Summary
Протокол здесь описывает измерение пространственной организации зрительных осей глаз комнатной мухи, нанесенных на карту автоматическим устройством, с использованием явления псевдопупила и механизма зрачка фоторецепторных клеток.
Abstract
В данной работе описывается автоматическое измерение пространственной организации зрительных осей глаз насекомых, которые состоят из нескольких тысяч зрительных единиц, называемых омматидиями. Каждый омматидий отбирает оптическую информацию под небольшим сплошным углом, с приблизительной гауссовской распределенной чувствительностью (половина ширины порядка 1°), центрированной вокруг визуальной оси. Вместе омматидии собирают визуальную информацию из почти панорамного поля зрения. Пространственное распределение визуальных осей, таким образом, определяет пространственное разрешение глаза. Знание оптической организации сложного глаза и его остроты зрения имеет решающее значение для количественных исследований нейронной обработки визуальной информации. Здесь мы представляем автоматизированную процедуру картирования зрительных осей сложного глаза, используя внутреннее, in vivo оптическое явление, псевдопупил, и механизм зрачка фоторецепторных клеток. Мы описываем оптомеханическую установку для сканирования глаз насекомых и используем экспериментальные результаты, полученные от комнатной мухи Musca domestica, чтобы проиллюстрировать этапы процедуры измерения.
Introduction
Компактность зрительных систем насекомых и ловкость их владельцев, демонстрирующая высокоразвитую обработку визуальной информации, заинтриговали людей как из научных, так и из ненаучных слоев. Составные глаза насекомых были признаны мощными оптическими устройствами, обеспечивающими острые и универсальные зрительные способности 1,2. Мухи, например, хорошо известны своей быстрой реакцией на движущиеся объекты, а пчелы славятся тем, что обладают цветовым зрением и поляризационным зрением2.
Составные глаза членистоногих состоят из многочисленных анатомически сходных единиц, омматидий, каждая из которых увенчана фасеточной линзой. У Двукрылых (мух) сборка фасетных линз, известных в совокупности как роговица, часто приближается к полушарию. Каждый омматидий пробы падающего света с небольшого сплошного угла половинной ширины порядка 1°. Омматидии двух глаз вместе отбирают примерно полный сплошной угол, но зрительные оси омматидий распределены неравномерно. Некоторые области глаз имеют высокую плотность зрительных осей, что создает область высокой пространственной остроты, в просторечии называемую ямкой. Оставшаяся часть глаза имеет более грубое пространственное разрешение 3,4,5,6,7,8,9.
Количественный анализ оптической организации сложных глаз имеет решающее значение для детальных исследований нейронной обработки визуальной информации. Исследования нейронных сетей мозга насекомого10 часто требуют знания пространственного распределения омматидиальных осей. Кроме того, сложные глаза вдохновили несколько технических инноваций. Многие инициативы по созданию био-вдохновленных искусственных глаз были построены на существующих количественных исследованиях реальных сложных глаз 11,12,13. Например, полупроводниковый датчик с высоким пространственным разрешением был разработан на основе модели глаз насекомых 11,14,15,16,17. Однако разработанные до сих пор устройства не реализовали фактические характеристики существующих глаз насекомых. Точное представление о сложных глазах насекомых и их пространственной организации потребует подробных и надежных данных от естественных глаз, которые не являются широко доступными.
Основной причиной скудости данных является крайняя утомительность имеющихся процедур построения графиков пространственных характеристик глаз. Это мотивировало попытки создать более автоматизированную процедуру картирования глаз. В первой попытке автоматизированного анализа глаз насекомых Дуглас и Велинг18 разработали процедуру сканирования для картирования размеров фасеток в роговице и продемонстрировали ее осуществимость для нескольких видов мух. Здесь мы расширяем их подход, разрабатывая методы не только сканирования граней роговицы, но и оценки визуальных осей омматидий, к которым принадлежат фасетки. Мы представляем случай с глазами комнатной мухи, чтобы проиллюстрировать соответствующие процедуры.
Экспериментальная установка для сканирования глаз насекомых является: частично оптической, т.е. микроскопом с камерой и оптикой освещения; частично механическая, т.е. гониометрическая система для вращения исследуемого насекомого; и частично вычислительное, т.е. использование программных драйверов для приборов и программ для выполнения измерений и анализов. Разработанные методы охватывают целый ряд вычислительных процедур, от захвата изображений, выбора каналов камеры и установки пороговых значений обработки изображений до распознавания отдельных фасетных местоположений с помощью ярких пятен света, отраженных от их выпуклых поверхностей. Методы преобразования Фурье имели решающее значение в анализе изображений, как для обнаружения отдельных граней, так и для анализа фасетных паттернов.
Документ структурирован следующим образом. Сначала мы представляем экспериментальную установку и феномен псевдопупила — оптический маркер, используемый для идентификации зрительных осей фоторецепторов в живых глазах 19,20,21. Далее излагаются алгоритмы, используемые в процедуре сканирования и анализе изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол соответствует руководящим принципам Университета по уходу за насекомыми.
1. Приготовление комнатной мухи, Musca domestica
- Соберите муху из лабораторно выращенной популяции. Поместите муху в латунный держатель (рисунок 1).
- Отрежьте 6 мм от верхней части удерживающей трубки (см. Таблицу материалов). Новая верхняя часть трубы имеет внешний диаметр 4 мм и внутренний диаметр 2,5 мм (рисунок 1А). Поместите живую муху внутрь трубки, запечатайте трубку хлопком, чтобы предотвратить повреждение мухи, и толкните муху так, чтобы голова выступала из трубки, а ее тело удерживалось (рисунок 1B). Обездвижьте голову пчелиным воском так, чтобы глаза оставались непокрытыми (рисунок 1С-Е).
- Снова отрежьте трубку так, чтобы длина трубки составляла 10 мм (рисунок 1С). Поместите пластиковую трубку с мухой в латунный держатель таким образом, чтобы один глаз мухи указывал вверх, когда держатель опирается на столешницу (рисунок 1D, E).
- Отрегулируйте ориентацию трубки таким образом, чтобы при возвышении гониометра на 0° (т.е. азимутальная ступень находится в горизонтальном положении) вертикальный пучок освещения микроскопа был перпендикулярен поверхности глаза в центральной области, между вентральным и дорсальным, а также между передним и задним краями глаза, чтобы весь глаз можно было сканировать в пределах диапазона азимута и высоты, разрешенных установкой.
2. Выравнивание оси вращения азимута гониометра с оптической осью микроскопа
- Установите штифт выравнивания на азимутальной ступени вращения таким образом, чтобы положение x-y наконечника можно было отрегулировать в соответствии с осью азимута на моторизованной ступени. Во время просмотра с помощью микроскопа, оснащенного 5-кратным объективом, сосредоточьтесь на наконечнике с помощью джойстика оси Z (рисунок 2).
- Совместите регулировку x-y оси азимута с оптической осью микроскопа и убедитесь, что оси возвышения и азимута вращающегося оси предварительно выровнены с центрированным штифтом с помощью джойстиков осей x и y.
- Манипулируйте джойстиками азимута и высоты, чтобы проверить, центрирован ли штифт относительно обеих степеней свободы. При хорошем центрировании кончик штифта остается примерно в том же положении во время вращения по азимуту и высоте.
3. Выравнивание глаз мухи с моторизованными ступенями
- При подъеме ступени на 0° установите муху и ее держатель на азимутальную ступень. Понаблюдайте за глазом мухи с помощью микроскопа.
- Когда светодиод подсветки включен, отрегулируйте горизонтальное положение мухи так, чтобы центр псевдопупила был выровнен с микроскопом. Отрегулируйте вертикальное положение мухи с помощью вращающегося винта держателя (рисунок 1D), так, чтобы глубокий псевдопупил (DPP; Рисунок 3) 19,20,21 выводится в фокус на уровне оси возвышения.
- Выровняйте DPP по отношению к осям азимута и высоты, центрировав его в поле зрения (см. рисунок 2). Используйте магниты, приклеенные к нижней части держателя мухи, чтобы прочно прикрепить его к железной пластине, установленной на азимутальной ступени, позволяя при этом ручную регулировку скольжения.
- Переключите вид на цифровую камеру, установленную на микроскопе. Запустите программную инициализацию системы GRACE, которая включает в себя инициализацию контроллеров двигателя и контроллера Arduino LED (рисунок 4). Поэтому откройте MATLAB R2020a или более позднюю версию. Запустите сценарий MATLAB Initialize_All_Systems (дополнительный файл 1).
- Проверьте, находится ли псевдопупил мухи (рисунок 3B, C) в центре проецируемого изображения на экране компьютера.
4. Автофокусировка и автоцентрирование
- Довести фокус до уровня псевдопупила роговицы (CPP; Рисунок 3B) 19,20,21 вручную с помощью джойстика оси Z.
- Запустите алгоритм автофокусировки (дополнительный файл 1, автофокусировка скрипта), чтобы получить четкое изображение на уровне роговицы. Проверьте, вернув фокус на уровень DPP, отрегулировав моторизованный каскад оси Z. Сохраняйте расстояние между DPP и CPP (в шагах двигателя).
- Тонкая настройка центрирования псевдопупила путем запуска алгоритма автоцентрирования (дополнительный файл 1, сценарий AC). Верните фокус на уровень CPP.
- Повторно запустите алгоритм автофокусировки. Обнулите моторизованные ступени в их текущих положениях (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), где E - высота, а A - азимут.
- Запустите алгоритм сканирования (дополнительный файл 1, скрипт Scan_Begin), который сэмплирует изображения глаз по траекториям с шагом 5°, выполняя алгоритмы автоцентрирования и автофокусировки.
- По завершении отбора проб выключите светодиодный контроллер и контроллеры двигателя.
- Обработайте изображения, применив алгоритмы обработки изображений (Дополнительный файл 1, скрипт ImProcFacets).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Животные и оптическая стимуляция
Эксперименты проводятся на комнатных мухах (Musca domestica), полученных из культуры, поддерживаемой департаментом эволюционной генетики в Университете Гронингена. Перед измерениями муху обездвиживают, склеивая ее воском с низкой температурой плавления в хорошо подогнанную трубку. Муха впоследствии монтируется на ступень моторизованного гониометра. Центр двух поворотных ступеней совпадает с фокусом микроскопической установки24. Луч света эпи-освещения подается источником света, который фокусирует свет на диафрагме, которая отображается в глазу мухи через полузеркало. Он, таким образом, активирует механизм зрачка ограниченного набора фоторецепторных клеток (рисунок 3). Оптические оси омматидий, которые содержат эти фоторецепторы, оцениваются путем вращения мухи небольшими шагами и фотографирования после каждого шага с помощью цветной цифровой камеры, прикрепленной к микроскопу (рисунок 2). Поскольку гранулы зрачкового пигмента отражаются преимущественно в длинноволновом диапазоне, красный канал цифровой камеры используется для различения псевдопупила от отражений фасеточного объектива. Последние отражения лучше всего изолировать от псевдопупила с помощью синего канала камеры.
Алгоритмы автофокусировки и автоцентрирования
Основными дополнительными алгоритмами, используемыми при сканировании глаза насекомого, являются автофокусировка и автоцентрирование (Дополнительный файл 1, скрипты AF и AC). Целью автофокусировки является приведение уровня роговицы в фокус камеры, чтобы обнаружить фасетные отражения, которые необходимы для идентификации отдельных омматидий (рисунок 3B). Процедура определения уровня роговицы заключается в изменении вертикального (Z) положения мухи шагами путем применения быстрого преобразования Фурье (FFT) к изображению, сделанному на каждом уровне, для определения пространственного частотного содержания. Критерием оптимальной фокусировки является уровень с наибольшей суммированной мощностью выше низкочастотной отсечки.
Входами для автофокусировки являются Z-позиции и потоковое видео с камеры. Выходы являются интегралом высокочастотного содержания изображения SF и уровнем фокусировки Z, где SF максимален. На начальном этапе Z-положение изображения камеры настраивается немного ниже гранечных объективов роговицы, а область, представляющая интерес для определения частотного содержания изображения, устанавливается. Цикл for запускает захват изображения и вычисляет сумму SF с фильтрацией высоких частот преобразования Фурье. Затем, поднимая двигатель оси Z вверх до уровня изображения над роговицей, обнаруживается уровень с самыми высокими частотами, т. е. где SF максимален, что принимается за уровень роговицы. Затем двигатель по оси Z настраивается на этот уровень, и делается снимок.
При фокусировке вниз от роговицы к уровню центра кривизны глаза отражения фасетки роговицы исчезают, а отражения псевдопупила сливаются в типичный семиточечный рисунок, что характерно для организации фоторецепторов внутри омматидии мухи (рисунок 3C; обратите внимание, что рисунок различим только в приблизительно сферических областях глаз). Рисунок в центре искривления глаза называется глубоким псевдопупилом (DPP)19,21.
Смещение мухи, расположенной на сцене с помощью X- и Y-двигателей так, чтобы центр светового пятна совпадал с центром изображения камеры, называется автоцентрированием. Эта процедура выравнивает грань омматидия, визуальная ось которого находится в центре ДПП, с пучком освещения и оптической осью микроскопа и камеры. Изображение гауссово фильтруется и бинаризируется, а затем центр псевдопупила определяется с помощью функции regionprops MATLAB. Входами являются положения X- и Y-двигателей и потоковое видео с камеры; выходом является расстояние между центрами изображения и псевдопупилом, которое затем переводится в сдвиг стадии.
Корреляция изображений
Глаз сканируется путем съемки и хранения фотографий при различных значениях высоты гониометра θ и азимута φ после процедур автофокусировки и автоцентрирования. Двумерная корреляция используется для определения сдвигов x-y между последовательными изображениями. Чтобы соотнести изображения, полученные в разных угловых положениях, важно понимать, что это обычно приводит к повороту текущего изображения по отношению к предыдущему изображению. Например, предположим, что центр исходного изображения соответствует точке C сферы (рисунок 5) и что происходит изменение азимута так, что плоскость OAB поворачивается над небольшим углом Δφ, становясь плоскостью OA'B. Затем центр изображения изменяется от точки C к точке C' (рисунок 5). Если плоскость изображения камеры перпендикулярна вектору OC, то поворот плоскости OAB к OA'B вызывает вращение изображения под углом β = Δφ cosθ, как β = CC'⁄BC, при этом CC' = CDΔφ, а cosθ = CD⁄BC (рисунок 5). Это означает, что в верхней части сферы (θ = 0°), β = Δφ, а на экваторе (θ = 90°) β = 0°. Когда Δφ = 0°, то есть когда изменяется только высота θ, изображения не поворачиваются относительно друг друга, поэтому β = 0°.
Во время процедуры сканирования процедура автоцентрирования центрирует омматидий, визуальная ось которого выровнена с оптической осью измерительной системы. Поворот азимута вызывает поворот на угол β и трансляцию фасетного рисунка. Чтобы определить последний сдвиг, два последовательных изображения коррелируют (после первого поворота первого изображения на угол поворота β), как описано на рисунке 6.
В алгоритме сдвига изображения (Дополнительный файл 1, скрипт ImProcFacets) отдельные грани идентифицируются центроидами их отражений в каждом изображении. Входными данными алгоритма являются высота и азимутальный угол, набор оцениваемых изображений, канал изображения и область интереса. Алгоритм создает набор центроидов и конечное изображение, которое содержит все коррелированные изображения, сделанные во время процедуры сканирования.
Гониометрическая система
Чтобы достичь выравнивания с освещением, глаз мухи должен быть сфотографирован с линзами фасетки роговицы в фокусе, а псевдопупил должен быть часто перенапряжен (здесь, после каждых 5 ° вращения). Этот автоматический процесс реализован с помощью системы GRACE (Гониометрический исследовательский аппарат для сложных глаз), схематически показанной на рисунке 4. Он состоит из трех основных подсистем: нижней и верхней ступеней с соответствующей электроникой в качестве электромеханического оборудования, прошивки, встроенной в физические контроллеры, и ПК, используемого для управления программным обеспечением, реализующим алгоритмы. Аппаратное обеспечение состоит из моторизованной и оптической ступеней, цифровой камеры, микроконтроллера для программирования интенсивности светодиодов и белого светодиодного источника света. Процедуры прошивки предоставляются с контроллерами двигателя, светодиодным контроллером и цифровой камерой. Программа состоит из алгоритмов управления положением и скоростями двигателя, регулировки светодиода, а также получения и анализа изображений. Алгоритмы, обсуждаемые далее, представляют собой основные вехи, которые позволяют системе GRACE сканировать глаза насекомых.
Глаза мухи и псевдопупилы
Когда глаз комнатной мухи освещен, падающий свет активирует механизм зрачка фоторецепторных клеток, систему подвижных пигментных гранул желтого цвета внутри тела клетки. Система управляет световым потоком, который запускает процесс фототрансдукции фоторецепторов, и, таким образом, имеет по существу ту же функцию, что и зрачок в человеческом глазу19,20. Активация механизма зрачка вызывает локально усиленное отражение в области глаз лицом к отверстию объектива микроскопа (рисунок 3). Положение ярко отражающей области глаза, псевдопупил 19,20,21, изменяется при вращении глаза, потому что падающий свет затем активирует механизм зрачка в другом наборе фоторецепторных клеток (см. Рисунок 6). Таким образом, псевдопупил действует как маркер зрительной оси омматидий, которые выровнены с микроскопом. Это позволяет отобразить пространственное распределение зрительных осей глаза 4,20,21,22,23.
Заполнение недостающих граней
Не все грани идентифицируются центроидной процедурой, например, из-за низкой локальной отражательной способности, вызванной незначительными неровностями поверхности или пылинками пыли. Последнее также может привести к ошибочным центроидам (рисунок 7А). Эта проблема решается, во-первых, промыванием глаз под водопроводным краном, а во-вторых, путем применения процедуры заполнения (скрипт ImProcFacets). Поэтому сначала определяются центроиды в области (рисунок 7А), а затем вычисляется БПФ (рисунок 7В). Первое кольцо гармоник (желтые звезды на рисунке 7B) определяет три ориентации, обозначенные синей, красной и зеленой линиями (рисунок 7B). Обратное преобразование гармоник вдоль трех ориентаций дает серые полосы на рисунке 7C-E. Подгонка полинома второго порядка к серым полосам дает линии, соединяющие фасетные центроиды вдоль трех осей решетки. Точки пересечения линий решетки, таким образом, соответствуют истинным фасетным центрам. Поскольку пример рисунка 7 является крайним случаем, он демонстрирует, что процедура надежна. В большинстве областей отсутствующие грани и ошибочные центроиды встречаются редко.
Сканирование глаза мухи
На рисунке 8 показана полоса омматидий, отсканированная по всему глазу путем выполнения серии ступенчатых азимутальных изменений с Δφ = 5°. Сканирование с фронтальной стороны глаза (рисунок 8А, справа) на боковую сторону (рисунок 8А, слева) происходило в 24 шага. Центроиды в значительной степени перекрывающихся фасетных паттернов впоследствии поворачивались β = Δφcosθ. Затем, после смещения центроидов каждого изображения и заполнения недостающих граней (с помощью скрипта ImProcFacets), колокализованные центроиды усредняли. На рисунке 8A показаны комбинированные изображения вместе с центрами изображения и фасетными центроидами. На рисунке 8B показана сборка граней в виде диаграммы Вороного.
Рисунок 1: Установка мухи в латунный держатель. (A) Наконечник с комнатной мухой, подлежащей исследованию. (B) Разрезанный наконечник с мухой осторожно придвинут к концу с помощью куска хлопка и палочки для еды. (C) наконечник с мухой далее разрезается на общую длину 10 мм. (D) Латунный держатель с мухой, помещаемый на ступень угломера; стрелка указывает на винт регулировки высоты. (E) Фотография мухи крупным планом с головой, обездвиженной куском низкотемпературного плавящегося воска (#) к кончику (*). Эпиосвещение активировало механизм зрачка фоторецепторов глаза, о чем свидетельствует желтый псевдопупил. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: GRACE, гониометрический исследовательский аппарат для сложных глаз. Исследуемое насекомое (муха) монтируется на моторизованной ступени, состоящей из трех ступеней трансляции (X, Y, Z) и двух ступеней вращения (возвышение и азимут). Объектив фокусирует свет от белого светодиода на диафрагме, фокусируемого через полузеркало в глазу мухи. Глаз фотографируется с помощью камеры, прикрепленной к микроскопу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оптика глаз мухи. (A) Диаграмма трех омматидий глаза мухи, каждая из которых увенчана двояковыпуклой фасеточной линзой, которая фокусирует падающий свет на набор фоторецепторных клеток (желтый), окруженный первичными (коричневыми) и вторичными (красными) пигментными клетками. Интенсивное освещение темных фоторецепторов (DA) вызывает миграцию желтых пигментных гранул (обозначенных черными точками), которые существуют внутри фоторецепторных клеток. Накопленные к кончику фоторецепторов, вблизи светочувствительных органелл, рабдомеров, они поглощают и рассеивают свет обратно в светоадаптированном (LA) состоянии. (B) Изображение на уровне поверхности глаза, показывающее фасетные отражения (яркие точки), а также отражение пигментных гранул в активированном состоянии (псевдопупил роговицы, CPP). (C) Изображение, сделанное на уровне центра искривления глаза (глубокий псевдопупил, DPP), отражающее расположение фоторецепторных клеток в трапециевидном рисунке, с их дистальными концами, расположенными примерно в фокальной плоскости фасеточных линз. Наложенное виртуальное изображение кончиков фоторецептора, таким образом, существует в плоскости центра искривления глаза. Шкала 100 мкм применяется к панелям B и C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Принципиальная схема системы GRACE. Программное обеспечение ПК управляет прошивкой, которая приводит в движение электромеханическое оборудование. Цифровая камера делает через оптическую стадию изображения глаза образца. Светодиодный источник света освещает образец, а двигатели моторизованной ступени приводят в действие X-, Y- и Z-трансляции, а также вращения по азимуту (A) и высоте (E). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Диаграмма для получения поворота изображения при сканировании глаза мухи. Если центр исходного изображения соответствует точке С сферы и происходит изменение азимута, то плоскость OAB поворачивается на малый угол Δφ, становясь плоскостью OA'B. Затем центр изображения изменяется от точки C к точке C'. Поворот плоской автономной адресной книги в OA'B вызывает поворот изображения под углом β = Δφ cosθ (см. текст, раздел Корреляция изображений). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Процедура обработки изображения для определения интеромматидиального угла. (A) Изображение, полученное во время сканирования по всему глазу, с фасетными центроидами, отмеченными зелеными кругами и красными квадратами, и зеленой точкой в центре изображения. (B) Последующее изображение после азимутального поворота на 5°, с фасетными центроидами, отмеченными красными квадратами и красной точкой в центре изображения. (C) Коррелограмма области в пределах зеленого квадрата А, коррелированная с изображением В. Вектор от центра C (зеленая точка) к максимальному значению коррелограммы представляет собой относительный сдвиг изображений A и B. С помощью этого вектора смещенный квадрат A и его центр рисуются в B, а фасетные центроиды (красные квадраты) B добавляются в A. Шкала 100 мкм применяется к панелям A-C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Получение отсутствующих фасетных центроидов путем применения преобразований Фурье. (A) Локальное RGB-изображение с фасетными центроидами (красными точками). Белые наконечники стрел указывают на отсутствующие грани, а красный наконечник стрелы указывает на ошибочный центроид. (B) БПФ центроидов А с первым кольцом гармоник, отмеченным желтыми звездами. (С-Е) Обратный БПФ центроидов вдоль трех направлений, обозначенных цветными линиями в B, давая сероватые полосы. Синие (C), красные (D) и зеленые (E) линии являются квадратичными полиномами, подходящими к серым полосам, а центроиды (красные круги) — это те, которые были получены до преобразований Фурье. F) установленные линии С-Е в сочетании с центроидами А. Отсутствующие фасетные центроиды затем извлекаются из точек пересечения. Шкала 100 мкм применяется к панелям A, C-F. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Правый глаз комнатной мухи, отсканированный с одной стороны на другую сторону. (A) Комбинированные, перекрывающиеся изображения серии изображений, в которых азимут был изменен шагом на 5°, вместе с центрами изображения (зеленые кресты) и фасетными центроидами (красные круги). (B) Диаграмма Вороного фасетных центроидов, с центрами изображения, как в A. Шкала 100 мкм применяется к панелям A и B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Пространственное распределение зрительных осей глаз комнатной мухи может быть построено с использованием псевдопупильского феномена сложных глаз и изменений отражения, вызванных светозависимым механизмом зрачка. Поэтому исследуемая муха устанавливается в гониометрическую систему, которая позволяет проверять локальный фасетный рисунок с помощью микроскопа, оснащенного цифровой камерой, все под компьютерным управлением. Анализ изображений дает карты глаз. Существенная трудность заключается в том, что без тщательного позиционирования глаза в начале измерений видимые положения как глаза, так и псевдопупила могут значительно изменяться даже при небольших вращениях гониометрического устройства. Эти изменения сводятся к минимуму путем позиционирования глазного центра в гониометрическом центре вращения, где наблюдается глубокий псевдопупил. Соотнося впоследствии измеренные изображения, можно отследить фасетный рисунок. Важно отметить, что угол поворота должен быть скорректирован до довольно небольшого значения, потому что в областях, где фасетная картина очень регулярна, процедура корреляции подвержена ошибочным результатам.
Здесь мы представили частичную карту глаз (рисунок 8), которая демонстрирует возможность высокоавтоматизированного картирования остроты зрения в глазах насекомых. Межкомматидные углы около 2,0°-2,5°, очевидные из сравнения фасетных интервалов со сдвигами 5° между последовательными центрами изображения, хорошо соответствуют данным, которые ранее были получены, гораздо более трудоемким образом, от одного и того же вида (Musca domestica)25. Полные карты глаз визуального пространства комнатных мух и других насекомых будут опубликованы в другом месте.
Метод, представленный здесь, позволяет отображать визуальные оси полного глаза, in vivo, всего за несколько часов, чего будет крайне трудно достичь при других подходах. Автоматизированный метод картографирования проиллюстрирован здесь для случая комнатной мухи, но его можно просто распространить на сложные глаза других насекомых, таких как бабочки. Однако вместо зрачкового отражения глаз бабочки служит маркером зрительной оси21,24. Альтернативным методом является недавно разработанная рентгеновская микротомография26. Этот ценный подход дает подробные анатомические карты, но уязвим для оптических ошибок, особенно когда визуальные оси омматидий смещены к поверхности глаза 21, или если обработкатканей искажает геометрию глаза настолько, чтобы поставить под угрозу измерения. Визуализация псевдопупила более или менее проста в глазах мух, которые имеют блестящий механизм зрачка. Это менее легко в сложных глазах с плохо отражающим механизмом зрачка, как, например, у пчел21. Тем не менее, для многих других видов насекомых, таких как мухи-солдаты или пчелы, может быть использована флуоресценция визуальных пигментов в омматидиальных рабдомах. Применение флуорофоров, создающих сильную рабдомную флуоресценцию, дает еще одну возможность оценить пространственную организацию зрительного пространства глаза27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов, о которых можно было бы сообщить.
Acknowledgments
Это исследование было финансово поддержано Управлением научных исследований ВВС / Европейским управлением аэрокосмических исследований и разработок AFOSR / EOARD (грант FA9550-15-1-0068, D.G.S.). Мы благодарим д-ра Приможа Пириха за многочисленные полезные обсуждения, а также Кехана Сату, Хейна Леертувера и Оскара Ринкона Карденьо за помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision of amplified images and digital communication with PC |
| High power star LED | Velleman | LH3WW | Light source for observation and imaging the compound eye |
| Holder for the investigated fly | University of Groningen | Different designs were manufactured by the university workshop | |
| Linear motor | ELERO | ELERO Junior 1, version C | Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A) |
| Low temperature melting wax | various | The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder | |
| Microscope | Zeiss | Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x | |
| Motor and LED Controller | University of Groningen | Z-o1 | Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies. |
| Motorized Stage | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom. |
| Optical components | LINUS | Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| PC running MATLAB | University of Groningen | The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system | |
| Power Supply (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Lithuania) | PUP120-17 | Dedicated power supply for the STANDA motor controllers |
| Soldering iron | various | Used for melting the wax | |
| Stepper and DC Motor Controller | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly |
| Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes. | Programming language used to implement the algorithms |
References
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M. Topography of vision and behaviour. The Journal of Experimental Biology. 212, Pt 21 3522-3532 (2009).
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002 (2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168 (2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782 (2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613 (2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267 (2021).
