيب ذبابة تم التحقيق فيها في نظام goniometric ، والذي يسمح بفحص نمط الوجه المحلي باستخدام إعداد مجهر مجهز بكاميرا رقمية ، وكلها تحت سيطرة الكمبيوتر. تحليل الصور ينتج خرائط العين. تتمثل إحدى الصعوبات الأساسية التي تواجهها في أنه بدون تحديد دقيق للعين في بداية القياسات ، يمكن أن تتغير المواضع المرئية لكل من العين والبؤبؤ الكاذب بشكل كبير حتى مع الدوران الصغير لجهاز goniometric. يتم تقليل هذه التغييرات عن طريق وضع مركز العين في مركز دوران goniometric ، حيث يتم ملاحظة التلميذ الزائف العميق. من خلال ربط الصور التي تم قياسها لاحقا ، يمكن تتبع نمط الوجه. الأهم من ذلك ، يجب تعديل زاوية الدوران إلى قيمة صغيرة إلى حد ما لأنه في المناطق التي يكون فيها نمط الوجه منتظما جدا ، يكون إجراء الارتباط عرضة لنتائج خاطئة.
هنا ، قدمنا خريطة جزئية للعين (الشكل 8) ، والتي توضح جدوى رسم الخرائط الآلية للغاية لحدة البصر في عيون الحشرات. تتوافق الزوايا البينية التي تبلغ حوالي 2.0 درجة إلى 2.5 درجة ، والتي تتجلى من مقارنة مسافات الأوجه مع تحولات 5 درجات بين مراكز الصور المتعاقبة ، بشكل جيد مع البيانات التي تم اشتقاقها سابقا ، بطريقة أكثر شاقة ، من نفس النوع (Musca domestica)25. سيتم نشر خرائط العين الكاملة للمساحة البصرية للذباب المنزلي والحشرات الأخرى في مكان آخر.
تسمح الطريقة المعروضة هنا برسم خرائط للمحاور البصرية للعين الكاملة ، في الجسم الحي ، في غضون ساعات قليلة فقط ، والتي سيكون من الصعب للغاية تحقيقها باستخدام طرق أخرى. يتم توضيح طريقة الرسم البياني الآلي هنا لحالة الذبابة المنزلية ، ولكن يمكن ببساطة تمديدها إلى العيون المركبة للحشرات الأخرى ، مثل الفراشات. ومع ذلك ، بدلا من انعكاس الحدقة ، فإن لمعان الفراشة يعمل بعد ذلك كعلامة محور بصري21,24. طريقة بديلة هي التصوير المقطعي المحوسب بالأشعة السينية26 الذي تم تطويره مؤخرا. ينتج عن هذا النهج القيم خرائط تشريحية مفصلة، ولكنه عرضة للأخطاء البصرية، وتحديدا عندما تكون المحاور البصرية للأوماتيديا منحرفة إلى سطح العين21، أو إذا كانت معالجة الأنسجة تشوه هندسة العين بما يكفي لتقويض القياسات. تصور التلميذ الزائف هو أكثر أو أقل وضوحا في عيون الذباب التي لديها آلية حدقة العين لامعة. هذا أقل سهولة في العيون المركبة مع آلية حدقة العين التي تعكس بشكل سيئ ، كما هو الحال ، على سبيل المثال ، في النحل21. ومع ذلك ، بالنسبة للعديد من أنواع الحشرات الأخرى ، مثل ذباب الجندي أو النحل ، يمكن استخدام تألق الأصباغ البصرية في الرهبنة الأوماتيدية. يوفر تطبيق الفلوروفورات التي تخلق تألقا قويا في الربيدات فرصة أخرى لتقدير التنظيم المكاني للمساحة البصرية للعين27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإبلاغ عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة ماليا من قبل مكتب البحث العلمي للقوات الجوية / المكتب الأوروبي لأبحاث وتطوير الفضاء الجوي AFOSR / EOARD (منحة FA9550-15-1-0068 ، إلى D.G.S.). نشكر الدكتور بريموز بيريه على العديد من المناقشات المفيدة وكيهان ساتو وهاين ليرتور وأوسكار رينكون كاردينو على المساعدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision of amplified images and digital communication with PC |
| High power star LED | Velleman | LH3WW | Light source for observation and imaging the compound eye |
| Holder for the investigated fly | University of Groningen | Different designs were manufactured by the university workshop | |
| Linear motor | ELERO | ELERO Junior 1, version C | Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A) |
| Low temperature melting wax | various | The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder | |
| Microscope | Zeiss | Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x | |
| Motor and LED Controller | University of Groningen | Z-o1 | Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies. |
| Motorized Stage | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom. |
| Optical components | LINUS | Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| PC running MATLAB | University of Groningen | The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system | |
| Power Supply (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Lithuania) | PUP120-17 | Dedicated power supply for the STANDA motor controllers |
| Soldering iron | various | Used for melting the wax | |
| Stepper and DC Motor Controller | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly |
| Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes. | Programming language used to implement the algorithms |
References
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M.
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002 (2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168 (2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782 (2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613 (2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267 (2021).
