Summary
ويفصل هذا البروتوكول إعداد وتصور الأنسجة الثابتة لعذراء ذبابة الفاكهة (Drosophila pupal notum). يمكن استخدامه إما للأنسجة السليمة أو المصابة ، ويتم الحفاظ على البنية الأصلية للأنسجة. يتم وصف جميع إجراءات التشريح والتثبيت والتلطيخ في هذه المقالة.
Abstract
الشرانق من ذبابة الفاكهة melanogaster غير متحركة لعدة أيام أثناء التحول ، والتي خلالها تطوير جسم جديد مع تكامل الكبار شفافة رقيقة. إن جمالها وشفافيتها تجعلها مثالية لتجارب التصوير الحي في الجسم الحي . ركزت العديد من الدراسات على الطبقة الظهارية الظهرية الأحادية للنعومة العذراء بسبب إمكانية الوصول إليها وحجمها الكبير نسبيا. بالإضافة إلى دراسات الميكانيكا الظهارية والتطور ، كان notum نسيجا مثاليا لدراسة التئام الجروح. بعد الإصابة ، يمكن التقاط عملية الإصلاح الظهاري بأكملها عن طريق التصوير الحي على مدار 6-12 ساعة. على الرغم من شعبية notum للتصوير الحي ، إلا أن عددا قليلا جدا من الدراسات المنشورة قد استخدمت عينات notum الثابتة. يعد التثبيت والتلطيخ من الأساليب الشائعة لجميع أنسجة ذبابة الفاكهة الأخرى تقريبا ، مستفيدين من الذخيرة الكبيرة من البقع الخلوية البسيطة والأجسام المضادة. ومع ذلك ، فإن notum العذراء هشة وعرضة للتجعيد والتشويه بعد إزالتها من الجسم ، مما يجعل من الصعب استكمال التصوير الحي. يوفر هذا البروتوكول طريقة مباشرة لإصلاح وتلطيخ العذراء ، سواء كانت سليمة أو بعد الجرح بالليزر. باستخدام هذه التقنية ، يتم لصق الجانب البطني من الخادرة على غطاء لشل حركة الخادرة ، ويتم إزالة الخادرة بعناية وتثبيتها وتلطيخها. يتم تركيب ظهارة notum على شريحة أو بين اثنين من أغطية لتسهيل التصوير من الجانب الظهري أو البطني للأنسجة.
Introduction
تم استخدام النعومة العذراء من ذبابة الفاكهة melanogaster بشكل متزايد لدراسات التصوير الحي في العقد الماضي لأن الحيوان غير متحرك ولديه بشرة شفافة في هذه المرحلة1،2،3،4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن notum العذراء يمثل تحديا في تشريحه وإصلاحه ، مما يجعل من الصعب استكمال دراسات التصوير الحية بالأجسام المضادة وتلطيخ الخلايا. الهدف العام من هذا العمل هو إنشاء بروتوكول قابل للتكرار لتشريح وإصلاح العذراء لتلطيخ الأجسام المضادة والخلايا على عينات جديدة أو تم تصويرها مسبقا على شكل صور حية.
عندما تبدأ اليرقات في التحول ، تسحب البشرة بعيدا عن بشرة اليرقات ، وتشكل حالة العذراء الصلبة8. يتم تقسيم خطة جسم اليرقات ، ويتم تطوير خطة جسم البالغين الجديدة. خلال هذا الوقت ، تكون الشرانق غير متحركة ، مما يجعلها مثالية للتصوير الحي. أحد الأنسجة التي يتم تصويرها بشكل شائع هو notum العذراء ، وهي ظهارة أحادية الطبقة للبالغين تتشكل في الصدر الظهري. يمكن الوصول إلى notum بصريا بعد تشريح بسيط لإزالة حالة العذراء9. يمكن بعد ذلك تركيب الحيوان بأكمله ، ويمكن تصوير النوتوم مباشرة لساعات أو أيام ، مما يجعله نسيجا مثاليا لدراسة سلوكيات الخلايا الظهارية أثناء التطور ، والتوازن ، وبعد الجرح10،11،12،13،14. ومع ذلك ، فإن notum يصعب تشريحه وإصلاحه لأنه هش ومغطى ببشرة رقيقة شفافة للبالغين مسعورة. هذه البشرة الكارهة للماء تجعلها عرضة للتجعيد في المحاليل المائية عند إزالتها من بقية الجسم. وبالتالي ، لم يتم الإبلاغ عن تشريح وتثبيت notum إلا نادرا ، وغالبا ما لا يتم وصف التشريح15،16،17،18. بدون بروتوكول مفصل في الأدبيات ، من الصعب للغاية على باحث ذبابة الفاكهة استكمال التصوير الحي مع تلطيخ الشرانق.
تهدف هذه التقنية إلى تشريح وإصلاح العينات التي تم تصويرها مباشرة في السابق ، بما في ذلك تلك التي أصيبت بالليزر. نظرا لأن التصوير الحي يتطلب إزالة حالة العذراء ، تبدأ تقنية التشريح هذه بإزالة حالة العذراء الأمامية ، على عكس البروتوكولات السابقة التي تثبت أو تقسم الشرانق داخل حالة العذراء4،19،20. ال notum هو نسيج هش ، وقد يؤدي الجرح إلى تفاقم هشاشته. وبالتالي ، لدعم هذا النسيج الحساس ، يتم تشريح التكامل (الظهارة وبشرة البالغين الشفافة المرفقة) من notum وجزء من الرأس والبطن بعيدا عن بقية الخادرة بينما يتم غمرها دائما في بيئة مائية. هذه الطريقة تقلل من احتمال تجعيد الأنسجة وكونها غير صالحة للاستخدام. نجحت هذه التقنية في تلطيخ أنسجة النوتوم الجريحة في وقت مبكر من 30 دقيقة بعد الجرح (الشكل 1E-H) وفي 3 ساعات بعد الجرح (الشكل 1I-L). من المتوقع أن يكون هذا البروتوكول فعالا طوال مدة تطوير الجرح أو إصلاح الجروح. ستكون التقنية الحالية مفيدة للباحثين الذين يرغبون في توحيد قدرات التصوير الحي للنعومة العذراء مع وفرة كواشف الكيمياء النسيجية المناعية المتاحة.
Protocol
تم الحفاظ على ذبابة الفاكهة melanogaster (ذباب الفاكهة) عند 25 درجة مئوية على وسط دبس دقيق الذرة القياسي. أجريت الدراسات على الشرانق الموسومة ب EGFP هيستون H2A (w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). تم الحصول على الذباب من مركز مخزون عام (انظر جدول المواد).
1. تجميد الشرانق
- ضع شريطا مقاس 2 بوصة من الشريط على الوجهين على شريحة المجهر.
- حدد الشرانق البيضاء في القوارير المرفوعة عند 25 درجة مئوية ، واستخدم علامة للإشارة إلى موقعها خارج القارورة. أعد القوارير إلى 25 درجة مئوية.
ملاحظة: تتميز الشرانق البيضاء بجمود حركتها ولونها الأبيض وشراكاتها الفارغة. هذه تشكل 0-1 ساعة بعد تشكيل puparium (APF) ، أو المرحلة P18. - بعد 12-15 ساعة ، قم بإزالة 3-4 من الشرانق المشار إليها بعناية (دون فرقعكها) باستخدام منظار تشريح وجمعها على شريحة المجهر بجوار الشريط.
ملاحظة: ستكون الشرانق الآن في المرحلة P5 مع كيس رأس مفصول مرئي في الطرف الأمامي8 من الشرانق . - ضع الشرانق على الأقل عرض خادرة واحدة على الشريط مع جوانبها البطنية لأسفل.
- ضع قطرة من الغراء اللاصق على فيلم بارافين (انظر جدول المواد) أو في غطاء أنبوب الطرد المركزي. اغمس نهاية طرف ماصة 0.1-10 ميكرولتر (بدون ماصة) في قطرة الغراء اللاصق. اضغط على طرف الماصة مرتين على غطاء 24 مم × 60 مم (سمك 1.5) ، على بعد 1 سم × 1 سم من الزاوية ، مما يخلق خطا من الغراء اللاصق ~ 1/2 طول الخادرة.
- قم مسبقا بتعيين ماصة 0.2-2 ميكرولتر (P2) إلى 2 ميكرولتر ، وماصة 200 ميكرولتر (P200) إلى 200 ميكرولتر ، وتناسبها مع نصائح بحيث تكون جاهزة للملء ب 1x PBS + 0.1 mM Ca2 + ، مما سيؤدي إلى تصلب الغراء اللاصق بسرعة عند الاتصال.
- أدخل الملقط (انظر جدول المواد) بالقرب من جانب الرأس وقم بإزالة العلبة برفق من الأمام إلى الخلف9. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من العلبة. أمسك بأرجل الخادرة النامية بزوج من الملقط الحاد واسحب الخادرة بعناية من علبتها.
ملاحظة: لن يكون تمزق صغير في الجزء البطني من الشرانق ضارا بهذا الإجراء. - ضع الخادرة في زاوية الغطاء.
- أمسك الخادرة في الجزء الخلفي من البطن أو الجناح النامي باستخدام ملقط حاد ، وارفعه ، وضع الجانب البطني من الشرانق في خط الغراء اللاصق.
- املأ ماصة P2 بسرعة ب 2 ميكرولتر من 1x PBS + 0.1 mM من Ca2 + ، واحتفظ بها في الهواء ، واطرد ما يكفي لتشكيل فقاعة صغيرة عند الطرف (0.25-0.5 ميكرولتر).
- المس الفقاعة الصغيرة للمحلول إلى جانب واحد من الشرانق عند قاعدة الصدر ، ثم كرر على الجانب الآخر.
ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى تصلب كمية صغيرة من الغراء اللاصق لتثبيت الخادرة في مكانها. بشكل عام ، لن يتم استخدام جميع الحلول. - املأ ماصة P200 ب 200 ميكرولتر من 1x PBS + 0.1 mM من Ca2+ ، ثم ضع طرف الماصة فوق الصدر واطرد المحتويات لغمر الشرانق تماما. ما تبقى من الغراء اللاصق سوف تصلب على الفور.
- قم بإزالة ~ 100 ميكرولتر من محلول PBS ، بحيث بالكاد يتم غمر الخادرة قبل المتابعة فورا إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: بالنسبة للعينات غير المصابة، ابدأ من الخطوة 1.1. بالنسبة للعينات المصابة التي تم تشريحها جزئيا، ابدأ في الخطوة 1.5. تم وصف الجرح عن طريق الاستئصال بالليزر سابقا14,21. يجب إجراء خطوات التجميد والتشريح والتركيب باستخدام مجهر التشريح.
2. تشريح النغمة
- أمسك بزوج من مقصات التشريح المجهري التي تجهز جانبا واحدا من المقبض مقابل السبابة والإصبع الأوسط لليد المهيمنة ، بحيث يطبق إبهام اليد المهيمنة قوة القطع (الشكل 2A ، B).
- قم بتثبيت عنق المقص ضد الإصبع الأوسط لليد غير المهيمنة أثناء تجهيز الغطاء بإصبع البنصر لليد غير المهيمنة.
- قصاصة في منتصف البطن الظهري لإنشاء ثقب صغير ، ~ 0.2-0.5 ملم. عادة ما ينسكب بعض الهيموليمف وهو مؤشر جيد على الخرق.
- قم بعمل قطع صغيرة بحجم 0.5-0.75 مم من خلال التكامل من الخلف إلى الأمام ، وتحيط بالأنسجة الظهرية لعزلها. لإنشاء نسيج مسطح قدر الإمكان ، تجنب القطع البطني جدا ؛ يجب إزالة "القبة" الظهرية فقط من الصدر جنبا إلى جنب مع أجزاء صغيرة من الرأس والبطن.
- كرر الجروح الخلفية إلى الأمامية على الجانب الآخر من الشرانق.
- قم بتدوير مرحلة التشريح للسماح بقطع نظيف عبر الرأس إذا لزم الأمر.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، سيتم فصل التكامل الظهري ، أو notum ، عن بقية الخادرة. إذا بدا منفصلا ولكن لا يمكن تحريكه بسهولة ، فإن بعض التخفيضات أسفل notum يمكن أن تساعد في إزاحته. - أضف ~ 200 ميكرولتر من 1x PBS إلى وسط الغطاء وقم بعمل قناة تربطه بقطرة التشريح الأصلية عن طريق سحب طرف الماصة برفق عبر زجاج الغطاء من القطرة الجديدة إلى الأصل.
- باستخدام زوج من الملقط الحاد ، ادفع أو اسحب النوتوم المعزول برفق إلى وسط الغطاء واستدار ، بحيث يواجه الجانب الداخلي لأعلى. لا تقم أبدا بإزالة الأنسجة من القطرة.
ملاحظة: من الضروري نقل النوتوم بعيدا عن موقع التشريح الأصلي لتجنب أي بقايا من الغراء اللاصق الذي يسد العينة أثناء التصوير اللاحق. - امسك النوتوم لأسفل باستخدام الملقط الحاد عن طريق الضغط على أقسام البطن أو الرأس. باستخدام زوج من الملقط الحاد و / أو عمليات الطرد اللطيفة ل 1x PBS من ماصة 200 ميكرولتر ، قم بإزالة أي جسم دهني متبقي أو عصابات عضلية أو هيموليمفاوية (إن وجدت) لفضح الظهارة أحادية الطبقة بالكامل وجعل التلطيخ النهائي أكثر توازنا. يجب أن تظهر النوتوم التشريحية كما في الشكل 3A.
- بمجرد تنظيف الأنسجة ، استخدم ماصة 200 ميكرولتر لإزالة أكبر قدر ممكن من محلول PBS (إلى جانب الحطام والجزء البطني من الشرانق) ، والمراقبة باستخدام نطاق تشريح لتجنب شفط النور.
- بمجرد إزالة معظم السائل ، استخدم نسيجا ماصا لمسح بقية الغراء اللاصق والخادرة بعناية ، بالإضافة إلى أي حطام آخر يبقى على الغطاء.
ملاحظة: إذا بقي بعض الغراء اللاصق على الغطاء ، فلن يسبب مشكلة طالما أنه أرق من الأنسجة الظهرية نفسها. - أضف 150-200 ميكرولتر من PFA بنسبة 4٪ (في 1x PBS) وقم بإصلاحه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اعتمادا على سرعة التشريح ، يمكن تشريح 1 أو أكثر من الشرانق أثناء تثبيت الخادرة الأولى.
- قم بإزالة PFA واستبدله ب 1x PBS لغسل notum مرة واحدة لمدة 30 ثانية.
- في حالة المضي قدما في تلطيخ الأجسام المضادة ، قم بإجراء غسلات لمدة 5 دقائق (3 مرات) في 1x PBS أو 1x PBST (الملف التكميلي 1) لتخلل الأنسجة إذا كان المستضد داخل الخلايا.
- قم بتخزين العينة في 1x PBS + 0.02٪ NaN3 بين عشية وضحاها في غرفة رطبة ، أو إذا كنت تخطط لتلطيخ الأنسجة ، فقم باحتضانها بين عشية وضحاها في محلول الحظر (الملف التكميلي 1).
3. تلطيخ النغمة
ملاحظة: للتلطيخ باستخدام الأجسام المضادة أو البقع الخلوية اتبع الخطوات أدناه. - يجب عدم إزالة النوتوم من المحلول ، لأن هذا من المحتمل أن يتسبب في تجعد الأنسجة. وبالتالي ، قم بتكييف بروتوكولات التلطيخ ليتم إجراؤها بالكامل على الغطاء والاحتفاظ بها في غرفة رطبة لأي خطوات أطول من 5 دقائق. يمكن أن تساعد مراقبة العينات تحت مجهر التشريح في منع الشفط العرضي للأنسجة أثناء الغسيل.
- لتصور حدود الخلية، احتضان 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية للماوس IgG2a المضادة ل FasIII (انظر جدول المواد) بتركيز 1:8 مخفف في حجب المخزن المؤقت + 0.02٪ NaN3 بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الأجسام المضادة الأولية الزائدة (3 مرات) باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS + 0.02٪ NaN3 لمدة 1 ساعة لكل غسل في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإجراء حضانة الأجسام المضادة الثانوية باستخدام 200 ميكرولتر من 1:200 تركيز مضاد للفأر IgGa2 في Cy3 في Block Buffer + 0.02٪ NaN3 لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الأجسام المضادة الثانوية الزائدة (3 مرات) باستخدام 200 ميكرولتر من 1x PBS + 0.02٪ NaN3 لمدة 1 ساعة لكل غسل في درجة حرارة الغرفة.
- لتصور النوى ، احتضن عينات في 1 ميكروغرام / مل من DAPI لمدة 45 دقيقة لإتاحة الوقت الكافي للبقعة لاختراق العصابات العضلية ؛ التثبيت في وسط تركيب يحتوي على DAPI غير فعال مع هذا الأنسجة.
- اغسل DAPI الزائد (3 مرات) ب 200 ميكرولتر من 1x PBS + 0.02٪ NaN 3 لمدة 5 دقائق لكل غسل في درجة حرارة الغرفة ، ثم اتركه في 200 ميكرولتر من 1x PBS + 0.02٪ NaN3 بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، أو قم بالتركيب على الفور.
4. تركيب وتصور notum
- بعد التلطيخ ، قم بإعداد غطاء جديد 24 × 60 (علوي) مع دعامات.
ملاحظة: نظرا لأن النوتوم على شكل قبة ، فإن تسويتها بالكامل تؤدي إلى أنسجة مشوهة مجعدة. إن خلق فجوة بين الغطاءين يسمح للنوتوم بالاحتفاظ بشكله الطبيعي. - قم بإنشاء فجوة ~ 200 ميكرومتر باستخدام فواصل مصنوعة من 22 × 22 غطاء (رقم 0 سمك ، ~ 100 ميكرومتر) ، ملتصقة ~ 1 سم مع طلاء الأظافر في منتصف الجزء العلوي.
- للالتصاق ، ضع الفواصل على الجزء العلوي وقم بطلاء الحواف البعيدة للفواصل بطبقة رقيقة من طلاء الأظافر. اتركيه يجف.
ملاحظة: استخدم فقط طلاء الأظافر الرقيق والسائل. سيضيف طلاء الأظافر السميك مساحة إضافية غير ضرورية بين الغطاء والغطاء العلوي. - قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المحلول المائي من العينة.
- ضع على الفور قطرتين (~ 100 ميكرولتر) من وسط التركيب المضاد للتلاشي (انظر جدول المواد) على العينة.
- إذا لزم الأمر ، استخدم ملقط نظيف وحاد لوضع النوتوم في وسط القطرة المتوسطة المتصاعدة المضادة للتلاشي.
- ضع الغطاء مع notum على دعم ~ 10 × 40 مم ، مثل قطعة من الرغوة الرقيقة (مقطوعة من مواد التعبئة داخل صناديق coverslip) ، لرفع العينة حتى لا تلتصق بسطح العمل.
- تحت نطاق التشريح ، اخفض الجزء العلوي ببطء على العينة. بمجرد أن يلتقي وسط التركيب المضاد للتلاشي مع الجزء العلوي، حرر بلطف واسمح للعمل الشعري بسحب الجزء العلوي لأسفل.
ملاحظة: خلال الثواني القليلة الأولى، يمكن إجراء تعديلات طفيفة على موضع الانزلاق دون الإضرار بالألم. - ضع قطعة أخرى من الرغوة على الجزء العلوي واستخدم شريحة مجهر قياسية كوزن لإقناع وسط التركيب المضاد للتلاشي بلطف بين غطاء العينة والجزء العلوي والفواصل.
- بعد 5-10 دقائق، استخدم منسيجا ماصا للتخلص من أي وسط تركيب زائد مضاد للتلاشي عن طريق لمس حواف الغطاء برفق.
- ضعي طلاء الأظافر بلطف على كل ركن من أركان الأغطية للالتصاق بها معا. بمجرد أن تجف ، قم بطلاء جميع حواف الأغطية لإغلاقها. تجنب طلاء جميع الحواف أولا ، لأن هذا يمكن أن يؤدي في كثير من الأحيان إلى تغيير الغطاء وإتلاف الأنسجة الظهرية.
- تصور النوتوم تحت المجهر الفلوري (انظر جدول المواد) من خلال الجانب الظهري و / أو البطني.
Representative Results
تعمل التقنية المقدمة بشكل جيد على النوتوم غير المصاب (الشكل 1A-D) ، مما يسمح بالتحقيق في تطور الأنسجة وتوازنها ، على سبيل المثال ، تكوين الخلايا الشعيرية الميكانيكية الحسية متعددة الصبغيات 18 ، أو الأمامية للتدفق الخلفي للخلايا الظهارية10. ينطبق هذا البروتوكول أيضا على النوتوم المبتور بالليزر (الشكل 1E-L) ، حيث يمكن تحليل الاستجابة الخلوية للإصابة مباشرة باستخدام الفلوروفورات الداخلية مثل Histone2-EGFP (الشكل 1B و F و J). يمكن أن يكشف ما بعد التلطيخ بالكيمياء النسيجية المناعية (الخطوة 3) عن العديد من الميزات ، مثل Fasciclin III ، الذي يصنف حدود الخلايا (الشكل 1C و G و K). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام البقع الكمية مثل DAPI (الشكل 1A و E و I) لتقييم تغيرات محتوى الحمض النووي ، بما في ذلك polyploidy22 الناجم عن الجرح.
البروتوكول الحالي مفيد بشكل خاص حيث يمكن استخدامه بعد تجارب التصوير الحي طويلة الأجل. نظرا لأن الشرانق غير متحركة ، يمكن تصويرها لساعات (الشكل 4A ، B). الأهم من ذلك ، أن هذا البروتوكول لا يسبب تغييرات كبيرة في البنية العامة لظهارة الجرح أو مورفولوجيتها بعد التشريح (الشكل 4B ، C). وبالتالي ، يمكن تصوير الميزات داخل الأنسجة على المدى الطويل ثم التحقيق فيها بشكل أكبر باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية أو البقع الخلوية.
التصوير العميق داخل الأنسجة معقد بسبب عتامتها ، ويتم طلاء ذبابة الفاكهة في بشرة شمعية8 مما يجعل التصوير العميق أكثر صعوبة. ومع ذلك ، باستخدام هذه التقنية ، يمكن وضع notum تشريح بين اثنين من أغطية الغطاء مما يسمح بتصوير الطبقة الأحادية الظهارية من كلا الجانبين: الجانب القمي من خلال البشرة (الشكل 5A-D) و / أو الجانب القاعدي من الظهارة التي تواجه تجويف الجسم (الشكل 5E-H). هذه الآراء المختلفة مناسبة بشكل مثالي لتصور الهياكل المختلفة داخل الأنسجة. على سبيل المثال ، يعد العرض القمي مثاليا لتصور حدود الخلايا الظهارية والنوى التي تقع أسفل البشرة مباشرة (الشكل 5A-D). مع المنظر القاعدي ، تكون هذه الإشارات القمية أقل وضوحا (الشكل 5E-H). ومع ذلك ، لوحظت الهياكل القاعدية على هامش الجرح (الشكل 5J ، L الأصفر ، الأسهم البيضاء). هذه الهياكل القاعدية أكثر إشراقا بكثير حيث يوجد انسداد أقل في المنظر القاعدي مقارنة بالعرض القمي.
الشكل 1: تشريح ذبابة الفاكهة وتثبيتها وملطخة بذبابة الفاكهة (A-D) غير المصابة. (E-H) ، جرح notum بعد 30 دقيقة من الاستئصال بالليزر. (I-L) جرح notum 3 ساعة بعد الاستئصال بالليزر. (أ، هاء، ط) تظهر بقعة DAPI النوى. (ب، و، ي) Histone2-EGFP المعدلة وراثيا ، المستخدمة في التصوير الحي ، مرئية بعد التثبيت والتلطيخ. (C، G، K) يظهر الجسم المضاد ل FasIII أن بقع الأجسام المضادة تعمل بشكل جيد على الصبغة الثابتة. (D، H، L) صورة مدمجة. يتم التقاط الصور بهدف 40x باستخدام الفحص المجهري للقرص الدوار ، ويتم عرض الإسقاطات القصوى لكثافة مكدسات Z باستخدام شرائح Z بحجم 0.3 ميكرومتر. يمثل A-D 263 شريحة Z. E-H تمثل 195 شريحة. I-L يمثل 53 شريحة Z. يشير الخط البرتقالي المتقطع إلى هامش الجرح. شريط المقياس في L هو 25 ميكرومتر ، ينطبق على A-L. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وضع اليد لتشريح النوتوم. (A-B) المناظر اليسرى واليمنى لوضع اليد لحمل مقص التشريح المجهري. لمنع اهتزاز اليد ، يتم وضع عنق المقص ضد الإصبع الأوسط لليد غير المهيمنة. يجب أن يكون المقص موازيا لشريحة المجهر لتجنب تشوه أنسجة النوتوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تشريح النوتوم بشكل صحيح مقابل النوتوم المجعد (أ) التشريح العذراوي بعد التشريح والتنظيف غير المجعد والجاهز للتثبيت. (ب) تجعد العذراء على نفسه بعد إزالته من 1x PBS ، مما يجعله غير قابل للاستخدام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الصور السابقة واللاحقة للإصلاح متشابهة إلى حد كبير. تم تصوير نوتوم العذراء التي تعبر عن Histone2-EGFP في النوى (A) حية قبل الاستئصال و (B) 3 ساعات بعد الاستئصال بالليزر. (ج) تم استرجاع النوتوم وتشريحه وإصلاحه كما هو مذكور في البروتوكول وإعادة تصويره بعد تثبيته. يتم تصنيف موقع الجرح بنجمة حمراء. تم التقاط الصور بهدف 40x باستخدام المجهر الغزلي للقرص ، وتم التقاط شرائح Z كل 0.3 ميكرومتر. يتم عرض إسقاطات الكثافة القصوى ل 34 شريحة Z قبل الجرح (A) ، و 48 شريحة Z بعد 3 ساعات من الجرح (B) ، و 103 شرائح Z بعد التشريح والتثبيت والتلطيخ (C). شريط المقياس في C هو 25 ميكرومتر ، ينطبق على A-C. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تصوير الجوانب القمية والقاعدية للنوتوم المصاب. يتم عرض نفس العذراء الجريحة في جميع اللوحات. يتم تمييز الجرح بنجمة حمراء. يشير الخط البرتقالي المنقط إلى هامش الجرح. (أ-دال) يتم تصوير notum من الجانب القمي ، من خلال البشرة. (ه-ح) يتم تصوير notum من الجانب الداخلي القاعدي. (I-L) تعرض اللوحات العلوية صورة X-Z للنوتوم، الجانب القمي لأعلى، مع تعيين الورقة الظهارية بواسطة مثلث أبيض. يشير الخط البرتقالي إلى المستوى القاعدي القمي لشريحة X-Y ، كما هو موضح في الألواح السفلية. داخل اللوحات السفلية ، يظهر الخط البرتقالي مستوى صورة X-Z أعلاه. (I) notum مصورة بشكل قمي - شريحة قمي. تعرض طريقة العرض X-Z العلوية تصويرا دقيقا للورقة الظهارية القمية (المثلث الأبيض). طريقة العرض هذه تعادل طريقة عرض التصوير المباشر. (ي) نوتوم مصور قمي - شريحة قاعدية ، تعوقها جزئيا الأنسجة القمي. الأنسجة الأخرى التي يشار إليها بالسهم الأصفر (الشريط العضلي المحتمل) والأسهم البيضاء (خلايا الدم المحتملة) مرئية على الجانب القاعدي. (K) notum المصور بشكل أساسي - شريحة قمية ، تعوقها جزئيا الأنسجة القاعدية وجرب الجرح (المنطقة المركزية المظلمة). (L) نوتوم مصور بشكل أساسي - شريحة قاعدية. تظهر طريقة العرض هذه الأنسجة القاعدية المشار إليها بالأسهم الصفراء والبيضاء بشكل أفضل. A,E: DAPI STAIN, B,F: Histone-EGFP, C,G: FasIII staining. تم التقاط الصور بهدف 20x باستخدام الفحص المجهري للقرص الغزل. تم أخذ شرائح Z كل 0.9 ميكرومتر. يظهر A-D الحد الأقصى لإسقاط الكثافة البالغ 19 شريحة. يمثل E-H الحد الأقصى لإسقاط الكثافة البالغ 17 شريحة. تنطبق أشرطة مقياس 25 ميكرومتر في D و H و L على A-D ، E-H ، I-L ، على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الملف التكميلي 1: إعداد الحلول والمخازن المؤقتة. يتم تفصيل وصفات الحلول التالية: 1xPBS ، 1x PBST ، محلول الحظر ، ومثبت بارافورمالديهايد. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Discussion
خطوات حاسمة
سيؤدي تحسين ثلاث خطوات إلى زيادة نجاح هذا البروتوكول بشكل كبير. أولا ، في الخطوة 1.5 ، كن متحفظا مع الغراء اللاصق المطبق على الغطاء. إذا تمت إضافة الكثير من الغراء اللاصق ، يمكن أن تصبح الشرانق مدفونة في طبقة سميكة من الغراء اللاصق الصلب ، مما سيجعل التشريح مستحيلا ، وإذا كان يغطي النوتوم نفسه ، فإن الغراء اللاصق سوف يحجب الضوء من العينة. ثانيا ، خلال الخطوات 2.3-2.6 ، تأكد من إزالة القبة العلوية فقط من النوتوم ، باستثناء أكبر قدر ممكن من الأنسجة الجانبية. إذا تم تضمينه ، ضغط الأنسجة الجانبية أثناء التركيب وتتسبب في ربط منتصف النوتوم إلى الداخل ، وغالبا ما تضعه خارج مسافة العمل لأهداف الفتحة العددية العالية. ثالثا ، أثناء خطوة التنظيف 2.9 ، يجب توخي الحذر الشديد لعدم إتلاف الظهارة أحادية الطبقة. إذا كان النسيج يحتوي على أجزاء كبيرة مفقودة أو لا يمكن اكتشاف أي إشارة ، فمن المحتمل أن تكون هذه الخطوة هي المسؤولة.
استكشاف الاخطاء
المشكلة 1: بعد التركيب ، تخرج الخادرة من الشريط على الوجهين أثناء التشريح. هذه مشكلة شائعة ، خاصة بالنسبة للمبتدئين. أفضل علاج هو التأكد من أن الجزء الخارجي من علبة الشرانق جاف تماما / خال من حطام الطعام. إن إزالة الطعام باستخدام زوج من الملقط الحاد والسماح للعلبة بالجفاف في الهواء لمدة 10-15 دقيقة سيساعد على الالتصاق بالشريط. بدلا من ذلك ، استخدم اليد غير المهيمنة وزوجا من الملقط الحاد لتثبيت الشرانق على الشريط أثناء التشريح. إذا استمرت المشكلة ، فإن تطبيق قطرة صغيرة من طلاء الأظافر 5-10 ميكرولتر على قاعدة الطرف الخلفي من العلبة والسماح لها بالتصلب بشكل عام يوفر التصاق كاف حتى لأشد الشرانق جموحا.
المشكلة 2: ينهار Notum أثناء الخطوة 2.3 ، أو أن الخرق الأولي من خلال التكامل ليس سلسا. إذا كان من الصعب اختراق التكامل ، فقد يكون هناك الكثير من الغراء اللاصق من خطوات التجميد. سيؤدي وضع الشرانق المشوهة في غراء أقل لاصقا إلى تحسين هذه المشكلة. علاوة على ذلك ، تأكد من أن مقص التشريح المجهري حاد. لن يتمكن المقص الحاد من قطع التكامل ويميل إلى التسبب في انهياره إلى الداخل. بمجرد انسكاب الشرانق الليمفاوية من الشرانق ، تأكد من أن إحدى شفرات القطع يمكن أن تدخل الخادرة دون التسبب في تشوه النوروم. إذا انهارت الشفرة ولم تدخل الشفرة إلى الخادرة ، فاستمر في القص حتى تدخل شفرة إلى الشرانق.
المشكلة 3: أثناء الخطوة 2.4 ، يمسك المقص بالتكامل أو يسحبه. إذا بدأ المقص في التقاط أو سحب التكامل ، فغالبا ما يساعد على التبديل إلى الجانب الآخر من الشرانق والمضي قدما في "تخفيف" التكامل. المزيد من مقص التشريح المجهري الحاد سيجعل من الصعب تحقيق تخفيضات نظيفة من خلال التكامل ، ويجب استخدام مقص حاد.
المسألة 4: يتم شفط العينة عن طريق الخطأ أثناء التلطيخ (الخطوات 3.1-3.6). من الصعب رؤية النوتوم التشريحي لأنه شفاف. قد يكون من المفيد وضع ورقة زرقاء داكنة أو سوداء أسفل الغطاء لتوفير التباين (يعمل رف حامل طرف الماصة القديم بشكل جيد.) بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء جميع تغييرات الحل تحت مجهر التشريح.
المشكلة 5: لم يتم اكتشاف أي إشارة / تم اكتشاف إشارة غير مكتملة. بعد استبعاد المشاكل الخاصة بالبقع ، إذا لم يتم اكتشاف أي إشارة أو كانت غير مكتملة ، فمن المحتمل أن تكون الخطوة 2.9 (التنظيف) هي الجاني. يمكن أن تنشأ إشارة غائبة أو غير مكتملة من تلف وإزالة الأنسجة الظهارية أثناء التنظيف. على العكس من ذلك ، يمكن أن تحدث إشارة ضعيفة بسبب انسداد من عصابات العضلات / خلايا الجسم الدهنية إذا لم تتم إزالتها ، لأنها يمكن أن تحد من انتشار البقع والأجسام المضادة في النغمة بالنسبة للأنسجة المحيطة. في حالة تلف الأنسجة ، فإن كونك أكثر لطفا أثناء التنظيف هو الحل الأفضل. بدلا من ذلك ، إذا كانت البقعة مرئية ولكنها غير مكتملة ، فمن المستحسن زيادة النشاط / الوقت المخصص لخطوة التنظيف لإزالة أكبر قدر ممكن من العضلات والجسم الدهني. علاوة على ذلك ، يمكن أن تساعد زيادة مدة البقعة في حل هذه المشكلة من خلال تنظيف أفضل.
المسألة 6: النسيج المخاطي له مظهر مشوه / مجعد أثناء التصوير. يأتي التواء وتجاعيد الأنسجة من مصدرين. أولا ، سيؤدي ضغط notum أثناء التركيب إلى إبزيمه وتشويهه. أفضل حل هو إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الجانبية بحيث تكون القبة قصيرة قدر الإمكان ويمكن أن تتناسب بين فواصل الغطاء. ثانيا ، إذا تم ثني notum أثناء التشريح ، فلن يتم تقويم هذا الانحناء أثناء التركيب ، لذلك يجب توخي الحذر الشديد لعدم تشويه النوتوم أثناء التشريح. الانحناء العرضي للنوتوم هو الأكثر شيوعا عند قطع التكامل بعيدا عن بقية الشرانق. من المغري أن يكون مقص التشريح بزاوية بالنسبة إلى الشرانق بدلا من الاحتفاظ بها في مستوى العينة مثل الشرانق. ومع ذلك ، يتسبب المقص ذو الزاوية في ربط التكامل لأعلى عند قطعه بدلا من البقاء مسطحا.
الأساليب الحالية والقيود والتطبيقات المستقبلية
أبلغ وانغ وآخرون 20 عن بروتوكول تشريح مماثل لعزل ظهارة العذراء. تتطلب هذه التقنية أن تبقى الخادرة داخل حالتها وأن يتم تقسيمها بسرعة باستخدام مشرط. هذا البروتوكول غير متوافق مع العينات التي تم تصويرها مسبقا على الهواء مباشرة، حيث يتطلب التصوير المباشر إزالة جزء كبير من علبة العذراء. نظرا لأن الشرانق تفتقر إلى الصلابة ، فإن التقسيم الثنائي للعذراء خارج العلبة يشوه الأنسجة ، مما ألهم إنشاء هذا البروتوكول. تسمح التقنية المفصلة هنا بعزل وتثبيت النوتوم ، ويمكن استخدامها كخطوة أولى لمجموعة واسعة من الطرق الأخرى مثل التقسيم بالتبريد أو التهجين في الموقع أو المجهر الإلكتروني.
هذه التقنية لها بعض القيود. أولا ، يعد تشريح وإصلاح وتلطيخ النوتوم أكثر استهلاكا للوقت من البروتينات الموسومة بالفلورسنت في التصوير الحي في النوتوم ، والتي لا تتطلب سوى تشريح بسيط لإزالة حالة العذراء 9,23. ثانيا ، بالمقارنة مع تشريح أنسجة ذبابة الفاكهة الأخرى ، فإن هذا التشريح أكثر صعوبة بسبب الأنسجة الرقيقة والهشة والبشرة الكارهة للماء. لمجرد تصور البروتينات في ظهارة ذبابة الفاكهة ، فإن الكيمياء النسيجية المناعية على الأجنة الثابتة أو أقراص جناح اليرقات أو المبيضين أسهل. ومع ذلك ، تسمح هذه التقنية بإقران قوة التصوير الحي بالتثبيت والتلطيخ ، مما يجعلها أداة قوية بمجرد إتقانها.
تقنية التشريح / التثبيت لها بعض المزايا على التصوير المباشر. يمكن حل الهياكل القاعدية (الداخلية) بشكل أفضل من خلال عرض قاعدي (الشكل 5L ، J). والأهم من ذلك، أن التصوير الحي يقتصر على الفلوروفورات التي يجب توفيرها وراثيا، وغالبا ما تتطلب مخططات عبور وراثية طويلة. وعلى النقيض من ذلك، يسمح البروتوكول الحالي بتطبيق البقع، والكيمياء النسيجية المناعية، وغيرها من التقنيات التي تتطلب تشريحا وتثبيتا. هذا يزيد بشكل كبير من عدد الإشارات التي يتم فحصها في الأنسجة مع احتمال تقليل الوقت اللازم للنتائج التجريبية.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور م. شين هوتسون على إنشاء نظام الاستئصال بالليزر المستخدم في جرح العذراء ومساهماته وملاحظاته على تطوير البروتوكول. تم دعم هذا العمل من قبل 1R01GM130130 إلى APM و M. Shane Hutson. تم دعم JW بواسطة 2T32HD007502-21.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” Scotch Permanent Double-Sided tape | Scotch 3M | 665 | |
| 0.1-10 µL uTIP pipette tip | Biotix | M-0011-9FC | |
| 22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
| 24 x 60 mm coverslip | Corning | 2980-246 | |
| 3M VetBond | 3M | 1469SB | Called "adhesive glue" in protocol |
| Anti-FasIII primary Mouse IgG2a | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Chemical | c79-500 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | No. 11254-20 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt | Fine Science Tools | No. 11254-20 | Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone |
| Fisherbrand Double frosted microscope slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
| Fluorescent Light Source | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
| Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
| Fly Vial Foam Plugs "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water | Cole-Parmer | 759075D | A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water. |
| KimWipe | KimTech | 34155 | Called "Absorbent Tissue" in protocol |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
| NIS Elements Software | Nikon | AR | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
| Plastic Vials | Genesee Scientific | 32-114 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
| Stereo Microdissection Scope | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | New or freshly sharpened scissors |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Called " antifade mounting medium" in protocol |
| Vecta Shield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Not ideal for pupal notum. |
| X-Light V2 Spinning Disc | Crest Optics | V2 L-FOV |
References
- Valon, L., et al. Robustness of epithelial sealing is an emerging property of local ERK feedback driven by cell elimination. Developmental Cell. 56 (12), 1700-1711 (2021).
- Levayer, R., Dupont, C., Moreno, E. Tissue crowding induces caspase-dependent competition for space. Current Biology. 26 (5), 670-677 (2016).
- Couturier, L., et al. Regulation of cortical stability by RhoGEF3 in mitotic sensory organ precursor cells in Drosophila. Biology Open. 6 (12), 1851-1860 (2017).
- Couturier, L., Mazouni, K., Corson, F., Schweisguth, F. Regulation of Notch output dynamics via specific E(spl)-HLH factors during bristle patterning in Drosophila. Nature Communications. 10, 3486 (2019).
- Fujisawa, Y., Shinoda, N., Chihara, T., Miura, M. ROS regulate caspase-dependent cell delamination without apoptosis in the drosophila pupal notum. iScience. 23, 101413 (2020).
- Besson, C., et al. Planar cell polarity breaks the symmetry of par protein distribution prior to mitosis in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 25 (8), 1104-1110 (2015).
- Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. Apoptosis ensures spacing pattern formation of drosophila sensory organs. Current Biology. 21, 278-287 (2011).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Moreira, C., Regan, J., Zaidman-Rémy, A., Jacinto, A., Prag, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods in Molecular Biology. 769, Clifton, N.J. 249-260 (2011).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. Elife. 4, 08519 (2015).
- Cristo, I., Carvalho, L., Ponte, S., Jacinto, A. Novel role for Grainy head in the regulation of cytoskeletal and junctional dynamics during epithelial repair. Journal of Cell Science. 131 (17), 213595 (2018).
- Bellaïche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nature Cell Biology. 3 (1), 50-57 (2001).
- Shannon, E. K. Multiple mechanisms drive calcium signal dynamics around laser-induced epithelial wounds. Biophysical Journal. 113 (7), 1623-1635 (2017).
- O'Connor, J. T., et al. Proteolytic activation of Growth-blocking peptides triggers calcium responses through the GPCR Mthl10 during epithelial wound detection. Developmental Cell. 56 (15), 2160-2175 (2021).
- Hartenstein, V., Posakony, J. W. Development of adult sensilla on the wing and notum of Drosophila melanogaster. Development. 107 (2), 389-405 (1989).
- Yeh, E., Zhou, L., Rudzik, N., Boulianne, G. L. Neuralized functions cell autonomously to regulate Drosophila sense organ development. The EMBO Journal. 19 (17), 4827-4837 (2000).
- Loubéry, S., et al. Uninflatable and notch control the targeting of sara endosomes during asymmetric division. Current Biology. 24 (18), 2142-2148 (2014).
- Kawamori, A., Shimaji, K., Yamaguchi, M. Dynamics of endoreplication during Drosophila posterior scutellar macrochaete development. PLoS One. 7 (6), 38714 (2012).
- Couturier, L., Schweisguth, F. Notch Signaling: Methods and Protocols. Bellen, H. J., Yamamoto, S. , Springer. New York. 79-86 (2014).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (56), e3139 (2011).
- Kiehart, D. P., et al. Cell Biology (Third Edition). Celis, J. E., et al. , Academic Press. 87-103 (2006).
- Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila model to study wound-induced polyploidization. Journal of Visualized Experiments. (160), e61252 (2020).
- O’Connor, J. T., S, E. K., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Mounting Drosophila pupae for laser ablation and live imaging of the dorsal thorax. STAR Protocols. , (2022).
