Summary
여기서 프로토콜은 광수용체 세포의 유사 동공 현상 및 동공 메커니즘을 사용하여 자동 장치에 의해 매핑 된 집파리 눈의 시각적 축의 공간 조직의 측정을 설명합니다.
Abstract
이 논문은 ommatidia라고 불리는 수천 개의 시각 단위로 구성된 곤충 복합 눈의 시각 축의 공간 조직의 자동 측정을 설명합니다. 각 옴마티듐은 시각적 축을 중심으로 대략 가우시안 분포 감도(1° 정도의 절반 너비)를 사용하여 작은 고체 각도에서 광학 정보를 샘플링합니다. 함께 옴마티디아는 거의 파노라마 시야에서 시각 정보를 수집합니다. 따라서 시각적 축의 공간 분포는 눈의 공간 해상도를 결정합니다. 복합 눈의 광학 조직과 시력에 대한 지식은 시각 정보의 신경 처리에 대한 양적 연구에 중요합니다. 여기서 우리는 광수용체 세포의 본질적인, 생체 내 광학 현상, 의사 동공 및 동공 메커니즘을 사용하여 복합 눈의 시각 축을 매핑하기위한 자동화 된 절차를 제시합니다. 우리는 곤충 눈을 스캔하기위한 광역학적 설정을 간략하게 설명하고 집파리, Musca domestica에서 얻은 실험 결과를 사용하여 측정 절차의 단계를 설명합니다.
Introduction
곤충 시각 시스템의 컴팩트 함과 고도로 발달 된 시각 정보 처리를 보여주는 소유자의 민첩성은 과학적 배경과 비 과학적 배경을 가진 사람들에게 흥미를 불러 일으켰습니다. 곤충 복합 눈은 급성 및 다재다능한 시각 능력 1,2을 가능하게하는 강력한 광학 장치로 인식되었습니다. 예를 들어, 파리는 움직이는 물체에 대한 빠른 반응으로 잘 알려져 있으며, 꿀벌은 색각과 편광 비전2를 가진 것으로 유명합니다.
절지 동물의 복합 눈은 해부학적으로 유사한 수많은 단위 인 옴마티디아 (ommatidia)로 구성되며, 각각은 패싯 렌즈로 덮여 있습니다. Diptera (파리)에서는 각막으로 통칭되는 패싯 렌즈의 조립이 종종 반구에 근사합니다. 각 옴마티듐은 1° 정도의 반폭을 갖는 작은 고체 각도에서 입사광을 샘플링합니다. 두 눈의 옴마티디아는 대략 전체 고체 각도를 샘플링하지만 옴마티디아의 시각적 축은 고르게 분포되어 있지 않습니다. 특정 눈 영역에는 시각적 축의 밀도가 높기 때문에 구어체로 fovea라고 불리는 높은 공간 예민한 영역을 만듭니다. 눈의 나머지 부분은더 거친 공간 해상도 3,4,5,6,7,8,9를 갖습니다.
복합 눈의 광학 조직에 대한 정량적 분석은 시각 정보의 신경 처리에 대한 자세한 연구에 중요합니다. 곤충의 뇌의 신경 네트워크에 대한 연구10은 종종 옴마티드 축의 공간 분포에 대한 지식을 필요로합니다. 또한, 복합 눈은 몇 가지 기술 혁신에 영감을 불어 넣었습니다. 바이오에서 영감을 얻은 인공 눈을 생산하기위한 많은 이니셔티브는 실제 복합 눈11,12,13에 대한 기존의 양적 연구에 기반을두고 있습니다. 예를 들어, 높은 공간 분해능을 가진 반도체 기반 센서는 곤충 화합물 눈 11,14,15,16,17의 모델을 기반으로 설계되었습니다. 그러나 지금까지 개발 된 장치는 기존 곤충 눈의 실제 특성을 구현하지 못했습니다. 곤충 복합 눈과 공간 조직의 정확한 표현은 광범위하게 이용 가능하지 않은 자연 눈의 상세하고 신뢰할 수있는 데이터가 필요합니다.
데이터가 부족한 주된 이유는 눈의 공간 특성을 차트화하는 데 사용할 수있는 절차의 극단적 인 지루함 때문입니다. 이것은 더 자동화 된 눈 매핑 절차를 수립하려는 시도에 동기를 부여했습니다. 곤충 복합 눈의 자동 분석에 대한 첫 번째 시도에서 Douglass와 Wehling18 은 각막의 패싯 크기를 매핑하기위한 스캐닝 절차를 개발하고 몇 가지 비행 종에 대한 타당성을 입증했습니다. 여기서 우리는 각막의 측면을 스캔하는 것뿐만 아니라 패싯이 속한 옴마티디아의 시각적 축을 평가하는 방법을 개발함으로써 접근 방식을 확장합니다. 우리는 관련된 절차를 예시하기 위해 집파리의 눈을 제시합니다.
곤충 눈을 스캔하기위한 실험 설정은 부분적으로 광학, 즉 카메라 및 조명 광학이있는 현미경입니다. 부분적으로 기계적, 즉 조사된 곤충을 회전시키기 위한 고니오미터 시스템; 부분적으로 계산, 즉 측정 및 분석을 실행하기위한 계측기 및 프로그램을위한 소프트웨어 드라이버의 사용. 개발된 방법에는 이미지 캡처, 카메라 채널 선택, 이미지 처리 임계값 설정부터 볼록한 표면에서 반사되는 밝은 반점을 통해 개별 패싯 위치를 인식하는 것까지 다양한 계산 절차가 포함됩니다. 푸리에 변환 방법은 개별 패싯을 감지하고 패싯 패턴을 분석하는 데 모두 이미지 분석에서 매우 중요했습니다.
논문은 다음과 같이 구성되어 있습니다. 우리는 먼저 실험 설정과 의사 동공 현상 - 살아있는 눈에서 광수용체의 시각 축을 식별하는 데 사용되는 광학 마커 19,20,21을 소개합니다. 그 후, 스캐닝 절차 및 이미지 분석에 사용되는 알고리즘이 요약됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜은 대학의 곤충 관리 지침에 따라 진행됩니다.
1. 하우스 플라이의 준비, 무스카 국내
- 실험실에서 사육 된 인구에서 파리를 수집하십시오. 플라이를 황동 홀더에 놓습니다(그림 1).
- 구속 튜브의 윗부분에서 6mm를 자릅니다 (재료 표 참조). 튜브의 새로운 상부는 4mm의 외부 직경과 2.5mm의 내부 직경을 가지고 있습니다 (그림 1A). 살아있는 파리를 튜브 내부에 놓고 파리의 손상을 방지하기 위해 튜브를 면으로 밀봉한 다음 머리가 튜브에서 튀어 나와 몸체가 구속되도록 파리를 밀어 넣습니다 (그림 1B). 눈이 드러나지 않도록 밀랍으로 머리를 고정시킵니다(그림 1C-E).
- 튜브 길이가 10mm가 되도록 튜브를 다시 자릅니다(그림 1C). 플라이가 있는 플라스틱 튜브를 황동 홀더에 놓으면 홀더가 탁상용 위에 놓일 때 파리의 한쪽 눈이 위쪽을 향하도록 합니다(그림 1D,E).
- 고니오미터 고도가 0°(즉, 방위각 단계가 수평 위치에 있음)에 따라, 현미경의 수직 조명 빔이 중앙 영역, 복부와 등쪽 사이, 눈의 전방 및 후방 가장자리 사이에서 눈 표면에 수직이 되도록 튜브의 방향을 조정하여 전체 눈이 설정에 의해 허용되는 방위각 및 고도 범위 내에서 스캔될 수 있도록 합니다.
2. 고니오미터의 자전 방위각 축과 현미경 광축의 정렬
- 방위각 회전 스테이지에 정렬 핀을 장착하여 팁의 xy 위치를 전동 스테이지의 방위각 축과 일치하도록 조정할 수 있습니다. 5x 조준이 장착된 현미경으로 보는 동안 z축 조이스틱을 사용하여 팁에 초점을 맞춥니다(그림 2).
- 방위각 축의 xy 조정을 현미경의 광축에 맞추고 x축 및 y축 조이스틱을 사용하여 고도 및 방위각 회전 축이 중심 핀과 미리 정렬되도록 합니다.
- 방위각과 고도 조이스틱을 조작하여 핀이 자유도에 대해 중앙에 있는지 확인합니다. 중앙에 잘 맞으면 핀 팁은 방위각 및 고도 회전 중에 대략 동일한 위치에 남아 있습니다.
3. 플라이 아이와 전동 스테이지의 정렬
- 고도 단계가 0°인 상태에서 플라이와 홀더를 방위각 단계에 장착합니다. 현미경으로 파리의 눈을 관찰하십시오.
- 조명 LED를 켠 상태에서 플라이의 수평 위치를 조정하여 의사 동공의 중심이 현미경과 정렬되도록 하십시오. 홀더의 회전 나사를 사용하여 플라이의 수직 위치를 조정하고(그림 1D), 깊은 의사 동공(DPP; 그림 3) 19,20,21은 고도축의 수준에서 초점이 맞춰진다.
- DPP를 방위각 및 고도축에 대해 시야각에 중심을 두어 정렬합니다( 그림 2 참조). 플라이 홀더의 바닥에 붙어있는 자석을 사용하여 방위각 단계에 장착 된 철판에 단단히 부착하고 수동 슬라이딩 조정을 허용합니다.
- 뷰를 현미경에 장착된 디지털 카메라로 전환합니다. 모터 컨트롤러 및 Arduino LED 컨트롤러 초기화를 포함하는 GRACE 시스템의 소프트웨어 초기화를 실행합니다(그림 4). 따라서 MATLAB R2020a 이상 버전을 엽니다. MATLAB 스크립트를 Initialize_All_Systems 실행합니다(보충 파일 1).
- 파리의 의사 동공(그림 3B, C)이 컴퓨터 화면에서 투영된 이미지의 중앙에 있는지 확인합니다.
4. 자동 초점 조정 및 자동 중심 설정
- 각막 유사 동공 (CPP; 그림 3B) 19,20,21 z축 조이스틱을 사용하여 수동으로 작업합니다.
- 자동 초점 알고리즘(보충 파일 1, 스크립트 AF)을 실행하여 각막 수준에서 선명한 이미지를 얻습니다. 전동 z축 스테이지를 조정하여 DPP 레벨로 초점을 되돌려 확인하세요. DPP와 CPP 사이의 거리를 저장합니다(모터 단계에서).
- 자동 중심화 알고리즘(보충 파일 1, 스크립트 AC)을 실행하여 의사 동공 중심화를 미세 조정합니다. 초점을 CPP 수준으로 되돌립니다.
- 자동 초점 알고리즘을 다시 실행합니다. 현재 위치(X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0,0)에서 전동 스테이지를 제로로 설정하며, 여기서 E는 고도이고 A는 방위각입니다.
- 자동 센터링 및 자동 초점 알고리즘을 수행하는 동안 5° 단계로 궤적을 따라 눈 이미지를 샘플링하는 검색 알고리즘(보충 파일 1, 스크립트 Scan_Begin)을 실행합니다.
- 샘플링이 끝나면 LED 컨트롤러와 모터 컨트롤러를 끕니다.
- 이미지 처리 알고리즘(보충 파일 1, 스크립트 ImProcFacets)을 적용하여 이미지를 처리합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
동물 및 광학 자극
실험은 흐로 닝겐 대학 (University of Groningen)의 진화 유전학과에서 유지 한 문화에서 얻은 집파리 (Musca domestica)에서 수행됩니다. 측정 전에, 파리는 잘 맞는 튜브에 저융점 왁스로 접착하여 고정시킵니다. 파리는 이후 전동 고니오미터의 무대에 장착됩니다. 두 회전 스테이지의 중심은 현미경 셋업(24)의 초점과 일치한다. 에피 조명 광선은 광원에 의해 공급되며, 광원은 하프 미러를 통해 파리의 눈에 이미지화되는 다이어프램에 빛을 집중시킵니다. 따라서, 이는 제한된 세트의 광수용체 세포의 동공 메커니즘을 활성화시킨다(그림 3). 이러한 광수용체를 품고 있는 옴마티디아의 광학 축은 파리를 작은 단계로 회전시키고 현미경에 부착된 컬러 디지털 카메라로 각 단계 후에 사진을 찍음으로써 평가됩니다(그림 2). 동공 안료 과립은 주로 장파장 범위에서 반사되기 때문에 디지털 카메라의 빨간색 채널은 패싯 렌즈 반사에서 의사 동공을 구별하는 데 사용됩니다. 후자의 반사는 카메라의 파란색 채널을 사용하여 의사 동공과 가장 잘 격리됩니다.
자동 초점 조정 및 자동 센터링 알고리즘
곤충의 눈을 스캔하는 동안 사용되는 주요 추가 알고리즘은 자동 초점 조정 및 자동 중심 지정 (보충 파일 1, 스크립트 AF 및 AC)입니다. 자동 초점 조정의 목표는 각막 수준을 카메라의 초점으로 가져와 개별 옴마티디아를 식별하는 데 필요한 패싯 반사를 감지하는 것입니다(그림 3B). 각막 레벨을 검출하는 절차는 공간 주파수 함량을 결정하기 위해 각 레벨에서 촬영된 이미지에 고속 푸리에 변환(FFT)을 적용하여 단계적으로 플라이의 수직(Z) 위치를 변경하는 것이다. 최적의 초점에 대한 기준은 저주파 차단보다 합산 전력이 가장 큰 레벨입니다.
자동 초점 조정을 위한 입력은 카메라의 Z 위치 및 스트리밍 비디오입니다. 출력은 이미지 SF의 고주파 콘텐츠와 SF가 최대인 초점 레벨 Z의 적분입니다. 초기 단계에서, 카메라 이미지의 Z-위치는 각막 패싯 렌즈보다 약간 낮게 조정되고, 이미지의 주파수 컨텐츠를 결정하기 위해 관심 영역이 설정된다. for 루프는 이미지 캡처를 시작하고 하이패스 필터링된 푸리에 변환 SF의 합을 계산합니다. 그런 다음 z축 모터를 각막 위의 이미지 레벨로 위쪽으로 밟으면 가장 높은 주파수를 가진 레벨, 즉 SF가 최대인 레벨이 발견되며, 이는 각막 레벨로 취해집니다. 그런 다음 Z 축 모터가 해당 레벨로 조정되고 이미지가 촬영됩니다.
각막에서 눈의 곡률 중심 수준으로 초점을 맞출 때, 각막 패싯 반사는 사라지고 의사 동공 반사는 전형적인 일곱 점 패턴으로 합쳐지며, 이는 파리 옴마티디아 내의 광수용체 조직의 특징입니다 (그림 3C; 패턴은 대략 구형의 눈 영역에서만 구별됩니다). 눈의 곡률 수준의 중심에있는 패턴을 깊은 의사 동공 (DPP) 19,21이라고합니다.
조명 지점의 중심이 카메라 이미지의 중심과 일치하도록 X- 및 Y 모터로 스테이지에 위치한 플라이를 이동시키는 것을 자동 센터링이라고합니다. 이 절차는 DPP의 중앙에 있는 시각축이 있는 옴마티듐의 면을 현미경 및 카메라의 조명 빔 및 광축과 정렬합니다. 이미지는 가우시안 필터링되고 이진화된 다음, 유사 동공의 중심은 regionprops MATLAB 함수를 사용하여 결정됩니다. 입력은 X- 및 Y 모터의 위치와 카메라의 스트리밍 비디오입니다. 출력은 이미지의 중심과 의사 동공 사이의 거리이며, 이는 무대 이동으로 변환됩니다.
이미지 상관 관계 지정
눈은 자동 초점 조정 및 자동 중심화 절차 후에 고니오미터 고도 θ 및 방위각 φ의 다양한 값에서 사진을 촬영하고 저장하여 스캔됩니다. 이차원 상관 관계는 연속적인 이미지 간의 xy 이동을 결정하는 데 사용됩니다. 서로 다른 각도 위치에서 얻은 이미지를 상호 연관시키기 위해서는 일반적으로 이전 이미지에 대한 현재 이미지의 회전이 발생한다는 것을 깨닫는 것이 필수적입니다. 예를 들어, 초기 이미지의 중심이 구의 점 C에 해당하고(그림 5), 방위각의 변화가 발생하여 평면 OAB가 작은 각도 Δφ에 걸쳐 회전하여 평면 OA'B가 된다고 가정해 보겠습니다. 그러면 이미지의 중심이 C 지점에서 C 지점으로 변경됩니다'(그림 5). 카메라 이미지 평면이 벡터 OC에 수직인 경우, 평면 OAB를 OA'B로 회전하면 β = CC'⁄BC, CC' = CDΔφ 및 cosθ와 같이 각도 β = Δφ cosθ에 걸쳐 이미지가 회전합니다(그림 5). 이는 구의 상부(θ=0°)에서 β = Δφ이고, 적도(θ=90°)에서는 β=0°라는 것을 의미한다. Δφ = 0°인 경우, 즉 고도 θ만 변경되면 이미지는 서로에 대해 회전하지 않으므로 β = 0°입니다.
스캐닝 절차 동안, 자동 센터링 절차는 시각 축이 측정 시스템의 광축과 정렬된 옴마티듐을 중심에 맞춥니다. 방위각의 회전은 각도 β과 패싯 패턴의 변환에 의한 회전을 일으킵니다. 후자의 시프트를 결정하기 위해, 그림 6에서 설명된 바와 같이(회전 각도β에 의해 첫 번째 이미지를 먼저 회전시킨 후) 두 개의 연속적인 이미지가 상관된다.
이미지 시프트 알고리즘(보충 파일 1, 스크립트 ImProcFacets)에서 개별 패싯은 각 이미지에서 반사의 중심에 의해 식별됩니다. 알고리즘에 대한 입력은 고도 및 방위각, 평가할 이미지 세트, 이미지 채널 및 관심 영역입니다. 이 알고리즘은 중심 집합과 스캐닝 절차 중에 촬영된 모든 상관 관계가 있는 이미지를 포함하는 최종 이미지를 생성합니다.
고니오메트릭 시스템
조명과의 정렬을 달성하기 위해서는 파리의 눈을 각막 패싯 렌즈에 초점을 맞추어 촬영해야하며 의사 동공은 자주 (여기에서 5 ° 회전 후) 중심을 재조정해야합니다. 이 자동 공정은 그림 4에 개략적으로 표시된 GRACE 시스템(복합 눈을 위한 Goniometric Research Apparatus for Compound Eyes)을 사용하여 실현됩니다. 그것은 세 가지 주요 하위 시스템으로 구성됩니다 : 전기 기계 하드웨어로 각각의 전자 장치를 사용하는 하위 및 상위 단계, 물리적 컨트롤러에 내장 된 펌웨어 및 알고리즘을 구현하는 소프트웨어를 작동하는 데 사용되는 PC. 하드웨어는 전동 및 광학 스테이지, 디지털 카메라, LED 강도 프로그래밍을 위한 마이크로 컨트롤러 및 백색 LED 광원으로 구성됩니다. 펌웨어의 루틴은 모터 컨트롤러, LED 컨트롤러 및 디지털 카메라와 함께 제공됩니다. 이 소프트웨어는 모터 위치와 속도를 제어하고, LED를 조정하고, 이미지를 획득하고 분석하는 알고리즘으로 구성됩니다. 다음에 논의된 알고리즘은 GRACE 시스템이 곤충 눈을 스캔할 수 있게 하는 주요 이정표를 나타냅니다.
날아가는 눈과 의사 눈동자
집파리의 눈이 비추어질 때, 입사광은 세포체 내부의 움직이는 노란색 색소 과립의 시스템인 광수용체 세포의 동공 메커니즘을 활성화시킨다. 상기 시스템은 광수용체의 광전달 과정을 촉발시키는 광속을 제어하고, 따라서 본질적으로 인간의 눈(19,20)에서 동공과 동일한 기능을 갖는다. 동공 메커니즘의 활성화는 현미경 목표의 조리개를 향하는 눈 영역에서 국부적으로 향상된 반사를 일으킵니다 (그림 3). 밝게 반사되는 눈 영역인 유사 동공 19,20,21의 위치는 입사광이 다른 광수용체 세포 세트에서 동공 메커니즘을 활성화시키기 때문에 눈의 회전에 따라 변한다(도 6 참조). 따라서 의사 동공은 현미경과 정렬 된 옴마티디아의 시각 축의 마커 역할을합니다. 이것은 눈의 시각 축 4,20,21,22,23의 공간 분포의 매핑을 허용한다.
누락된 패싯 채우기
예를 들어, 모든 패싯이 중심 절차에 의해 식별되는 것은 아니며, 예를 들어, 사소한 표면 불규칙성 또는 먼지 얼룩으로 인한 낮은 국소 반사율로 인해 식별됩니다. 후자는 또한 잘못된 중심을 초래할 수 있습니다 (그림 7A). 이 문제는 먼저 수돗물로 눈을 씻고 두 번째로 채우기 절차 (스크립트 ImProcFacets)를 적용하여 해결됩니다. 따라서, 한 영역의 중심이 먼저 결정되고(도 7A), FFT가 계산된다(도 7B). 고조파의 첫 번째 링(그림 7B의 노란색 별)은 파란색, 빨간색 및 녹색 선으로 표시된 세 가지 방향을 정의합니다(그림 7B). 세 배향을 따른 고조파의 역변환은 그림 7C-E에서 회색 밴드를 산출한다. 두 번째 순서 다항식을 회색 밴드에 맞추면 세 격자 축을 따라 패싯 중심을 연결하는 선이 생성됩니다. 따라서 격자선의 교차점은 실제 패싯 중심과 일치합니다. 그림 7의 예는 극단적인 경우이므로 절차가 견고하다는 것을 보여줍니다. 대부분의 지역에서는 누락 된 측면과 잘못된 중심이 드뭅니다.
플라이 아이 스캔
도 8 은 Δφ = 5°로 일련의 단계적 방위각 변화를 수행함으로써 눈을 가로질러 스캔된 옴마티디아 밴드를 도시한다. 눈의 정면 측면 (도 8A, 오른쪽)에서 측면 (도 8A, 왼쪽)으로의 스캔은 24 단계에서 발생했다. 크게 겹치는 패싯 패턴의 중심은 후속적으로 β = Δφcosθ에 의해 회전되었다. 그런 다음 각 이미지의 중심을 이동하고 누락 된 패싯 ( 스크립트 ImProcFacets 사용)을 채운 후 공동 현지화 된 중심을 평균화했습니다. 도 8A는 이미지 중심 및 패싯 중심과 함께 결합된 이미지를 도시한다. 도 8B는 보로노이 다이어그램으로서 패싯들의 어셈블리를 도시한다.
그림 1: 플라이를 황동 홀더에 장착합니다 . (A) 조사할 집파리가 있는 팁. (B) 면과 젓가락을 사용하여 파리가 끝까지 부드럽게 밀어 넣은 컷 팁. (c) 파리가 있는 팁이 총 길이 10mm로 더 절단된다. (D) 고니오미터 스테이지에 배치되는 플라이를 갖는 황동 홀더; 화살표는 높이 조정 나사를 가리킵니다. (E) 저온 용융 왁스 (#) 조각으로 고정시킨 머리를 팁에 고정시킨 파리의 클로즈업 사진(*). Epi-illumination은 노란색 의사 동공에 의해 밝혀진 것처럼 눈의 광수용체의 동공 메커니즘을 활성화시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: GRACE, 복합 눈을 위한 Goniometric Research Apparatus for Compound Eyes. 조사 된 곤충 (파리)은 세 개의 번역 단계 (X, Y, Z)와 두 개의 회전 단계 (고도 및 방위각)로 구성된 전동 단계에 장착됩니다. 렌즈는 다이어프램에서 흰색 LED의 빛을 집중시키고 플라이의 눈에서 하프 미러를 통해 초점을 맞춥니다. 눈은 현미경에 부착 된 카메라로 촬영됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 플라이 아이의 광학. (A) 플라이 아이의 3개의 옴마티디아에 대한 다이어그램으로, 각각 원발성(갈색) 및 이차(빨간색) 안료 세포로 둘러싸인 일련의 광수용체 세포(노란색)에 입사광을 집중시키는 쌍볼록한 패싯 렌즈로 덮여 있습니다. 어두운 적응 (DA) 광수용체의 강렬한 조명은 광수용체 세포 내부에 존재하는 황색 안료 과립 (검은 점으로 표시됨)의 이동을 일으 킵니다. 광수용체의 끝쪽으로, 빛에 민감한 소기관, 횡문근 근처에 축적되어, 그들은 광 적응 (LA) 상태에서 빛을 흡수하고 후방 산란시킨다. (b) 눈 표면의 수준에서의 이미지는, 활성화된 상태에서의 패싯 반사(밝은 점들) 뿐만 아니라 안료 과립 반사(각막 유사동공, CPP)를 보여준다. (C) 눈 만곡의 중심 (깊은 의사 동공, DPP)의 수준에서 촬영 된 이미지로, 사다리꼴 패턴으로 광수용체 세포의 배치를 반영하며, 원위 끝은 패싯 렌즈의 초점면 부근에 위치합니다. 따라서 광수용체 팁의 중첩된 가상 이미지는 눈 만곡의 중심 평면에 존재합니다. 스케일 바 100 μm는 패널 B와 C에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: GRACE 시스템의 개략도. PC 소프트웨어는 펌웨어를 제어하여 전자 기계 하드웨어를 구동합니다. 디지털 카메라는 광학 스테이지를 통해 표본의 눈 이미지를 촬영합니다. LED 광원은 시편을 비추고 전동 스테이지의 모터는 X-, Y- 및 Z 번역뿐만 아니라 방위각 (A) 및 고도 (E) 회전을 작동시킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 플라이 아이(fly eye)를 스캔할 때 이미지 회전을 유도하기 위한 도면. 초기 이미지의 중심이 구의 점 C에 해당하고 방위각의 변화가 발생하면 평면 OAB는 작은 각도 Δφ에 걸쳐 회전하여 평면 OA'B가됩니다. 그러면 이미지의 중심이 C 지점에서 C 지점으로 바뀝니다. 평면 OAB를 OA'B로 회전하면 각도 β = Δφ cosθ에 걸쳐 이미지가 회전합니다(텍스트, 이미지 상관 관계 섹션 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 색간 각도를 결정하기 위한 이미지 처리 절차 . (A) 녹색 원과 빨간색 사각형으로 표시된 패싯 중심과 이미지 중앙에 녹색 점이 있는 눈으로 스캔하는 동안 촬영한 이미지입니다. (B) 5°의 방위각 회전 후 후속 이미지로, 이미지 중앙에 빨간색 사각형과 빨간색 점으로 표시된 패싯 중심이 표시됩니다. (C) 이미지 B와 상관 관계가있는 A의 녹색 사각형 내의 영역의 Correlogram. C의 중심(녹색 점)에서 코렐로그램의 최대값까지의 벡터는 이미지 A와 B의 상대적 이동을 나타냅니다. 이 벡터를 사용하면 A의 이동된 사각형과 그 중심이 B로 그려지고 B의 면이 중심(빨간색 사각형)이 A에 추가됩니다. 스케일 막대 100μm는 패널 A-C에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 푸리에 변환을 적용하여 누락된 패싯 중심을 도출합니다. (A) 패싯 중심(빨간색 점)이 있는 로컬 RGB 이미지입니다. 흰색 화살촉은 면이 누락되었음을 나타내고 빨간색 화살촉은 잘못된 중심을 가리킵니다. (B) 노란색 별로 표시된 고조파의 첫 번째 고리가있는 A의 중심 FFT. (C-E) B의 컬러 선으로 표시된 세 방향을 따라 중심을 역으로 FFT하여 칙칙한 밴드를 산출합니다. 파란색(C), 빨간색(D) 및 녹색(E) 선은 회색 밴드에 맞는 사분면 다항식이며, 중심(빨간색 원)은 푸리에 변환 전에 얻은 선입니다. (F) C-E의 적합 라인은 A의 중심과 함께 결합되었습니다. 누락 된 패싯 중심은 교차점에서 파생됩니다. 스케일 바 100 μm는 패널 A, C-F에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 한쪽에서 다른 쪽으로 스캔한 집파리의 오른쪽 눈. (A) 방위각이 5°씩 단계적으로 변경된 이미지 계열의 겹치는 이미지를 이미지 중심(녹색 십자선) 및 면의 중심(빨간색 원)과 결합했습니다. (B) A. 스케일 막대 100μm와 같이 이미지 중심이 있는 패싯 중심형의 Voronoi 다이어그램이 패널 A와 B에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
집파리 눈의 시각적 축의 공간 분포는 복합 눈의 의사 동공 현상과 빛에 의존하는 동공 메커니즘에 의한 반사 변화를 사용하여 차트화 할 수 있습니다. 따라서 조사 된 파리는 고니오메트릭 시스템에 장착되어있어 디지털 카메라가 장착 된 현미경 설정으로 로컬 패싯 패턴을 검사 할 수 있으며 모두 컴퓨터 제어하에 있습니다. 이미지 분석은 아이맵을 생성합니다. 직면 한 근본적인 어려움은 측정 초기에 눈을 조심스럽게 배치하지 않으면 눈과 의사 동공의 볼 위치가 goniometric 장치의 작은 회전으로도 상당히 바뀔 수 있다는 것입니다. 이러한 변화는 깊은 의사 동공이 관찰되는 고니오메트릭 회전 중심에 안구 중심을 배치함으로써 최소화됩니다. 후속적으로 측정된 이미지들을 상관시킴으로써, 패싯 패턴이 추적될 수 있다. 중요한 것은 패싯 패턴이 매우 규칙적인 영역에서는 상관 절차가 잘못된 결과를 얻기 쉽기 때문에 회전 각도를 다소 작은 값으로 조정해야한다는 것입니다.
여기에서는 곤충 눈의 시력에 대한 고도로 자동화 된 매핑의 실현 가능성을 보여주는 부분 아이 맵 (그림 8)을 제시했습니다. 패싯 간격을 연속적인 이미지 중심 사이의 5° 시프트와 비교함으로써 명백한 약 2.0°-2.5°의 색간 각도는 동일한 종(Musca domestica)25에서 훨씬 더 힘든 방식으로 이전에 파생된 데이터와 잘 일치한다. 집파리와 다른 곤충의 시각적 공간에 대한 완전한 안지도가 다른 곳에서 출판 될 것입니다.
여기에 제시된 방법은 생체 내에서 단 몇 시간 내에 완전한 눈의 시각적 축을 매핑 할 수 있으며, 이는 다른 접근법으로는 달성하기가 매우 어려울 것입니다. 자동화 된 차트 작성 방법은 집파리의 경우에 대해 여기에 설명되어 있지만 나비와 같은 다른 곤충의 복합 눈까지 간단히 확장 할 수 있습니다. 그러나, 동공 반사 대신에, 나비 눈빛은 시각 축 마커(21,24)로서 기능한다. 대안적인 방법은 최근에 개발된 X선 마이크로단층 촬영(26)이다. 이러한 귀중한 접근법은 상세한 해부학적 맵을 산출하지만, 광학 오류, 특히 옴마티디아의 시각적 축이 눈 표면(21)으로 비뚤어지거나 조직 처리가 측정을 손상시키기에 충분히 눈 기하학적 구조를 왜곡시키는 경우에 취약하다. 의사 동공의 시각화는 반짝이는 동공 메커니즘을 가진 비행 눈에서 다소 간단합니다. 이것은 예를 들어 꿀벌21에서와 같이 잘 반영되지 않는 동공 메커니즘을 가진 복합 눈에서는 덜 쉽습니다. 그러나 군인 파리 나 꿀벌과 같은 많은 다른 곤충 종의 경우 옴마티드 횡문에서 시각적 안료의 형광을 사용할 수 있습니다. 강한 횡문근 형광을 생성하는 형광단의 적용은 눈의 시각 공간(27)의 공간 조직을 추정할 수 있는 또 다른 기회를 제공한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는보고 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 공군 과학 연구 사무소 / 항공 우주 연구 개발 AFOSR / EOARD (FA9550-15-1-0068, D.G.S.에 부여)에 의해 재정적으로 지원되었습니다. 많은 도움이 되는 토론을 해주신 Primož Pirih 박사님과 Kehan Satu, Hein Leertouber, Oscar Rincón Cardeño에게 도움을 주신 것에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision of amplified images and digital communication with PC |
| High power star LED | Velleman | LH3WW | Light source for observation and imaging the compound eye |
| Holder for the investigated fly | University of Groningen | Different designs were manufactured by the university workshop | |
| Linear motor | ELERO | ELERO Junior 1, version C | Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A) |
| Low temperature melting wax | various | The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder | |
| Microscope | Zeiss | Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x | |
| Motor and LED Controller | University of Groningen | Z-o1 | Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies. |
| Motorized Stage | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom. |
| Optical components | LINUS | Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| PC running MATLAB | University of Groningen | The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system | |
| Power Supply (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Lithuania) | PUP120-17 | Dedicated power supply for the STANDA motor controllers |
| Soldering iron | various | Used for melting the wax | |
| Stepper and DC Motor Controller | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly |
| Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes. | Programming language used to implement the algorithms |
References
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M.
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002 (2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168 (2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782 (2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613 (2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267 (2021).
