Summary
Protokollen beskriver her målingen af den rumlige organisering af de visuelle akser af housefly øjne, kortlagt af en automatisk enhed, ved hjælp af pseudopupil fænomenet og pupilmekanismen i fotoreceptorcellerne.
Abstract
Dette papir beskriver den automatiske måling af den rumlige organisering af de visuelle akser af insekt sammensatte øjne, som består af flere tusinde visuelle enheder kaldet ommatidia. Hvert ommatidium prøver den optiske information fra en lille solid vinkel med en omtrentlig gaussisk fordelt følsomhed (halv bredde i størrelsesordenen 1 °) centreret omkring en visuel akse. Sammen samler ommatidia de visuelle oplysninger fra et næsten panoramisk synsfelt. Den rumlige fordeling af de visuelle akser bestemmer således øjets rumlige opløsning. Kendskab til den optiske organisering af et sammensat øje og dets synsstyrke er afgørende for kvantitative undersøgelser af neural behandling af den visuelle information. Her præsenterer vi en automatiseret procedure til kortlægning af et sammensat øjes visuelle akser ved hjælp af et iboende, in vivo optisk fænomen, pseudopupil og fotoreceptorcellernes pupilmekanisme. Vi skitserer den optomekaniske opsætning til scanning af insektøjne og bruger eksperimentelle resultater opnået fra en husflue, Musca domestica, til at illustrere trinene i måleproceduren.
Introduction
Kompaktiteten af insekt visuelle systemer og deres ejers smidighed, der demonstrerer højt udviklet visuel informationsbehandling, har fascineret mennesker fra både videnskabelige og ikke-videnskabelige baggrunde. Insekt sammensatte øjne er blevet anerkendt som kraftfulde optiske enheder, der muliggør akut og alsidig visuel kapacitet 1,2. Fluer er for eksempel kendt for deres hurtige reaktioner på bevægelige objekter, og bier er berømte for at have farvesyn og polariseringsvision2.
Leddyrets sammensatte øjne består af talrige anatomisk lignende enheder, ommatidia, som hver især er dækket af en facetlinse. I Diptera (fluer) tilnærmer samlingen af facetlinser, kendt samlet som hornhinden, ofte en halvkugle. Hvert ommatidium prøver indfaldende lys fra en lille fast vinkel med halv bredde i størrelsesordenen 1 °. Ommatidia af de to øjne sammen sampler omtrent den fulde faste vinkel, men ommatidiaens visuelle akser er ikke jævnt fordelt. Visse øjenområder har en høj tæthed af visuelle akser, hvilket skaber et område med høj rumlig skarphed, i daglig tale kaldet en fovea. Den resterende del af øjet har derefter en grovere rumlig opløsning 3,4,5,6,7,8,9.
En kvantitativ analyse af den optiske organisering af de sammensatte øjne er afgørende for detaljerede undersøgelser af den neurale behandling af visuel information. Undersøgelser af de neurale netværk i et insekts hjerne10 kræver ofte viden om den rumlige fordeling af ommatidialakserne. Desuden har sammensatte øjne inspireret flere tekniske innovationer. Mange initiativer til fremstilling af bioinspirerede kunstige øjne er bygget på eksisterende kvantitative undersøgelser af ægte sammensatte øjne 11,12,13. For eksempel blev en halvlederbaseret sensor med høj rumlig opløsning designet baseret på modellen af insektforbindelsesøjne 11,14,15,16,17. Imidlertid har de hidtil udviklede enheder ikke implementeret de faktiske egenskaber ved eksisterende insektøjne. Nøjagtige repræsentationer af insekt sammensatte øjne og deres rumlige organisation vil kræve detaljerede og pålidelige data fra naturlige øjne, som ikke er meget tilgængelige.
Hovedårsagen til manglen på data er den ekstreme kedelighed af de tilgængelige procedurer til kortlægning af øjnenes rumlige egenskaber. Dette har motiveret forsøg på at etablere en mere automatiseret øjenkortlægningsprocedure. I et første forsøg på automatiserede analyser af insekt sammensatte øjne udviklede Douglass og Wehling18 en scanningsprocedure til kortlægning af facetstørrelser i hornhinden og demonstrerede dens gennemførlighed for nogle få fluearter. Her udvider vi deres tilgang ved at udvikle metoder til ikke kun at scanne hornhindens facetter, men også vurdere de visuelle akser i ommatidia, som facetterne tilhører. Vi præsenterer sagen om husflueøjne for at eksemplificere de involverede procedurer.
Den eksperimentelle opsætning til scanning af insektøjne er: delvis optisk, dvs. et mikroskop med kamera og belysningsoptik; delvis mekanisk, dvs. et goniometersystem til rotation af det undersøgte insekt; og delvist beregningsmæssige, dvs. brug af softwaredrivere til instrumenter og programmer til udførelse af målinger og analyser. De udviklede metoder omfatter en række beregningsprocedurer, fra optagelse af billeder, valg af kamerakanaler og indstilling af billedbehandlingstærskler til genkendelse af individuelle facetplaceringer via lyse lyspunkter reflekteret fra deres konvekse overflader. Fourier-transformationsmetoder var afgørende i billedanalysen, både til at detektere individuelle facetter og til at analysere facetmønstrene.
Papiret er struktureret som følger. Vi introducerer først den eksperimentelle opsætning og pseudopupil-fænomenet - den optiske markør, der bruges til at identificere fotoreceptorernes visuelle akser i levende øjne 19,20,21. Derefter skitseres de algoritmer, der anvendes i scanningsproceduren og billedanalysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er i overensstemmelse med universitetets retningslinjer for insektpleje.
1. Forberedelse af en husflue, Musca domestica
- Saml fluen fra den laboratorieopdrættede befolkning. Placer fluen i messingholderen (figur 1).
- Skær 6 mm fra den øverste del af fastholdelsesrøret (se Materialetabel). Den nye øverste del af røret har en udvendig diameter på 4 mm og en indvendig diameter på 2,5 mm (figur 1A). Placer den levende flue inde i røret, forsegl røret med bomuld for at forhindre beskadigelse af fluen, og skub fluen, så hovedet stikker ud af røret, og dets krop fastholdes (figur 1B). Immobiliser hovedet med bivoks, så øjnene forbliver afdækkede (figur 1C-E).
- Skær røret igen, således at rørlængden er 10 mm (figur 1C). Placer plastrøret med fluen i messingholderen, således at fluens ene øje peger opad, når holderen hviler på en bordplade (figur 1D,E).
- Juster rørets retning således, at mikroskopets lodrette belysningsstråle med goniometerhøjden ved 0° (dvs. azimuttrinnet er i vandret position) er vinkelret på øjenoverfladen i et centralt område, mellem ventral og dorsal og mellem forreste og bageste kanter af øjet, så hele øjet kan scannes inden for det område af azimut og højde, der er tilladt af opsætningen.
2. Justering af goniometerets roterende azimutakse med mikroskopets optiske akse
- Monter en justeringsstift på azimutrotationstrinnet, så spidsens x-y-position kan justeres til at falde sammen med azimutaksen på det motoriserede trin. Mens du ser med mikroskopet, der er udstyret med et 5x mål, skal du fokusere på spidsen ved hjælp af z-akse joysticket (figur 2).
- Juster x-y-justeringen af azimutaksen med mikroskopets optiske akse, og sørg for, at højde- og azimutrotationsakserne er forudjusteret med den centrerede stift ved hjælp af x- og y-akse joystickene.
- Manipuler joystickene til azimut og højde for at kontrollere, om stiften er centreret i forhold til begge frihedsgrader. Når den er godt centreret, forbliver stiftspidsen i omtrent samme position under azimut- og højderotationer.
3. Justering af flueøjet med de motoriserede trin
- Med højdetrinnet på 0° monteres fluen og dens holder på azimuttrinnet. Overhold fluens øje med mikroskopet.
- Når belysnings-LED'en er tændt, skal du justere fluens vandrette position, så midten af pseudopupilen er justeret med mikroskopet. Juster fluens lodrette position ved hjælp af holderens roterende skrue (figur 1D), så den dybe pseudopupil (DPP; Figur 3) 19,20,21 bringes i fokus på højdeaksens niveau.
- Juster DPP'en i forhold til azimut- og højdeakserne ved at centrere den i synsfeltet (se figur 2). Brug magneterne limet til bunden af flueholderen til at fastgøre den fast på en jernplade monteret på azimuttrinnet, samtidig med at manuel glidejustering tillades.
- Skift udsigten til det digitale kamera monteret ved mikroskopet. Kør softwareinitialiseringen af GRACE-systemet, som omfatter initialisering af motorcontrollerne og Arduino LED-controlleren (figur 4). Åbn derfor MATLAB R2020a eller nyere version. Kør MATLAB-scriptet Initialize_All_Systems (supplerende fil 1).
- Bekræft, om fluens pseudopupil (figur 3B, C) er i midten af det projicerede billede på computerskærmen.
4. Autofokusering og autocentrering
- Bring fokus til niveauet af hornhinde pseudopupil (CPP; Figur 3B) 19,20,21 manuelt ved hjælp af joysticket med z-aksen.
- Kør autofokuseringsalgoritmen (Supplementary File 1, script AF) for at opnå et skarpt billede på hornhindeniveau. Kontroller ved at returnere fokus til DPP-niveauet ved at justere det motoriserede z-aksetrin. Opbevar afstanden mellem DPP og CPP (i motoriske trin).
- Finjuster pseudopupil-centreringen ved at køre autocentreringsalgoritmen (Supplerende fil 1, script AC). Bring fokus tilbage til CPP-niveauet.
- Kør autofokuseringsalgoritmen igen. Nul de motoriserede trin i deres nuværende positioner (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), hvor E er højde og A er azimut.
- Kør scanningsalgoritmen (Supplementary File 1, script Scan_Begin), som prøver øjenbilleder langs baner i 5 ° trin, mens du udfører autocentrerings- og autofokuseringsalgoritmerne.
- Ved afslutningen af prøveudtagningen skal du slukke for LED-controlleren og motorstyringerne.
- Behandl billederne ved at anvende billedbehandlingsalgoritmerne (Supplementary File 1, script ImProcFacets).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyr og optisk stimulering
Eksperimenter udføres på husfluer (Musca domestica) opnået fra en kultur, der opretholdes af Institut for Evolutionær Genetik ved Universitetet i Groningen. Før målingerne immobiliseres en flue ved at lime den med en lavsmeltepunktsvoks i et velsiddende rør. Fluen monteres efterfølgende på scenen af et motoriseret goniometer. Midten af de to roterende trin falder sammen med brændpunktet for en mikroskopisk opsætning24. Epi-belysningslysstrålen leveres af en lyskilde, der fokuserer lys på en membran, der afbildes ved fluens øje via et halvspejl. Det aktiverer således pupilmekanismen for et begrænset sæt fotoreceptorceller (figur 3). De optiske akser i ommatidia, der huser disse fotoreceptorer, vurderes ved at rotere fluen i små trin og tage fotografier efter hvert trin med et farve digitalkamera fastgjort til et mikroskop (figur 2). Fordi pupillpigmentgranulatet overvejende reflekteres i det lange bølgelængdeområde, bruges digitalkameraets røde kanal til at skelne pseudopupilen fra facetlinsens refleksioner. Sidstnævnte refleksioner isoleres bedst fra pseudopupilen ved hjælp af kameraets blå kanal.
Algoritmer til autofokusering og autocentrering
De vigtigste yderligere algoritmer, der bruges under scanning af et insekts øje, er autofokusering og autocentrering (Supplerende fil 1, scripts AF og AC). Målet med autofokusering er at bringe hornhindeniveauet til kameraets fokus for at detektere de facetrefleksioner, der er nødvendige for identifikation af individuel ommatidia (figur 3B). Proceduren til påvisning af hornhindeniveauet er at ændre fluens lodrette (Z) position i trin ved at anvende den hurtige Fourier-transformation (FFT) på billedet taget på hvert niveau for at bestemme det rumlige frekvensindhold. Kriteriet for optimal fokus er niveauet med den største summerede effekt over en lavfrekvent afskæring.
Indgangene til autofokusering er Z-positioner og streaming af video fra kameraet. Outputtene er integreret i det højfrekvente indhold i billedet SF og fokuseringsniveauet Z, hvor SF er maksimalt. I det indledende trin justeres Z-positionen af kamerabilledet til lidt under hornhindefacetlinserne, og interesseområdet for at bestemme billedets frekvensindhold indstilles. For loop starter billedoptagelsen og beregner summen af den high-pass filtrerede Fourier-transform SF. Ved derefter at træde z-aksemotoren opad til et billedniveau over hornhinden, findes niveauet med de højeste frekvenser, dvs. hvor SF er maksimal, hvilket antages at være hornhindeniveauet. Z-aksemotoren justeres derefter til dette niveau, og der tages et billede.
Når man fokuserer ned fra hornhinden mod niveauet af øjets krumningscenter, forsvinder hornhindefacetterrefleksionerne væk, og pseudopupilrefleksionerne samles i et typisk syvpunktsmønster, hvilket er karakteristisk for organiseringen af fotoreceptorerne i flueommatidien (figur 3C; bemærk, at mønsteret kun er tydeligt i ca. sfæriske øjenområder). Mønsteret i øjets centrum af krumningsniveauet kaldes den dybe pseudopupil (DPP)19,21.
At flytte fluen placeret på scenen med X- og Y-motorerne, så midten af lyspunktet falder sammen med midten af kamerabilledet kaldes autocentrering. Denne procedure justerer facetten af ommatidiumet, hvis visuelle akse er i midten af DPP med belysningsstrålen og den optiske akse af mikroskopet og kameraet. Billedet er gaussisk filtreret og binariseret, og derefter bestemmes midten af pseudopupilen ved hjælp af regionprops MATLAB-funktionen. Indgangene er positionerne for X- og Y-motorerne og streamingvideoen fra kameraet; output er afstanden mellem midten af billedet og pseudopupil, som derefter oversættes til et sceneskift.
Korrelering af billeder
Øjet scannes ved at tage og opbevare fotografier ved forskellige værdier af goniometerhøjden θ og azimut φ efter autofokuserings- og autocentreringsprocedurerne. Todimensionel korrelation bruges til at bestemme x-y-forskydningerne mellem successive billeder. For at korrelere billederne opnået ved forskellige vinkelpositioner er det vigtigt at indse, at dette generelt resulterer i en rotation af det aktuelle billede i forhold til det forrige billede. Lad os for eksempel antage, at midten af et indledende billede svarer til punkt C i en kugle (figur 5), og at der sker en ændring i azimut, så plan OAB roteres over en lille vinkel Δφ og bliver plan OA'B. Midten af billedet ændres derefter fra punkt C til punkt C ' (figur 5). Hvis kameraets billedplan er vinkelret på vektoren OC, forårsager rotation af plan OAB til OA'B rotation af billedet over en vinkel β = Δφ cosθ, som β = CC'⁄BC, med CC' = CDΔφ og cosθ = CD⁄BC (figur 5). Dette betyder, at øverst i kuglen (θ = 0°), β = Δφ, og ved ækvator (θ = 90°) β = 0°. Når Δφ = 0°, det vil sige, når kun højden θ ændres, roteres billederne ikke i forhold til hinanden, så β = 0°.
Under scanningsproceduren centrerer autocentreringsproceduren ommatidiumet, hvis visuelle akse er justeret med målesystemets optiske akse. Rotation af azimut forårsager en rotation med en vinkel β og en oversættelse af facetmønsteret. For at bestemme sidstnævnte skift korreleres to på hinanden følgende billeder (efter først at have roteret det første billede med rotationsvinklen β), som forklaret i figur 6.
I billedforskydningsalgoritmen (Supplementary File 1, script ImProcFacets) identificeres de enkelte facetter af centroiderne af deres refleksioner i hvert billede. Indgangene til algoritmen er højde- og azimutvinklen, det sæt billeder, der skal vurderes, billedkanalen og interesseområdet. Algoritmen producerer et sæt centroider og et endeligt billede, der indeholder alle de korrelerede billeder taget under scanningsproceduren.
Det goniometriske system
For at opnå overensstemmelse med belysningen skal fluens øje fotograferes med hornhindefacetlinserne i fokus, og pseudopupilen skal fornyes ofte (her efter hver 5° rotation). Denne automatiske proces realiseres med GRACE-systemet (Goniometric Research Apparatus for Compound Eyes), vist skematisk i figur 4. Den består af tre hovedundersystemer: de nedre og øvre trin med deres respektive elektronik som den elektromekaniske hardware, firmwaren indlejret i de fysiske controllere og pc'en, der bruges til at betjene den software, der implementerer algoritmerne. Hardwaren består af de motoriserede og optiske trin, det digitale kamera, en mikrocontroller til programmering af LED-intensiteter og en hvid LED-lyskilde. Firmwarens rutiner leveres med motorstyringerne, LED-controlleren og i digitalkameraet. Softwaren består af algoritmerne til styring af motorpositioner og hastigheder, justering af LED'en og erhvervelse og analyse af billeder. De næste algoritmer repræsenterer de vigtigste milepæle, der gør det muligt for GRACE-systemet at scanne insektøjne.
Flyve øjne og pseudopupils
Når et husflueøje er belyst, aktiverer det indfaldende lys pupilmekanismen i fotoreceptorcellerne, et system af mobile, gulfarvede pigmentgranulater inde i cellelegemet. Systemet styrer den lysstrøm, der udløser fotoreceptorernes fototransduktionsproces, og har således stort set samme funktion som pupillen i det menneskelige øje19,20. Aktiveringen af pupilmekanismen forårsager en lokalt forbedret refleksion i øjenområdet, der vender mod åbningen af mikroskopets mål (figur 3). Placeringen af det stærkt reflekterende øjenområde, pseudopupil 19,20,21, ændres ved rotation af øjet, fordi det indfaldende lys derefter aktiverer pupilmekanismen i et andet sæt fotoreceptorceller (se figur 6). Pseudopupilen fungerer således som en markør for ommatidiaens visuelle akse, der er justeret med mikroskopet. Dette muliggør kortlægning af den rumlige fordeling af øjets visuelle akser 4,20,21,22,23.
Udfylde manglende facetter
Ikke alle facetter identificeres ved centroidproceduren, f.eks. på grund af en lav lokal refleksion forårsaget af mindre uregelmæssigheder i overfladen eller støvpletter. Sidstnævnte kan også resultere i fejlagtige centroider (figur 7A). Dette problem løses først ved at vaske øjnene under en vandhane og for det andet ved at anvende en udfyldningsprocedure (script ImProcFacets). Derfor bestemmes centroiderne i et område først (figur 7A), og derefter beregnes FFT (figur 7B). Den første ring af harmoniske (gule stjerner i figur 7B) definerer tre retninger, angivet med de blå, røde og grønne linjer (figur 7B). Omvendt transformation af harmoniske langs de tre retninger giver de grå bånd i figur 7C-E. Montering af et andenordenspolynomium til de grå bånd giver linjer, der forbinder facet centroiderne langs de tre gitterakser. Gitterlinjernes krydsningspunkter svarer således til de sande facetcentre. Da eksemplet med figur 7 er et ekstremt tilfælde, viser det, at proceduren er robust. I de fleste områder er manglende facetter og fejlagtige centroider sjældne.
Scanning af et flueøje
Figur 8 viser et bånd af ommatidia scannet over øjet ved at udføre en række trinvise azimutale ændringer med Δφ = 5°. Scanning fra øjets forside (figur 8A, højre) til sidesiden (figur 8A, venstre) fandt sted i 24 trin. Centroiderne af de stort set overlappende facetmønstre blev efterfølgende roteret af β = Δφcosθ. Derefter, efter at have skiftet centroiderne i hvert billede og udfyldt de manglende facetter (med script ImProcFacets), blev de colocaliserede centroider gennemsnitligt. Figur 8A viser de kombinerede billeder sammen med billedcentrene og facet centroiderne. Figur 8B viser samlingen af facetter som et Voronoi-diagram.
Figur 1: Montering af fluen i messingholderen. (A) En spids med en stueflue, der skal undersøges. (B) Den afskårne spids med fluen skubbes forsigtigt til enden ved hjælp af et stykke bomuld og en spisepind. (C) spidsen med fluen yderligere skåret til en samlet længde på 10 mm. (D) messingholderen med fluen, der skal placeres på goniometertrinnet; pilen peger på højdejusteringsskruen. (E) Nærbillede af fluen med hovedet immobiliseret af et stykke smeltevoks ved lav temperatur (#) til spidsen (*). Epi-belysning har aktiveret pupilmekanismen i øjets fotoreceptorer, som afsløret af den gule pseudopupil. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: GRACE, det goniometriske forskningsapparat til sammensatte øjne. Det undersøgte insekt (en flue) er monteret på det motoriserede stadium bestående af tre oversættelsestrin (X, Y, Z) og to rotationstrin (højde og azimut). Et objektiv fokuserer lys fra en hvid LED på en membran, fokuseret via et halvspejl ved fluens øje. Øjet er fotograferet med et kamera fastgjort til et mikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Optik af flueøjne. (A) Diagram over tre ommatidier af et flueøje, hver dækket af en bikonveks facetlinse, der fokuserer indfaldende lys på et sæt fotoreceptorceller (gul), omgivet af primære (brune) og sekundære (røde) pigmentceller. Intens belysning af mørktilpassede (DA) fotoreceptorer forårsager migration af gule pigmentgranulater (angivet med sorte prikker), som findes inde i fotoreceptorcellerne. Akkumuleret mod spidsen af fotoreceptorerne, nær de lysfølsomme organeller, rhabdomeres, absorberer de og backscatter lys i den lystilpassede (LA) tilstand. (B) Billede på øjenoverfladens niveau, der viser facetrefleksionerne (lyse prikker) samt pigmentgranulatrefleksionen i aktiveret tilstand (hornhinde pseudopupil, CPP). (C) Billede taget på niveau med midten af øjenkrumningen (den dybe pseudopupil, DPP), der afspejler arrangementet af fotoreceptorcellerne i et trapezformet mønster med deres distale ender placeret omkring facetlinsernes brændplan. Et overlejret virtuelt billede af fotoreceptorspidserne findes således i planet for midten af øjenkrumningen. Skalalinje 100 μm gælder for panelerne B og C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Skematisk diagram over GRACE-systemet. Pc-softwaren styrer firmwaren, som driver den elektromekaniske hardware. Digitalkameraet tager via et optisk trin billeder af prøvens øje. LED-lyskilden belyser prøven, og motorerne i det motoriserede trin aktiverer X-, Y- og Z-oversættelserne samt azimut (A) og elevation (E) rotationer. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Diagram til afledning af billedrotationen ved scanning af flueøjet. Hvis midten af et indledende billede svarer til punkt C i en kugle, og der sker en ændring i azimut, roteres plan OAB over en lille vinkel Δφ og bliver plan OA'B. Midten af billedet ændres derefter fra punkt C til punkt C '. Rotation af plan OAB til OA'B forårsager rotation af billedet over en vinkel β = Δφ cosθ (se tekst, afsnit Korrelerende billeder). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Billedbehandlingsproceduren til bestemmelse af interommatidialvinklen. (A) Billede taget under en scanning på tværs af øjet med facet centroider markeret med grønne cirkler og røde firkanter og en grøn prik i billedcentret. (B) Efterfølgende billede efter en azimutal rotation på 5°, med facet centroider markeret med røde firkanter og en rød prik i billedcentret. (C) Korrelogram af området inden for den grønne firkant af A korreleret med billede B. Vektoren fra midten af C (grøn prik) til korrelogrammets maksimale værdi repræsenterer det relative skift af billeder A og B. Ved hjælp af denne vektor tegnes den forskudte firkant af A og dens centrum i B, og facet centroiderne (røde firkanter) af B tilføjes i A. Skalalinje 100 μm gælder for paneler A-C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Udledning af manglende facet centroider ved at anvende Fourier-transformationer. (A) Et lokalt RGB-billede med facet centroider (røde prikker). Hvide pilespidser angiver manglende facetter, og den røde pilespids peger på en fejlagtig centroid. (B) FFT af centroiderne af A med den første ring af harmoniske markeret med gule stjerner. (C-E) Invers FFT af centroiderne langs de tre retninger angivet med de farvede linjer i B, hvilket giver de grålige bånd. De blå (C), røde (D) og grønne (E) linjer er kvadratiske polynomier, der passer til de grå bånd, og centroiderne (røde cirkler) er dem, der blev opnået før Fourier-transformationerne. (F) De monterede linjer af C-E kombineret sammen med centroiderne af A. De manglende facet centroider er derefter afledt af krydsningspunkterne. Skala bar 100 μm gælder for paneler A, C-F. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Højre øje på en husflue scannet fra den ene side til den anden side. (A) Kombinerede overlappende billeder af en billedserie, hvor azimuten blev ændret trinvist med 5° sammen med billedcentrene (grønne kryds) og facet centroiderne (røde cirkler). (B) Voronoi-diagram over facet centroiderne med billedcentrene som i A. Skalalinje 100 μm gælder for panelerne A og B. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende fil 1: Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den rumlige fordeling af de visuelle akser af husflueøjne kan kortlægges ved hjælp af pseudopupil-fænomenet sammensatte øjne og refleksionsændringerne forårsaget af den lysafhængige pupilmekanisme. Derfor er en undersøgt flue monteret i et goniometrisk system, som muliggør inspektion af det lokale facetmønster med et mikroskopopsætning udstyret med et digitalt kamera, alt under computerkontrol. Billedanalyse giver øjenkort. En væsentlig vanskelighed er, at uden omhyggelig placering af øjet i begyndelsen af målingerne kan de viste positioner for både øjet og pseudopupilen ændre sig betydeligt selv med små rotationer af den goniometriske enhed. Disse ændringer minimeres ved at placere øjencentret ved det goniometriske rotationscenter, hvor den dybe pseudopupil observeres. Ved at korrelere de efterfølgende målte billeder kan facetmønsteret spores. Det er vigtigt, at rotationsvinklen justeres til en ret lille værdi, fordi korrelationsproceduren i områder, hvor facetmønsteret er meget regelmæssigt, er tilbøjelig til fejlagtige resultater.
Her har vi præsenteret et delvist øjekort (figur 8), som viser muligheden for en højautomatisk kortlægning af synsstyrken i insektøjne. De interommatidiale vinkler på omkring 2,0°-2,5°, der fremgår af sammenligningen af facetafstandene med 5°-forskydningerne mellem successive billedcentre, svarer godt til data, der tidligere på en meget mere besværlig måde stammer fra den samme art (Musca domestica)25. Komplette øjenkort over det visuelle rum af husfluer og andre insekter vil blive offentliggjort andetsteds.
Metoden, der præsenteres her, gør det muligt at kortlægge de visuelle akser i et komplet øje, in vivo, inden for få timer, hvilket vil være ekstremt vanskeligt at opnå med andre tilgange. Den automatiserede kortlægningsmetode er illustreret her for husfluens tilfælde, men den kan simpelthen udvides til andre insekters sammensatte øjne, såsom sommerfugle. Men i stedet for pupilrefleksionen fungerer sommerfugleøjnehinen som den visuelle aksemarkør21,24. En alternativ metode er den nyligt udviklede røntgenmikrotomografi26. Denne værdifulde tilgang giver detaljerede anatomiske kort, men er sårbar over for optiske fejl, især hvor ommatidiaens visuelle akser er skæve til øjenoverfladen21, eller hvis vævsbehandling forvrænger øjengeometrien nok til at kompromittere målinger. Visualiseringen af pseudopupilen er mere eller mindre ligetil i flueøjne, der har en skinnende pupilmekanisme. Dette er mindre let i sammensatte øjne med en dårligt reflekterende elevmekanisme, som for eksempel i bier21. Men for mange andre insektarter, såsom soldaterfluer eller bier, kan fluorescensen af de visuelle pigmenter i de ommatidiale rhabdoms anvendes. Anvendelsen af fluoroforer, der skaber en stærk rhabdomfluorescens, giver en anden mulighed for at estimere den rumlige organisering af øjets visuelle rum27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at rapportere.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet økonomisk af Air Force Office of Scientific Research/European Office of Aerospace Research and Development AFOSR/EOARD (bevilling FA9550-15-1-0068 til D.G.S.). Vi takker Dr. Primož Pirih for mange nyttige diskussioner og Kehan Satu, Hein Leertouwer og Oscar Rincón Cardeño for hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision of amplified images and digital communication with PC |
| High power star LED | Velleman | LH3WW | Light source for observation and imaging the compound eye |
| Holder for the investigated fly | University of Groningen | Different designs were manufactured by the university workshop | |
| Linear motor | ELERO | ELERO Junior 1, version C | Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A) |
| Low temperature melting wax | various | The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder | |
| Microscope | Zeiss | Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x | |
| Motor and LED Controller | University of Groningen | Z-o1 | Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies. |
| Motorized Stage | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom. |
| Optical components | LINUS | Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| PC running MATLAB | University of Groningen | The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system | |
| Power Supply (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Lithuania) | PUP120-17 | Dedicated power supply for the STANDA motor controllers |
| Soldering iron | various | Used for melting the wax | |
| Stepper and DC Motor Controller | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly |
| Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes. | Programming language used to implement the algorithms |
References
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M.
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002 (2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168 (2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782 (2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613 (2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267 (2021).
