Summary
הפרוטוקול כאן מתאר את מדידת הארגון המרחבי של הצירים החזותיים של עיני הבית, הממופים על ידי מכשיר אוטומטי, באמצעות תופעת הפסאודו-פופיל ומנגנון האישון של תאי הפוטורצפטור.
Abstract
מאמר זה מתאר את המדידה האוטומטית של הארגון המרחבי של הצירים החזותיים של עיניים מורכבות חרקים, המורכבות מכמה אלפי יחידות חזותיות הנקראות אומטידיה. כל אומטידיום מדגים את המידע האופטי מזווית מוצקה קטנה, עם רגישות משוערת של גאוס התפלגות (חצי רוחב בסדר גודל של 1°) שבמרכזה ציר ראייה. יחד, האומטידיה אוספת את המידע החזותי משדה ראייה כמעט פנורמי. ההתפלגות המרחבית של הצירים החזותיים קובעת אפוא את הרזולוציה המרחבית של העין. הידע על הארגון האופטי של עין מורכבת וחדות הראייה שלה הוא חיוני למחקרים כמותיים של עיבוד עצבי של המידע החזותי. כאן אנו מציגים הליך אוטומטי למיפוי צירי הראייה של עין מורכבת, תוך שימוש בתופעה אופטית פנימית, in vivo , הפסאודו-פופיל, ומנגנון האישון של תאי הפוטורצפטור. אנו מתווים את המערך האופטומכני לסריקת עיני החרקים ומשתמשים בתוצאות ניסיוניות המתקבלות מ-housefly, Musca domestica, כדי להמחיש את השלבים בהליך המדידה.
Introduction
הקומפקטיות של מערכות הראייה של חרקים והזריזות של בעליהן, המדגימות עיבוד מידע חזותי מפותח מאוד, סיקרנו אנשים מרקע מדעי ולא מדעי כאחד. עיניים מורכבות חרקים זוהו כמכשירים אופטיים רבי עוצמה המאפשרים יכולות ראייה חריפות ורב-תכליתיות 1,2. זבובים, למשל, ידועים בתגובות המהירות שלהם לעצמים נעים, והדבורים מפורסמות בכך שהן בעלות ראיית צבעים וראיית קיטוב2.
העיניים המורכבות של פרוקי הרגליים מורכבות מיחידות דומות אנטומית רבות, האומטידיה, שכל אחת מהן מכוסה בעדשת פן. ב-Diptera (זבובים), הרכבה של עדשות פאה, הידועות באופן קולקטיבי כקרנית, קרובות לחצי כדור. כל אומטידיום מדגים אור תקרית מזווית מוצקה קטנה עם חצי רוחב בסדר גודל של 1°. האומטידיה של שתי העיניים יחד מדגימה בערך את מלוא הזווית המוצקה, אך הצירים החזותיים של האומטידיה אינם מופצים באופן שווה. באזורי עיניים מסוימים יש צפיפות גבוהה של צירי ראייה, מה שיוצר אזור של חדות מרחבית גבוהה, הנקרא באופן מילולי fovea. לחלק הנותר של העין יש אז רזולוציה מרחבית גסה יותר 3,4,5,6,6,7,8,9.
ניתוח כמותי של הארגון האופטי של העיניים המורכבות הוא חיוני למחקרים מפורטים של העיבוד העצבי של מידע חזותי. מחקרים על הרשתות העצביות של מוחו של חרק10 דורשים לעתים קרובות ידע על ההתפלגות המרחבית של הצירים האומטידיים. יתר על כן, עיניים מורכבות היוו השראה למספר חידושים טכניים. יוזמות רבות לייצור עיניים מלאכותיות בהשראה ביולוגית נבנו על מחקרים כמותיים קיימים של עיניים מורכבות אמיתיות 11,12,13. לדוגמה, חיישן מבוסס מוליכים למחצה עם רזולוציה מרחבית גבוהה תוכנן על סמך המודל של עיניים מורכבות חרקים 11,14,15,16,17. עם זאת, המכשירים שפותחו עד כה לא יישמו את המאפיינים האמיתיים של עיני החרקים הקיימות. ייצוגים מדויקים של עיניים מורכבות חרקים והארגון המרחבי שלהן ידרשו נתונים מפורטים ואמינים מעיניים טבעיות, שאינן זמינות באופן נרחב.
הסיבה העיקרית למחסור בנתונים היא המייגעות הקיצונית של ההליכים הזמינים לשרטוט המאפיינים המרחביים של העיניים. זה הניע ניסיונות להקים הליך מיפוי עיניים אוטומטי יותר. בניסיון ראשון לניתוח אוטומטי של עיניים מורכבות חרקים, דאגלס וולינג18 פיתחו הליך סריקה למיפוי גדלי פנים בקרנית והדגימו את היתכנותו עבור כמה מיני זבובים. כאן אנו מרחיבים את גישתם על ידי פיתוח שיטות לא רק לסריקת היבטי הקרנית אלא גם להערכת הצירים החזותיים של האומטידיה שאליהם שייכים ההיבטים. אנו מציגים את המקרה של housefly eyes כדי להדגים את ההליכים המעורבים.
המערך הניסיוני לסריקת עיני חרקים הוא: אופטי בחלקו, כלומר מיקרוסקופ עם מצלמה ואופטיקה של תאורה; מכני בחלקו, כלומר מערכת גוניומטר לסיבוב החרק הנחקר; וחישוב חלקי, כלומר שימוש במנהלי התקנים של תוכנה עבור המכשירים והתוכנות לביצוע מדידות וניתוחים. השיטות שפותחו כוללות מגוון של הליכים חישוביים, החל מלכידת תמונות, בחירת ערוצי מצלמה וקביעת ספי עיבוד תמונה וכלה בזיהוי מיקומי היבטים בודדים באמצעות נקודות אור בהירות המוחזרות מהמשטחים הקמורים שלהן. שיטות התמרת פורייה היו חיוניות בניתוח התמונה, הן לאיתור היבטים בודדים והן לניתוח דפוסי הפאות.
המאמר בנוי באופן הבא. תחילה אנו מציגים את מערך הניסוי ואת תופעת הפסאודו-פופיל - הסמן האופטי המשמש לזיהוי הצירים החזותיים של הפוטורצפטורים בעיניים חיות 19,20,21. לאחר מכן, האלגוריתמים המשמשים בהליך הסריקה ובניתוח התמונה מתוארים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול הוא בהתאם להנחיות הטיפול בחרקים של האוניברסיטה.
1. הכנת בית, מוסקה בייתה
- לאסוף את הזבוב מהאוכלוסייה שגודלה במעבדה. הניחו את הזבוב במחזיק הפליז (איור 1).
- חותכים 6 מ"מ מהחלק העליון של הצינור המרסן (ראו טבלת חומרים). לחלק העליון החדש של הצינור יש קוטר חיצוני של 4 מ"מ וקוטר פנימי של 2.5 מ"מ (איור 1A). מניחים את הזבוב החי בתוך הצינור, אוטמים את הצינור בכותנה כדי למנוע פגיעה בזבוב, ודוחפים את הזבוב כך שהראש בולט מהצינור וגופו מרוסן (איור 1B). שתקו את הראש בשעוות דבורים כך שהעיניים יישארו חשופות (איור 1C-E).
- חותכים את הצינור שוב כך שאורך הצינור הוא 10 מ"מ (איור 1C). מניחים את צינור הפלסטיק עם הזבוב במחזיק הפליז, כך שעין אחת של הזבוב מצביעה כלפי מעלה כאשר המחזיק מונח על שולחן (איור 1D,E).
- התאימו את כיוון הצינור כך שכאשר גובה הגוניומטר יהיה ב-0° (כלומר, שלב האזימוט נמצא במצב אופקי), קרן ההארה האנכית של המיקרוסקופ תהיה בניצב למשטח העין באזור מרכזי, בין הגחון לגב, ובין הקצוות הקדמיים והאחוריים של העין, כך שניתן יהיה לסרוק את העין כולה בטווח האזימוט והגובה המותרים על ידי ההתקנה.
2. יישור ציר האזימוט המסתובב של הגוניומטר עם הציר האופטי של המיקרוסקופ
- הרכיבו סיכת יישור על שלב הסיבוב של האזימוט כך שניתן יהיה להתאים את מיקום x-y של הקצה כך שיתאים לציר האזימוט על הבמה הממונעת. במהלך הצפייה במיקרוסקופ, המצויד במטרה של פי 5, התמקדו בקצה באמצעות הג'ויסטיק של ציר z (איור 2).
- יישמו את כוונון x-y של ציר האזימוט עם הציר האופטי של המיקרוסקופ וודאו כי צירי הגובה והאזימוט הסיבוביים מיושרים מראש עם הסיכה הממורכזת, באמצעות הג'ויסטיקים של ציר x ו-y.
- תמרנו את האזימוט ואת ג'ויסטיקי ההגבהה כדי לבדוק אם הסיכה ממורכזת ביחס לשתי דרגות החופש. כאשר הוא ממורכז היטב, קצה הסיכה נשאר, בערך, באותו מיקום במהלך אזימוט וסיבובי גובה.
3. יישור עין הזבוב עם השלבים הממונעים
- כאשר שלב הגובה הוא 0°, הרכיבו את הזבוב ומחזיקו על שלב האזימוט. התבונן בעין הזבוב באמצעות המיקרוסקופ.
- כאשר נורית התאורה דולקת, התאם את המיקום האופקי של הזבוב כך שמרכז הפסאודו-פופיל יתיישר עם המיקרוסקופ. התאם את המיקום האנכי של הזבוב באמצעות הבורג המסתובב של המחזיק (איור 1D), כך שהפסאודו-פופיל העמוק (DPP; איור 3) 19,20,21 מובא לפוקוס ברמת ציר הגובה.
- יישרו את ה-DPP ביחס לצירי האזימוט וההגבהה על-ידי ריכוזו בשדה הראייה (ראו איור 2). השתמשו במגנטים המודבקים לתחתית מחזיק הזבובים כדי להצמיד אותו בחוזקה ללוח ברזל המותקן על שלב האזימוט, תוך מתן אפשרות להתאמות החלקה ידניות.
- העבר את התצוגה למצלמה הדיגיטלית המותקנת במיקרוסקופ. הפעל את אתחול התוכנה של מערכת GRACE, הכוללת אתחול בקרי המנוע ובקר ה-LED של Arduino (איור 4). לכן, פתח את MATLAB R2020a או גרסה גבוהה יותר. הפעל את Initialize_All_Systems הסקריפט של MATLAB (קובץ משלים 1).
- ודא אם הפסאודו-פופיל של הזבוב (איור 3B,C) נמצא במרכז התמונה המוקרנת על מסך המחשב.
4. מיקוד אוטומטי ומרכז אוטומטי
- הביאו את הפוקוס לרמה של פסאודו-פופיל הקרנית (CPP; איור 3B) 19,20,21 ידנית באמצעות הג'ויסטיק של ציר z.
- הפעל את אלגוריתם המיקוד האוטומטי (קובץ משלים 1, מיקוד אוטומטי של סקריפט) כדי להשיג תמונה חדה ברמת הקרנית. בדוק על ידי החזרת המיקוד לרמת DPP על ידי התאמת שלב ציר ה- z הממונע. אחסן את המרחק בין ה- DPP ל- CPP (בשלבי המנוע).
- כוונון עדין של מרכוז פסאודו-פופיל על-ידי הפעלת אלגוריתם המרכז האוטומטי (קובץ משלים 1, Script AC). החזירו את המיקוד לרמת CPP.
- הפעל מחדש את אלגוריתם המיקוד האוטומטי. אפס את השלבים הממונעים במיקומם הנוכחי (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0,0), כאשר E הוא גובה ו-A הוא אזימוט.
- הפעל את אלגוריתם הסריקה (קובץ משלים 1, סקריפט Scan_Begin), אשר מדגים תמונות עיניים לאורך מסלולים בצעדים של 5° , תוך ביצוע האלגוריתמים של מרכז אוטומטי ומיקוד אוטומטי.
- בסיום הדגימה, כבה את בקר ה- LED ואת בקרי המנוע.
- לעבד את התמונות על ידי החלת האלגוריתמים לעיבוד תמונה (קובץ משלים 1, סקריפט ImProcFacets).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעלי חיים וגירוי אופטי
ניסויים מבוצעים על פלי בית (Musca domestica) המתקבלים מתרבות המתוחזקת על ידי המחלקה לגנטיקה אבולוציונית באוניברסיטת חרונינגן. לפני המדידות, זבוב משותק על ידי הדבקתו בשעווה בעלת נקודת התכה נמוכה בצינור מתאים היטב. הזבוב מותקן לאחר מכן על הבמה של גוניומטר ממונע. מרכז שני השלבים הסיבוביים עולה בקנה אחד עם נקודת המוקד של מערך מיקרוסקופי24. קרן האור האפי-תאורה מסופקת על ידי מקור אור, הממקד את האור בסרעפת המצולמת בעין הזבוב באמצעות חצי מראה. לפיכך, הוא מפעיל את מנגנון האישון של קבוצה מוגבלת של תאים פוטורצפטורים (איור 3). הצירים האופטיים של האומטידיה המאכלסים את הפוטורצפטורים האלה מוערכים על ידי סיבוב הזבוב בצעדים קטנים וצילום תמונות לאחר כל צעד עם מצלמה דיגיטלית צבעונית המחוברת למיקרוסקופ (איור 2). מכיוון שגרגירי הפיגמנט האישוניים משתקפים בעיקר בטווח אורכי הגל הארוכים, הערוץ האדום של המצלמה הדיגיטלית משמש להבחנה בין הפסאודו-פופיל לבין השתקפויות עדשת הפן. ההשתקפויות האחרונות מבודדות בצורה הטובה ביותר מהפסאודו-פופיל באמצעות הערוץ הכחול של המצלמה.
אלגוריתמים של מיקוד אוטומטי וריכוז אוטומטי
האלגוריתמים הנוספים העיקריים המשמשים לסריקת עין החרק הם המיקוד האוטומטי והמרכז האוטומטי (קובץ משלים 1, סקריפטים AF ו-AC). המטרה של מיקוד אוטומטי היא להביא את רמת הקרנית למוקד המצלמה, כדי לזהות את ההשתקפויות הפאה הנחוצות לזיהוי של אומטידיה בודדת (איור 3B). הנוהל לאיתור רמת הקרנית הוא לשנות את המיקום האנכי (Z) של הזבוב בשלבים על ידי החלת התמרת פורייה המהירה (FFT) על התמונה שצולמה בכל רמה כדי לקבוע את תוכן התדר המרחבי. הקריטריון למיקוד אופטימלי הוא הרמה עם ההספק המסוכם הגדול ביותר מעל ניתוק בתדר נמוך.
הכניסות למיקוד אוטומטי הן מיקומי Z והזרמת וידאו מהמצלמה. הפלטים הם האינטגרל של התוכן בתדר הגבוה של התמונה SF ורמת המיקוד Z שבה SF הוא מקסימלי. בשלב הראשוני, מיקום ה-Z של תמונת המצלמה מותאם לקצת מתחת לעדשות הפאה הקרנית, ואזור העניין לקביעת תוכן התדר של התמונה מוגדר. הלולאה עבור מתחילה את לכידת התמונה ומחשבת את סכום ה-SF המסונן של פורייה. על ידי דריכה של מנוע ציר z כלפי מעלה לרמת תמונה מעל הקרנית, נמצאה הרמה עם התדרים הגבוהים ביותר, כלומר, כאשר SF הוא מקסימלי, אשר נלקח להיות רמת הקרנית. לאחר מכן, מנוע ציר ה-z מותאם לרמה זו ותמונה מצולמת.
כאשר מתמקדים מהקרנית לכיוון רמת מרכז העקמומיות של העין, השתקפויות הפאה הקרנית מתפוגגות, וההשתקפויות הפסאודו-פופיל מתלכדות לתבנית טיפוסית של שבע נקודות, שהיא מאפיין לארגון הפוטורצפטורים בתוך האומטידיה של הזבוב (איור 3C; שימו לב שהתבנית נבדלת רק באזורי עיניים כדוריים בקירוב). התבנית במרכז רמת העקמומיות של העין נקראת פסאודו-פופיל עמוק (DPP)19,21.
הזזת הזבוב הממוקם בשלב עם מנועי ה-X וה-Y כך שמרכז נקודת האור חופף למרכז התמונה של המצלמה נקראת autocentering. הליך זה מיישר את הפן של האומטידיום שציר הראייה שלו נמצא במרכז ה- DPP עם קרן ההארה והציר האופטי של המיקרוסקופ והמצלמה. התמונה היא גאוס מסוננת ובינארית, ואז מרכז הפסאודו-פופיל נקבע באמצעות פונקציית MATLAB של zoneprops . הקלטים הם מיקומי מנועי ה-X וה-Y והווידאו המזרים מהמצלמה; הפלט הוא המרחק בין מרכזי התמונה לפסאודו-פופיל, אשר מתורגם לאחר מכן לשינוי במה.
קורלציה בין תמונות
העין נסרקת על ידי צילום ואחסון תצלומים בערכים שונים של גובה הגוניומטר θ ואזימוט φ לאחר הליכי המיקוד האוטומטי והמרכז האוטומטי. מתאם דו-ממדי משמש לקביעת ההזזות x-y בין תמונות עוקבות. כדי לתאם את התמונות המתקבלות במיקומים זוויתיים שונים, חיוני להבין כי זה בדרך כלל גורם לסיבוב של התמונה הנוכחית ביחס לתמונה הקודמת. לדוגמה, הבה נניח שמרכז התמונה הראשונית מתאים לנקודה C של כדור (איור 5) וששינוי באזימוט מתרחש כך שמישור OAB מסובב על פני זווית קטנה Δφ, והופך למישור OA'B. לאחר מכן, מרכז התמונה משתנה מנקודה C לנקודה C' (איור 5). אם מישור התמונה של המצלמה מאונך לווקטור OC, סיבוב מישור OAB ל-OA'B גורם לסיבוב התמונה על פני זווית β = Δφ cosθ, כפי β = CC'⁄BC, עם CC' = CDΔφ, ו- cosθ = CD⁄BC (איור 5). משמעות הדבר היא שבראש הכדור (θ = 0°), β = Δφ, ובקו המשווה (θ = 90°), β = 0°. כאשר Δφ = 0°, כלומר, כאשר רק הגובה θ משתנה, התמונות אינן מסובבות זו ביחס זו לזו, ולכן β = 0°.
במהלך הליך הסריקה, הליך המרכז האוטומטי מרכז את האומטידיום שציר הראייה שלו מיושר עם הציר האופטי של מערכת המדידה. סיבוב האזימוט גורם לסיבוב על ידי זווית β ותרגום של תבנית הפאנט. כדי לקבוע את ההזזה האחרונה, יש קורלציה בין שתי תמונות עוקבות (לאחר סיבוב ראשון של התמונה הראשונה לפי זווית הסיבוב β), כפי שמוסבר באיור 6.
באלגוריתם הזזת התמונה (קובץ משלים 1, סקריפט ImProcFacets), ההיבטים הבודדים מזוהים על ידי הצנטרואידים של ההשתקפויות שלהם בכל תמונה. הקלטים לאלגוריתם הם זווית הגובה והאזימוט, קבוצת התמונות שיש להעריך, ערוץ התמונה ואזור העניין. האלגוריתם מייצר קבוצה של סנטרואידים ותמונה סופית המכילה את כל התמונות המתואמות שצולמו במהלך הליך הסריקה.
המערכת הגוניומטרית
על מנת להשיג יישור קו עם התאורה, יש לצלם את העין של הזבוב עם עדשות הפאה הקרנית במיקוד, ואת הפסאודו-פופיל יש להחליף את הפסאודו-פופיל לעתים קרובות יותר (כאן, לאחר כל סיבוב של 5 מעלות). תהליך אוטומטי זה מתממש באמצעות מערכת GRACE (מנגנון מחקר גוניומטרי לעיניים מורכבות), המוצגת באופן סכמטי באיור 4. הוא מורכב משלוש תת-מערכות עיקריות: השלבים התחתונים והעליונים עם האלקטרוניקה המתאימה שלהם כחומרה האלקטרו-מכנית, הקושחה המוטמעת בבקרים הפיזיים, והמחשב המשמש להפעלת התוכנה המיישמת את האלגוריתמים. החומרה מורכבת מהשלבים הממונעים והאופטיים, המצלמה הדיגיטלית, מיקרו-בקר לתכנות עוצמות LED ומקור אור LED לבן. שגרות הקושחה מסופקות עם בקרי המנוע, בקר ה-LED ובמצלמה הדיגיטלית. התוכנה מורכבת מהאלגוריתמים לשליטה במיקומים ובמהירויות המנוע, התאמת הנורית ורכישה וניתוח של תמונות. האלגוריתמים שיידונו בהמשך מייצגים את אבני הדרך העיקריות המאפשרות למערכת GRACE לסרוק את עיני החרקים.
עיניים מעופפות ופסאודו-פופילים
כאשר עין הבית מוארת, אור האירוע מפעיל את מנגנון האישון של תאי הפוטורצפטור, מערכת של גרגירי פיגמנט ניידים בצבע צהוב בתוך גוף התא. המערכת שולטת בשטף האור המפעיל את תהליך הפוטו-טרנסדוקציה של הפוטורצפטורים, ולכן יש לה למעשה את אותה פונקציה כמו האישון בעין האנושית 19,20. הפעלת מנגנון האישון גורמת להשתקפות מוגברת מקומית באזור העיניים הפונה אל פתח הצמצם של מטרת המיקרוסקופ (איור 3). המיקום של אזור העין המשקף בבהירות, הפסאודו-פופיל 19,20,21, משתנה עם סיבוב העין מכיוון שאור האירוע מפעיל את מנגנון האישון בקבוצה אחרת של תאים פוטורצפטורים (ראו איור 6). הפסאודו-פופיל משמש אפוא כסמן לציר החזותי של האומטידיה המיושרים עם המיקרוסקופ. זה מאפשר מיפוי של ההתפלגות המרחבית של הצירים החזותיים של העין 4,20,21,22,23.
מילוי היבטים חסרים
לא כל ההיבטים מזוהים על ידי הפרוצדורה הצנטרואידית, למשל, בשל רפלקציה מקומית נמוכה הנגרמת על ידי אי-סדרים קלים על פני השטח או כתמים של אבק. זה האחרון יכול גם לגרום לצנטרואידים שגויים (איור 7A). בעיה זו נפתרת ראשית על ידי שטיפת העיניים מתחת לברז מים ושנית על ידי החלת הליך מילוי (סקריפט ImProcFacets). לכן, הצנטרואידים באזור מסוים נקבעים תחילה (איור 7A), ולאחר מכן מחושב ה-FFT (איור 7B). הטבעת הראשונה של ההרמוניות (כוכבים צהובים באיור 7B) מגדירה שלושה כיוונים, המסומנים על ידי הקווים הכחולים, האדומים והירוקים (איור 7B). טרנספורמציה הפוכה של ההרמוניות לאורך שלושת הכיוונים מניבה את הפסים האפורים באיור 7C-E. התאמת פולינום מסדר שני לפסים האפורים מניבה קווים המחברים את הצנטרואידים הפאתיים לאורך שלושת צירי הסריג. נקודות המעבר של קווי הסריג, אם כן, תואמות את מרכזי הפן האמיתיים. מכיוון שהדוגמה של איור 7 היא מקרה קיצוני, היא מדגימה שההליך חזק. ברוב האזורים, היבטים חסרים וצנטרואידים שגויים הם נדירים.
סריקת עין זבוב
איור 8 מראה רצועה של אומטידיה נסרקת לרוחב העין על-ידי ביצוע סדרה של שינויים אזימוטאליים מדורגים עם Δφ = 5°. סריקה מהצד הקדמי של העין (איור 8A, מימין) לצד הצדדי (איור 8A, משמאל) התרחשה ב-24 צעדים. הצנטרואידים של תבניות הפאנט החופפות ברובן סובבו לאחר מכן על ידי β = Δφφcosθ. לאחר מכן, לאחר הזזת הצנטרואידים של כל תמונה ומילוי ההיבטים החסרים (עם ImProcFacets של סקריפט), ממוצע הצנטרואידים הקולוקליים. איור 8A מציג את התמונות המשולבות, יחד עם מרכזי התמונה וצנטרואידי הפן. איור 8B מציג את הרכבית ההיבטים כדיאגרמת וורונוי.
איור 1: הרכבת הזבוב לתוך מחזיק הפליז. (B) הקצה החתוך עם הזבוב נדחף בעדינות לקצה באמצעות חתיכת כותנה ומקל אכילה. (C) הקצה עם הזבוב נחתך עוד יותר לאורך כולל של 10 מ"מ. (D) מחזיק הפליז עם הזבוב שיונח על במת הגוניומטר; החץ מצביע על בורג כוונון הגובה. (E) תמונת תקריב של הזבוב כשהראש משותק על ידי חתיכת שעווה נמסה בטמפרטורה נמוכה (#) עד הקצה (*). ההארה האפית הפעילה את מנגנון האישון של הפוטורצפטורים של העין, כפי שנחשף על ידי הפסאודו-פופיל הצהוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: GRACE, מנגנון המחקר הגוניומטרי לעיניים מורכבות. החרק הנחקר (זבוב) מותקן בשלב הממונע המורכב משלושה שלבי תרגום (X, Y, Z) ושני שלבי סיבוב (גובה ואזימוט). עדשה ממקדת אור מנורית LED לבנה בסרעפת, הממוקדת דרך חצי מראה בעין הזבוב. העין מצולמת במצלמה המחוברת למיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: אופטיקה של עיניים זבוביות. (A) דיאגרמה של שלוש אומטידיה של עין זבוב, שכל אחת מהן מכוסה בעדשת פאה דו-קונווקסית, הממקדת את אור האירוע על קבוצה של תאים פוטורצפטורים (צהובים), המוקפים בתאי פיגמנט ראשוניים (חומים) ומשניים (אדומים). תאורה אינטנסיבית של פוטורצפטורים המותאמים לכהה (DA) גורמת לנדידה של גרגירי פיגמנט צהובים (המסומנים על ידי נקודות שחורות), הקיימים בתוך תאי הפוטורצפטור. הם מצטברים לקראת קצה הפוטורצפטורים, ליד האברונים הרגישים לאור, הרבדומרים, הם בולעים ומחזירים אור במצב המותאם לאור (LA). (B) תמונה בגובה פני השטח של העין, המציגה את השתקפויות הפן (נקודות בהירות) כמו גם את השתקפות גרגיר הפיגמנט במצב הפעיל (פסאודופופיל הקרנית, CPP). (C) התמונה צולמה ברמה של מרכז עקמומיות העין (פסאודו-פופיל עמוק, DPP), המשקפת את סידור התאים הפוטורצפטורים בתבנית טרפזית, כאשר הקצוות הדיסטליים שלהם ממוקמים בערך במישור המוקד של עדשות הפאנט. תמונה וירטואלית על גבית של קצות הפוטורצפטור, אם כן, קיימת במישור של עקמומיות מרכז העין. סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר חל על לוחות B ו- C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: דיאגרמה סכמטית של מערכת GRACE. תוכנת המחשב שולטת בקושחה, אשר מניעה את החומרה האלקטרו-מכנית. המצלמה הדיגיטלית מצלמת, באמצעות שלב אופטי, תמונות של עין הדגימה. מקור אור ה-LED מאיר את הדגימה, והמנועים של השלב הממונע מפעילים את תרגומי ה-X,Y וה-Z, כמו גם את סיבובי האזימוט (A) והגובה (E). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: דיאגרמה לגזירת סיבוב התמונה בעת סריקת עין הזבוב. אם מרכז התמונה הראשונית מתאים לנקודה C של כדור ומתרחש שינוי באזימוט, מישור OAB מסובב על פני זווית קטנה Δφ, והופך למישור OA'B. מרכז התמונה משתנה מנקודה C לנקודה C'. סיבוב מישור OAB ל- OA'B גורם לסיבוב התמונה על פני זווית β = Δφ cosθ (ראה טקסט, סעיף קורלציה של תמונות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: הליך עיבוד התמונה לקביעת הזווית הבין-אומטידיאלית. (A) תמונה שצולמה במהלך סריקה לרוחב העין, עם סנטרואידים של פאה המסומנים בעיגולים ירוקים וריבועים אדומים, ונקודה ירוקה במרכז התמונה. (B) תמונה עוקבת לאחר סיבוב אזימוטאלי של 5°, עם סנטרואידים פאתיים המסומנים בריבועים אדומים ונקודה אדומה במרכז התמונה. (C) קורלוגרמה של השטח בתוך הריבוע הירוק של A בקורלציה עם תמונה B. הווקטור ממרכז C (נקודה ירוקה) לערך המרבי של המתאם מייצג את ההזזה היחסית של תמונות A ו-B. באמצעות וקטור זה, הריבוע המוסט של A ומרכזו מצוירים ב-B וצנטרואידי הפאה (ריבועים אדומים) של B מתווספים ב-A. סרגל קנה המידה 100 μm חל על לוחות A-C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: גזירת סנטרואידים של פאה חסרה על-ידי החלת התמרות פורייה. ראשי חץ לבנים מציינים היבטים חסרים, וראש החץ האדום מצביע על מרכז שגוי. (B) FFT של הצנטרואידים של A עם טבעת ההרמוניות הראשונה המסומנת על ידי כוכבים צהובים. (ג-ה) FFT הפוך של הצנטרואידים לאורך שלושת הכיוונים המסומנים על ידי הקווים הצבעוניים ב- B, המניבים את הפסים האפרפרים. הקווים הכחולים (C), האדומים (D) והירוקים (E) הם פולינומים ריבועיים המתאימים לפסים האפורים, והצנטרואידים (עיגולים אדומים) הם אלה שהתקבלו לפני התמרות פורייה. (F) הקווים המותאמים של C-E משולבים, יחד עם הצנטרואידים של A. הצנטרואידים החסרים נגזרים לאחר מכן מנקודות המעבר. סרגל קנה מידה של 100 מיקרומטר חל על לוחות A, C-F. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: העין הימנית של עקרת בית שנסרקה מצד לצד השני. (A) תמונות משולבות וחופפות של סדרת תמונות שבה האזימוט השתנה באופן מדורג ב-5°, יחד עם מרכזי התמונה (צלבים ירוקים) וצנטרואידי הפן (עיגולים אדומים). (B) דיאגרמת וורונוי של הצנטרואידים הפאתטיים, עם מרכזי התמונה כמו ב- A. סרגל קנה המידה 100 μm חל על לוחות A ו- B. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתן לשרטט את ההתפלגות המרחבית של הצירים החזותיים של עיני הבית באמצעות תופעת הפסאודו-פופיל של עיניים מורכבות ושינויי ההשתקפות הנגרמים על ידי מנגנון האישון התלוי באור. לכן, זבוב נחקר מותקן במערכת גוניומטרית, המאפשרת בדיקה של תבנית הפאה המקומית עם מערך מיקרוסקופ המצויד במצלמה דיגיטלית, הכל בשליטת מחשב. ניתוח תמונות מניב מפות עיניים. קושי חיוני שנתקלים בו הוא שללא מיקום זהיר של העין בתחילת המדידות, המיקומים הנצפים הן של העין והן של הפסאודו-פופיל יכולים להשתנות במידה ניכרת גם עם סיבובים קטנים של המכשיר הגוניומטרי. שינויים אלה ממוזערים על ידי מיקום מרכז העין במרכז הסיבוב הגוניומטרי, שם נצפה פסאודופופיל עמוק. על-ידי קורלציה בין התמונות שנמדדו לאחר מכן, ניתן לעקוב אחר תבנית הפאה. חשוב לציין, יש להתאים את זווית הסיבוב לערך קטן למדי מכיוון שבאזורים שבהם תבנית הפאה היא רגולרית מאוד, הליך המתאם נוטה לתוצאות שגויות.
כאן הצגנו מפת עיניים חלקית (איור 8), המדגימה את ההיתכנות של מיפוי אוטומטי מאוד של חדות הראייה בעיני החרקים. הזוויות הבין-אומטידיאליות של כ-2.0°-2.5°, הניכרות מהשוואת מרווחי הפאות לתזוזות של 5° בין מרכזי תמונה עוקבים, תואמות היטב לנתונים שנגזרו בעבר, באופן מייגע הרבה יותר, מאותו המין (Musca domestica)25. מפות עיניים מלאות של המרחב החזותי של זבובי בית וחרקים אחרים יפורסמו במקומות אחרים.
השיטה המוצגת כאן מאפשרת למפות את הצירים החזותיים של עין שלמה, in vivo, תוך שעות ספורות בלבד, שיהיה קשה מאוד להשיג עם גישות אחרות. שיטת הגרפים האוטומטית מומחשת כאן למקרה של ה-housefly, אך ניתן פשוט להרחיב אותה לעיניים המורכבות של חרקים אחרים, כגון פרפרים. עם זאת, במקום השתקפות האישון, עין הפרפר משמשת כסמן ציר הראייה21,24. שיטה חלופית היא מיקרוטומוגרפיה של קרני רנטגן שפותחה לאחרונה26. גישה רבת ערך זו מניבה מפות אנטומיות מפורטות, אך היא חשופה לשגיאות אופטיות, במיוחד כאשר הצירים החזותיים של האומטידיה מוטים אל פני השטח של העין21, או אם עיבוד רקמות מעוות את הגיאומטריה של העין מספיק כדי לפגוע במדידות. ההדמיה של הפסאודו-פופיל פשוטה פחות או יותר בעיניים זבוביות שיש להן מנגנון אישון מבריק. זה פחות קל בעיניים מורכבות עם מנגנון אישון משקף בצורה גרועה, כמו, למשל, בדבורים21. עם זאת, עבור מיני חרקים רבים אחרים, כגון זבובי חיילים או דבורים, ניתן להשתמש בפלואורסצנטיות של הפיגמנטים החזותיים ברהבדומים האומטידיאליים. היישום של פלואורופורים היוצרים פלואורסצנציה רבדומית חזקה מציע הזדמנות נוספת להעריך את הארגון המרחבי של מרחב הראייה של העין27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לדווח עליהם.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך כספית על ידי משרד המחקר המדעי של חיל האוויר / המשרד האירופי למחקר ופיתוח תעופה וחלל AFOSR / EOARD (מענק FA9550-15-1-0068, ל- D.G.S.). אנו מודים לד"ר פרימוז' פיריה על דיונים מועילים רבים ולקהאן סאטו, היין לרטאוור ואוסקר רינקון קרדניו על הסיוע.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision of amplified images and digital communication with PC |
| High power star LED | Velleman | LH3WW | Light source for observation and imaging the compound eye |
| Holder for the investigated fly | University of Groningen | Different designs were manufactured by the university workshop | |
| Linear motor | ELERO | ELERO Junior 1, version C | Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A) |
| Low temperature melting wax | various | The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder | |
| Microscope | Zeiss | Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x | |
| Motor and LED Controller | University of Groningen | Z-o1 | Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies. |
| Motorized Stage | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom. |
| Optical components | LINUS | Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| PC running MATLAB | University of Groningen | The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system | |
| Power Supply (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Lithuania) | PUP120-17 | Dedicated power supply for the STANDA motor controllers |
| Soldering iron | various | Used for melting the wax | |
| Stepper and DC Motor Controller | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly |
| Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes. | Programming language used to implement the algorithms |
References
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M.
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002 (2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168 (2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782 (2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613 (2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267 (2021).
