Summary
Buradaki protokol, psödopupil fenomenini ve fotoreseptör hücrelerinin göz bebeği mekanizmasını kullanarak, otomatik bir cihazla haritalandırılan housefly gözlerinin görsel eksenlerinin mekansal organizasyonunun ölçümünü açıklamaktadır.
Abstract
Bu makalede, ommatidia adı verilen binlerce görsel birimden oluşan böcek bileşik gözlerinin görsel eksenlerinin mekansal organizasyonunun otomatik ölçümü açıklanmaktadır. Her ommatidiyum, optik bilgiyi küçük bir katı açıdan, görsel bir eksen etrafında ortalanmış yaklaşık Gaussian-dağıtılmış hassasiyetle (1° mertebesinde yarım genişlikte) örneklemektedir. Birlikte, ommatidia görsel bilgiyi neredeyse panoramik bir görüş alanından toplar. Görsel eksenlerin uzamsal dağılımı böylece gözün uzamsal çözünürlüğünü belirler. Bileşik bir gözün optik organizasyonu ve görme keskinliği hakkında bilgi, görsel bilginin nöral işlenmesinin nicel çalışmaları için çok önemlidir. Burada, bir bileşik gözün görme eksenlerini, içsel, in vivo optik bir fenomen, psödopupilla ve fotoreseptör hücrelerinin göz bebeği mekanizmasını kullanarak haritalamak için otomatik bir prosedür sunuyoruz. Böcek gözlerini taramak için optomekanik kurulumu özetliyoruz ve ölçüm prosedüründeki adımları göstermek için bir ev sineği olan Musca domestica'dan elde edilen deneysel sonuçları kullanıyoruz.
Introduction
Böcek görsel sistemlerinin kompaktlığı ve sahiplerinin çevikliği, oldukça gelişmiş görsel bilgi işlemeyi gösteren, hem bilimsel hem de bilimsel olmayan geçmişlerden gelen insanların ilgisini çekmiştir. Böcek bileşik gözleri, akut ve çok yönlü görme kapasiteleri sağlayan güçlü optik cihazlar olarak kabul edilmiştir 1,2. Örneğin, sinekler hareketli nesnelere hızlı tepkileriyle tanınırlar ve arılar renk görüşüne ve polarizasyon vizyonuna sahip olmalarıyla ünlüdür2.
Eklembacaklıların bileşik gözleri, her biri bir faset lens ile kapatılmış ommatidia olan anatomik olarak benzer çok sayıda birimden oluşur. Diptera'da (sinekler), topluca kornea olarak bilinen faset lenslerin montajı genellikle bir yarımküreye yaklaşır. Her ommatidyum, 1° mertebesinde yarım genişliğe sahip küçük bir katı açıdan gelen ışığı örnekler. İki gözün ommatidiası birlikte yaklaşık olarak tam katı açıyı örneklemektedir, ancak ommatidianın görsel eksenleri eşit olarak dağılmamıştır. Bazı göz bölgeleri, halk arasında fovea olarak adlandırılan yüksek uzamsal keskinliğe sahip bir bölge oluşturan yüksek yoğunluklu görme eksenlerine sahiptir. Gözün kalan kısmı daha sonra daha kaba bir uzamsal çözünürlüğe sahiptir 3,4,5,6,7,8,9.
Bileşik gözlerin optik organizasyonunun nicel bir analizi, görsel bilginin nöral işlenmesinin ayrıntılı çalışmaları için çok önemlidir. Bir böceğin beyninin sinir ağları üzerine yapılan çalışmalar10 genellikle ommatidial eksenlerin mekansal dağılımı hakkında bilgi gerektirir. Ayrıca, bileşik gözler birçok teknik yeniliğe ilham kaynağı olmuştur. Biyo-esinlenmiş yapay gözler üretmek için birçok girişim, gerçek bileşik gözlerin mevcut nicel çalışmaları üzerine inşa edilmiştir11,12,13. Örneğin, yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip yarı iletken tabanlı bir sensör, böcek bileşik gözleri11,14,15,16,17 modeline dayanarak tasarlanmıştır. Bununla birlikte, şimdiye kadar geliştirilen cihazlar, mevcut böcek gözlerinin gerçek özelliklerini uygulamamıştır. Böcek bileşik gözlerinin ve mekansal organizasyonlarının doğru temsilleri, yaygın olarak bulunmayan doğal gözlerden ayrıntılı ve güvenilir veriler gerektirecektir.
Verilerin yetersizliğinin ana nedeni, gözlerin mekansal özelliklerini çizmek için mevcut prosedürlerin aşırı sıkıcılığıdır. Bu, daha otomatik bir göz haritalama prosedürü oluşturma girişimlerini motive etti. Douglass ve Wehling18 , böcek bileşik gözlerinin otomatik analizlerine yönelik ilk girişimde, korneadaki faset boyutlarını haritalamak için bir tarama prosedürü geliştirdi ve birkaç sinek türü için fizibilitesini gösterdi. Burada sadece korneanın fasetlerini taramak için değil, aynı zamanda fasetlerin ait olduğu ommatidianın görsel eksenlerini değerlendirmek için yöntemler geliştirerek yaklaşımlarını genişletiyoruz. İlgili prosedürleri örneklemek için ev sineği gözleri vakasını sunuyoruz.
Böcek gözlerini taramak için deneysel düzenek şudur: kısmen optik, yani kamera ve aydınlatma optiğine sahip bir mikroskop; kısmen mekanik, yani araştırılan böceği döndürmek için bir gonyometre sistemi; ve kısmen hesaplamalı, yani ölçüm ve analizlerin yürütülmesi için araçlar ve programlar için yazılım sürücülerinin kullanılması. Geliştirilen yöntemler, görüntü yakalamaktan, kamera kanallarını seçmekten ve görüntü işleme eşiklerini ayarlamaktan, dışbükey yüzeylerinden yansıyan parlak ışık noktaları aracılığıyla bireysel faset konumlarını tanımaya kadar bir dizi hesaplama prosedürünü kapsar. Fourier dönüştürme yöntemleri, hem bireysel fasetleri tespit etmek hem de faset kalıplarını analiz etmek için görüntü analizinde çok önemliydi.
Makale aşağıdaki gibi yapılandırılmıştır. İlk olarak deney düzeneğini ve psödopupil fenomenini (fotoreseptörlerin canlı gözlerdeki görsel eksenlerini tanımlamak için kullanılan optik işaretleyici) tanıtıyoruz 19,20,21. Daha sonra, tarama prosedüründe ve görüntü analizinde kullanılan algoritmalar özetlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, Üniversitenin böcek bakım yönergelerine uygundur.
1. Bir ev sineğinin hazırlanması, Musca domestica
- Sineği laboratuvarda yetiştirilen popülasyondan toplayın. Sineği pirinç tutucuya yerleştirin (Şekil 1).
- Kısıtlama borusunun üst kısmından 6 mm kesin (bkz. Borunun yeni üst kısmı 4 mm dış çapa ve 2,5 mm iç çapa sahiptir (Şekil 1A). Canlı sineği tüpün içine yerleştirin, sineğe zarar gelmesini önlemek için tüpü pamukla kapatın ve sineği kafa tüpten çıkıntı yapacak ve gövdesi kısıtlanacak şekilde itin (Şekil 1B). Kafayı balmumu ile hareketsiz hale getirin, böylece gözler açık kalır (Şekil 1C-E).
- Tüpü, tüp uzunluğu 10 mm olacak şekilde tekrar kesin (Şekil 1C). Plastik tüpü sinekle birlikte pirinç tutucuya yerleştirin, böylece tutucu bir masa üstünde dururken sineğin bir gözü yukarı doğru bakacak şekilde (Şekil 1D, E).
- Tüpün oryantasyonunu 0 ° 'de gonyometre yüksekliği ile (yani, azimut aşaması yatay bir konumdadır), mikroskopun dikey aydınlatma demeti merkezi bir bölgede, ventral ve dorsal arasında ve gözün ön ve arka kenarları arasında göz yüzeyine dik olacak şekilde ayarlayın, böylece tüm göz kurulumun izin verdiği azimut ve yükseklik aralığında taranabilir.
2. Gonyometrenin dönen azimut ekseninin mikroskop optik ekseni ile hizalanması
- Azimut dönüş aşamasına bir hizalama pimi takın, böylece ucun x-y konumu motorlu aşamadaki azimut ekseni ile çakışacak şekilde ayarlanabilir. 5x objektifle donatılmış mikroskopla izlerken, z ekseni joystick'i kullanarak uca odaklanın (Şekil 2).
- Azimut ekseninin x-y ayarını mikroskobun optik ekseniyle hizalayın ve x ve y ekseni joysticklerini kullanarak yükseklik ve azimut döner eksenlerinin ortalanmış pimle önceden hizalandığından emin olun.
- Pimin her iki serbestlik derecesine göre ortalanmış olup olmadığını kontrol etmek için azimut ve yükseklik joysticklerini manipüle edin. İyi ortalandığında, pim ucu azimut ve yükseklik rotasyonları sırasında yaklaşık olarak aynı konumda kalır.
3. Sinek gözünün motorlu aşamalarla hizalanması
- Yükseklik aşaması 0 ° 'deyken, sineği ve tutucusunu azimut aşamasına monte edin. Sineğin gözünü mikroskopla gözlemleyin.
- Aydınlatma LED'i açıkken, sineğin yatay konumunu, psödopupilla merkezi mikroskopla aynı hizada olacak şekilde ayarlayın. Tutucunun dönen vidasını kullanarak sineğin dikey konumunu ayarlayın (Şekil 1D), böylece derin psödopupil (DPP; Şekil 3) 19,20,21 yükseklik ekseni seviyesinde odak noktasına getirilir.
- DPP'yi görüş alanında ortalayarak azimut ve yükseklik eksenlerine göre hizalayın (bkz. Şekil 2). Sinek tutucunun altına yapıştırılmış mıknatısları, manuel kayar ayarlamalara izin verirken, azimut aşamasına monte edilmiş bir demir plakaya sıkıca yapıştırmak için kullanın.
- Görünümü mikroskopa monte edilmiş dijital kameraya geçirin. Motor kontrolörlerinin ve Arduino LED kontrolörünün başlatılmasını içeren GRACE sisteminin yazılım başlatmasını çalıştırın (Şekil 4). Bu nedenle, MATLAB R2020a veya daha yüksek bir sürümünü açın. MATLAB komut dosyası Initialize_All_Systems çalıştırın (Ek Dosya 1).
- Sineğin psödopupillasının (Şekil 3B, C) bilgisayar ekranında yansıtılan görüntünün merkezinde olup olmadığını doğrulayın.
4. Otomatik odaklama ve otomatik merkezleme
- Odağı kornea psödopupil seviyesine getirin (CPP; Şekil 3B) 19,20,21 z ekseni joystick kullanılarak manuel olarak.
- Kornea seviyesinde keskin bir görüntü elde etmek için otomatik odaklama algoritmasını (Ek Dosya 1, komut dosyası AF) çalıştırın. Motorlu z ekseni aşamasını ayarlayarak odağı DPP seviyesine döndürerek kontrol edin. DPP ve CPP arasındaki mesafeyi saklayın (motor adımlarında).
- Otomatik merkezleme algoritmasını çalıştırarak psödopupil merkezlemesinde ince ayar yapın (Ek Dosya 1, komut dosyası AC). Odağı CPP seviyesine geri getirin.
- Otomatik odaklama algoritmasını yeniden çalıştırın. Motorlu aşamaları mevcut konumlarında sıfırlayın (X,Y,Z,E,A) = (0,0,0,0,0), burada E yükseklik ve A azimuttur.
- Otomatik merkezleme ve otomatik odaklama algoritmalarını gerçekleştirirken yörüngeler boyunca göz görüntülerini 5° adımlarla örnekleyen tarama algoritmasını (Ek Dosya 1, komut dosyası Scan_Begin) çalıştırın.
- Örneklemenin sonunda, LED Kontrolörünü ve motor kontrolörlerini kapatın.
- Görüntü işleme algoritmalarını (Ek Dosya 1, komut dosyası ImProcFacets) uygulayarak görüntüleri işleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hayvanlar ve optik stimülasyon
Deneyler, Groningen Üniversitesi Evrimsel Genetik Bölümü tarafından sürdürülen bir kültürden elde edilen ev sinekleri (Musca domestica) üzerinde gerçekleştirilir. Ölçümlerden önce, bir sinek, iyi oturan bir tüpe düşük erime noktalı bir balmumu ile yapıştırılarak hareketsiz hale getirilir. Sinek daha sonra motorlu bir gonyometrenin sahnesine monte edilir. İki döner aşamanın merkezi, mikroskobik bir kurulumun odak noktası ile çakışır24. Epi-aydınlatma ışık demeti, ışığı yarım ayna aracılığıyla sineğin gözünde görüntülenen bir diyaframa odaklayan bir ışık kaynağı tarafından sağlanır. Böylece, sınırlı bir fotoreseptör hücre kümesinin pupilla mekanizmasını aktive eder (Şekil 3). Bu fotoreseptörleri barındıran ommatidianın optik eksenleri, sineğin küçük adımlarla döndürülmesi ve mikroskopa bağlı renkli bir dijital kamera ile her adımdan sonra fotoğraf çekilmesiyle değerlendirilir (Şekil 2). Pupilla pigment granülleri ağırlıklı olarak uzun dalga boyu aralığında yansıdığından, dijital kameranın kırmızı kanalı, psödopupillayı faset lens yansımalarından ayırt etmek için kullanılır. İkinci yansımalar, kameranın mavi kanalı kullanılarak psödopupilladan en iyi şekilde izole edilir.
Otomatik odaklama ve otomatik merkezleme algoritmaları
Bir böceğin gözünü tararken kullanılan ana ek algoritmalar otomatik odaklama ve otomatik merkezlemedir (Ek Dosya 1, komut dosyaları AF ve AC). Otomatik odaklamanın amacı, bireysel ommatidinin tanımlanması için gerekli olan faset yansımalarını tespit etmek için kornea seviyesini kameranın odağına getirmektir (Şekil 3B). Kornea seviyesini tespit etme prosedürü, uzamsal frekans içeriğini belirlemek için her seviyede çekilen görüntüye hızlı Fourier dönüşümü (FFT) uygulayarak sineğin dikey (Z) konumunu adım adım değiştirmektir. Optimum odaklama kriteri, düşük frekanslı bir kesmenin üzerinde en büyük toplam güce sahip seviyedir.
Otomatik odaklama için girişler Z konumları ve kameradan video akışıdır. Çıkışlar, SF görüntüsünün yüksek frekanslı içeriğinin ve SF'nin maksimum olduğu Z netleme seviyesinin ayrılmaz bir parçasıdır. İlk adımda, kamera görüntüsünün Z-konumu kornea faset lenslerinin biraz altına ayarlandı ve görüntünün frekans içeriğini belirlemek için ilgilenilen bölge ayarlandı. for döngüsü, görüntü yakalamayı başlatır ve yüksek geçişli filtrelenmiş Fourier dönüşümlü SF'nin toplamını hesaplar. Daha sonra z ekseni motorunu korneanın üzerindeki bir görüntü seviyesine doğru yukarı doğru basarak, en yüksek frekanslara sahip seviye, yani SF'nin maksimum olduğu ve kornea seviyesi olarak kabul edilen seviye bulunur. Z eksenli motor daha sonra bu seviyeye ayarlanır ve bir görüntü alınır.
Korneadan gözün eğrilik merkezi seviyesine doğru odaklanıldığında, kornea faset yansımaları kaybolur ve psödopupilla yansımaları, sinek ommatidiası içindeki fotoreseptörlerin organizasyonu için bir özellik olan tipik yedi noktalı bir desende birleşir (Şekil 3C; desenin sadece yaklaşık küresel göz bölgelerinde belirgin olduğunu unutmayın). Gözün eğrilik seviyesinin merkezindeki patern derin psödopupil (DPP) 19,21 olarak adlandırılır.
X ve Y motorlarıyla sahnede konumlandırılan sineğin, ışık noktasının merkezinin kamera görüntüsünün merkeziyle çakışacak şekilde kaydırılmasına, otomatik merkezleme denir. Bu prosedür, görsel ekseni DPP'nin merkezinde bulunan ommatidiyumun fasetini, aydınlatma ışını ve mikroskop ve kameranın optik ekseni ile hizalar. Görüntü Gauss filtrelenmiş ve ikilileştirilmiştir ve daha sonra pseudopupil'ın merkezi regionprops MATLAB işlevi kullanılarak belirlenir. Girişler, X ve Y motorlarının konumları ve kameradan gelen video akışıdır; çıktı, görüntü merkezleri ile psödopupil arasındaki mesafedir ve daha sonra bir aşama kaymasına çevrilir.
Görüntüleri ilişkilendirme
Otomatik odaklama ve otomatik merkezleme işlemlerinden sonra göz, gonyometre yüksekliği θ ve azimut φ çeşitli değerlerinde fotoğraf çekilerek ve saklanarak taranır. İki boyutlu korelasyon, ardışık görüntüler arasındaki x-y kaymalarını belirlemek için kullanılır. Farklı açısal konumlarda elde edilen görüntüleri ilişkilendirmek için, bunun genellikle mevcut görüntünün önceki görüntüye göre dönmesiyle sonuçlandığını anlamak önemlidir. Örneğin, bir başlangıç görüntüsünün merkezinin bir kürenin C noktasına karşılık geldiğini (Şekil 5) ve azimutta bir değişikliğin meydana geldiğini, böylece düzlem OAB'nin küçük bir açı Δφ üzerinde döndürüldüğünü ve düzlem OA'B haline geldiğini varsayalım. Görüntünün merkezi daha sonra C noktasından C' noktasına değişir (Şekil 5). Kamera görüntü düzlemi OC vektörüne dikilse, OAB düzleminin OA'B'ye dönmesi, görüntünün β = CC'⁄BC olarak, CC' = CDΔφ ve cosθ = CD⁄BC ile β = Δφ cosθ açı üzerinde dönmesine neden olur (Şekil 5). Bu, kürenin tepesinde (θ = 0 °), β = Δφ ve ekvatorda (θ = 90 °), β = 0 ° anlamına gelir. Δφ = 0° olduğunda, yani yalnızca θ yüksekliği değiştirildiğinde, görüntüler birbirine göre döndürülmez, bu nedenle β = 0°.
Tarama prosedürü sırasında, otomatik merkezleme prosedürü, görsel ekseni ölçüm sisteminin optik ekseni ile hizalanmış ommatidiyumu merkezler. Azimutun dönmesi, β bir açıyla dönmeye ve faset deseninin çevrilmesine neden olur. İkinci kaymayı belirlemek için, Şekil 6'da açıklandığı gibi, iki ardışık görüntü ilişkilendirilir (ilk görüntüyü β dönme açısıyla döndürdükten sonra).
Görüntü kaydırma algoritmasında (Ek Dosya 1, komut dosyası ImProcFacets), bireysel fasetler her görüntüdeki yansımalarının merkezcikleri tarafından tanımlanır. Algoritmaya girişler, yükseklik ve azimut açısı, değerlendirilecek görüntü kümesi, görüntü kanalı ve ilgilenilen bölgedir. Algoritma, bir dizi merkezcil ve tarama prosedürü sırasında çekilen tüm ilişkili görüntüleri içeren son bir görüntü üretir.
Gonyometrik sistem
Aydınlatma ile hizalamayı sağlamak için, sineğin gözü odaktaki kornea faset lensleriyle fotoğraflanmalı ve psödopupilla sık sık tekrarlanmalıdır (burada, her 5 ° dönüşten sonra). Bu otomatik süreç, Şekil 4'te şematik olarak gösterilen GRACE sistemi (Bileşik Gözler için Goniometrik Araştırma Aparatı) ile gerçekleştirilir. Üç ana alt sistemden oluşur: elektromekanik donanım olarak kendi elektronikleriyle alt ve üst aşamalar, fiziksel denetleyicilere gömülü ürün yazılımı ve algoritmaları uygulayan yazılımı çalıştırmak için kullanılan PC. Donanım, motorlu ve optik aşamalardan, dijital kameradan, LED yoğunluklarını programlamak için bir mikrodenetleyiciden ve beyaz bir LED ışık kaynağından oluşur. Ürün yazılımının rutinleri motor kontrolörleri, LED Kontrol Cihazı ve dijital kamerada sağlanır. Yazılım, motor konumlarını ve hızlarını kontrol etmek, LED'i ayarlamak ve görüntüleri elde etmek ve analiz etmek için algoritmalardan oluşur. Daha sonra tartışılan algoritmalar, GRACE sisteminin böcek gözlerini taramasını sağlayan ana kilometre taşlarını temsil etmektedir.
Sinek gözleri ve sahte öğrenciler
Bir ev sineği gözü aydınlatıldığında, gelen ışık, fotoreseptör hücrelerinin göz bebeği mekanizmasını, hücre gövdesi içindeki hareketli, sarı renkli pigment granüllerinden oluşan bir sistemi aktive eder. Sistem, fotoreseptörlerin fototransdüksiyon sürecini tetikleyen ışık akısını kontrol eder ve böylece esasen insan gözündeki göz bebeği ile aynı işleve sahiptir19,20. Göz bebeği mekanizmasının aktivasyonu, mikroskopun amacının açıklığına bakan göz bölgesinde lokal olarak gelişmiş bir yansımaya neden olur (Şekil 3). Parlak bir şekilde yansıyan göz bölgesinin konumu, psödopupil 19,20,21, gözün dönmesiyle değişir, çünkü gelen ışık daha sonra farklı bir fotoreseptör hücre kümesindeki göz bebeği mekanizmasını aktive eder (bkz. Şekil 6). Psödopupil böylece mikroskopla hizalanmış ommatidianın görsel ekseninin bir belirteci olarak işlev görür. Bu, gözün görme eksenlerinin uzamsal dağılımının haritalandırılmasını sağlar 4,20,21,22,23.
Eksik fasetlerin doldurulması
Tüm fasetler, örneğin, küçük yüzey düzensizliklerinin veya toz lekelerinin neden olduğu düşük yerel yansıma nedeniyle, merkezcil prosedürle tanımlanmaz. İkincisi ayrıca hatalı merkezcilere de neden olabilir (Şekil 7A). Bu sorun ilk olarak gözleri bir su musluğunun altında yıkayarak ve ikinci olarak bir doldurma prosedürü (script ImProcFacets) uygulanarak çözülür. Bu nedenle, bir alandaki merkezciler önce belirlenir (Şekil 7A) ve daha sonra FFT hesaplanır (Şekil 7B). İlk armonik halkası (Şekil 7B'deki sarı yıldızlar) mavi, kırmızı ve yeşil çizgilerle gösterilen üç yönü tanımlar (Şekil 7B). Harmoniklerin üç oryantasyon boyunca ters dönüşümü, Şekil 7C-E'deki gri bantları verir. Gri bantlara ikinci dereceden bir polinom takılması, faset merkezcikleri üç kafes ekseni boyunca birbirine bağlayan çizgiler verir. Kafes çizgilerinin kesişme noktaları, bu nedenle, gerçek faset merkezlerine karşılık gelir. Şekil 7 örneği aşırı bir durum olduğundan, prosedürün sağlam olduğunu göstermektedir. Çoğu bölgede, eksik fasetler ve hatalı merkezler nadirdir.
Sinek gözünü tarama
Şekil 8, Δφ = 5 ° ile bir dizi kademeli azimuthal değişikliği gerçekleştirerek göz boyunca taranan bir ommatidia bandını göstermektedir. Gözün ön tarafından (Şekil 8A, sağ) yanal tarafa (Şekil 8A, sol) tarama 24 adımda gerçekleşti. Büyük ölçüde örtüşen faset desenlerinin sentroidleri daha sonra β = Δφcosθ tarafından döndürüldü. Daha sonra, her görüntünün merkezcilerini kaydırdıktan ve eksik fasetleri doldurduktan sonra (ImProcFasets senaryosu ile), kolokalize merkezcilerin ortalaması alındı. Şekil 8A, görüntü merkezleri ve faset merkezlerle birlikte birleştirilmiş görüntüleri göstermektedir. Şekil 8B, fasetlerin montajını bir Voronoi diyagramı olarak göstermektedir.
Resim 1: Sineğin pirinç tutucuya monte edilmesi . (A) Araştırılacak bir ev sineği ile bir uç. (B) Sinek ile kesilmiş uç, bir parça pamuk ve bir çubuk kullanılarak yavaşça sonuna kadar itilir. (C) Sineğin ilave kesildiği uç, toplam uzunluğu 10 mm'dir. (D) Gonyometre aşamasına yerleştirilecek sinek ile pirinç tutucu; ok yükseklik ayar vidasını işaret eder. (E) Ucu (*) düşük sıcaklıkta eriyen bir balmumu (#) parçası tarafından hareketsiz bırakılmış kafa ile sineğin yakın plan fotoğrafı. Epi-aydınlatma, sarı psödopupilla tarafından ortaya çıkarıldığı gibi, gözün fotoreseptörlerinin göz bebeği mekanizmasını aktive etmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: GRACE, Bileşik Gözler için Gonyometrik Araştırma Aparatı. İncelenen böcek (bir sinek), üç çeviri aşaması (X, Y, Z) ve iki dönme aşamasından (yükseklik ve azimut) oluşan motorlu aşamaya monte edilir. Bir lens, beyaz bir LED'den gelen ışığı diyaframa odaklar, sineğin gözündeki yarım ayna aracılığıyla odaklanır. Göz, mikroskopa bağlı bir kamera ile fotoğraflanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Sinek gözlerinin optiği . (A) Her biri bikonveks faset lensle kapatılmış, gelen ışığı birincil (kahverengi) ve ikincil (kırmızı) pigment hücreleri ile çevrili bir dizi fotoreseptör hücresine (sarı) odaklayan bir sinek gözünün üç ommatidisinin diyagramı. Koyuluğa adapte olmuş (DA) fotoreseptörlerin yoğun aydınlatılması, fotoreseptör hücrelerinin içinde bulunan sarı pigment granüllerinin (siyah noktalarla gösterilir) göçüne neden olur. Fotoreseptörlerin ucuna doğru, ışığa duyarlı organellerin yakınında birikmiş, rabdomerler, ışığa adapte olmuş (LA) durumda ışığı emer ve geri saçarlar. (B) Göz yüzeyi seviyesinde, faset yansımalarını (parlak noktalar) ve aktif durumdaki pigment granül yansımasını (kornea psödopupil, CPP) gösteren görüntü. (C) Göz eğriliğinin merkezi seviyesinde (derin psödopupil, DPP) çekilen, fotoreseptör hücrelerinin yamuk bir düzende düzenlenmesini yansıtan, distal uçları faset lenslerin odak düzlemine yerleştirilmiş görüntü. Fotoreseptör uçlarının üst üste bindirilmiş sanal bir görüntüsü, bu nedenle, göz eğriliğinin merkezinin düzleminde bulunur. Ölçek çubuğu 100 μm, B ve C panelleri için geçerlidir.
Şekil 4: GRACE sisteminin şematik diyagramı. PC yazılımı, elektromekanik donanımı çalıştıran bellenimi kontrol eder. Dijital kamera, optik bir sahne aracılığıyla , numunenin gözünün görüntülerini alır. LED ışık kaynağı numuneyi aydınlatır ve motorlu aşamanın motorları X-, Y- ve Z-çevirilerinin yanı sıra azimut (A) ve yükseklik (E) rotasyonlarını harekete geçirir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sinek gözünü tararken görüntü dönüşünü türetmek için diyagram. İlk görüntünün merkezi bir kürenin C noktasına karşılık gelirse ve azimutta bir değişiklik meydana gelirse, düzlem OAB küçük bir açı Δφ üzerinde döndürülür ve düzlem OA'B olur. Görüntünün merkezi daha sonra C noktasından C' noktasına değişir. OAB düzleminin OA'B'ye dönmesi, görüntünün bir açı üzerinde dönmesine neden olur β = Δφ cosθ (bkz. metin, görüntüleri ilişkilendirme bölümü). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İnterommatidiyal açıyı belirlemek için görüntü işleme prosedürü . (A) Göz boyunca bir tarama sırasında, yeşil daireler ve kırmızı karelerle işaretlenmiş faset merkezcilleri ve görüntü merkezinde yeşil bir nokta ile çekilen görüntü. (B) 5°'lik azimuthal dönüşünden sonra, kırmızı karelerle işaretlenmiş faset merkezcilleri ve görüntü merkezinde kırmızı bir nokta bulunan sonraki görüntü. (C) A'nın yeşil karesi içindeki alanın korelogramı B görüntüsü ile korelasyon gösterir. C'nin merkezinden (yeşil nokta) korrelogramın maksimum değerine vektör, A ve B görüntülerinin göreceli kaymasını temsil eder. Bu vektörü kullanarak, A'nın kaymış karesi ve merkezi B'de çizilir ve B'nin faset merkezoidleri (kırmızı kareler) A'ya eklenir. ölçek çubuğu 100 μm, A-C panellerine uygulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Fourier dönüşümleri uygulayarak eksik faset merkezoidlerinin türetilmesi. (A) Faset merkezcikleri (kırmızı noktalar) içeren yerel bir RGB görüntüsü. Beyaz ok uçları eksik fasetleri gösterir ve kırmızı ok ucu hatalı bir merkeze işaret eder. (B) A'nın merkezlerinin FFT'si, sarı yıldızlarla işaretlenmiş ilk armonik halkası ile. (C-E) B'deki renkli çizgilerle gösterilen üç yön boyunca sentroidlerin ters FFT'si, grimsi bantları verir. Mavi (C), kırmızı (D) ve yeşil (E) çizgiler gri bantlara uyan ikinci dereceden polinomlardır ve merkezciller (kırmızı daireler) Fourier dönüşümlerinden önce elde edilenlerdir. (F) Takılan C-E hatları, A'nın merkezcikleri ile birleştirilmiştir. Eksik faset merkezciller daha sonra geçiş noktalarından türetilir. Ölçek çubuğu 100 μm A, C-F panelleri için geçerlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Bir ev sineğinin sağ gözü bir taraftan diğer tarafa tarandı . (A) Azimutun görüntü merkezleri (yeşil haçlar) ve faset merkezcileri (kırmızı daireler) ile birlikte adım adım 5° değiştirildiği bir görüntü serisinin üst üste binen görüntüleri birleştirildi. (B) Faset merkezcilerin Voronoi diyagramı, A. Ölçek çubuğu 100 μm'deki gibi görüntü merkezleri ile A ve B panelleri için geçerlidir.
Ek Dosya 1: Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ev sineği gözlerinin görsel eksenlerinin uzamsal dağılımı, bileşik gözlerin psödopupil fenomeni ve ışığa bağımlı göz bebeği mekanizmasının neden olduğu yansıma değişiklikleri kullanılarak grafiklendirilebilir. Bu nedenle, araştırılan bir sinek, hepsi bilgisayar kontrolü altında olan bir dijital kamera ile donatılmış bir mikroskop kurulumuyla yerel faset deseninin incelenmesine izin veren gonyometrik bir sisteme monte edilir. Görüntü analizi göz haritaları verir. Karşılaşılan önemli bir zorluk, ölçümlerin başında gözün dikkatli bir şekilde konumlandırılmamasıyla, hem gözün hem de psödopupilla arasındaki konumların, gonyometrik cihazın küçük rotasyonlarında bile önemli ölçüde değişebilmesidir. Bu değişiklikler, göz merkezinin derin psödopupilla gözlendiği gonyometrik dönme merkezine konumlandırılmasıyla en aza indirilir. Daha sonra ölçülen görüntüleri ilişkilendirerek, faset deseni izlenebilir. Önemli olarak, dönme açısının oldukça küçük bir değere ayarlanması gerekir, çünkü faset deseninin çok düzenli olduğu alanlarda, korelasyon prosedürü hatalı sonuçlara eğilimlidir.
Burada, böcek gözlerinde görme keskinliğinin yüksek oranda otomatikleştirilmiş haritalanmasının fizibilitesini gösteren kısmi bir göz haritası (Şekil 8) sunduk. Faset aralıklarının birbirini izleyen görüntü merkezleri arasındaki 5° kaymalarla karşılaştırılmasından açıkça anlaşılan 2.0°-2.5° civarındaki interommatidial açılar, daha önce aynı türden (Musca domestica)25 çok daha zahmetli bir şekilde elde edilen verilere iyi karşılık gelir. Ev sineklerinin ve diğer böceklerin görsel alanının tam göz haritaları başka bir yerde yayınlanacaktır.
Burada sunulan yöntem, tam bir gözün görsel eksenlerini, in vivo, sadece birkaç saat içinde haritalamaya izin verir, bu da diğer yaklaşımlarla elde edilmesi son derece zor olacaktır. Otomatik grafik yöntemi, ev sineği durumunda burada gösterilmiştir, ancak kelebekler gibi diğer böceklerin bileşik gözlerine genişletilebilir. Bununla birlikte, pupilla yansıması yerine, kelebek göz parlaklığı daha sonra görsel eksen işaretleyicisi21,24 olarak işlev görür. Alternatif bir yöntem yakın zamanda geliştirilen X-ışını mikrotomografisi26'dır. Bu değerli yaklaşım ayrıntılı anatomik haritalar verir, ancak özellikle ommatidianın görsel eksenlerinin göz yüzeyine çarpıtıldığı durumlarda21 veya doku işlemenin göz geometrisini ölçümlerden ödün verecek kadar bozması durumunda optik hatalara karşı savunmasızdır. Psödopupil'ın görselleştirilmesi, parlak bir göz bebeği mekanizmasına sahip sinek gözlerinde az ya da çok basittir. Bu, örneğin arılarda olduğu gibi, zayıf yansıtıcı bir göz bebeği mekanizmasına sahip bileşik gözlerde daha az kolaydır21. Yine de, asker sinekleri veya arılar gibi diğer birçok böcek türü için, ommatidial rehabilitasyonlardaki görsel pigmentlerin floresansı kullanılabilir. Güçlü bir rabdom floresansı yaratan floroforların uygulanması, gözün görme alanının mekansal organizasyonunu tahmin etmek için başka bir fırsat sunar27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların bildirecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi / Avrupa Havacılık ve Uzay Araştırma ve Geliştirme Ofisi AFOSR / EOARD (hibe FA9550-15-1-0068, D.G.S.'ye) tarafından finansal olarak desteklenmiştir. Birçok yararlı tartışma için Dr. Primož Pirih'e ve yardımları için Kehan Satu, Hein Leertourer ve Oscar Rincón Cardeño'ya teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital Camera | PointGrey | BFLY-U3-23S6C-C | Acquision of amplified images and digital communication with PC |
| High power star LED | Velleman | LH3WW | Light source for observation and imaging the compound eye |
| Holder for the investigated fly | University of Groningen | Different designs were manufactured by the university workshop | |
| Linear motor | ELERO | ELERO Junior 1, version C | Actuates the upper microscope up and down. (Load 300N, Stroke speed 15mm/s, nominal current 1.2A) |
| Low temperature melting wax | various | The low-temperature melting point wax serves to immobilize the fly and fix it to the holder | |
| Microscope | Zeiss | Any alternative microscope brand will do; the preferred objective is a 5x | |
| Motor and LED Controller | University of Groningen | Z-o1 | Designed and built by the University of Groningen and based on Arduino and Adafruit technologies. |
| Motorized Stage | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8MT175-50XYZ-8MR191-28 | A 6 axis motorized stage modified to have 5 degrees of freedom. |
| Optical components | LINUS | Several diagrams and lenses forming an epi-illumination system (see Stavenga, Journal of Experimental Biology 205, 1077-1085, 2002) | |
| PC running MATLAB | University of Groningen | The PC is able to process the images of the PointGrey camera, control the LED intensity, and send control commants to the motor cotrollers of the system | |
| Power Supply (36V, 3.34A) | Standa (Vilnius, Lithuania) | PUP120-17 | Dedicated power supply for the STANDA motor controllers |
| Soldering iron | various | Used for melting the wax | |
| Stepper and DC Motor Controller | Standa (Vilnius, Lithuania) | 8SMC4-USB-B9-B9 | Dedicated controllers for the STANDA motorized stage capable of communicating with MATLAB |
| Finntip-61 | Finnpipette Ky, Helsinki | FINNTIP-61, 200-1000μL | PIPETTE TIPS FOR FINNPIPETTES, 400/BOX. It is used to restrain the fly |
| Carving Pen Shaping/Thread Burning Tool | Max Wax | The tip of the carving pen is designed to transfer wax to the head of fly | |
| MATLAB | Mathworks, Natick, MA, USA | main program plus Image Acquisition, Image Analysis, and Instrument Control toolboxes. | Programming language used to implement the algorithms |
References
- Land, M. F., Nilsson, D. Animal Eyes. , Oxford University Press. (2012).
- Cronin, T. W., Johnsen, S., Marshall, N. J., Warrant, E. J. Visual Ecology. , Princeton University Press. (2014).
- Horridge, G. A. The separation of visual axes in apposition compound eyes. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B. 285 (1003), 1-59 (1978).
- Land, M. F., Eckert, H. Maps of the acute zones of fly eyes. Journal of Comparative Physiology. A. 156, 525-538 (1985).
- Warrant, E. J. The design of compound eyes and the illumination of natural habitats. Ecology of Sensing. Barth, F. G., Schmid, A. , Springer. Berlin. 187-213 (2001).
- Warrant, E. J., Kelber, A., Kristensen, N. P. Eyes and vision. In. Handbook of Zoology, Vol. IV, Part 36, Lepidoptera, Moths and Butterflies, Vol 2: Morphology, Physiology and Development. Kristensen, N. P. , Walter de Gruyter. Berlin New York. 325-359 (2003).
- Petrowitz, R., Dahmen, H., Egelhaaf, M., Krapp, H. G. Arrangement of optical axes and spatial resolution in the compound eye of the female blowfly Calliphora. Journal of Comparative Physiology. A. 186 (7-8), 737-746 (2000).
- Smolka, J., Hemmi, J. M.
- Krapp, H. G., Gabbiani, F. Spatial distribution of inputs and local receptive field properties of a wide-field, looming sensitive neuron. Journal of Neurophysiology. 93 (4), 2240-2253 (2005).
- Strausfeld, N. J. Arthropod Brains: Evolution, Functional Elegance, and Historical Significance. , Belknap Press of Harvard University Press. (2012).
- Jeong, K. H., Kim, J., Lee, L. P. Biologically inspired artificial compound eyes. Science. 312 (5773), 557-561 (2006).
- Davis, J., Barrett, S., Wright, C., Wilcox, M. A bio-inspired apposition compound eye machine vision sensor system. Bioinspiration & Biomimetics. 4 (4), 046002 (2009).
- Lee, G. J., Choi, C., Kim, D., Song, Y. M. Bioinspired artificial eyes: Optic components, digital cameras, and visual prostheses. Advanced Functional Materials. 28 (24), 1870168 (2018).
- Zhang, K., et al. Origami silicon optoelectronics for hemispherical electronic eye systems. Nature Communications. 8, 1782 (2017).
- Wang, M., et al. Subtle control on hierarchic reflow for the simple and massive fabrication of biomimetic compound eye arrays in polymers for imaging at a large field of view. Journal of Materials Chemistry. C. 4, 108-112 (2016).
- Floreano, D., et al. Miniature curved artificial compound eyes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 9267-9272 (2013).
- Song, Y. M., et al. Digital cameras with designs inspired by the arthropod eye. Nature. 497 (7447), 95-99 (2013).
- Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A. 202 (12), 839-851 (2016).
- Franceschini, N. Sampling of the visual environment by the compound eye of the fly: fundamentals and applications. Photoreceptor Optics. Snyder, A. W., Menzel, R. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 98-125 (1975).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. The automatic control of the light flux in the compound eye of Diptera. Spectral, statistical, and dynamical properties of the mechanism. Biological Cybernetics. 21, 181-203 (1976).
- Stavenga, D. G. Pseudopupils of compound eyes. Handbook of Sensory Physiology, Vol VII/6A. Autrum, H. , Springer. Berlin-Heidelberg-New York. 357-439 (1979).
- Stavenga, D. G., Kruizinga, R., Leertouwer, H. L. Dioptrics of the facet lenses of male blowflies Calliphora and Chrysomia. Journal of Comparative Physiology A. 166, 365-371 (1990).
- Straw, A. D., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A "bright zone" in male hoverfly (Eristalis tenax) eyes and associated faster motion detection and increased contrast sensitivity. The Journal of Experimental Biology. 209, 4339-4354 (2006).
- Stavenga, D. G. Reflections on colourful ommatidia of butterfly eyes. The Journal of Experimental Biology. 205, 1077-1085 (2002).
- Beersma, D. G. M., Stavenga, D. G., Kuiper, J. W. Organization of visual axes in the compound eye of the fly Musca domestica L. and behavioural consequences. Journal of Comparative Physiology. 102, 305-320 (1975).
- Taylor, G. J., et al. Bumblebee visual allometry results in locally improved resolution and globally improved sensitivity. eLife. 8, 40613 (2019).
- Rigosi, E., Warrant, E. J., O'Carroll, D. C. A new, fluorescence-based method for visualizing the pseudopupil and assessing optical acuity in the dark compound eyes of honeybees and other insects. Scientific Reports. 11, 21267 (2021).
