Dissekering, fastgørelse og visualisering af Drosophila Pupal Notum

Summary

Den nuværende protokol beskriver forberedelsen og visualiseringen af fast væv i Drosophila pupal notum. Det kan bruges til enten intakt eller såret væv, og vævets oprindelige arkitektur bevares. Procedurerne for dissekering, fastgørelse og farvning er alle beskrevet i denne artikel.

Abstract

Pupperne af Drosophila melanogaster er immobile i flere dage under metamorfose, hvor de udvikler en ny krop med et tyndt gennemsigtigt voksent integument. Deres immobilitet og gennemsigtighed gør dem ideelle til in vivo live imaging eksperimenter. Mange undersøgelser har fokuseret på det dorsale epitelmonolag af pupal notum på grund af dets tilgængelighed og relativt store størrelse. Ud over undersøgelserne af epitelmekanik og udvikling har notum været et ideelt væv til at studere sårheling. Efter en skade kan hele epitelreparationsprocessen fanges ved levende billeddannelse over 6-12 timer. På trods af populariteten af notum til levende billeddannelse har meget få offentliggjorte undersøgelser brugt faste notumprøver. Fiksering og farvning er almindelige tilgange til næsten alle andre Drosophila-væv, der udnytter det store repertoire af enkle cellulære pletter og antistoffer. Imidlertid er pupal notum skrøbelig og tilbøjelig til at krølle og forvrængning efter fjernelse fra kroppen, hvilket gør det udfordrende at supplere levende billeddannelse. Denne protokol tilbyder en ligetil metode til fastgørelse og farvning af pupal notum, både intakt og efter laser-såring. Med denne teknik limes den ventrale side af puppen ned til et dækslip for at immobilisere puppen, og notum fjernes forsigtigt, fastgøres og farves. Notumepitelet er monteret på et dias eller mellem to dæksler for at lette billeddannelse fra vævets dorsale eller ventrale side.

Introduction

Pupal notum af Drosophila melanogaster er i stigende grad blevet brugt til levende billeddannelsesundersøgelser i det sidste årti, fordi dyret er både immobilt og har en gennemsigtig kutikel på dette stadium 1,2,3,4,5,6,7. Imidlertid er pupal notum udfordrende at dissekere og rette, hvilket gør det vanskeligt at supplere levende billeddannelsesundersøgelser med antistof og cellefarvning. Det overordnede mål med dette arbejde er at skabe en reproducerbar protokol til dissekering og fastgørelse af pupal notum for antistof og cellefarvning på nye eller tidligere levende afbildede prøver.

Når larver begynder metamorfose, trækker epidermis sig væk fra larvebåndet og danner en hård puppekasse⁸. Larvekropsplanen nedbrydes, og den nye voksenkropsplan udvikles. I løbet af denne tid er pupper immobile, hvilket gør dem ideelle til levende billeddannelse. Et almindeligt afbildet væv er pupal notum, et voksent monolagsepitel, der dannes i den dorsale thorax. Notum er visuelt tilgængelig efter en simpel dissektion for at fjerne puppehuset⁹. Hele dyret kan derefter monteres, og notum kan levende afbildes i timer eller dage, hvilket gør det til et ideelt væv til at studere epitelcelleadfærd under udvikling, homeostase og efter såring 10,11,12,13,14. Notum er imidlertid udfordrende at dissekere og rette, fordi det er skrøbeligt og dækket af en tynd gennemsigtig voksen kutikel, der er hydrofob. Denne hydrofobe kutikle gør den tilbøjelig til at krølle i vandige opløsninger, når den fjernes fra resten af kroppen. Således er notum dissektion og fiksering kun sjældent blevet rapporteret, og dissektionen er ofte ikke beskrevet 15,16,17,18. Uden en detaljeret protokol i litteraturen er det uoverkommeligt vanskeligt for en Drosophila-forsker at supplere levende billeddannelse med farvning af pupper.

Denne teknik har til formål at reproducere dissekere og fiksere prøver, der tidligere er blevet levende afbildet, herunder dem, der er blevet lasersårede. Fordi levende billeddannelse kræver fjernelse af puppehuset, begynder denne dissektionsteknik med at fjerne den forreste puppesag, i modsætning til tidligere protokoller, der fastgør eller skærer pupper inden for puppesagen ^4,19,20. Notum er et skrøbeligt væv, og sår kan forværre dets skrøbelighed. For at understøtte dette sarte væv dissekeres integumentet (epitelet og den vedhæftede gennemsigtige voksne kutikel) af notum og en del af hovedet og maven således væk fra resten af puppen, mens den altid er nedsænket i et vandigt miljø. Denne metode reducerer sandsynligheden for, at vævet krøller og er ubrugeligt. Denne teknik har med succes farvet såret notumvæv så tidligt som 30 minutter efter såring (figur 1E-H) og ved 3 timer efter såring (figur 1I-L). Denne protokol forventes at være effektiv i løbet af notumudvikling eller sårreparation. Den nuværende teknik vil være nyttig for forskere, der ønsker at forene puppenolumets levende billeddannelsesfunktioner med overflod af tilgængelige immunhistokemiske reagenser.

Protocol

Drosophila melanogaster (bananfluer) blev opretholdt ved 25 °C på et standard majsmelamelassemedium. Undersøgelserne blev udført på EGFP-mærket histon H2A-pupper (w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). Fluerne blev hentet fra et offentligt lagercenter (se Tabel over materialer).

1. Pupae immobilisering

1. Påfør en 2" strimmel dobbeltsidet tape på et mikroskop dias.
2. Identificer hvide forpupper i hætteglas hævet ved 25 °C, og brug en markør til at angive deres placering uden for hætteglasset. Hætteglassene returneres til 25 °C.
   BEMÆRK: Hvide forpupper er kendetegnet ved deres immobilitet, hvide farve og everted spirakels. Disse danner 0-1 time efter pupariumdannelse (APF) eller trin P1⁸.
3. 12-15 timer senere skal du forsigtigt fjerne 3-4 af de angivne pupper (uden at poppe dem) ved hjælp af et dissektionsomfang og samle dem på mikroskopdiaset ved siden af båndet.
   BEMÆRK: Pupae vil nu være fase P5 med en everted hovedsæk synlig ved puppens forreste ende⁸.
4. Placer pupperne mindst en puppebredde fra hinanden på båndet med deres ventrale sider nedad.
5. Anbring en dråbe klæbende lim på en paraffinfilm (se Materialetabel) eller i et centrifugerørslåg. Dyp enden af en 0,1-10 μL pipettespids (ingen pipette) i dråben af klæbende lim. Tryk to gange på pipettespidsen på et dæksel på 24 mm x 60 mm (1,5 tykkelse), 1 cm x 1 cm væk fra et hjørne, hvilket skaber en linje med klæbende lim ~ 1/2 puppens længde.
6. Forudindstille en 0,2-2 μL (P2) pipette til 2 μL og en 200 μL (P200) pipette til 200 μL, og tilpas dem med spidser, så de er klar til at blive fyldt med 1x PBS + 0,1 mM Ca²⁺, som hurtigt størkner klæbelimen ved kontakt.
7. Indsæt tang (se Materialetabel) nær siden af hovedet, og fjern forsigtigt sagen fra den forreste til bageste⁹. Fjern så meget af sagen som muligt. Tag fat i puppens udviklende ben med et par stumpe tang og træk forsigtigt puppen fra sin sag.
   BEMÆRK: Et lille brud på den ventrale del af pupperne vil ikke være skadeligt for denne procedure.
8. Læg puppen i hjørnet af dækslippen.
9. Tag fat i puppen ved den bageste mave eller den udviklende vinge med stump tang, løft og læg den ventrale side af pupperne ned i klæbelimlinjen.
10. Fyld hurtigt P2-pipetten med 2 μL 1x PBS + 0,1 mM Ca^2+, og hold den i luften, udvis lige nok til at danne en lille boble i spidsen (0,25-0,5 μL).
11. Berør den lille boble af opløsningen til den ene side af pupperne ved bunden af brystkassen, og gentag derefter på den anden side.
    BEMÆRK: Dette vil størkne en lille mængde af klæbelimen for at holde puppen på plads. Generelt vil alle løsningerne ikke blive brugt.
12. Fyld P200-pipetten med 200 μL 1x PBS + 0,1 mM Ca²⁺, læg derefter pipettens spids over brystkassen og udvis indholdet for at nedsænke pupperne helt. Resten af klæbelimen størkner straks.
13. Fjern ~ 100 μL af PBS-opløsningen, så puppen næppe er nedsænket, før den straks fortsætter til næste trin.
    BEMÆRK: For usårede prøver skal du starte fra trin 1.1. For sårede delvist dissekerede prøver skal du starte ved trin 1.5. Såring via laserablation er tidligere beskrevet^14,21. Immobiliserings-, dissektions- og monteringstrin skal udføres ved hjælp af et dissektionsmikroskop.

2. Dissekering af notum

1. Tag fat i en mikrodissektionssaks, der afstiver den ene side af håndtaget mod den dominerende hånds pegefinger og langfinger, så tommelfingeren på den dominerende hånd anvender skærekraften (figur 2A, B).
2. Stabiliser saksens hals mod langfingeren på den ikke-dominerende hånd, mens du afstiver dækslippen med ringfingeren på den ikke-dominerende hånd.
3. Snip i midten af den dorsale mave for at skabe et lille hul, ~ 0,2-0,5 mm. Nogle hæmolymfe vil normalt spilde ud og er en god indikator for overtrædelsen.
4. Lav små 0,5-0,75 mm snit gennem integumentet fra den bageste til forreste, der omkranser det dorsale væv for at isolere det. For at skabe et væv så fladt som muligt skal du undgå at skære for ventralt; kun thoraxens dorsale 'kuppel' skal fjernes sammen med små sektioner af hovedet og maven.
5. Gentag bagud til forreste snit på den anden side af puppen.
6. Drej dissektionstrinnet for at muliggøre et rent snit gennem hovedet, hvis det er nødvendigt.
   BEMÆRK: På dette stadium vil dorsal integumentet eller notum blive adskilt fra resten af puppen. Hvis det ser ud til at være adskilt, men ikke let flyttes, kan et par nedskæringer under notum hjælpe med at løsne det.
7. Tilsæt ~ 200 μL 1x PBS til midten af dæksedlen, og lav en kanal, der forbinder den med den originale dissektionsdråbe ved forsigtigt at trække pipettespidsen hen over dækglasset fra den nye dråbe til originalen.
8. Brug et par stumpe tang til forsigtigt at skubbe eller trække det isolerede notum til midten af dækslen og rotere, så den indvendige side vender opad. Fjern aldrig vævet fra dråben.
   BEMÆRK: Det er vigtigt at flytte notum væk fra det oprindelige dissektionssted for at undgå rester af klæbelimen, der lukker prøven under senere billeddannelse.
9. Hold notum ned med den stumpe tang ved at trykke ind i abdominal eller hovedsektionerne. Brug et par skarpe tang og / eller blide udvisninger af 1x PBS fra en 200 μL pipette, fjern eventuelle resterende fedtlegemer, muskelbånd eller hæmolymfe (hvis til stede) for fuldt ud at udsætte monolagsepitelet og gøre den eventuelle farvning mere jævn. Det dissekerede notum skal fremgå som i figur 3A.
10. Når vævet er rent, skal du bruge en 200 μL pipette til at fjerne så meget af PBS-opløsningen som muligt (sammen med snavs og den ventrale del af puppen), overvågning med et dissektionsomfang for at undgå at aspirere notum.
11. Når det meste af væsken er fjernet, skal du bruge et absorberende væv til forsigtigt at tørre resten af klæbelim og puppe samt andet snavs, der dvæler på dækslen.
    BEMÆRK: Hvis der forbliver noget klæbende lim på dæksedlen, vil det ikke forårsage et problem, så længe det er tyndere end selve dorsalvævet.
12. Tilsæt 150-200 μL 4% PFA (i 1x PBS) og fix i 20 min ved stuetemperatur. Afhængigt af dissektionshastigheden kan 1 eller flere pupper dissekeres under den første puppes fiksering.
13. Fjern PFA og erstat det med 1x PBS for at vaske notum en gang i 30 s.
14. Hvis du fortsætter med antistoffarvning, skal du udføre 5 minutters vask (3 gange) i 1x PBS eller 1x PBST (Supplerende fil 1) for at permeabilisere vævet, hvis antigenet er intracellulært.
15. Opbevar prøven i 1x PBS + 0,02% NaN₃ natten over i et befugtet kammer, eller hvis du planlægger at plette vævet, skal du inkubere natten over i blokeringsopløsning (supplerende fil 1).

3. Farvning af notum

BEMÆRK: Følg nedenstående trin for farvning ved hjælp af antistoffer eller cellulære pletter. -Notum må ikke fjernes fra opløsningen, da dette sandsynligvis vil få vævet til at krølle. Tilpas således farvningsprotokoller, der skal udføres udelukkende på dæksedlen, og opbevar dem i et befugtet kammer i alle trin længere end 5 minutter. Overvågning af prøverne under et dissektionsmikroskop kan bidrage til at forhindre utilsigtet aspiration af vævet under vask.

1. For at visualisere cellegrænserne skal du inkubere 200 μL anti-FasIII primært Mus IgG2a-antistof (se Materialetabel) ved 1:8 koncentration fortyndet i Blokeringsbuffer + 0,02 %_NaN3 natten over ved 4 °C.
2. Udvask overskydende primært antistof (3 gange) med 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN₃ i 1 time pr. vask ved stuetemperatur.
3. Udfør sekundær antistofinkubation med 200 μL 1:200 koncentration anti-mus IgGa2 i Cy3 i blokeringsbuffer + 0,02% NaN₃ i 2 timer ved stuetemperatur.
4. Udvask overskydende sekundært antistof (3 gange) med 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN₃ i 1 time pr. vask ved stuetemperatur.
5. For at visualisere kernerne skal du inkubere prøver i 1 μg / ml DAPI i 45 minutter for at give tilstrækkelig tid til, at pletten kan trænge gennem muskelbånd; fastgørelse i et DAPI-holdige monteringsmedium er ikke effektivt med dette væv.
6. Vask overskydende DAPI (3 gange) ud med 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN₃ i 5 minutter pr. vask ved stuetemperatur, og lad det derefter stå i 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN₃ natten over ved 4 °C, eller monter straks.

4. Montering og visualisering af notum

1. Efter farvning skal du forberede en ny 24 × 60 coverslip (topper) med understøtninger.
   BEMÆRK: Fordi notum er kuppelformet, resulterer udfladning af det fuldstændigt i forvrænget rynket væv. Oprettelse af et mellemrum mellem de to dæksedler gør det muligt for notum at bevare sin normale form.
2. Opret et hul på ~ 200 μm ved hjælp af afstandsstykke lavet af 22 x 22 dæksedler (nr. 0 tykkelse, ~ 100 μm tyk), klæbet ~ 1 cm fra hinanden med neglelak midt på topperen.
3. For at klæbe skal du placere afstandsrene på topperen og male afstandskanternes distale kanter med et tyndt lag neglelak. Lad tørre.
   BEMÆRK: Brug kun en neglelak, der er tynd og løbende; tyk neglelak vil tilføje unødvendig ekstra plads mellem dæksedlen og topperen.
4. Fjern så meget af den vandige opløsning som muligt fra prøven.
5. Påfør straks to dråber (~ 100 μL) anti-fade monteringsmedium (se tabel over materialer) på prøven.
6. Brug om nødvendigt rene, skarpe tang til at placere notum i midten af den anti-fade monteringsmediumdråbe.
7. Placer dæksedlen med notum på en ~ 10 x 40 mm støtte, såsom et stykke tyndt skum (skåret fra emballagematerialet inde i dækslipskasser) for at hæve prøven, så den ikke klæber til arbejdsfladen.
8. Under et dissektionsomfang sænkes topperen langsomt ned på prøven. Når anti-fade monteringsmediet møder topperen, skal du forsigtigt slippe og tillade kapillær handling at trække topperen ned.
   BEMÆRK: Inden for de første par sekunder kan der foretages mindre justeringer af dækslipspositionen uden at beskadige notummet.
9. Placer et andet stykke skum på topperen, og brug et standard mikroskop dias som en vægt til forsigtigt at lokke anti-fade monteringsmediet mellem prøvedækslen, topperen og afstandsstykkerne.
10. Efter 5-10 minutter skal du bruge et absorberende væv til at transportere overskydende anti-fade monteringsmedium væk ved forsigtigt at røre ved kanterne på dækslipsen.
11. Påfør forsigtigt neglelak på hvert hjørne af dæksedlerne for at klæbe dem sammen. Når det er tørt, skal du male alle kanter af dækslipsene for at forsegle. Undgå at belægge alle kanter først, da dette ofte kan flytte dækslen og beskadige det dorsale væv.
12. Visualiser notum under fluorescensmikroskopi (se materialetabel) gennem den dorsale og/eller ventrale side.

Representative Results

Den præsenterede teknik fungerer godt på det usårede notum (figur 1A-D), hvilket muliggør undersøgelse af vævets udvikling og homeostase, f.eks. dannelsen af de polyploide mekanosensoriske børsteceller¹⁸ eller den forreste til den bageste strøm af epitelceller¹⁰. Denne protokol gælder også for et laser-ableret notum (figur 1E-L), hvor det cellulære respons på skade kan analyseres live med endogene fluoroforer såsom Histone2-EGFP (figur 1B, F, J). Efterfarvning med immunhistokemi (trin 3) kan afsløre mange funktioner, såsom Fasciclin III, som mærker cellegrænser (figur 1C, G, K). Derudover kan kvantitative pletter såsom DAPI (figur 1A,E,I) bruges til at vurdere ændringer i DNA-indholdet, herunder sårinduceret polyploidi²².

Den nuværende protokol er særlig gavnlig, da den kan bruges efter langsigtede live billeddannelseseksperimenter. Da pupper er immobile, kan de afbildes i timevis (figur 4A,B). Det er vigtigt, at denne protokol ikke forårsager betydelige ændringer i sårepitelets overordnede arkitektur eller morfologi efter dissektion (figur 4B,C). Således kunne træk i vævet afbildes på lang sigt og derefter undersøges yderligere med immunohistokemi eller cellulære pletter.

Billeddannelse dybt inde i væv er kompleks på grund af deres uigennemsigtighed, og Drosophila er belagt med en voksagtig kutikkel⁸, hvilket gør dyb billeddannelse endnu vanskeligere. Med denne teknik kan et dissekeret notum imidlertid placeres mellem to dæksedler, der muliggør billeddannelse af epitelmonolaget fra begge sider: den apikale side gennem neglebåndet (figur 5A-D) og / eller den basale side af epitelet, der vender mod kropshulrummet (figur 5E-H). Disse forskellige synspunkter er ideelle til at visualisere forskellige strukturer i vævet. For eksempel er den apikale visning ideel til visualisering af epitelcellegrænser og kerner, der ligger lige under neglebåndet (figur 5A-D). Med basalvisningen er disse apikale signaler mindre synlige (figur 5E-H). Imidlertid observeres basale strukturer ved sårmargenen (figur 5J, L gul, hvide pile). Disse basale strukturer er meget lysere, da der er mindre okklusion i basalvisningen end i den apikale visning.

Figur 1: Dissekeret, fikseret og farvet Drosophila pupal nota. (A-D) Usyet notum. (E-H), Såret notum 30 min efter laserablation. (I-L) Såret notum 3 timer efter laserablation. (A,E,I) DAPI-plet viser kerner. (B,F,J) Transgen Histone2-EGFP, der anvendes i levende billeddannelse, er synlig efter fastgørelse og farvning. (C,G,K) Anti-FasIII-antistoffet viser, at antistofpletter fungerer godt på det faste notum. (D,H,L) Flettet billede. Billederne er taget med 40x målsætning ved hjælp af spindeskivemikroskopi, maksimal intensitetsfremspring af Z-stakke vises med 0,3 μm Z-skiver. A-D repræsenterer 263 Z-skiver. E-H repræsenterer 195 skiver. I-L repræsenterer 53 Z-skiver. Den orange stiplede linje angiver sårmargen. Skalabjælken i L er 25 μm, der gælder for A-L. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Håndplacering til notumdissektion. (A-B) Venstre og højre visning af håndplacering til at holde mikrodissektionsaksen. For at forhindre håndrysten placeres saksens hals mod langfingeren på den ikke-dominerende hånd. Saks skal være parallel med mikroskopets dias for at undgå vridning af notumvævet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Korrekt dissekeret notum vs. krøllet notum. (A) Pupal notum post dissektion og rengøring ukrøllet og klar til fiksering. (B) Pupal notum krøllet på sig selv efter at være blevet fjernet fra 1x PBS, hvilket gør det ubrugeligt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Før- og efterfaste billeder er stort set ens. En pupal notum, der udtrykker Histone2-EGFP i kernerne, blev afbildet (A) levende før ablation og (B) 3 timer efter laserablation. (C) Notummet blev hentet, dissekeret og fastgjort som nævnt i protokollen og genbilledet efter fastgørelsen. Sårstedet er mærket med en rød stjerne. Billederne blev taget med 40x målsætning ved hjælp af spindeskivemikroskopi, Z-skiver blev taget hver 0,3 μm. Maksimale intensitetsfremskrivninger på 34 Z-skiver, der er forviklede (A), 48 Z-skiver 3 timer efter såring (B) og 103 Z-skiver efter dissektion, fiksering og farvning (C), vises. Skalabjælken i C er 25 μm, der gælder for A-C. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Billeddannelse af apikale og basale sider af et såret notum. Det samme sårede puppe notum er vist i alle paneler. Såret er markeret med en rød stjerne. Den orange prikkede linje angiver sårmargenen. (A-D) Notum er afbildet fra den apikale side gennem neglebåndet. (E-H) Notum er afbildet fra den basale indvendige side. (I-L) De øverste paneler viser et X-Z-billede af notum, apikal side op, med epitelarket udpeget af en hvid trekant. Den orange linje betegner det apikale-basale plan af X-Y-skiven, vist i de nederste paneler. Inden for de nederste paneler viser den orange linje planet for ovenstående X-Z-billede. (I) Apikalt afbildet notum - apikal skive. Den øverste X-Z-visning viser præcis billeddannelse af det apikale epitelark (hvid trekant). Denne visning svarer til en direkte billedvisning. (J) Apikalt afbildet notum - basal skive, delvist blokeret af apikalt væv. Andre væv betegnet med gul pil (muligt muskelbånd) og hvide pile (mulige blodlegemer) er synlige på basalsiden. (K) Basalt afbildet notum - apikal skive, delvist blokeret af basalvæv og sårskurv (mørkt centralt område). (L) Basalt afbildet notum - basal skive. Denne visning viser bedst basalvævene betegnet med gule og hvide pile. A,E: DAPI-plet, B,F: Histone-EGFP, C,G: FasIII-farvning. Billederne blev taget med 20x mål med roterende diskmikroskopi. Z-skiver blev taget hver 0,9 μm. A-D viser den maksimale intensitetsfremskrivning på 19 skiver. E-H repræsenterer den maksimale intensitetsfremspring på 17 skiver. 25 μm skalastænger i D,H,L gælder for henholdsvis A-D, E-H, I-L. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende fil 1: Forberedelse af opløsninger og buffere. Opskrifter på følgende opløsninger er detaljerede: 1xPBS, 1x PBST, blokeringsopløsning og paraformaldehydfikseringsmiddel. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Kritiske skridt
Optimering af tre trin vil dramatisk øge succesen med denne protokol. Først i trin 1.5 skal du være sparsom med klæbelimen, der påføres dækslen. Hvis der tilsættes for meget klæbende lim, kan pupperne blive begravet i et tykt lag størknet klæbende lim, hvilket vil gøre dissektion umulig, og hvis den dækker selve notummet, vil klæbelimen okkludere lyset fra prøven. For det andet skal du i trin 2.3-2.6 sørge for kun at fjerne notumets øverste kuppel, eksklusive så meget af det laterale væv som muligt. Hvis det er inkluderet, vil det laterale væv blive komprimeret under monteringen og få midten af notumet til at spænde indad, hvilket ofte placerer det uden for arbejdsafstanden for høje numeriske blændemål. For det tredje skal der under rengøringstrin 2.9 udvises ekstrem forsigtighed for ikke at beskadige monolagsepitelet. Hvis vævet har store portioner, der mangler, eller der ikke kan detekteres noget signal, vil dette trin sandsynligvis skyldes.

Fejlfinding
Udgave 1: Efter montering kommer puppen væk fra det dobbeltsidede tape under dissektion. Dette er et almindeligt problem, især for begyndere. Det bedste middel er at sikre, at ydersiden af puppekassen er helt tør/fri for madrester. Fjernelse af mad med et par stumpe tang og lade sagen lufttørre i 10-15 minutter hjælper med at klæbe til båndet. Alternativt kan du bruge den ikke-dominerende hånd og et par stumpe tang til at holde pupperne nede mod båndet under dissektion. Hvis problemet fortsætter, giver påføring af en lille, 5-10 μL dråbe neglelak på bunden af den bageste ende af sagen og lade den hærde generelt tilstrækkelig vedhæftning til selv den mest urerulieret af pupper.

Udgave 2: Notum kollapser under trin 2.3, eller det oprindelige brud gennem integumentet er ikke glat. Hvis integumentet er vanskeligt at bryde, kan der være for meget klæbende lim fra immobiliseringstrinnene. Placering af de dissekerede pupper i mindre klæbende lim vil forbedre dette problem. Sørg desuden for, at mikrodissektionsaksen er skarp. Stump saks vil ikke være i stand til at skære ind i integumentet og har tendens til at få det til at kollapse indad. Når hæmolymfe spildes ud af pupperne, skal du sørge for, at et af skærebladene kan komme ind i puppen uden at få notum til at deformere. Hvis notum kollapser, og bladet ikke kommer ind i puppen, skal du fortsætte med at klippe, indtil et blad kommer ind i pupperne.

Udgave 3: Under trin 2.4 fanger eller trækker saksen integumentet. Hvis saksen begynder at fange eller trække integumentet, hjælper det ofte at skifte til den modsatte side af pupperne og fortsætte med at 'løsne' integumentet. Yderligere stump mikrodissektionssaks vil gøre det vanskeligt at opnå rene snit gennem integumentet, og skærpet saks skal bruges.

Udgave 4: Prøven aspireres ved et uheld under farvning (trin 3.1-3.6). Det dissekerede notum er udfordrende at se, fordi det er gennemsigtigt. Det kan være nyttigt at placere et mørkeblåt eller sort ark under dækskortet for at give kontrast (et gammelt pipettespidsholderstativ fungerer godt.) Derudover kan alle opløsningsændringer udføres under et dissektionsmikroskop.

Problem 5: Der registreres intet signal/der registreres et ujævnt signal. Efter at have udelukket pletspecifikke problemer, hvis der ikke registreres noget signal, eller det er ujævnt, er trin 2.9 (rengøring) sandsynligvis synderen. Et fraværende eller ujævnt signal kan stamme fra beskadigelse og fjernelse af epitelvævet under rengøring. Omvendt kan et dårligt signal skyldes okklusion fra muskelbåndene/fedtkropscellerne, hvis de ikke fjernes, da de kan begrænse diffusionen af pletter og antistoffer i notum i forhold til det omgivende væv. Hvis vævet er beskadiget, er det den bedste løsning at være blidere under rengøring. Hvis pletten i stedet er synlig, men ujævn, anbefales det at øge kraften / tiden dedikeret til rengøringstrinnet for at fjerne så meget af muskel- og fedtkroppen som muligt. Yderligere kan forøgelse af plettens varighed hjælpe med at løse dette problem med bedre rengøring.

Udgave 6: Notumvævet har et skævt / rynket udseende under billeddannelse. Vridning og rynker af vævet kommer fra to kilder. For det første vil komprimering af notum under montering få det til at spænde og kæde. Den bedste løsning er at fjerne så meget af det laterale væv som muligt, så kuplen er så kort som muligt og kan passe mellem dækslip-afstandsstykkene. For det andet, hvis notum er bøjet under dissektion, vil denne bøjning ikke rette sig ud under monteringen, så der skal udvises ekstra omhu for ikke at fordreje notum under dissektion. Utilsigtet bøjning af notum er mest almindelig, når man skærer integumentet væk fra resten af pupperne. Det er fristende at have dissektionssaksen i en vinkel i forhold til pupperne i stedet for at holde dem i prøveplanet som pupper. Vinklet saks får dog integumentet til at spænde opad, når det skæres i stedet for at forblive fladt.

Eksisterende metoder, begrænsninger og fremtidige applikationer
Wang et ^al.20 rapporterede en sammenlignelig dissektionsprotokol for isolering af puppeepitel. Denne teknik kræver, at puppen forbliver inden for sin sag og hurtigt gennemskæres med en skalpel. Denne protokol er uforenelig med tidligere levende afbildede prøver, da levende billeddannelse kræver fjernelse af en stor del af puppehuset. Fordi pupper mangler stivhed, manglede puppebisektion uden for sagen vævet og inspirerede oprettelsen af denne protokol. Teknikken, der er beskrevet her, giver mulighed for isolering og fiksering af notum, og den kan bruges som det første skridt til en lang række andre metoder såsom kryosectioning, in situ-hybridisering eller elektronmikroskopi.

Denne teknik har nogle begrænsninger. For det første er dissekering, fastgørelse og farvning af notum mere tidskrævende end levende billeddannelse fluorescerende mærkede proteiner i notum, hvilket kun kræver en simpel dissektion for at fjerne puppehuset ^9,23. For det andet er denne dissektion vanskeligere sammenlignet med dissektioner af andre Drosophila-væv på grund af det tynde, skrøbelige væv og hydrofobe kutikling. For blot at visualisere proteiner i Drosophila epithelia er immunhistokemi på faste embryoner, larvevingeskiver eller æggestokke lettere. Denne teknik gør det imidlertid muligt at parre kraften i levende billeddannelse med fiksering og farvning, hvilket gør det til et kraftfuldt værktøj, når det først er mestret.

En dissektions- / fikseringsteknik har nogle fordele i forhold til levende billeddannelse. Basal (indvendige) strukturer kan løses bedre med en basal visning (figur 5L,J). Vigtigst er det, at levende billeddannelse er begrænset til fluoroforer, der skal leveres genetisk, hvilket ofte kræver lange genetiske krydsningsordninger. I modsætning hertil tillader den nuværende protokol anvendelse af pletter, immunhistokemi og andre teknikker, der kræver dissektion og fiksering. Dette øger dramatisk antallet af signaler, der undersøges i vævet, samtidig med at det potentielt reducerer tiden til eksperimentelle resultater.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
½” Scotch Permanent Double-Sided tape	Scotch 3M	665
0.1-10 µL uTIP pipette tip	Biotix	M-0011-9FC
22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips	Thomas Scientific	1207Z28
24 x 60 mm coverslip	Corning	2980-246
3M VetBond	3M	1469SB	Called "adhesive glue" in protocol
Anti-FasIII primary Mouse IgG2a	Developmental Studies Hybridoma Bank	7G10
Calcium Chloride	Fisher Chemical	c79-500
Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a	Jackson ImmunoResearch	115-165-206
DAPI	Sigma Aldrich	D9542-1mg
Dumont #5 Fine Tip Forceps	Fine Science Tools	No. 11254-20
Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt	Fine Science Tools	No. 11254-20	Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone
Fisherbrand Double frosted microscope slides	Fisher Scientific	22-034-486
Fluorescent Light Source	Lumencor	Celesta 90-10512
Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A	Bloomington Drosophila Stock Center	24163
Fly Vial Foam Plugs "Flugs"	Genesee Scientific	49-101
Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water	Cole-Parmer	759075D	A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water.
KimWipe	KimTech	34155	Called "Absorbent Tissue" in protocol
Nikon Ti2 Eclipse	Nikon	Eclipse Ti2-E
NIS Elements Software	Nikon	AR
Parafilm	Pechiney Plastic Packaging	PM-996
Paraformaldehyde (PFA) 16%	Ted Pella, Inc	18505
Plastic Vials	Genesee Scientific	32-114
Sodium Azide (NaN3)	Fisher Scientific	19038-1000
Stereo Microdissection Scope	Carl Zeiss	STEMI 2000
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00	New or freshly sharpened scissors
Vecta Shield	Vector Laboratories	H-1000	Called " antifade mounting medium" in protocol
Vecta Shield with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Not ideal for pupal notum.
X-Light V2 Spinning Disc	Crest Optics	V2 L-FOV