Summary
ここでのプロトコルは、擬似瞳孔現象と視細胞の瞳孔機構を用いて、自動装置によってマッピングされたイエバエの目の視覚軸の空間的組織化の測定を記述する。
Abstract
本稿では、昆虫複眼の視覚軸の空間的組織化の自動測定について述べるが、これはオンマチディアと呼ばれる数千の視覚単位からなる。各オンマチジウムは、視軸を中心とするおおよそのガウス分布感度(1°程度の半値幅)で、小さな立体角から光学情報をサンプリングします。一緒に、ommatidiaはほぼパノラマの視野から視覚情報を収集します。したがって、視覚軸の空間分布は、目の空間分解能を決定する。複眼の光学的組織化とその視力に関する知識は、視覚情報の神経処理の定量的研究にとって極めて重要である。ここでは、内在的な 生体内 光学現象、疑似瞳孔、および視細胞の瞳孔機構を使用して、複眼の視覚軸をマッピングするための自動化された手順を提示する。昆虫の目をスキャンするための光力学的セットアップを概説し、イエバエ、 Musca domesticaから得られた実験結果を使用して、測定手順のステップを説明します。
Introduction
昆虫の視覚システムのコンパクトさとその所有者の敏捷性は、高度に発達した視覚情報処理を実証し、科学的背景と非科学的背景の両方から人々を魅了してきました。昆虫複眼は、急性で汎用性の高い視覚能力を可能にする強力な光学デバイスとして認識されています1,2。例えば、ハエは動く物体に対する反応が速いことでよく知られており、ミツバチは色覚と偏光視力を持つことで有名です2。
節足動物の複眼は、解剖学的に類似した多数の単位、オマチジアで構成され、それぞれがファセットレンズによってキャップされている。双翅目(ハエ)では、角膜として総称されるファセットレンズの集合体は、しばしば半球に近似する。各オンマチジウムサンプルは、半値幅が1°程度の小さな立体角から光を入射します。2つの目のオンマチディアは、ほぼ完全な立体角をサンプリングしますが、オンマチディアの視覚軸は均等に分布していません。特定の目の領域は視覚軸の密度が高く、口語的に中心窩と呼ばれる高い空間的鋭敏さの領域を作り出します。次に、眼の残りの部分は、より粗い空間分解能3,4,5,6,7,8,9を有する。
複眼の光学的組織化の定量的分析は、視覚情報の神経処理の詳細な研究にとって極めて重要である。昆虫の脳10のニューラルネットワークの研究は、しばしばオマチジウム軸の空間分布の知識を必要とする。さらに、複眼はいくつかの技術革新に影響を与えました。バイオにインスパイアされた人工眼を製造するための多くのイニシアチブは、実際の複眼の既存の定量的研究に基づいて構築されています11,12,13。例えば、高空間分解能の半導体ベースのセンサは、昆虫複眼11,14,15,16,17のモデルに基づいて設計されました。しかし、これまでに開発された装置は、既存の昆虫の目の特徴を実際に実装していない。昆虫の複眼とその空間的構成を正確に表現するには、自然の目からの詳細で信頼性の高いデータが必要ですが、これは広くは利用できません。
データの不足の主な理由は、目の空間特性をチャート化するための利用可能な手順の極端な退屈さです。これにより、より自動化されたアイマッピング手順を確立しようとする試みが動機付けられました。昆虫の複眼の自動分析の最初の試みで、DouglassとWehling18 は角膜のファセットサイズをマッピングするためのスキャン手順を開発し、いくつかのハエ種でその実現可能性を実証しました。ここでは、角膜のファセットをスキャンするだけでなく、ファセットが属するオマチディアの視覚軸を評価する方法を開発することによって、彼らのアプローチを拡張します。私たちは、関連する手順を例示するためにイエバエの目の例を提示します。
昆虫の目をスキャンするための実験セットアップは、部分的に光学的、すなわち、カメラおよび照明光学系を備えた顕微鏡である。部分的に機械的、すなわち、調査された昆虫を回転させるためのゴニオメータシステム;部分的に計算された、すなわち、測定および分析を実行するための機器およびプログラム用のソフトウェアドライバの使用。開発された手法は、画像のキャプチャ、カメラチャンネルの選択、画像処理のしきい値の設定から、凸面から反射された光の輝点 を介した 個々のファセット位置の認識まで、さまざまな計算手順を網羅しています。フーリエ変換法は、個々のファセットの検出とファセットパターンの解析の両方において、画像解析において極めて重要であった。
論文の構成は以下の通りです。まず、実験セットアップと疑似瞳孔現象、すなわち生きた目の光受容体の視覚軸を識別するために使用される光学マーカーを紹介する19,20,21.続いて、スキャン手順と画像解析で使用されるアルゴリズムの概要を説明します。
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Protocol
プロトコルは、大学の昆虫ケアガイドラインに準拠しています。
1.イエバエ、ムスカドメカの準備
- 実験室で飼育された人口からハエを集める。フライを真鍮ホルダーに入れます(図1)。
- 拘束チューブの上部から6 mm切ります(材料表を参照)。チューブの新しい上部の外径は4mm、内径は2.5mmです(図1A)。生きたフライをチューブの中に置き、フライを傷つけないようにチューブを綿で密封し、頭がチューブから突き出して体が拘束されるようにフライを押します(図1B)。目が覆われていないままになるように、ミツロウで頭を固定します(図1C-E)。
- チューブの長さが10mmになるようにチューブをもう一度切断します(図1C)。フライの入ったプラスチックチューブを真鍮ホルダーに置き、ホルダーが卓上に置かれているときにフライの片目が上を向くようにします(図1D、E)。
- ゴニオメーターの仰角を0°にすると(すなわち、方位角ステージが水平位置にある)、顕微鏡の垂直照明ビームが中央領域、腹側と背側の間、および眼の前縁と後縁の間において眼の表面に垂直になるようにチューブの向きを調整し、セットアップによって許容される方位角および仰角の範囲内で眼全体をスキャンすることができる。
2. ゴニオメーターの回転方位軸と顕微鏡の光軸のアライメント
- アライメントピンを方位角回転ステージに取り付けて、先端のx-y位置が電動ステージの方位軸と一致するように調整できるようにします。5倍対物レンズを備えた顕微鏡で見ながら、z軸ジョイスティックを使用して先端に焦点を合わせます(図2)。
- X軸とY軸のジョイスティックを使用して、方位角軸のx-y調整を顕微鏡の光軸に合わせ、仰角と方位角の回転軸が中央のピンにあらかじめ揃っていることを確認します。
- 方位角ジョイスティックと仰角ジョイスティックを操作して、ピンが両方の自由度に対して中央にあるかどうかを確認します。ピン先を十分に中央に配置すると、方位角と仰角の回転中は、ピン先端はほぼ同じ位置にとどまります。
3. フライアイと電動ステージのアライメント
- 仰角ステージを0°にして、フライとそのホルダーを方位角ステージに取り付けます。顕微鏡でハエの目を観察します。
- 照明LEDを点灯させた状態で、擬似瞳孔の中心が顕微鏡に揃うようにフライの水平位置を調整します。ホルダーの回転スクリュー(図1D)を使用してフライの垂直位置を調整し、深い擬似瞳孔(DPP;図3)19、20、21 は標高軸のレベルでフォーカスが当てられます。
- DPP を視野の中央に配置して、方位角軸と仰角軸に対して DPP を合わせます ( 図 2 参照)。フライホルダーの底部に接着された磁石を使用して、方位角ステージに取り付けられた鉄板にしっかりと固定し、手動でスライド調整することができます。
- 顕微鏡に装着したデジタルカメラに視点を切り替えます。GRACEシステムのソフトウェア初期化を実行します。これには、モータコントローラとArduinoのLEDコントローラの初期化が含まれます(図4)。したがって、MATLAB R2020a以上のバージョンを開きます。MATLAB スクリプト をInitialize_All_Systems 実行します (補足ファイル 1)。
- ハエの擬似瞳孔(図3B、C)がコンピュータ画面に投影された画像の中心にあるかどうかを確認します。
4. オートフォーカスとオートセンタリング
- 角膜偽瞳孔のレベルに焦点を合わせる (CPP;図3B) 19,20,21 Z軸ジョイスティックを使用して手動で。
- オートフォーカスアルゴリズム(補足ファイル1、スクリプトAF)を実行して、角膜レベルで鮮明な画像を取得します。電動Z軸段を調整して、焦点をDPPレベルに戻して確認します。DPP と CPP の間の距離を (モーター ステップ単位で) 格納します。
- オートセンタリングアルゴリズム(補足ファイル1、スクリプトAC)を実行して、疑似瞳孔センタリングを微調整します。フォーカスを CPP レベルに戻します。
- オートフォーカスアルゴリズムを再実行します。電動ステージを現在の位置 (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0,0) でゼロにします (E は標高、A は方位角)。
- スキャンアルゴリズム(補足ファイル1、スクリプトScan_Begin)を実行し、オートセンタリングアルゴリズムとオートフォーカスアルゴリズムを実行しながら、軌道に沿って目の画像を5°ステップでサンプリングします。
- サンプリングが終了したら、LEDコントローラとモータコントローラの電源を切ります。
- 画像処理アルゴリズム (補足ファイル 1、スクリプト ImProcFacets) を適用して画像を処理します。
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Representative Results
動物と光刺激
実験は、フローニンゲン大学の進化遺伝学部によって維持されている培養物から得られたイエバエ(Musca domestica)に対して行われる。測定の前に、ハエは、よくフィットするチューブ内の低融点ワックスで接着することによって固定化される。フライはその後、電動ゴニオメーターのステージに取り付けられます。2つの回転ステージの中心は、顕微鏡セットアップ24の焦点と一致する。落射照明光ビームは、ハーフミラー を介して フライの目で撮像されるダイアフラムに光を集光する光源によって供給される。したがって、それは、制限された光受容体細胞のセットの瞳孔機構を活性化する(図3)。これらの感光体を保有するオンマチディアの光軸は、ハエを小さなステップで回転させ、各ステップの後に顕微鏡にカラーデジタルカメラを取り付けて写真を撮ることによって評価されます(図2)。瞳孔色素顆粒は主に長波長域で反射するため、デジタルカメラの赤色チャネルを使用して、ファセットレンズの反射から疑似瞳孔を区別する。後者の反射は、カメラの青色チャンネルを使用して疑似瞳孔から分離するのが最適です。
オートフォーカスとオートセンタリングアルゴリズム
昆虫の目をスキャンする際に使用される主な追加アルゴリズムは、オートフォーカスとオートセンタリング(補足ファイル1、スクリプトAFとAC)です。オートフォーカスの目的は、個々のommatidiaの識別に必要なファセット反射を検出するために、角膜レベルをカメラの焦点に合わせることです(図3B)。角膜レベルを検出する手順は、各レベルで撮影された画像に高速フーリエ変換(FFT)を適用して空間周波数成分を決定することによって、フライの垂直(Z)位置を段階的に変更することです。最適なフォーカスの基準は、低周波カットオフを超える最大合計電力を持つレベルです。
オートフォーカスの入力は、Z位置とカメラからのストリーミングビデオです。出力は、画像SFの高周波成分と、SFが最大であるフォーカスレベルZの積分です。最初のステップでは、カメラ画像のZ位置が角膜ファセットレンズのわずかに下になるように調整され、画像の周波数成分を決定するための関心領域が設定される。forループは画像キャプチャを開始し、ハイパスフィルタリングされたフーリエ変換SFの合計を計算します。次に、z軸モータを角膜の上の画像レベルまで上方にステップすることにより、最も高い周波数を有するレベル、すなわちSFが最大であるレベルが見出され、これは角膜レベルとみなされる。次に、z軸モーターがそのレベルに調整され、画像が撮影されます。
角膜から眼の曲率中心のレベルに向かって焦点を合わせると、角膜ファセット反射は消え、擬似瞳孔反射は典型的な7ドットパターンに合体し、これはハエの腫瘍内の光受容体の組織化の特徴である(図3C;パターンはほぼ球形の眼領域でのみ区別されることに注意してください)。眼の曲率中心レベルのパターンは、深部擬似瞳孔(DPP)19,21と呼ばれます。
XモーターとYモーターでステージに配置されたフライをシフトして、ライトスポットの中心がカメラ画像の中心と一致するようにすることは、オートセンタリングと呼ばれます。この手順では、視覚軸がDPPの中心にあるオンマチジウムのファセットを、顕微鏡およびカメラの照明ビームおよび光軸に合わせる。画像はガウスフィルタリングされ、二値化され、次に、擬似瞳孔の中心が regionprops MATLAB関数を使用して決定される。入力は、XモーターとYモーターの位置とカメラからのストリーミングビデオです。出力は、画像の中心と疑似瞳孔の間の距離であり、その後、ステージシフトに変換されます。
画像の関連付け
オートフォーカスおよびオートセンタリング手順の後、ゴニオメーター標高θおよび方位角φのさまざまな値で写真を撮影して保存することによって、眼がスキャンされます。2次元相関は、連続する画像間のx-yシフトを決定するために使用されます。異なる角度位置で得られた画像を相関させるためには、これは一般に、前の画像に対する現在の画像の回転をもたらすことを認識することが不可欠である。たとえば、初期画像の中心が球の点C(図5)に対応し、方位角の変化が起こり、平面OABが小さな角度Δφ上で回転して平面OA'Bになったとします。その後、画像の中心が点CからC'点に変わります(図5)。カメラの画像面がベクトルOCに対して垂直である場合、平面OABをOA'Bに回転させると、β = CC'⁄BC、CC' = CDΔφ、cosθ = CD⁄BCのように、β = Δφ cosθの角度にわたって画像が回転します(図5)。これは、球の上部(θ = 0°)ではβ = Δφ、赤道(θ = 90°)ではβ = 0°であることを意味します。Δφ=0°の場合、すなわち標高θのみが変化すると、画像は互いに回転しないので、β=0°となる。
スキャン手順の間、オートセンタリング手順は、視覚軸が測定システムの光軸と整列しているオマチジウムを中心とする。方位角の回転は、β角度による回転とファセットパターンの平行移動を引き起こします。後者のシフトを決定するために、 図6で説明するように、2つの連続する画像が相関されます(最初に最初の画像を回転角度βで回転させた後)。
イメージ シフト アルゴリズム (補足ファイル 1、スクリプト ImProcFacets) では、個々のファセットは、各イメージ内の反射の重心によって識別されます。アルゴリズムへの入力は、仰角と方位角、評価する画像のセット、画像チャンネル、および関心領域です。このアルゴリズムは、一連の重心と、スキャン手順中に撮影されたすべての相関画像を含む最終画像を生成します。
ゴニオメトリックシステム
照明とのアライメントを達成するためには、ハエの眼は角膜ファセットレンズに焦点を合わせて撮影する必要があり、疑似瞳孔は頻繁に(ここでは、5°の回転ごとに)再センタリングされなければならない。この自動プロセスは、 図4に模式的に示すGRACEシステム(複眼用ゴニオメトリック研究装置)によって実現されます。これは、電気機械ハードウェアとしてそれぞれの電子機器を備えた下段と上段、物理コントローラに埋め込まれたファームウェア、およびアルゴリズムを実装するソフトウェアを操作するために使用されるPCの3つの主要なサブシステムで構成されています。ハードウェアは、電動ステージと光学ステージ、デジタルカメラ、LED強度をプログラミングするためのマイクロコントローラ、および白色LED光源で構成されています。ファームウェアのルーチンは、モータコントローラ、LEDコントローラ、およびデジタルカメラに付属しています。このソフトウェアは、モータの位置と速度の制御、LEDの調整、画像の取得と解析のためのアルゴリズムで構成されています。次に説明するアルゴリズムは、GRACEシステムが昆虫の目をスキャンできるようにする主要なマイルストーンを表しています。
フライアイと疑似瞳孔
イエバエの目が照らされると、入射光は、細胞体内の可動性黄色の色素顆粒のシステムである視細胞の瞳孔機構を活性化する。このシステムは、光受容体の光形質導入プロセスを誘発する光束を制御し、したがって、人間の眼における瞳孔と本質的に同じ機能を有する19,20。瞳孔機構の活性化は、顕微鏡の対物レンズの開口部に面した眼領域において局所的に増強された反射を引き起こす(図3)。明るく反射する眼領域、擬似瞳孔19、20、21の位置は、入射光が次に異なる光受容体細胞のセットにおいて瞳孔機構を活性化するので、眼の回転時に変化する(図6参照)。したがって、擬似瞳孔は、顕微鏡と整列しているオンマチディアの視覚軸のマーカーとして作用する。これにより、眼の視覚軸4、20、21、22、23の空間分布のマッピングが可能になる。
欠落しているファセットの入力
たとえば、表面のわずかな凹凸やほこりの斑点によって引き起こされる局所反射率が低いため、すべてのファセットが重心手順によって識別されるわけではありません。後者は、誤った重心をもたらすこともあります(図7A)。この問題は、まず水道の蛇口で目を洗うことで解決され、次に充填手順 (スクリプト ImProcFacets) を適用することで解決されます。したがって、エリア内の重心が最初に決定され(図7A)、次にFFTが計算されます(図7B)。高調波の最初のリング(図7Bの黄色の星)は、青、赤、緑の線で示される3つの方向を定義します(図7B)。3つの方向に沿った高調波の逆変換は、図7C-Eの灰色のバンドを生成します。2 次多項式を灰色のバンドに当てはめると、3 つの格子軸に沿ってファセット重心を結ぶ線が生成されます。したがって、格子線の交差点は、真のファセット中心に対応します。図 7 の例は極端なケースであるため、手順が堅牢であることを示しています。ほとんどの領域で、ファセットの欠落や誤った重心はまれです。
フライアイのスキャン
図8は、Δφ = 5°で一連の段階的な方位角変化を実行することによって、眼全体でスキャンされたオンマチジアのバンドを示しています。走査は、眼の前頭側(図8A、右)から側方側(図8A、左)まで、24ステップで起こった。大きく重なり合ったファセットパターンの重心は、その後、β = Δφcosθ で回転しました。次に、各画像の重心をシフトし、欠落しているファセットを (スクリプト ImProcFacets を使用して) 埋めた後、共局在化された重心を平均化しました。図8Aは、画像中心およびファセット重心と共に、結合された画像を示す。図8Bは、ファセットのアセンブリをボロノイ図として示している。
図1:真鍮ホルダーにフライを取り付ける 。(A)調査対象のイエバエの先端。(B)ハエで切った先端を、綿一枚と箸でそっと端まで押した。(C)フライの先端を全長10mmにさらに切断する(D)ゴニオメーターステージに置かれるフライを備えた真鍮ホルダー。矢印は高さ調整ネジを指しています。(E)先端に低温溶融ワックス(#)片で頭を固定したハエのクローズアップ写真(*)。落射照明は、黄色の擬似瞳孔によって明らかにされるように、眼の光受容体の瞳孔機構を活性化した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:GRACE、複眼のためのゴニオメトリック研究装置。 調査された昆虫(フライ)は、3つの平行移動段階(X、Y、Z)と2つの回転段階(仰角および方位角)からなる電動段階に取り付けられる。レンズは、白色LEDからの光をダイアフラムに集光し、ハーフミラー を介して フライの目に集光します。顕微鏡に取り付けられたカメラで目を撮影します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:フライアイの光学系。(A)フライアイの3つのオンマチディアの図で、それぞれが両凸ファセットレンズで覆われており、入射光を一次(茶色)と二次(赤)の色素細胞に囲まれた一連の視細胞(黄色)に集光します。暗回帰(DA)感光体の強い照明は、光受容体細胞の内部に存在する黄色の色素顆粒(黒い点で示す)の移動を引き起こす。光受容体の先端に向かって蓄積され、光感受性オルガネラの近く、ラブドメアは、光適応(LA)状態で光を吸収および後方散乱する。(b)眼表面のレベルにおける画像、ファセット反射(明るいドット)ならびに活性化状態における色素顆粒反射(角膜偽瞳孔、CPP)を示す。(C)視細胞の台形パターンにおける配置を反映した眼湾曲中心(深部疑似瞳孔DPP)のレベルで撮影された画像で、遠位端がファセットレンズの焦点面付近に位置する。したがって、感光体先端の重畳された虚像は、眼湾曲中心の平面に存在する。スケールバー100μmはパネルBとCに適用されます。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
図4:GRACEシステムの概略図。 PCソフトウェアはファームウェアを制御し、電気機械式ハードウェアを駆動します。デジタルカメラは、光学ステージ を介して 、標本の目の画像を撮影します。LED光源は試料を照らし、電動ステージのモーターはX、Y、Zの平行移動、方位角(A)と仰角(E)の回転を作動させます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:フライアイをスキャンする際の画像回転を導出するための図。初期画像の中心が球の点Cに対応し、方位角の変化が生じた場合、平面OABは小さな角度Δφ上で回転し、平面OA'Bとなる。その後、画像の中心が点 C から点 C' に変わります。平面 OAB から OA'B への回転は、β = Δφ cosθ の角度にわたって画像の回転を引き起こします (テキスト、画像の相関のセクションを参照)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:体間角を決定するための画像処理手順 。(A)目を横切ってスキャン中に撮影された画像で、ファセット重心は緑色の円と赤色の正方形でマークされ、画像の中心には緑色の点があります。(B) 5°の方位角回転後の後続の画像で、ファセットの重心は赤い四角でマークされ、画像の中心に赤い点があります。(C)Aの緑色の正方形内の領域のコレログラムは、画像Bと相関する。Cの中心(緑色の点)からコレログラムの最大値までのベクトルは、画像AとBの相対的なシフトを表します。そのベクトルを使用して、シフトしたAの正方形とその中心がBに描画され、Bのファセット重心(赤い正方形)がAに追加されます。 スケールバー100μmはパネルA〜Cに適用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:フーリエ変換を適用して欠落しているファセット重心を導出する。(A)ファセット重心(赤い点)を持つローカルRGB画像。白い矢印はファセットが欠落していることを示し、赤い矢印は誤った重心を指しています。(B) 黄色い星でマークされた高調波の最初の環を持つAの重心のFFT。(C-E)B の色付きの線で示される 3 つの方向に沿った重心の逆 FFT は、灰色がかったバンドを生成します。青 (C)、赤 (D)、緑 (E) の線は灰色のバンドに収まる 2 次多項式であり、重心 (赤の円) はフーリエ変換の前に得られたものです。(F) C-E の適合線を A の重心と組み合わせたもの。欠落しているファセット重心は、交差点から導出されます。スケールバー100μmは、パネルA、C-Fに適用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:イエバエの右目は、片側から反対側にスキャン しました。(A)方位角が5°ずつ段階的に変化した一連の画像と、画像中心(緑色の十字)とファセットの重心(赤い円)を組み合わせたものです。(B) ファセット重心のボロノイ図で、画像中心はA. スケールバー 100 μm がパネル A とパネル B に適用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
イエバエの目の視覚軸の空間分布は、複眼の擬似瞳孔現象と光依存の瞳孔機構による反射変化を用いてチャート化することができる。したがって、調査されたハエはゴニオメトリックシステムに取り付けられ、デジタルカメラを備えた顕微鏡セットアップで局所的なファセットパターンを検査することができ、すべてコンピュータの制御下で行われる。画像解析により、アイマップが生成されます。遭遇する本質的な困難は、測定の開始時に眼を慎重に位置決めしなければ、ゴニオメトリック装置の小さな回転であっても、眼と疑似瞳孔の両方の視認位置がかなり変化する可能性があることである。これらの変化は、深い疑似瞳孔が観察されるゴニオメトリック回転中心に眼中心を配置することによって最小限に抑えられる。その後に測定された画像を相関させることによって、ファセットパターンを追跡することができる。重要なのは、ファセットパターンが非常に規則的な領域では、相関手順が誤った結果になりやすいため、回転角度をかなり小さな値に調整する必要があることです。
ここでは、昆虫の目における視力の高度に自動化されたマッピングの実現可能性を示す部分的なアイマップ(図8)を提示した。ファセット間隔と連続する画像中心間の5°シフトを比較すると明らかな約2.0°-2.5°の対間角度は、以前に同じ種(Musca domestica)からはるかに面倒な方法で派生したデータによく対応しています25。イエバエや他の昆虫の視覚空間の完全なアイマップは、他の場所で公開されます。
ここで提示する方法は、イン ビボで、わずか数時間以内に完全な眼の視覚軸をマッピングすることを可能にするが、これは他のアプローチで達成することは極めて困難であろう。自動化されたチャート作成方法は、イエバエの場合のためにここで示されていますが、それは単に蝶のような他の昆虫の複眼に拡張することができます。しかしながら、瞳孔反射の代わりに、蝶のアイシャインは、次に、視軸マーカ21、24として機能する。別の方法は、最近開発されたX線マイクロトモグラフィー26である。この貴重なアプローチは、詳細な解剖学的マップをもたらすが、光学誤差、特に、ommatidiaの視覚軸が眼表面21に歪んでいる場合、または組織処理が測定を損なうほど眼の幾何学的形状を歪める場合、光学誤差に対して脆弱である。擬似瞳孔の視覚化は、光沢のある瞳孔機構を有するフライアイでは多かれ少なかれ単純である。これは、例えばミツバチ21のように、反射の悪い瞳孔機構を有する複眼では容易ではない。しかし、兵士のハエやミツバチなどの他の多くの昆虫種では、オマチジウム横紋の視覚色素の蛍光を使用することができます。強い横紋蛍光を作り出す蛍光色素の適用は、眼の視覚空間27の空間的組織を推定する別の機会を提供する。
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Disclosures
著者らには報告すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、空軍科学研究局/欧州航空宇宙研究開発局AFOSR/EOARD(助成金FA9550-15-1-0068、D.G.S.)の財政的支援を受けた。多くの有益な議論をしてくれたプリモシュ・ピリ博士、そしてケハン・サトゥ、ハイン・リールトゥーワー、オスカー・リンコン・カルデーニョの支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision of amplified images and digital communication with PC |
| High power star LED | Velleman | LH3WW | Light source for observation and imaging the compound eye |
| Holder for the investigated fly | University of Groningen | Different designs were manufactured by the university workshop | |
| Linear motor | ELERO | ELERO Junior 1, version C | Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A) |
| Low temperature melting wax | various | The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder | |
| Microscope | Zeiss | Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x | |
| Motor and LED Controller | University of Groningen | Z-o1 | Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies. |
| Motorized Stage | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom. |
| Optical components | LINUS | Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| PC running MATLAB | University of Groningen | The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system | |
| Power Supply (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Lithuania) | PUP120-17 | Dedicated power supply for the STANDA motor controllers |
| Soldering iron | various | Used for melting the wax | |
| Stepper and DC Motor Controller | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly |
| Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes. | Programming language used to implement the algorithms |
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