Summary
Protokollet här beskriver mätningen av den rumsliga organisationen av de visuella axlarna av husflyögon, kartlagda av en automatisk anordning, med användning av pseudopupilfenomenet och fotoreceptorcellernas pupilmekanism.
Abstract
Detta dokument beskriver den automatiska mätningen av den rumsliga organisationen av de visuella axlarna av insektsföreningsögon, som består av flera tusentals visuella enheter som kallas ommatidia. Varje ommatidium samplar den optiska informationen från en liten fast vinkel, med en ungefärlig Gaussisk-fördelad känslighet (halvbredd i storleksordningen 1 °) centrerad kring en visuell axel. Tillsammans samlar ommatidierna den visuella informationen från ett nästan panoramiskt synfält. Den rumsliga fördelningen av de visuella axlarna bestämmer således ögats rumsliga upplösning. Kunskap om den optiska organisationen av ett sammansatt öga och dess synskärpa är avgörande för kvantitativa studier av neural bearbetning av den visuella informationen. Här presenterar vi en automatiserad procedur för att kartlägga ett sammansatt ögas visuella axlar, med hjälp av ett inneboende, in vivo optiskt fenomen, pseudopupilen och pupillmekanismen hos fotoreceptorcellerna. Vi beskriver den optomekaniska inställningen för skanning av insektsögon och använder experimentella resultat som erhållits från en husfluga, Musca domestica, för att illustrera stegen i mätproceduren.
Introduction
Kompaktiteten hos insektsvisuella system och deras ägares smidighet, som visar högutvecklad visuell informationsbehandling, har fascinerat människor från både vetenskapliga och icke-vetenskapliga bakgrunder. Insektsföreningsögon har erkänts som kraftfulla optiska enheter som möjliggör akut och mångsidig visuell kapacitet 1,2. Flugor är till exempel kända för sina snabba svar på rörliga föremål, och bin är kända för att ha färgseende ochpolariseringssyn 2.
Leddjurens sammansatta ögon består av många anatomiskt liknande enheter, ommatidierna, som var och en är täckt av en fasettlins. I Diptera (flugor) närmar sig monteringen av fasettlinser, kollektivt känd som hornhinnan, ofta en halvklot. Varje ommatidium provtar infallande ljus från en liten fast vinkel med halvbredd i storleksordningen 1°. Ommatidia av de två ögonen tillsammans prov ungefär hela den fasta vinkeln, men ommatidias visuella axlar är inte jämnt fördelade. Vissa ögonområden har en hög densitet av visuella axlar, vilket skapar en region med hög rumslig skärpa, i allmänhet kallad en fovea. Den återstående delen av ögat har då en grövre rumslig upplösning 3,4,5,6,7,8,9.
En kvantitativ analys av den optiska organisationen av de sammansatta ögonen är avgörande för detaljerade studier av neural bearbetning av visuell information. Studier av de neurala nätverken i en insekts hjärna10 kräver ofta kunskap om den rumsliga fördelningen av de ommatidiella axlarna. Dessutom har sammansatta ögon inspirerat till flera tekniska innovationer. Många initiativ för att producera bioinspirerade konstgjorda ögon har byggts på befintliga kvantitativa studier av verkliga sammansatta ögon 11,12,13. Till exempel designades en halvledarbaserad sensor med hög rumslig upplösning baserat på modellen av insektsföreningsögon 11,14,15,16,17. De enheter som hittills utvecklats har emellertid inte implementerat de faktiska egenskaperna hos befintliga insektsögon. Noggranna representationer av insektsföreningsögon och deras rumsliga organisation kommer att kräva detaljerade och tillförlitliga data från naturliga ögon, vilket inte är allmänt tillgängligt.
Den främsta orsaken till bristen på data är den extrema tråkigheten hos de tillgängliga förfarandena för att kartlägga ögonens rumsliga egenskaper. Detta har motiverat försök att etablera en mer automatiserad ögonkartläggningsprocedur. I ett första försök till automatiserade analyser av insektsföreningar utvecklade Douglass och Wehling18 ett skanningsförfarande för att kartlägga fasettstorlekar i hornhinnan och visade dess genomförbarhet för några få flugarter. Här utvidgar vi deras tillvägagångssätt genom att utveckla metoder för att inte bara skanna hornhinnans fasetter utan också bedöma de visuella axlarna i ommatidia som fasetterna tillhör. Vi presenterar fallet med husflyögon för att exemplifiera de inblandade förfarandena.
Den experimentella installationen för att skanna insektsögon är: delvis optisk, dvs ett mikroskop med kamera och belysningsoptik; delvis mekaniskt, dvs ett goniometersystem för att rotera den undersökta insekten; och delvis beräkningsmässig, dvs användning av mjukvarudrivrutiner för instrument och program för att utföra mätningar och analyser. De utvecklade metoderna omfattar en rad beräkningsprocedurer, från att ta bilder, välja kamerakanaler och ställa in trösklar för bildbehandling till att känna igen enskilda fasettplatser via ljusa ljuspunkter som reflekteras från deras konvexa ytor. Fouriertransformmetoder var avgörande i bildanalysen, både för att detektera enskilda aspekter och för att analysera fasettmönstren.
Uppsatsen är uppbyggd enligt följande. Vi introducerar först den experimentella installationen och pseudopupilfenomenet - den optiska markören som används för att identifiera fotoreceptorernas visuella axlar i levande ögon 19,20,21. Därefter beskrivs algoritmerna som används i skanningsproceduren och bildanalysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet är i enlighet med universitetets riktlinjer för insektsvård.
1. Förberedelse av en husfluga, Musca domestica
- Samla flugan från den laboratorieuppfödda befolkningen. Placera flugan i mässingshållaren (figur 1).
- Skär 6 mm från den övre delen av fasthållningsröret (se materialtabell). Den nya övre delen av röret har en ytterdiameter på 4 mm och en innerdiameter på 2,5 mm (figur 1A). Placera den levande flugan inuti röret, försegla röret med bomull för att förhindra att flugan skadas och tryck på flugan så att huvudet sticker ut från röret och dess kropp är fasthållen (figur 1B). Immobilisera huvudet med bivax så att ögonen förblir avtäckta (figur 1C-E).
- Skär röret igen så att rörlängden är 10 mm (figur 1C). Placera plaströret med flugan i mässingshållaren, så att ena ögat på flugan pekar uppåt när hållaren vilar på en bordsskiva (figur 1D,E).
- Justera rörets orientering så att med goniometerhöjden vid 0 ° (dvs. azimutsteget är i ett horisontellt läge) är mikroskopets vertikala belysningsstråle vinkelrätt mot ögonytan i ett centralt område, mellan ventral och dorsal, och mellan främre och bakre kanter av ögat, så att hela ögat kan skannas inom det intervall av azimut och höjd som tillåts av installationen.
2. Justering av goniometerns roterande azimutaxel med mikroskopets optiska axel
- Montera en justeringsstift på azimutrotationssteget så att spetsens x-y-position kan justeras så att den sammanfaller med azimutaxeln på det motoriserade steget. När du tittar med mikroskopet, utrustat med ett 5x-mål, fokusera på spetsen med z-axelns joystick (figur 2).
- Rikta in x-y-justeringen av azimutaxeln mot mikroskopets optiska axel och se till att höjd- och azimutrotationsaxlarna är förjusterade med den centrerade stiftet med hjälp av x- och y-axelns joysticks.
- Manipulera joysticks för azimut och höjd för att kontrollera om stiftet är centrerat med avseende på båda frihetsgraderna. När den är väl centrerad förblir stiftspetsen i ungefär samma position under azimut- och höjdrotationer.
3. Inriktning av flugögat med de motoriserade stegen
- Med höjdsteget vid 0 °, montera flugan och dess hållare på azimutsteget. Observera flugans öga med mikroskopet.
- Med belysningslampan på, justera flugans horisontella läge så att pseudopupilens mitt är i linje med mikroskopet. Justera flugans vertikala läge med hjälp av hållarens roterande skruv (figur 1D), så att den djupa pseudopupilen (DPP; Figur 3) 19,20,21 sätts i fokus på höjdaxelns nivå.
- Rikta in DPP med avseende på azimut- och höjdaxlarna genom att centrera den i synfältet (se figur 2). Använd magneterna limmade på botten av flughållaren för att fästa den ordentligt på en järnplatta monterad på azimutsteget, samtidigt som du tillåter manuella glidjusteringar.
- Byt vy till digitalkameran monterad vid mikroskopet. Kör programvaruinitieringen av GRACE-systemet, vilket inkluderar initialisering av motorstyrenheterna och Arduino LED-styrenheten (figur 4). Öppna därför MATLAB R2020a eller högre version. Kör MATLAB-skriptet Initialize_All_Systems (tilläggsfil 1).
- Bekräfta om flugans pseudopupil (figur 3B,C) är i mitten av den projicerade bilden på datorskärmen.
4. Autofokusering och autocentering
- Ta fokus till nivån på hornhinnans pseudopupil (CPP; Figur 3B) 19,20,21 manuellt med hjälp av z-axelns joystick.
- Kör autofokuseringsalgoritmen (tilläggsfil 1, skript AF) för att uppnå en skarp bild på hornhinnenivå. Kontrollera genom att återställa fokus till DPP-nivån genom att justera det motoriserade z-axelsteget. Förvara avståndet mellan DPP och CPP (i motorsteg).
- Finjustera pseudopupilcentreringen genom att köra autocenteringalgoritmen (tilläggsfil 1, skript AC). Ta tillbaka fokus till CPP-nivån.
- Kör om autofokuseringsalgoritmen. Nollställ de motoriserade stegen vid deras nuvarande positioner (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), där E är höjd och A är azimut.
- Kör skanningsalgoritmen (Supplementary File 1, script Scan_Begin), som samplar ögonbilder längs banor i 5 ° steg, medan du utför autocentering- och autofokuseringsalgoritmerna.
- Vid slutet av provtagningen stänger du av LED-styrenheten och motorstyrenheterna.
- Bearbeta bilderna genom att använda bildbehandlingsalgoritmerna (tilläggsfil 1, skript ImProcFacets).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Djur och optisk stimulering
Experiment utförs på husflugor (Musca domestica) erhållna från en kultur som upprätthålls av institutionen för evolutionär genetik vid universitetet i Groningen. Före mätningarna immobiliseras en fluga genom att limma den med ett lågsmältpunktsvax i ett välsittande rör. Flugan monteras därefter på scenen i en motoriserad goniometer. Mitten av de två roterande stegen sammanfaller med brännpunkten för en mikroskopisk inställning24. Ljusstrålen för epi-belysning levereras av en ljuskälla, som fokuserar ljus på ett membran som avbildas vid flugans öga via en halvspegel. Det aktiverar således pupillmekanismen för en begränsad uppsättning fotoreceptorceller (Figur 3). De optiska axlarna i ommatidia som innehåller dessa fotoreceptorer bedöms genom att rotera flugan i små steg och ta fotografier efter varje steg med en färg digitalkamera ansluten till ett mikroskop (Figur 2). Eftersom pupillpigmentgranulerna reflekterar övervägande i det långa våglängdsområdet används digitalkamerans röda kanal för att skilja pseudopupilen från fasettlinsreflektionerna. De senare reflektionerna isoleras bäst från pseudopupilen med kamerans blå kanal.
Autofokusering och autocentering algoritmer
De viktigaste ytterligare algoritmerna som används vid skanning av en insekts öga är autofokusering och autocentering (tilläggsfil 1, skript AF och AC). Målet med autofokusering är att föra hornhinnenivån till kamerans fokus för att upptäcka de fasettreflektioner som är nödvändiga för identifiering av enskilda ommatidier (figur 3B). Proceduren för att detektera hornhinnenivån är att ändra flugans vertikala (Z) position i steg genom att applicera den snabba Fouriertransformen (FFT) på bilden som tas på varje nivå för att bestämma det rumsliga frekvensinnehållet. Kriteriet för optimal fokusering är den nivå med störst summerad effekt över en lågfrekvent avstängning.
Ingångarna för autofokusering är Z-positionerna och strömmande video från kameran. Utgångarna är integralen av det högfrekventa innehållet i bilden SF och fokuseringsnivån Z där SF är maximal. I det första steget justeras kamerabildens Z-position till något under hornhinnans fasettlinser, och det område som är av intresse för att bestämma bildens frekvensinnehåll ställs in. For-slingan startar bildtagningen och beräknar summan av den högpassfiltrerade Fourier-transform SF. Genom att sedan kliva z-axelmotorn uppåt till en bildnivå ovanför hornhinnan hittas nivån med de högsta frekvenserna, dvs där SF är maximal, vilket antas vara hornhinnenivån. Z-axelmotorn justeras sedan till den nivån och en bild tas.
När man fokuserar ner från hornhinnan mot nivån på ögats krökningscentrum bleknar hornhinnans fasettreflektioner bort och pseudopupilreflektionerna samlas i ett typiskt sjupunktsmönster, vilket är en egenskap för organisationen av fotoreceptorerna i flugommatidia (Figur 3C; notera att mönstret endast är distinkt i ungefär sfäriska ögonområden). Mönstret vid ögats krökningsnivå kallas den djupa pseudopupilen (DPP)19,21.
Att flytta flugan placerad på scenen med X- och Y-motorerna så att ljuspunktens mitt sammanfaller med mitten av kamerabilden kallas autocentering. Denna procedur justerar ommatidiumets fasett vars visuella axel ligger i mitten av DPP med belysningsstrålen och mikroskopets och kamerans optiska axel. Bilden är Gaussisk filtrerad och binariserad, och sedan bestäms mitten av pseudopupilen med hjälp av funktionen regionprops MATLAB. Ingångarna är positionerna för X- och Y-motorerna och strömmande video från kameran; utgången är avståndet mellan bildcentrum och pseudopupil, som sedan översätts till ett scenskifte.
Korrelera bilder
Ögat skannas genom att ta och lagra fotografier vid olika värden av goniometerhöjden θ och azimut φ efter autofokuserings- och autocenteringprocedurerna. Tvådimensionell korrelation används för att bestämma x-y-förskjutningarna mellan på varandra följande bilder. För att korrelera bilderna som erhållits vid olika vinkelpositioner är det viktigt att inse att detta i allmänhet resulterar i en rotation av den aktuella bilden i förhållande till föregående bild. Låt oss till exempel anta att mitten av en initial bild motsvarar punkt C i en sfär (figur 5) och att en förändring i azimut inträffar så att plan OAB roteras över en liten vinkel Δφ och blir plan OA'B. Bildens mittpunkt ändras sedan från punkt C till punkt C' (figur 5). Om kamerans bildplan är vinkelrätt mot vektorn OC, orsakar rotation av plan OAB till OA'B rotation av bilden över en vinkel β = Δφ cosθ, som β = CC'⁄BC, med CC' = CDΔφ och cosθ = CD⁄BC (figur 5). Detta innebär att på toppen av sfären (θ = 0°), β = Δφ och vid ekvatorn (θ = 90°), β = 0°. När Δφ = 0°, det vill säga när endast höjden θ ändras, roteras inte bilderna i förhållande till varandra, så β = 0°.
Under skanningsproceduren centrerar autocenteringproceduren ommatidium vars visuella axel är i linje med mätsystemets optiska axel. Rotation av azimut orsakar en rotation med en vinkel β och en översättning av fasettmönstret. För att bestämma det senare skiftet korreleras två på varandra följande bilder (efter att den första bilden först har roterats med rotationsvinkeln β), vilket förklaras i figur 6.
I bildskiftalgoritmen (Supplementary File 1, skript ImProcFacets) identifieras de enskilda fasetterna av centroiderna av deras reflektioner i varje bild. Ingångarna till algoritmen är höjd- och azimutvinkeln, uppsättningen bilder som ska bedömas, bildkanalen och intresseområdet. Algoritmen producerar en uppsättning centroider och en slutlig bild som innehåller alla korrelerade bilder som tagits under skanningsproceduren.
Det goniometriska systemet
För att uppnå anpassning till belysningen måste flugans öga fotograferas med hornhinnans fasettlinser i fokus, och pseudopupilen måste recenteras ofta (här, efter varje 5 ° rotation). Denna automatiska process realiseras med GRACE-systemet (Goniometric Research Apparatus for Compound Eyes), som visas schematiskt i figur 4. Den består av tre huvudundersystem: de nedre och övre stadierna med deras respektive elektronik som den elektromekaniska hårdvaran, firmware inbäddad i de fysiska styrenheterna och datorn som används för att driva programvaran som implementerar algoritmerna. Hårdvaran består av de motoriserade och optiska stegen, digitalkameran, en mikrokontroller för programmering av LED-intensiteter, och en vit LED-ljuskälla. Firmwareens rutiner är försedda med motorstyrenheterna, LED-styrenheten och i digitalkameran. Programvaran består av algoritmerna för att styra motorpositioner och hastigheter, justera lysdioden och hämta och analysera bilder. Algoritmerna som diskuteras härnäst representerar de viktigaste milstolparna som gör det möjligt för GRACE-systemet att skanna insektsögon.
Flyga ögon och pseudopupils
När ett husflyöga är upplyst aktiverar det infallande ljuset pupillmekanismen hos fotoreceptorcellerna, ett system med mobila, gulfärgade pigmentgranuler inuti cellkroppen. Systemet styr ljusflödet som utlöser fototransduktionsprocessen hos fotoreceptorerna och har därmed i huvudsak samma funktion som pupillen i det mänskliga ögat19,20. Aktiveringen av pupillmekanismen orsakar en lokalt förbättrad reflektion i ögonområdet mot bländaren på mikroskopets mål (figur 3). Positionen för det starkt reflekterande ögonområdet, pseudopupilen19,20,21, ändras vid ögats rotation eftersom det infallande ljuset sedan aktiverar pupillmekanismen i en annan uppsättning fotoreceptorceller (se figur 6). Pseudopupilen fungerar således som en markör för den visuella axeln hos ommatidierna som är i linje med mikroskopet. Detta möjliggör kartläggning av den rumsliga fördelningen av ögats visuella axlar 4,20,21,22,23.
Fylla i saknade aspekter
Inte alla aspekter identifieras av centroidproceduren, till exempel på grund av en låg lokal reflektans orsakad av mindre ojämnheter i ytan eller dammfläckar. Det senare kan också resultera i felaktiga centroider (figur 7A). Detta problem löses först genom att tvätta ögonen under en vattenkran och för det andra genom att tillämpa en fyllningsprocedur (skript ImProcFacets). Därför bestäms centroiderna i ett område först (figur 7A) och sedan beräknas FFT (figur 7B). Den första ringen av övertoner (gula stjärnor i figur 7B) definierar tre riktningar, indikerade av de blå, röda och gröna linjerna (figur 7B). Invers transformation av övertonerna längs de tre orienteringarna ger de grå banden i figur 7C-E. Att montera ett andra ordningens polynom på de grå banden ger linjer som förbinder fasettcentroiderna längs de tre gitteraxlarna. Gitterlinjernas korsningspunkter motsvarar således de sanna fasettcentren. Eftersom exemplet med figur 7 är ett extremfall visar det att förfarandet är robust. I de flesta områden är saknade aspekter och felaktiga centroider sällsynta.
Skanna ett flugöga
Figur 8 visar ett band av ommatidier som skannats över ögat genom att utföra en serie stegvisa azimutala förändringar med Δφ = 5°. Skanning från ögats främre sida (figur 8A, höger) till sidosidan (figur 8A, vänster) skedde i 24 steg. Centroiderna i de i stort sett överlappande fasettmönstren roterades därefter med β = Δφcosθ. Sedan, efter att ha flyttat centroiderna för varje bild och fyllt i de saknade fasetterna (med skript ImProcFacets), var de samlokaliserade centroiderna i genomsnitt. Figur 8A visar de kombinerade bilderna, tillsammans med bildcentren och fasettcentroider. Figur 8B visar montering av fasetter som ett Voronoi-diagram.
Figur 1: Montera flugan i mässingshållaren. (B) Den skurna spetsen med flugan försiktigt skjuten till änden med en bit bomull och en ätpinne. (C) Spetsen med flugan skärs ytterligare till en total längd av 10 mm. (D) Mässingshållaren med flugan som ska placeras på goniometersteget; pilen pekar på höjdjusteringsskruven. (E) Närbild av flugan med huvudet immobiliserat av en bit smältvax med låg temperatur (#) till spetsen (*). Epi-belysning har aktiverat pupillmekanismen hos ögats fotoreceptorer, vilket avslöjas av den gula pseudopupilen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: GRACE, den goniometriska forskningsapparaten för sammansatta ögon. Den undersökta insekten (en fluga) är monterad i det motoriserade steget som består av tre översättningssteg (X, Y, Z) och två rotationssteg (höjd och azimut). En lins fokuserar ljus från en vit lysdiod vid ett membran, fokuserat via en halvspegel vid flugans öga. Ögat fotograferas med en kamera fäst vid ett mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
(A) Diagram över tre ommatidier i ett flugöga, var och en täckt av en bikonvex fasettlins, som fokuserar infallande ljus på en uppsättning fotoreceptorceller (gul), omgiven av primära (bruna) och sekundära (röda) pigmentceller. Intensiv belysning av mörkanpassade (DA) fotoreceptorer orsakar migration av gula pigmentgranuler (indikerade med svarta prickar), som finns inuti fotoreceptorcellerna. Ackumulerat mot spetsen av fotoreceptorerna, nära de ljuskänsliga organellerna, rabdomererna, absorberar de och bakåtspriderar ljus i det ljusanpassade (LA) tillståndet. (B) Bild på ögonytans nivå, som visar fasettreflektionerna (ljusa prickar) samt pigmentgranulreflektionen i aktiverat tillstånd (hornhinnans pseudopupil, CPP). (C) Bild tagen på nivån av centrum av ögonkrökningen (den djupa pseudopupilen, DPP), vilket återspeglar arrangemanget av fotoreceptorcellerna i ett trapetsformat mönster, med deras distala ändar placerade vid ungefär fasettlinsernas fokalplan. En överlagrad virtuell bild av fotoreceptorspetsarna finns således i planet i mitten av ögonkrökningen. Skalstreck 100 μm gäller för panelerna B och C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Schematiskt diagram över GRACE-systemet. PC-programvaran styr firmware, som driver den elektromekaniska hårdvaran. Digitalkameran tar, via ett optiskt steg, bilder av provets öga. LED-ljuskällan belyser provet, och motorerna i det motoriserade steget aktiverar X-, Y- och Z-översättningarna samt azimut (A) och höjd (E) rotationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Diagram för att härleda bildrotationen när du skannar flugögat. Om mitten av en initial bild motsvarar punkt C i en sfär och en förändring i azimut inträffar, roteras planet OAB över en liten vinkel Δφ och blir plan OA'B. Bildens mittpunkt ändras sedan från punkt C till punkt C'. Rotation av plan OAB till OA'B orsakar rotation av bilden över en vinkel β = Δφ cosθ (se text, avsnitt Korrelerande bilder). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Bildbehandlingsproceduren för att bestämma interommatidialvinkeln(A) Bild tagen under en skanning över ögat, med fasettcentroider markerade med gröna cirklar och röda rutor och en grön prick i bildcentret. (B) Efterföljande bild efter en azimutal rotation på 5 °, med fasettcentroider markerade med röda rutor och en röd prick i bildcentret. (C) Korrelogram över området inom den gröna kvadraten av A korrelerat med bild B. Vektorn från mitten av C (grön punkt) till korrelogrammets maximala värde representerar den relativa förskjutningen av bilderna A och B. Med hjälp av den vektorn ritas den förskjutna kvadraten av A och dess centrum i B och fasettcentroiderna (röda rutor) av B läggs till i A. Skalfältet 100 μm gäller för panelerna A-C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 7: Härleda saknade fasettcentroider genom att använda Fouriertransformationer. Vita pilspetsar indikerar saknade fasetter och den röda pilspetsen pekar på en felaktig centroid. (B) FFT för centroiderna i A med den första ringen av övertoner markerade med gula stjärnor. (C-E) Invers FFT av centroiderna längs de tre riktningarna som indikeras av de färgade linjerna i B, vilket ger de gråaktiga banden. De blå (C), röda (D) och gröna (E) linjerna är kvadratiska polynompassningar till de grå banden, och centroiderna (röda cirklar) är de som erhölls före Fouriertransformerna. F) De monterade linjerna för C-E tillsammans med centroiderna i A. De saknade fasettcentroiderna härleds sedan från korsningsställena. Skalstreck 100 μm gäller för panelerna A, C-F. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 8: Det högra ögat på en husfluga skannad från ena sidan till den andra sidan. (B) Voronoi-diagram över fasettcentroiderna, med bildcentren som i A. Skalfältet 100 μm gäller för panelerna A och B. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den rumsliga fördelningen av de visuella axlarna i husflyögon kan kartläggas med hjälp av pseudopupilfenomenet sammansatta ögon och reflektionsförändringarna orsakade av den ljusberoende pupillmekanismen. Därför monteras en undersökt fluga i ett goniometriskt system, vilket möjliggör inspektion av det lokala fasettmönstret med en mikroskopinställning utrustad med en digitalkamera, allt under datorstyrning. Bildanalys ger ögonkartor. En väsentlig svårighet som uppstår är att utan noggrann positionering av ögat i början av mätningarna kan de betraktade positionerna för både ögat och pseudopupilen förändras avsevärt även med små rotationer av den goniometriska anordningen. Dessa förändringar minimeras genom att placera ögoncentret vid det goniometriska rotationscentret, där den djupa pseudopupilen observeras. Genom att korrelera de därefter uppmätta bilderna kan fasettmönstret spåras. Viktigt är att rotationsvinkeln måste justeras till ett ganska litet värde eftersom i områden där fasettmönstret är mycket regelbundet är korrelationsförfarandet benäget för felaktiga resultat.
Här har vi presenterat en partiell ögonkarta (figur 8), som visar genomförbarheten av högautomatiserad kartläggning av synskärpan i insektsögon. De interommatidiella vinklarna på cirka 2,0 ° -2,5 °, vilket framgår av att jämföra fasettavstånden med 5 ° -förskjutningarna mellan på varandra följande bildcentra, motsvarar väl data som tidigare härleddes, på ett mycket mer mödosamt sätt, från samma art (Musca domestica)25. Kompletta ögonkartor över det visuella utrymmet för husflugor och andra insekter kommer att publiceras någon annanstans.
Metoden som presenteras här gör det möjligt att kartlägga de visuella axlarna på ett komplett öga, in vivo, inom bara några timmar, vilket kommer att vara extremt svårt att uppnå med andra tillvägagångssätt. Den automatiserade kartläggningsmetoden illustreras här för fallet med husflugan, men den kan helt enkelt utvidgas till andra insekters sammansatta ögon, såsom fjärilar. Men i stället för pupillreflektionen fungerar fjärilsögonhinnen då som den visuella axelmarkören21,24. En alternativ metod är den nyligen utvecklade röntgenmikrotomografin26. Detta värdefulla tillvägagångssätt ger detaljerade anatomiska kartor, men är sårbart för optiska fel, särskilt där ommatidias visuella axlar är snedställda mot ögonytan21, eller om vävnadsbehandling snedvrider ögongeometrin tillräckligt för att äventyra mätningar. Visualiseringen av pseudopupilen är mer eller mindre enkel i flugögon som har en glänsande pupillmekanism. Detta är mindre lätt i sammansatta ögon med en dåligt reflekterande pupilmekanism, som till exempel i bin21. Men för många andra insektsarter, som soldatflugor eller bin, kan fluorescensen hos de visuella pigmenten i de ommatidiella rabdomerna användas. Tillämpningen av fluoroforer som skapar en stark rabdomfluorescens erbjuder en annan möjlighet att uppskatta den rumsliga organisationen av ögats visuella utrymme27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att rapportera.
Acknowledgments
Denna studie stöddes ekonomiskt av Air Force Office of Scientific Research/European Office of Aerospace Research and Development AFOSR/EOARD (bidrag FA9550-15-1-0068, till D.G.S.). Vi tackar Dr. Primož Pirih för många hjälpsamma diskussioner och Kehan Satu, Hein Leertouwer och Oscar Rincón Cardeño för hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision of amplified images and digital communication with PC |
| High power star LED | Velleman | LH3WW | Light source for observation and imaging the compound eye |
| Holder for the investigated fly | University of Groningen | Different designs were manufactured by the university workshop | |
| Linear motor | ELERO | ELERO Junior 1, version C | Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A) |
| Low temperature melting wax | various | The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder | |
| Microscope | Zeiss | Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x | |
| Motor and LED Controller | University of Groningen | Z-o1 | Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies. |
| Motorized Stage | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom. |
| Optical components | LINUS | Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| PC running MATLAB | University of Groningen | The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system | |
| Power Supply (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Lithuania) | PUP120-17 | Dedicated power supply for the STANDA motor controllers |
| Soldering iron | various | Used for melting the wax | |
| Stepper and DC Motor Controller | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly |
| Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes. | Programming language used to implement the algorithms |
References
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M.
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002 (2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168 (2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782 (2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613 (2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267 (2021).
