Summary
Protokollen beskriver her måling av den romlige organisasjonen av de visuelle aksene til husflyøyne, kartlagt av en automatisk enhet, ved hjelp av pseudopupil-fenomenet og elevmekanismen til fotoreseptorcellene.
Abstract
Dette papiret beskriver den automatiske målingen av den romlige organisasjonen av de visuelle aksene av insektforbindelser, som består av flere tusen visuelle enheter kalt ommatidia. Hvert ommatidium prøver den optiske informasjonen fra en liten solid vinkel, med en omtrentlig Gauss-distribuert følsomhet (halv bredde i størrelsesorden 1 °) sentrert rundt en visuell akse. Sammen samler ommatidiaen den visuelle informasjonen fra et nesten panoramisk synsfelt. Den romlige fordelingen av de visuelle aksene bestemmer dermed øyets romlige oppløsning. Kunnskap om den optiske organisasjonen av et sammensatt øye og dets synsstyrke er avgjørende for kvantitative studier av nevral behandling av visuell informasjon. Her presenterer vi en automatisert prosedyre for kartlegging av et sammensatt øyes visuelle akser, ved hjelp av et iboende, in vivo optisk fenomen, pseudopupil og elevmekanismen til fotoreseptorcellene. Vi skisserer det optomekaniske oppsettet for skanning av insektøyne og bruker eksperimentelle resultater hentet fra en husflue, Musca domestica, for å illustrere trinnene i måleprosedyren.
Introduction
Kompaktiteten til insekt visuelle systemer og smidigheten til sine eiere, som demonstrerer høyt utviklet visuell informasjonsbehandling, har fascinert folk fra både vitenskapelig og ikke-vitenskapelig bakgrunn. Insekt sammensatte øyne har blitt anerkjent som kraftige optiske enheter som muliggjør akutt og allsidig visuell kapasitet 1,2. Fluer, for eksempel, er kjent for sine raske svar på bevegelige gjenstander, og bier er kjent for å ha fargesyn og polarisasjonssyn2.
De sammensatte øynene til leddyr består av mange anatomisk lignende enheter, ommatidia, som hver er avkortet av en fasettlinse. I Diptera (fluer) er samlingen av fasettlinser, kjent kollektivt som hornhinnen, ofte tilnærmet en halvkule. Hvert ommatidium prøver innfallende lys fra en liten solid vinkel med halv bredde i størrelsesorden 1 °. Ommatidia av de to øynene sammen prøver omtrent full solid vinkel, men de visuelle aksene til ommatidia er ikke jevnt fordelt. Enkelte øyeområder har en høy tetthet av visuelle akser, noe som skaper en region med høy romlig skarphet, i daglig tale kalt en fovea. Den gjenværende delen av øyet har da en grovere romlig oppløsning 3,4,5,6,7,8,9.
En kvantitativ analyse av den optiske organisasjonen av de sammensatte øynene er avgjørende for detaljerte studier av nevral behandling av visuell informasjon. Studier av nevrale nettverk av et insekts hjerne10 krever ofte kunnskap om den romlige fordelingen av ommatidialaksene. Videre har sammensatte øyne inspirert flere tekniske innovasjoner. Mange initiativer for å produsere bioinspirerte kunstige øyne er bygget på eksisterende kvantitative studier av ekte sammensatte øyne 11,12,13. For eksempel ble en halvlederbasert sensor med høy romlig oppløsning designet basert på modellen av insekt sammensatte øyne 11,14,15,16,17. Imidlertid har enhetene utviklet så langt ikke implementert de faktiske egenskapene til eksisterende insektøyne. Nøyaktige representasjoner av insekt sammensatte øyne og deres romlige organisasjon vil kreve detaljerte og pålitelige data fra naturlige øyne, som ikke er omfattende tilgjengelig.
Hovedårsaken til mangelen på data er den ekstreme kjedeligheten i de tilgjengelige prosedyrene for å kartlegge øynenees romlige egenskaper. Dette har motivert forsøk på å etablere en mer automatisert øyekartleggingsprosedyre. I et første forsøk på automatiserte analyser av insekt sammensatte øyne, utviklet Douglass og Wehling18 en skanningsprosedyre for å kartlegge fasettstørrelser i hornhinnen og demonstrerte dens gjennomførbarhet for noen få fluearter. Her utvider vi deres tilnærming ved å utvikle metoder for ikke bare å skanne fasettene på hornhinnen, men også vurdere de visuelle aksene til ommatidia som fasettene tilhører. Vi presenterer saken om husflueøyne for å eksemplifisere prosedyrene som er involvert.
Det eksperimentelle oppsettet for skanning av insektøyne er: delvis optisk, dvs. et mikroskop med kamera og belysningsoptikk; delvis mekanisk, dvs. et goniometersystem for å rotere det undersøkte insektet; og delvis beregningsmessig, det vil si bruk av programvaredrivere for instrumentene og programmene for å utføre målinger og analyser. De utviklede metodene omfatter en rekke beregningsprosedyrer, fra å ta bilder, velge kamerakanaler og sette terskler for bildebehandling til å gjenkjenne individuelle fasettsteder via lyse lyspunkter som reflekteres fra deres konvekse overflater. Fouriertransformasjonsmetoder var avgjørende i bildeanalysen, både for å oppdage individuelle fasetter og for å analysere fasettmønstrene.
Papiret er strukturert som følger. Vi introduserer først det eksperimentelle oppsettet og pseudopupilfenomenet - den optiske markøren som brukes til å identifisere de visuelle aksene til fotoreceptorene i levende øyne 19,20,21. Deretter skisseres algoritmene som brukes i skanneprosedyren og bildeanalysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er i samsvar med universitetets retningslinjer for insektpleie.
1. Forberedelse av en husflue, Musca domestica
- Samle fluen fra laboratorieoppdratt befolkning. Plasser fluen i messingholderen (figur 1).
- Skjær 6 mm fra den øvre delen av festerøret (se materialtabell). Den nye øvre delen av røret har en ytre diameter på 4 mm og en indre diameter på 2,5 mm (figur 1A). Plasser den levende fluen inne i røret, forsegl røret med bomull for å forhindre skade fluen, og skyv fluen slik at hodet stikker ut fra røret og kroppen holdes fast (figur 1B). Immobiliser hodet med bivoks slik at øynene forblir avdekket (Figur 1C-E).
- Klipp røret igjen slik at rørlengden er 10 mm (figur 1C). Plasser plastrøret med fluen i messingholderen, slik at det ene øyet på fluen peker oppover når holderen hviler på en bordplate (figur 1D, E).
- Juster orienteringen av røret slik at med goniometerhøyden ved 0 ° (dvs. asimuttrinnet er i horisontal stilling), er den vertikale belysningsstrålen til mikroskopet vinkelrett på øyeoverflaten i et sentralt område, mellom ventral og dorsal, og mellom fremre og bakre kanter av øyet, slik at hele øyet kan skannes innenfor rekkevidden av asimut og høyde tillatt av oppsettet.
2. Justering av goniometerets roterende asimutakse med mikroskopets optiske akse
- Monter en justeringspinne på asimutrotasjonstrinnet slik at x-y-posisjonen til spissen kan justeres for å falle sammen med asimutaksen på det motoriserte trinnet. Mens du ser med mikroskopet, utstyrt med et 5x-mål, fokuserer du på spissen ved hjelp av z-aksens joystick (figur 2).
- Juster x-y-justeringen av asimutaksen med mikroskopets optiske akse og sørg for at høyde- og asimutroterende akser er forhåndsjustert med den sentrerte tappen, ved hjelp av x- og y-akse-styrespakene.
- Manipuler asimut- og høydespakene for å sjekke om tappen er sentrert med hensyn til begge frihetsgrader. Når den er godt sentrert, forblir pinnespissen i omtrent samme posisjon under asimut- og høyderotasjoner.
3. Justering av flueøyet med de motoriserte stadiene
- Med høydetrinnet på 0°, monter fluen og holderen på asimuttrinnet. Observer fluens øye med mikroskopet.
- Med belysningslampen på, juster den horisontale posisjonen til fluen slik at midten av pseudopupilen er justert med mikroskopet. Juster den vertikale posisjonen til fluen ved å bruke holderens roterende skrue (figur 1D), slik at den dype pseudopupilen (DPP; Figur 3) 19,20,21 bringes i fokus på høydeaksens nivå.
- Juster DPP med hensyn til asimut- og høydeaksene ved å sentrere den i synsfeltet (se figur 2). Bruk magnetene limt til bunnen av flueholderen til å feste den fast på en jernplate montert på asimuttrinnet, samtidig som du tillater manuelle glidejusteringer.
- Bytt visningen til digitalkameraet som er montert i mikroskopet. Kjør programvareinitialiseringen av GRACE-systemet, som inkluderer initialisering av motorkontrollerne og Arduino LED-kontrolleren (figur 4). Åpne derfor MATLAB R2020a eller nyere versjon. Kjør MATLAB-skriptet Initialize_All_Systems (tilleggsfil 1).
- Bekreft om fluens pseudopupil (figur 3B, C) er i midten av det projiserte bildet på dataskjermen.
4. Autofokus og autosentrering
- Bringe fokus til nivået av hornhinnen pseudopupil (CPP; Figur 3B) 19,20,21 manuelt ved hjelp av z-aksen joystick.
- Kjør autofokusalgoritmen (Supplementary File 1, script AF) for å oppnå et skarpt bilde på hornhinnenivå. Kontroller ved å returnere fokuset til DPP-nivået ved å justere det motoriserte z-aksetrinnet. Oppbevar avstanden mellom DPP og CPP (i motortrinn).
- Finjuster pseudopupil-sentreringen ved å kjøre autocentering-algoritmen (Supplementary File 1, script AC). Ta fokuset tilbake til CPP-nivå.
- Kjør autofokusalgoritmen på nytt. Nullstille de motoriserte stadiene i sine nåværende posisjoner (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), hvor E er høyde og A er asimut.
- Kjør skannealgoritmen (Supplementary File 1, script Scan_Begin), som prøver øyebilder langs baner i 5° trinn, mens du utfører autosentrerings- og autofokusalgoritmene.
- Ved avslutningen av prøvetakingen, slå av LED-kontrolleren og motorkontrollerne.
- Behandle bildene ved å bruke bildebehandlingsalgoritmene (Supplementary File 1, script ImProcFacets).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyr og optisk stimulering
Eksperimenter utføres på husfluer (Musca domestica) hentet fra en kultur opprettholdt av Institutt for evolusjonær genetikk ved Universitetet i Groningen. Før målingene immobiliseres en flue ved å lime den med en lavsmeltepunktvoks i et godt passende rør. Fluen blir deretter montert på scenen til et motorisert goniometer. Midten av de to roterende stadiene sammenfaller med fokuspunktet til et mikroskopisk oppsett24. Epi-belysningslysstrålen leveres av en lyskilde, som fokuserer lys på en membran som er avbildet ved fluens øye via et halvspeil. Det aktiverer dermed elevmekanismen til et begrenset sett med fotoreseptorceller (figur 3). De optiske aksene til ommatidiene som har disse fotoreseptorene, vurderes ved å rotere fluen i små trinn og ta bilder etter hvert trinn med et farge digitalkamera festet til et mikroskop (figur 2). Fordi pupillpigmentgranulatene hovedsakelig reflekterer i det lange bølgelengdeområdet, brukes den røde kanalen til digitalkameraet til å diskriminere pseudopupilen fra fasettlinserefleksjonene. Sistnevnte refleksjoner isoleres best fra pseudopupilen ved hjelp av kameraets blå kanal.
Autofokus- og autosentreringsalgoritmer
De viktigste tilleggsalgoritmene som brukes mens du skanner et insekts øye, er autofokus og autocentering (Tilleggsfil 1, skript AF og AC). Målet med autofokusering er å bringe hornhinnen til kameraets fokus, for å oppdage fasettrefleksjonene som er nødvendige for identifisering av individuell ommatidi (figur 3B). Prosedyren for å oppdage hornhinnen er å endre den vertikale (Z) posisjonen til fluen i trinn ved å bruke den raske Fourier-transformasjonen (FFT) på bildet tatt på hvert nivå for å bestemme det romlige frekvensinnholdet. Kriteriet for optimal fokus er nivået med størst summert effekt over en lavfrekvent grenseverdi.
Inngangene for autofokus er Z-posisjonene og streaming av video fra kameraet. Utgangene er integralet av det høyfrekvente innholdet i bildet SF og fokuseringsnivået Z der SF er maksimalt. I det første trinnet justeres Z-posisjonen til kamerabildet til litt under hornhinnens fasettlinser, og området av interesse for å bestemme bildets frekvensinnhold er satt. For-løkken starter bildeopptaket og beregner summen av den høypassfiltrerte Fourier-transform SF. Ved å tråkke z-aksemotoren oppover til et bildenivå over hornhinnen, er nivået med de høyeste frekvensene funnet, dvs. hvor SF er maksimal, som tas for å være hornhinnen. Z-aksemotoren justeres deretter til det nivået, og det tas et bilde.
Når du fokuserer ned fra hornhinnen mot nivået av øyets krumningssenter, forsvinner hornhinnens fasettrefleksjoner, og pseudopupilrefleksjonene smelter sammen til et typisk syvpunktsmønster, noe som er karakteristisk for organiseringen av fotoreceptorene i fly ommatidia (figur 3C; merk at mønsteret bare er tydelig i omtrent sfæriske øyeområder). Mønsteret på øyets krumningsnivå kalles den dype pseudopupil (DPP)19,21.
Å skifte fluen plassert på scenen med X- og Y-motorene slik at midten av lyspunktet sammenfaller med midten av kamerabildet kalles autosentrering. Denne prosedyren justerer fasiten til ommatidium hvis visuelle akse er i midten av DPP med belysningsstrålen og den optiske aksen til mikroskopet og kameraet. Bildet er Gaussisk filtrert og binarisert, og deretter bestemmes midten av pseudopupil ved hjelp av regionprops MATLAB-funksjonen. Inngangene er posisjonene til X- og Y-motorene og streamingvideoen fra kameraet; utgangen er avstanden mellom sentrene for bilde og pseudopupil, som deretter oversettes til et sceneskifte.
Korrelere bilder
Øyet skannes ved å ta og lagre fotografier ved ulike verdier av goniometerhøyden θ og azimut φ etter autofokus- og autosentreringsprosedyrene. Todimensjonal korrelasjon brukes til å bestemme x-y-skiftene mellom påfølgende bilder. For å korrelere bildene oppnådd ved forskjellige vinkelposisjoner, er det viktig å innse at dette generelt resulterer i en rotasjon av det nåværende bildet i forhold til det forrige bildet. La oss for eksempel anta at midten av et innledende bilde tilsvarer punkt C i en kule (figur 5) og at en endring i asimut skjer slik at plan OAB roteres over en liten vinkel Δφ, og blir plan OA'B. Midten av bildet endres deretter fra punkt C til punkt C' (figur 5). Hvis kamerabildeplanet er vinkelrett på vektoren OC, forårsaker rotasjon av plan OAB til OA'B rotasjon av bildet over en vinkel β = Δφ cosθ, som β = CC'⁄BC, med CC' = CDΔφ, og cosθ = CD⁄BC (figur 5). Dette betyr at på toppen av sfæren (θ = 0°), β = Δφ, og ved ekvator (θ = 90°), β = 0°. Når Δφ = 0°, det vil si når bare høyden θ endres, roteres ikke bildene i forhold til hverandre, så β = 0°.
Under skanneprosedyren sentrerer autocenteringsprosedyren ommatidium hvis visuelle akse er justert med målesystemets optiske akse. Rotasjon av asimuten forårsaker en rotasjon med en vinkel β og en oversettelse av fasettmønsteret. For å bestemme sistnevnte skift korreleres to påfølgende bilder (etter først å ha rotert det første bildet med rotasjonsvinkelen β), som forklart i figur 6.
I bildeskiftalgoritmen (Supplementary File 1, script ImProcFacets) identifiseres de enkelte fasettene av sentroidene til refleksjonene i hvert bilde. Inngangene til algoritmen er høyden og asimutvinkelen, settet med bilder som skal vurderes, bildekanalen og interesseområdet. Algoritmen produserer et sett med sentroider og et endelig bilde som inneholder alle de korrelerte bildene tatt under skanneprosedyren.
Det goniometriske systemet
For å oppnå justering med belysningen må fluens øye fotograferes med hornhinnens fasettlinser i fokus, og pseudopupilen må recenteres ofte (her etter hver 5° rotasjon). Denne automatiske prosessen realiseres med GRACE-systemet (Goniometric Research Apparatus for Compound Eyes), vist skjematisk i figur 4. Den består av tre hovedundersystemer: de nedre og øvre trinnene med deres respektive elektronikk som elektromekanisk maskinvare, fastvaren innebygd i de fysiske kontrollerne, og PCen som brukes til å betjene programvaren som implementerer algoritmene. Maskinvaren består av de motoriserte og optiske stadiene, digitalkameraet, en mikrokontroller for programmering av LED-intensiteter og en hvit LED-lyskilde. Fastvarens rutiner er utstyrt med motorstyringene, LED-kontrolleren og i digitalkameraet. Programvaren består av algoritmer for å kontrollere motorposisjoner og hastigheter, justere LED, og anskaffe og analysere bilder. Algoritmene som diskuteres neste representerer de viktigste milepælene som gjør det mulig for GRACE-systemet å skanne insektøyne.
Fly øyne og pseudopupils
Når et husflyøye er opplyst, aktiverer det innfallende lyset pupilmekanismen til fotoreseptorcellene, et system med mobile, gulfargede pigmentgranuler inne i cellekroppen. Systemet styrer lysstrømmen som utløser fototransduksjonsprosessen til fotoreseptorene, og har dermed i hovedsak samme funksjon som eleven i det menneskelige øye19,20. Aktiveringen av pupillmekanismen medfører en lokalt forsterket refleksjon i øyet som vender mot mikroskopets målåpning (figur 3). Posisjonen til det sterkt reflekterende øyeområdet, pseudopupil 19,20,21, endres ved rotasjon av øyet fordi det innfallende lyset deretter aktiverer pupillmekanismen i et annet sett med fotoreseptorceller (se figur 6). Pseudopupil fungerer dermed som en markør for den visuelle aksen til ommatidia som er justert med mikroskopet. Dette gjør det mulig å kartlegge den romlige fordelingen av øyets visuelle akser 4,20,21,22,23.
Fylle ut manglende fasetter
Ikke alle fasetter er identifisert ved sentroid-prosedyren, for eksempel på grunn av lav lokal refleksjon forårsaket av mindre overflate uregelmessigheter eller støvflekker. Sistnevnte kan også resultere i feilaktige sentroider (figur 7A). Dette problemet løses først ved å vaske øynene under en vannkran og for det andre ved å bruke en utfyllingsprosedyre (skript ImProcFacets). Derfor bestemmes sentroidene i et område først (figur 7A), og deretter beregnes FFT (figur 7B). Den første harmoniske ringen (gule stjerner i figur 7B) definerer tre retninger, indikert med de blå, røde og grønne linjene (figur 7B). Omvendt transformasjon av harmonikkene langs de tre retningene gir de grå båndene i figur 7C-E. Montering av et andreordens polynom til de grå båndene gir linjer som forbinder fasett sentroidene langs de tre gitteraksene. Krysspunktene til gitterlinjene samsvarer dermed med de sanne fasettsentrene. Siden eksemplet i figur 7 er et ekstremt tilfelle, viser det at prosedyren er robust. I de fleste områder er manglende fasetter og feilaktige sentroider sjeldne.
Skanner et flueøye
Figur 8 viser et bånd av ommatidia skannet over øyet ved å utføre en serie trinnvise azimuthalendringer med Δφ = 5 °. Skanning fra forsiden av øyet (figur 8A, høyre) til sidesiden (figur 8A, venstre) forekom i 24 trinn. Sentroidene i de stort sett overlappende fasettmønstrene ble deretter rotert med β = Δφcosθ. Deretter, etter å ha skiftet sentroidene til hvert bilde og fylt ut de manglende fasettene (med skript ImProcFacets), ble de kolokaliserte sentroidene i gjennomsnitt. Figur 8A viser de kombinerte bildene, sammen med bildesentrene og fasetterter. Figur 8B viser samlingen av fasetter som et Voronoi-diagram.
Figur 1: Montering av flua i messingholderen. (A) En spiss med en husflue som skal undersøkes. (B) Kuttspissen med fluen skyves forsiktig til enden ved hjelp av et stykke bomull og en spisepinne. (C) Spissen med fluen kuttes videre til en total lengde på 10 mm. (D) Messingholderen med fluen som skal plasseres på goniometertrinnet; pilen peker på høydejusteringsskruen. (E) Nærbilde av fluen med hodet immobilisert av et stykke lavtemperatur smeltevoks (#) til spissen (*). Epi-belysning har aktivert pupillmekanismen til øyets fotoreceptorer, som avslørt av den gule pseudopupilen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: GRACE, det goniometriske forskningsapparatet for sammensatte øyne. Det undersøkte insektet (en flue) er montert på det motoriserte stadiet bestående av tre oversettelsestrinn (X, Y, Z) og to rotasjonstrinn (høyde og asimut). En linse fokuserer lys fra en hvit LED på en membran, fokusert via et halvspeil ved fluens øye. Øyet fotograferes med et kamera festet til et mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Optikk av flueøyne. (A) Diagram over tre ommatidier av et flueøye, hver avkortet av en bikonveks fasettlinse, som fokuserer innfallslys på et sett med fotoreceptorceller (gul), omgitt av primære (brune) og sekundære (røde) pigmentceller. Intens belysning av mørktilpassede (DA) fotoreceptorer forårsaker migrasjon av gule pigmentgranuler (indikert med svarte prikker), som finnes inne i fotoreseptorcellene. Akkumulert mot spissen av fotoreseptorene, nær de lysfølsomme organellene, rhabdomeres, absorberer de og backscatter lys i lystilpasset (LA) tilstand. (B) Bilde på nivået av øyets overflate, som viser fasettrefleksjonene (lyse prikker) samt pigmentgranulatrefleksjonen i aktivert tilstand (hornhinnen pseudopupil, CPP). (C) Bilde tatt på nivået av sentrum av øyekrumningen (den dype pseudopupilen, DPP), som reflekterer arrangementet av fotoreceptorcellene i et trapesformet mønster, med deres distale ender plassert på omtrent fokalplanet til fasettlinsene. Et overlagret virtuelt bilde av fotoreseptorspissene eksisterer dermed i planet for sentrum av øyekrumningen. Skalalinje 100 μm gjelder for panel B og C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skjematisk diagram over GRACE-systemet. PC-programvaren styrer fastvaren, som driver den elektromekaniske maskinvaren. Digitalkameraet tar, via et optisk stadium, bilder av prøvens øye. LED-lyskilden lyser opp prøven, og motorene i det motoriserte stadiet aktiverer X-, Y- og Z-oversettelsene samt asimut (A) og høyde (E) rotasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Diagram for utledning av bilderotasjonen ved skanning av flueøyet. Hvis midten av et innledende bilde tilsvarer punkt C i en kule og en endring i asimut oppstår, roteres plan OAB over en liten vinkel Δφ, og blir plan OA'B. Midten av bildet endres deretter fra punkt C til punkt C'. Rotasjon av plan OAB til OA'B forårsaker rotasjon av bildet over en vinkel β = Δφ cosθ (se tekst, avsnitt Korreler bilder). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Bildebehandlingsprosedyren for å bestemme interommatidialvinkelen. (A) Bilde tatt under en skanning over øyet, med fasett sentroider merket med grønne sirkler og røde firkanter, og en grønn prikk i bildesenteret. (B) Etterfølgende bilde etter en azimuthalrotasjon på 5°, med fasetter som er markert med røde firkanter og en rød prikk i bildesenteret. (C) Korrelogram av området innenfor den grønne firkanten av A korrelert med bilde B. Vektoren fra sentrum av C (grønn prikk) til maksimumsverdien av korrelogrammet representerer det relative skiftet av bilder A og B. Ved å bruke den vektoren tegnes det forskjøvne kvadratet av A og dets senter i B og fasetterter (røde firkanter) av B legges til i A. Skalalinje 100 μm gjelder paneler A-C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Utlede manglende fasetter ved å bruke Fourier-transformasjoner. (A) Et lokalt RGB-bilde med fasetter (røde prikker). Hvite pilspisser indikerer manglende fasetter, og den røde pilspissen peker på en feilaktig sentroid. (B) FFT av sentroidene til A med den første ringen av harmoniske preget av gule stjerner. (CE) Invers FFT av sentroidene langs de tre retningene angitt av de fargede linjene i B, noe som gir de gråaktige båndene. De blå (C), røde (D) og grønne (E) linjene er kvadratiske polynomtilpasninger til de grå båndene, og sentroidene (røde sirkler) er de som ble oppnådd før Fourier-transformasjonene. (F) De monterte linjene til C-E kombinert, sammen med sentroidene til A. De manglende fasett sentroidene blir deretter avledet fra krysningspunktene. Skalastang 100 μm gjelder for panelene A, C-F. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Det høyre øyet til en husflue skannet fra den ene siden til den andre siden. (A) Kombinerte, overlappende bilder av en bildeserie der asimuten ble endret trinnvis med 5 °, sammen med bildesentrene (grønne kryss) og fasettertroidene (røde sirkler). (B) Voronoi-diagram over fasett-sentroidene, med bildesentrene som i A. Skalalinje 100 μm gjelder for panelene A og B. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den romlige fordelingen av de visuelle aksene til husflueøyne kan kartlegges ved hjelp av pseudopupilfenomenet sammensatte øyne og refleksjonsendringene forårsaket av den lysavhengige elevmekanismen. Derfor er en undersøkt flue montert i et goniometrisk system, som gjør det mulig å inspisere det lokale fasettmønsteret med et mikroskopoppsett utstyrt med et digitalt kamera, alt under datamaskinkontroll. Bildeanalyse gir øyekart. En viktig vanskelighet som oppstår er at uten forsiktig posisjonering av øyet i begynnelsen av målingene, kan de viste posisjonene til både øyet og pseudopupil endres betydelig selv med små rotasjoner av den goniometriske enheten. Disse endringene minimeres ved å plassere øyesenteret ved det goniometriske rotasjonssenteret, hvor den dype pseudopupil observeres. Ved å korrelere de påfølgende målte bildene, kan fasettmønsteret spores. Det er viktig at rotasjonsvinkelen må justeres til en ganske liten verdi fordi i områder der fasettmønsteret er veldig vanlig, er korrelasjonsprosedyren utsatt for feilaktige resultater.
Her har vi presentert et delvis øyekart (figur 8), som demonstrerer muligheten for høyautomatisk kartlegging av synsskarpheten i insektøyne. De interommatidiale vinklene på rundt 2,0°-2,5°, tydelig ved å sammenligne fasettavstandene med 5° skiftene mellom påfølgende bildesentre, samsvarer godt med data som tidligere ble avledet, på en mye mer arbeidskrevende måte, fra samme art (Musca domestica)25. Komplette øyekart over det visuelle rommet til husfluer og andre insekter vil bli publisert andre steder.
Metoden som presenteres her gjør det mulig å kartlegge de visuelle aksene til et komplett øye, in vivo, innen bare noen få timer, noe som vil være ekstremt vanskelig å oppnå med andre tilnærminger. Den automatiserte kartleggingsmetoden er illustrert her for tilfelle av husfluen, men den kan ganske enkelt utvides til de sammensatte øynene til andre insekter, for eksempel sommerfugler. Men i stedet for pupillrefleksjonen fungerer sommerfugløynehinen da som den visuelle aksemarkøren21,24. En alternativ metode er den nyutviklede røntgenmikrotomografien26. Denne verdifulle tilnærmingen gir detaljerte anatomiske kart, men er sårbar for optiske feil, spesielt der de visuelle aksene til ommatidia er skjevt til øyeoverflaten21, eller hvis vevsbehandling forvrenger øyegeometrien nok til å kompromittere målinger. Visualiseringen av pseudopupil er mer eller mindre grei i flueøyne som har en skinnende pupillmekanisme. Dette er mindre lett i sammensatte øyne med en dårlig reflekterende elevmekanisme, som for eksempel i bier21. Likevel, for mange andre insektarter, som soldatfluer eller bier, kan fluorescensen av de visuelle pigmentene i ommatidial rhabdoms brukes. Anvendelsen av fluoroforer som skaper en sterk rhabdomfluorescens gir en annen mulighet til å estimere den romlige organisasjonen av øyets visuelle rom27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å rapportere.
Acknowledgments
Denne studien ble økonomisk støttet av Air Force Office of Scientific Research / European Office of Aerospace Research and Development AFOSR / EOARD (grant FA9550-15-1-0068, til D.G.S.). Vi takker Dr. Primož Pirih for mange nyttige diskusjoner og Kehan Satu, Hein Leertouwer og Oscar Rincón Cardeño for hjelp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision of amplified images and digital communication with PC |
| High power star LED | Velleman | LH3WW | Light source for observation and imaging the compound eye |
| Holder for the investigated fly | University of Groningen | Different designs were manufactured by the university workshop | |
| Linear motor | ELERO | ELERO Junior 1, version C | Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A) |
| Low temperature melting wax | various | The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder | |
| Microscope | Zeiss | Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x | |
| Motor and LED Controller | University of Groningen | Z-o1 | Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies. |
| Motorized Stage | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom. |
| Optical components | LINUS | Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| PC running MATLAB | University of Groningen | The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system | |
| Power Supply (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Lithuania) | PUP120-17 | Dedicated power supply for the STANDA motor controllers |
| Soldering iron | various | Used for melting the wax | |
| Stepper and DC Motor Controller | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly |
| Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes. | Programming language used to implement the algorithms |
References
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M.
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002 (2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168 (2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782 (2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613 (2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267 (2021).
