Summary
Het huidige protocol beschrijft de voorbereiding en visualisatie van vast weefsel van het Drosophila popnotum. Het kan worden gebruikt voor intact of gewond weefsel en de oorspronkelijke architectuur van het weefsel blijft behouden. De procedures voor het ontleden, fixeren en kleuren worden allemaal beschreven in dit artikel.
Abstract
De poppen van Drosophila melanogaster zijn enkele dagen onbeweeglijk tijdens metamorfose, waarbij ze een nieuw lichaam ontwikkelen met een dun transparant volwassen omhulsel. Hun immobiliteit en transparantie maken ze ideaal voor in vivo live imaging-experimenten. Veel studies hebben zich gericht op de dorsale epitheliale monolaag van het popnotum vanwege de toegankelijkheid en relatief grote omvang. Naast de studies van epitheliale mechanica en ontwikkeling, is het notum een ideaal weefsel geweest om wondgenezing te bestuderen. Na een verwonding kan het hele epitheliale reparatieproces worden vastgelegd door live beeldvorming gedurende 6-12 uur. Ondanks de populariteit van het notum voor live beeldvorming, hebben zeer weinig gepubliceerde studies vaste notummonsters gebruikt. Fixatie en kleuring zijn veel voorkomende benaderingen voor bijna alle andere Drosophila-weefsels, waarbij gebruik wordt gemaakt van het grote repertoire van eenvoudige cellulaire vlekken en antilichamen. De pop notum is echter kwetsbaar en gevoelig voor krullen en vervorming na verwijdering uit het lichaam, waardoor het een uitdaging is om live beeldvorming aan te vullen. Dit protocol biedt een eenvoudige methode voor het fixeren en kleuren van het poptonum, zowel intact als na laserwonden. Met deze techniek wordt de ventrale kant van de pop op een deklip gelijmd om de pop te immobiliseren en wordt het notum zorgvuldig verwijderd, gefixeerd en gekleurd. Het notumepitheel wordt op een dia of tussen twee coverslips gemonteerd om beeldvorming van de dorsale of ventrale kant van het weefsel te vergemakkelijken.
Introduction
Het popnotum van Drosophila melanogaster is de laatste tien jaar steeds vaker gebruikt voor live imaging studies omdat het dier zowel immobiel is als in dit stadium een transparante cuticula heeft 1,2,3,4,5,6,7. Het popnotum is echter een uitdaging om te ontleden en te repareren, waardoor het moeilijk is om live beeldvormingsstudies aan te vullen met antilichamen en celkleuring. Het algemene doel van dit werk is het creëren van een reproduceerbaar protocol voor het ontleden en fixeren van het popnotum voor antilichaam- en celkleuring op nieuwe of eerder live-gebeelde monsters.
Als larven beginnen met metamorfose, trekt de opperhuid weg van de larvale cuticula en vormt een hard popgeval8. Het larvale lichaamsplan wordt afgebroken en het nieuwe volwassen lichaamsplan wordt ontwikkeld. Gedurende deze tijd zijn poppen immobiel, waardoor ze ideaal zijn voor live beeldvorming. Een veel voorkomend weefsel is het popnotum, een volwassen monolaagepitheel dat zich vormt in de dorsale thorax. Het notum is visueel toegankelijk na een eenvoudige dissectie om het popgeval9 te verwijderen. Het hele dier kan dan worden gemonteerd en het notum kan uren of dagen live worden afgebeeld, waardoor het een ideaal weefsel is om epitheelcelgedrag te bestuderen tijdens ontwikkeling, homeostase en na het verwondenvan 10,11,12,13,14. Het notum is echter een uitdaging om te ontleden en te repareren omdat het fragiel is en bedekt met een dunne transparante volwassen cuticula die hydrofoob is. Deze hydrofobe cuticula maakt het gevoelig voor krullen in waterige oplossingen wanneer het uit de rest van het lichaam wordt verwijderd. Notumdissectie en fixatie is dus slechts zelden gemeld en de dissectie wordt vaak niet beschreven 15,16,17,18. Zonder een gedetailleerd protocol in de literatuur is het voor een Drosophila-onderzoeker onbetaalbaar moeilijk om levende beeldvorming aan te vullen met kleuring van poppen.
Deze techniek is bedoeld om monsters die eerder live zijn gefotografeerd, inclusief monsters die met laser zijn gewond, reproduceerbaar te ontleden en te repareren. Omdat levende beeldvorming verwijdering van de pop moet vereisen, begint deze dissectietechniek met het verwijderen van het voorste popgeval, in tegenstelling tot eerdere protocollen die poppen vastpinnen of bisecteren binnen het popgeval 4,19,20. Het notum is een fragiel weefsel en verwonding kan de kwetsbaarheid ervan verergeren. Dus, om dit delicate weefsel te ondersteunen, worden het omhulsel (het epitheel en de bijgevoegde transparante volwassen cuticula) van het notum en een deel van het hoofd en de buik ontleed weg van de rest van de pop terwijl ze altijd ondergedompeld zijn in een waterige omgeving. Deze methode vermindert de kans dat het weefsel krult en onbruikbaar is. Deze techniek heeft met succes gewond notumweefsel gekleurd al 30 minuten na verwonding (figuur 1E-H) en na 3 uur na verwonding (figuur 1I-L). Dit protocol zal naar verwachting effectief zijn voor de duur van notumontwikkeling of wondherstel. De huidige techniek zal nuttig zijn voor onderzoekers die de live-imaging mogelijkheden van het pop notum willen verenigen met de overvloed aan beschikbare immunohistochemische reagentia.
Protocol
Drosophila melanogaster (fruitvliegjes) werden op 25 °C gehouden op een standaard maïsmeel-melasse medium. De studies werden uitgevoerd op EGFP-gelabelde histon H2A-poppen (w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). De vliegen werden verkregen uit een openbaar voorraadcentrum (zie Tabel met materialen).
1. Immobilisatie van poppen
- Breng een 2"-strook dubbelzijdige tape aan op een microscoopglaasje.
- Identificeer witte prepupae in injectieflacons die bij 25 °C zijn verhoogd en gebruik een marker om hun locatie buiten de injectieflacon aan te geven. Breng de injectieflacons terug tot 25 °C.
OPMERKING: Witte prepupae worden gekenmerkt door hun immobiliteit, witte kleur en everted spiracles. Deze vormen zich 0-1 uur na pupariumvorming (APF), of stadium P18. - Verwijder 12-15 uur later voorzichtig 3-4 van de aangegeven poppen (zonder ze te laten knallen) met behulp van een dissectiekijker en verzamel ze op de microscoopglaasjes naast de tape.
OPMERKING: Pupae zal nu stadium P5 zijn met een everted hoofdzak zichtbaar aan het voorste uiteinde van de poppen8. - Plaats de poppen minstens één popbreedte uit elkaar op de tape met hun ventrale zijkanten naar beneden.
- Plaats een druppel lijm op een paraffinefilm (zie Materiaaltabel) of in een deksel van een centrifugebuis. Dompel het uiteinde van een pipetpunt van 0,1-10 μL (geen pipet) in de druppel lijm. Tik de pipetpunt twee keer op een deklip van 24 mm x 60 mm (1,5 dikte), op 1 cm x 1 cm afstand van een hoek, waardoor een lijn lijm ~ 1/2 van de lengte van de pop ontstaat.
- Stel een pipet van 0,2-2 μL (P2) in op 2 μL en een pipet van 200 μL (P200) op 200 μL en monteer ze met tips zodat ze klaar zijn om te worden gevuld met 1x PBS + 0,1 mM Ca2+, waardoor de lijm bij contact snel stolt.
- Plaats een tang (zie materiaaltabel) aan de zijkant van de kop en verwijder de behuizing voorzichtig van de voorste naar de achterste9. Verwijder zoveel mogelijk van de behuizing. Pak de zich ontwikkelende benen van de pop vast met een stompe tang en trek de pop voorzichtig uit zijn koffer.
OPMERKING: Een kleine breuk op het ventrale deel van de poppen zal niet schadelijk zijn voor deze procedure. - Leg de pop in de hoek van de deklip.
- Pak de pop op de achterste buik of de zich ontwikkelende vleugel met stompe tang, til op en plaats de ventrale kant van de poppen in de lijn van lijm.
- Vul de P2-pipet snel met 2 μL van 1x PBS + 0,1 mM Ca2+, en houd hem in de lucht, stoten net genoeg uit om een kleine bel aan de punt te vormen (0,25-0,5 μL).
- Raak de kleine bel van de oplossing aan de ene kant van de poppen aan de basis van de thorax aan en herhaal dit aan de andere kant.
OPMERKING: Dit zal een kleine hoeveelheid lijm stollen om de pop op zijn plaats te houden. Over het algemeen worden niet alle oplossingen gebruikt. - Vul de P200 pipet met 200 μL 1x PBS + 0,1 mM Ca2+, plaats vervolgens de punt van de pipet over de thorax en verwijder de inhoud om de poppen volledig onder te dompelen. De rest van de lijm zal onmiddellijk stollen.
- Verwijder ~100 μL van de PBS-oplossing, zodat de pop nauwelijks onder water komt te staan voordat u onmiddellijk doorgaat naar de volgende stap.
OPMERKING: Voor niet-afgewikkelde monsters begint u bij stap 1.1. Voor gewonde gedeeltelijk ontlede monsters begint u bij stap 1.5. Verwonding via laserablatie is eerder beschreven14,21. Immobilisatie, dissectie en montagestappen moeten worden uitgevoerd met behulp van een dissectiemicroscoop.
2. Het notum ontleden
- Pak een microdissectieschaar vast die een kant van het handvat tegen de wijsvinger en middelvinger van de dominante hand zet, zodat de duim van de dominante hand de snijkracht uitoefent (figuur 2A, B).
- Stabiliseer de hals van de schaar tegen de middelvinger van de niet-dominante hand terwijl je de coverslip verstevigt met de ringvinger van de niet-dominante hand.
- Knip in het midden van de ruggenbuik om een klein gaatje te maken, ~0,2-0,5 mm. Sommige hemolymfe zal meestal uitlekken en is een goede indicator van de breuk.
- Maak kleine sneden van 0,5-0,75 mm door het omhulsel van het achterste naar het voorste, omcirkel het dorsale weefsel om het te isoleren. Om een weefsel zo vlak mogelijk te maken, vermijdt u te ventraal snijden; alleen de dorsale 'koepel' van de thorax moet worden verwijderd, samen met kleine delen van het hoofd en de buik.
- Herhaal achterste tot voorste snijwonden aan de andere kant van de poppen.
- Draai de dissectiefase om indien nodig een schone snede door de kop mogelijk te maken.
OPMERKING: In dit stadium zal het dorsale omhulsel, of notum, worden gescheiden van de rest van de pop. Als het gescheiden lijkt, maar niet gemakkelijk kan worden verplaatst, kunnen een paar sneden onder het notum helpen het los te maken. - Voeg ~ 200 μL 1x PBS toe aan het midden van de afdekplaat en maak een kanaal dat het verbindt met de originele dissectiedruppel door de pipetpunt voorzichtig over het afdekglas van de nieuwe druppel naar het origineel te slepen.
- Duw of sleep met een stompe tang de geïsoleerde notum voorzichtig naar het midden van de deklip en draai, zodat de binnenkant naar boven is gericht. Verwijder nooit het weefsel van de druppel.
OPMERKING: Het is essentieel om het notum weg te halen van de oorspronkelijke dissectieplaats om te voorkomen dat er resten van de lijm het monster afsluiten tijdens latere beeldvorming. - Houd het notum vast met de stompe tang door in de buik- of hoofdsecties te drukken. Gebruik een scherpe tang en/of zachte uitdrijvingen van 1x PBS uit een pipet van 200 μL om het resterende vetlichaam, spierbanden of hemolymfe (indien aanwezig) volledig bloot te leggen om het monolaagepitheel volledig bloot te leggen en de uiteindelijke kleuring gelijkmatiger te maken. Het ontleedde notum moet verschijnen zoals in figuur 3A.
- Zodra het weefsel schoon is, gebruikt u een pipet van 200 μL om zoveel mogelijk van de PBS-oplossing te verwijderen (samen met puin en het ventrale deel van de poppen), monitoring met een dissectiebereik om te voorkomen dat het notum wordt gespiratiseerd.
- Zodra het grootste deel van de vloeistof is verwijderd, gebruikt u een absorberend weefsel om de rest van de lijm en pop voorzichtig weg te vegen, evenals ander vuil dat op de deklip blijft hangen.
OPMERKING: Als er wat lijm op de deklip achterblijft, zal dit geen probleem veroorzaken zolang het dunner is dan het dorsale weefsel zelf. - Voeg 150-200 μL van 4% PFA (in 1x PBS) toe en bevestig gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Afhankelijk van de dissectiesnelheid kunnen 1 of meer poppen worden ontleed tijdens de fixatie van de eerste pop.
- Verwijder de PFA en vervang deze door 1x PBS om de notum eenmaal gedurende 30 s te wassen.
- Als u doorgaat met antilichaamkleuring, voert u 5 minuten wasbeurten (3 keer) uit in 1x PBS of 1x PBST (aanvullend bestand 1) om het weefsel te permeabiliseren als het antigeen intracellulair is.
- Bewaar het monster in 1x PBS + 0,02% NaN3 's nachts in een bevochtigde kamer, of als u van plan bent het weefsel te bevlekken, incubaleer dan een nacht in de blokkerende oplossing (aanvullend bestand 1).
3. Kleuring van het notum
OPMERKING: Voor kleuring met behulp van antilichamen of cellulaire vlekken volgt u de onderstaande stappen. -Het notum mag niet uit de oplossing worden verwijderd, omdat dit er waarschijnlijk voor kan zorgen dat het weefsel krult. Pas daarom kleuringsprotocollen aan die volledig op de afdekplaat moeten worden uitgevoerd en langer dan 5 minuten in een bevochtigde kamer moeten worden bewaard. Het monitoren van de monsters onder een dissectiemicroscoop kan helpen om onbedoelde aspiratie van het weefsel tijdens wasbeurten te voorkomen.
- Om de celgrenzen te visualiseren, incubeer in 200 μL anti-FasIII primair muis IgG2a-antilichaam (zie tabel met materialen) in een concentratie van 1:8 verdund in blocking buffer + 0,02% NaN3 's nachts bij 4 °C.
- Was overtollig primair antilichaam (3 keer) uit met 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 gedurende 1 uur per wasbeurt bij kamertemperatuur.
- Voer secundaire antilichaamincubatie uit met 200 μL van 1:200 concentratie antimuis IgGa2 in Cy3 in Blocking Buffer + 0,02% NaN3 gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Spoel overtollig secundair antilichaam (3 keer) uit met 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 gedurende 1 uur per wasbeurt bij kamertemperatuur.
- Om de kernen te visualiseren, incubeer monsters in 1 μg / ml DAPI gedurende 45 minuten om voldoende tijd te geven voor de vlek om door spierbanden te dringen; fixeren in een DAPI-bevattend montagemedium is niet effectief met dit weefsel.
- Was overtollige DAPI (3 keer) uit met 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 gedurende 5 minuten per wasbeurt bij kamertemperatuur en laat vervolgens 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 's nachts bij 4 °C intrekken of onmiddellijk monteren.
4. Montage en visualisatie van het notum
- Maak na het beitsen een nieuwe 24 × 60 coverslip (topper) met steunen.
OPMERKING: Omdat het notum koepelvormig is, resulteert het volledig afvlakken ervan in vervormd gerimpeld weefsel. Door een opening tussen de twee coverslips te creëren, kan het notum zijn normale vorm behouden. - Maak een opening van ~ 200 μm door afstandhouders te gebruiken die zijn gemaakt van 22 x 22 coverslips (nr. 0 dikte, ~ 100 μm dik), op ~ 1 cm uit elkaar geplakt met nagellak in het midden van de topper.
- Om te hechten, plaatst u de afstandhouders op de topper en schildert u de distale randen van de afstandhouders met een dunne laag nagellak. Laat drogen.
LET OP: Gebruik alleen een nagellak die dun en vloeibaar is; dikke nagellak voegt onnodig extra ruimte toe tussen de coverslip en topper. - Verwijder zoveel mogelijk van de waterige oplossing uit het monster.
- Breng onmiddellijk twee druppels (~100 μL) anti-fade montagemedium (zie Materiaaltabel) aan op het monster.
- Gebruik indien nodig een schone, scherpe tang om het notum in het midden van de anti-fade montagemediumdruppel te plaatsen.
- Plaats de afdekplaat met het notum op een ondersteuning van ~ 10 x 40 mm, zoals een stuk dun schuim (gesneden uit het verpakkingsmateriaal in coverslipdozen), om het monster zo te verheffen dat het zich niet aan het werkoppervlak hecht.
- Laat onder een dissectiekijker de topper langzaam op het monster zakken. Zodra het anti-fade montagemedium de topper ontmoet, laat u voorzichtig los en laat u capillaire actie de topper naar beneden trekken.
OPMERKING: Binnen de eerste paar seconden kunnen kleine aanpassingen worden aangebracht aan de positie van de coverslip zonder de notum te beschadigen. - Plaats nog een stuk schuim op de topper en gebruik een standaard microscoopglaasje als gewicht om het anti-fade montagemedium voorzichtig tussen de monsterafdekkingen, topper en afstandhouders te coaxen.
- Gebruik na 5-10 minuten een absorberend weefsel om overtollig anti-fade montagemedium af te voeren door de randen van de coverslip voorzichtig aan te raken.
- Breng voorzichtig nagellak aan op elke hoek van de dekenslips om ze aan elkaar te hechten. Eenmaal droog, verf alle randen van de dekens om af te dichten. Vermijd eerst het coaten van alle randen, omdat dit vaak de dekenslip kan verschuiven en het dorsale weefsel kan beschadigen.
- Visualiseer het notum onder fluorescentiemicroscopie (zie Tabel met materialen) via de dorsale en/of de ventrale zijde.
Representative Results
De gepresenteerde techniek werkt goed op het afgewikkelde notum (figuur 1A-D), waardoor onderzoek mogelijk is naar de ontwikkeling en homeostase van het weefsel, bijvoorbeeld de vorming van de polyploïde mechanosensorische borstelcellen18, of de voorste naar de achterste stroom van epitheelcellen10. Dit protocol is ook van toepassing op een laser-ablated notum (Figuur 1E-L), waar de cellulaire respons op letsel live kan worden geanalyseerd met endogene fluoroforen zoals Histone2-EGFP (Figuur 1B,F,J). Post-kleuring met immunohistochemie (stap 3) kan veel kenmerken onthullen, zoals Fasciclin III, dat celranden labelt (figuur 1C, G, K). Bovendien kunnen kwantitatieve vlekken zoals DAPI (figuur 1A, E, I) worden gebruikt om veranderingen in het DNA-gehalte te beoordelen, waaronder wondgeïnduceerde polyploïdie22.
Het huidige protocol is bijzonder gunstig omdat het kan worden gebruikt na langdurige live beeldvormingsexperimenten. Omdat poppen onbeweeglijk zijn, kunnen ze urenlang in beeld worden gebracht (figuur 4A, B). Belangrijk is dat dit protocol geen significante veranderingen veroorzaakt in de algehele architectuur of morfologie van het wondepitheel na dissectie (figuur 4B, C). Zo kunnen kenmerken in het weefsel op lange termijn in beeld worden gebracht en vervolgens verder worden onderzocht met immunohistochemie of cellulaire vlekken.
Beeldvorming diep in weefsels is complex vanwege hun opaciteit, en Drosophila zijn bedekt met een wasachtige cuticula8 waardoor diepe beeldvorming nog moeilijker wordt. Met deze techniek kan echter een ontleed notum tussen twee coverslips worden geplaatst, waardoor de epitheliale monolaag van beide kanten kan worden afgebeeld: de apicale kant door de cuticula (figuur 5A-D) en / of de basale kant van het epitheel die naar de lichaamsholte is gericht (figuur 5E-H). Deze verschillende weergaven zijn bij uitstek geschikt om verschillende structuren in het weefsel te visualiseren. De apicale weergave is bijvoorbeeld ideaal voor het visualiseren van epitheelcelranden en kernen die net onder de cuticula liggen (figuur 5A-D). Met de basale weergave zijn deze apicale signalen minder zichtbaar (figuur 5E-H). Basale structuren worden echter waargenomen aan de wondrand (figuur 5J, L gele, witte pijlen). Deze basale structuren zijn veel helderder omdat er minder occlusie is in de basale weergave dan in de apicale weergave.
Figuur 1: Ontleed, gefixeerd en bevlekt Drosophila pop nota. (A-D) Unwounded notum. (E-H), Gewond notum 30 min na laserablatie. (I-L) Gewond notum 3 uur na laserablatie. (A,E,I) DAPI-vlek toont kernen. (B,F,J) Transgene Histone2-EGFP, gebruikt in live beeldvorming, is zichtbaar na bevestiging en kleuring. (C,G,K) Het anti-FasIII antilichaam laat zien dat antilichaamvlekken goed werken op het vaste notum. (D,H,L) Samengevoegde afbeelding. De beelden worden vastgelegd met 40x objectief met behulp van draaiende schijfmicroscopie, maximale intensiteitsprojecties van Z-stacks worden getoond met 0,3 μm Z-slices. A-D staat voor 263 Z-slices. E-H vertegenwoordigt 195 plakjes. I-L staat voor 53 Z-slices. De oranje stippellijn geeft de wondmarge aan. Schaalbalk in L is 25 μm, van toepassing op A-L. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Handplaatsing voor notumdissectie. (A-B) Links en rechts van handplaatsing voor het vasthouden van de microdissectieschaar. Om schudden van de hand te voorkomen, wordt de nek van de schaar tegen de middelvinger van de niet-dominante hand geplaatst. Een schaar moet evenwijdig aan het microscoopglaasje staan om kromtrekken van het notumweefsel te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Correct ontleed notum vs. gekrulde notum. (A) Pop notum na dissectie en reiniging ongecureerd en klaar voor fixatie. (B) Pop notum krulde op zichzelf na verwijdering uit 1x PBS, waardoor het onbruikbaar werd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Pre- en post-fixed beelden zijn grotendeels vergelijkbaar. Een popnotum dat Histone2-EGFP in de kernen tot expressie bracht, werd afgebeeld (A) live vóór ablatie en (B) 3 uur na laserablatie. (C) Het notum werd opgehaald, ontleed en gefixeerd zoals vermeld in het protocol en opnieuw afgebeeld na bevestiging. De wondplaats is gelabeld met een rode ster. De beelden werden vastgelegd met 40x objectief met behulp van spinning disc microscopie, Z-slices werden genomen om de 0,3 μm. Maximale intensiteitsprojecties van 34 Z-slices pre-wounding (A), 48 Z-slices 3 h na wounding (B) en 103 Z-slices na dissectie, fixatie en kleuring (C) worden getoond. Schaalbalk in C is 25 μm, toepasbaar op A-C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Beeldvorming van apicale en basale zijden van een gewonde notum. Dezelfde gewonde pop notum is te zien in alle panelen. De wond is gemarkeerd met een rode ster. De oranje stippellijn geeft de wondmarge aan. (A-D) Het notum wordt afgebeeld vanaf de apicale kant, door de cuticula. (E-H) Het notum is afgebeeld vanaf de basale binnenzijde. (I-L) De bovenste panelen tonen een X-Z-afbeelding van het notum, apicale kant naar boven, met het epitheelblad aangeduid met een witte driehoek. De oranje lijn geeft het apicale-basale vlak van de X-Y-plak aan, weergegeven in de onderste panelen. In de onderste panelen toont de oranje lijn het vlak van de bovenstaande X-Z-afbeelding. (I) Apisch afgebeelde notum - apicale plak. De bovenste X-Z-weergave toont nauwkeurige beeldvorming van het apicale epitheelblad (witte driehoek). Deze weergave is gelijk aan een livebeeldweergave. (J) Apitisch afgebeelde notum - basale plak, gedeeltelijk belemmerd door apicale weefsel. Andere weefsels aangeduid met gele pijl (mogelijke spierband) en witte pijlen (mogelijke bloedcellen) zijn zichtbaar aan de basale kant. (K) Basaal afgebeelde notum - apicale plak, gedeeltelijk belemmerd door basaal weefsel en wondschurft (donker centraal gebied). (L) Basaal afgebeelde notum - basale plak. Deze weergave toont het best de basale weefsels aangeduid met gele en witte pijlen. A,E: DAPI beits, B,F: Histone-EGFP, C,G: FasIII kleuring. De beelden werden vastgelegd met 20x objectief met draaiende schijfmicroscopie. Om de 0,9 μm werden Z-plakjes genomen. A-D toont de maximale intensiteitsprojectie van 19 slices. E-H vertegenwoordigt de maximale intensiteitsprojectie van 17 segmenten. 25 μm schaalstaven in D, H, L zijn van toepassing op respectievelijk A-D, E-H, I-L. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Voorbereiding van oplossingen en buffers. Recepten voor de volgende oplossingen zijn gedetailleerd: 1xPBS, 1x PBST, blokkerende oplossing en paraformaldehyde fixatief. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Kritieke stappen
Het optimaliseren van drie stappen zal het succes van dit protocol drastisch vergroten. Wees eerst in stap 1.5 spaarzaam met de lijm die op de dekplaat is aangebracht. Als er te veel lijm wordt toegevoegd, kunnen de poppen worden begraven in een dikke laag gestolde lijm, waardoor dissectie onmogelijk wordt, en als het het notum zelf bedekt, zal de lijm het licht van het monster afsluiten. Ten tweede, tijdens stappen 2.3-2.6, zorg ervoor dat alleen de bovenste koepel van het notum wordt verwijderd, waarbij zoveel mogelijk van het laterale weefsel wordt uitgesloten. Indien opgenomen, zal het laterale weefsel tijdens de montage worden samengedrukt en ervoor zorgen dat het midden van het notum naar binnen knikt, waardoor het vaak buiten de werkafstand van hoge numerieke diafragmadoelen wordt geplaatst. Ten derde moet tijdens de reinigingsstap 2.9 uiterste zorg worden besteed aan het niet beschadigen van het monolaagepitheel. Als het weefsel grote delen mist of er geen signaal kan worden gedetecteerd, is deze stap waarschijnlijk de schuld.
Probleemoplossing
Probleem 1: Na montage komt de pop tijdens de dissectie los van de dubbelzijdige tape. Dit is een veel voorkomend probleem, vooral voor beginners. De beste remedie is om ervoor te zorgen dat de buitenkant van de poppenkast volledig droog / vrij van voedselresten is. Het verwijderen van voedsel met een stompe tang en het laten drogen van de behuizing gedurende 10-15 minuten aan de lucht zal helpen om aan de tape te hechten. U kunt ook de niet-dominante hand en een stompe tang gebruiken om de poppen tijdens de dissectie tegen de tape te houden. Als het probleem aanhoudt, biedt het aanbrengen van een kleine druppel nagellak van 5-10 μL op de basis van het achterste uiteinde van de behuizing en laat het verharden over het algemeen voldoende hechting voor zelfs de weerbarstige poppen.
Probleem 2: Notum stort in tijdens stap 2.3, of de eerste breuk door het omhulsel verloopt niet soepel. Als het omhulsel moeilijk te doorbreken is, kan er te veel lijm uit de immobilisatiestappen komen. Het plaatsen van de ontleedde poppen in minder kleeflijm zal dit probleem verbeteren. Zorg er verder voor dat de microdissectieschaar scherp is. Stompe scharen zullen niet in staat zijn om in het omhulsel te snijden en hebben de neiging om het naar binnen te laten instorten. Zodra hemolymfe uit de poppen morst, moet u ervoor zorgen dat een van de snijmessen de poppen kan binnendringen zonder dat de notum vervormt. Als het notum instort en het blad niet in de poppen komt, ga dan door met knippen totdat een mes de poppen binnendringt.
Probleem 3: Tijdens stap 2.4 vangt of sleept de schaar het omhulsel. Als de schaar het omhulsel begint te vangen of te slepen, helpt het vaak om over te schakelen naar de andere kant van de poppen en verder te gaan met het 'losmaken' van het omhulsel. Verdere stompe microdissectieschaar zal het moeilijk maken om schone sneden door het omhulsel te bereiken en er moet een geslepen schaar worden gebruikt.
Probleem 4: Het monster wordt per ongeluk aangezogen tijdens het kleuren (stappen 3.1-3.6). Het ontleedde notum is moeilijk te zien omdat het transparant is. Het kan handig zijn om een donkerblauw of zwart vel onder de coverslip te plaatsen om contrast te bieden (een oud pipetpunthouderrek werkt goed.) Bovendien kunnen alle oplossingsveranderingen worden uitgevoerd onder een dissectiemicroscoop.
Probleem 5: Er wordt geen signaal gedetecteerd / fragmentarisch signaal wordt gedetecteerd. Na het uitsluiten van vlekspecifieke problemen, als er geen signaal wordt gedetecteerd of als het fragmentarisch is, is stap 2.9 (reiniging) waarschijnlijk de boosdoener. Een afwezig of fragmentarisch signaal kan ontstaan door beschadiging en verwijdering van het epitheelweefsel tijdens het reinigen. Omgekeerd kan een slecht signaal worden veroorzaakt door occlusie van de spierbanden / vetlichaamcellen als ze niet worden verwijderd, omdat ze de diffusie van vlekken en antilichamen in het notum ten opzichte van het omliggende weefsel kunnen beperken. Als het weefsel beschadigd is, is zachter zijn tijdens het reinigen de beste oplossing. Als de vlek in plaats daarvan zichtbaar maar fragmentarisch is, wordt aanbevolen om de kracht / tijd die aan de reinigingsstap is besteed te verhogen om zoveel mogelijk van het spier- en vetlichaam te verwijderen. Verder kan het verlengen van de vlekduur helpen dit probleem op te lossen met een betere reiniging.
Probleem 6: Het notumweefsel heeft een vervormd/gerimpeld uiterlijk tijdens beeldvorming. Kromtrekken en rimpelen van het weefsel komen uit twee bronnen. Ten eerste zal het comprimeren van het notum tijdens de montage ervoor zorgen dat het knikt en kromtrekt. De beste oplossing is om zoveel mogelijk van de laterale weefsels te verwijderen, zodat de koepel zo kort mogelijk is en tussen de coverslip afstandhouders past. Ten tweede, als het notum tijdens de dissectie wordt gebogen, zal deze bocht niet rechttrekken tijdens de montage, dus er moet extra zorg worden besteed aan het niet kromtrekken van het notum tijdens de dissectie. Het per ongeluk buigen van het notum komt het meest voor bij het wegsnijden van het omhulsel van de rest van de poppen. Het is verleidelijk om de dissectieschaar onder een hoek ten opzichte van de poppen te hebben in plaats van ze in het monstervlak te houden als de poppen. Een schuine schaar zorgt er echter voor dat het omhulsel omhoog knikt bij het knippen in plaats van plat te blijven.
Bestaande methoden, beperkingen en toekomstige toepassingen
Wang et al.20 rapporteerden een vergelijkbaar dissectieprotocol voor de isolatie van popepitheel. Deze techniek vereist dat de pop binnen zijn behuizing blijft en snel wordt doorsneden met een scalpel. Dit protocol is niet compatibel met eerder live-imaged monsters, omdat live beeldvorming vereist dat een groot deel van de popcase wordt verwijderd. Omdat poppen geen stijfheid hebben, mangelde de bisectie van de pop buiten de behuizing het weefsel, wat de creatie van dit protocol inspireerde. De hier beschreven techniek maakt isolatie en fixatie van het notum mogelijk en kan worden gebruikt als de eerste stap voor een breed scala aan andere methoden zoals cryosectie, in situ hybridisatie of elektronenmicroscopie.
Deze techniek heeft enkele beperkingen. Ten eerste is het ontleden, fixeren en kleuren van het notum tijdrovender dan live-imaging fluorescerend gelabelde eiwitten in het notum, waarvoor slechts een eenvoudige dissectie nodig is om het popgeval te verwijderen 9,23. Ten tweede, in vergelijking met dissecties van andere Drosophila-weefsels, is deze dissectie moeilijker vanwege het dunne, fragiele weefsel en de hydrofobe cuticula. Voor het eenvoudig visualiseren van eiwitten in Drosophila epithelia is immunohistochemie op vaste embryo's, larvale vleugelschijven of eierstokken gemakkelijker. Deze techniek maakt het echter mogelijk om de kracht van live beeldvorming te combineren met fixatie en kleuring, waardoor het een krachtig hulpmiddel is als het eenmaal onder de knie is.
Een dissectie/fixatie techniek heeft enkele voordelen ten opzichte van live imaging. Basale (inwendige) structuren kunnen beter worden opgelost met een basaal beeld (figuur 5L,J). Het belangrijkste is dat live beeldvorming beperkt is tot fluoroforen die genetisch moeten worden geleverd, wat vaak langdurige genetische kruisingsschema's vereist. Het huidige protocol maakt daarentegen de toepassing van vlekken, immunohistochemie en andere technieken mogelijk die dissectie en fixatie vereisen. Dit verhoogt het aantal gesondeerde signalen in het weefsel dramatisch, terwijl de tijd tot experimentele resultaten mogelijk wordt verkort.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen Dr. M. Shane Hutson bedanken voor het opzetten van het laserablatiesysteem dat wordt gebruikt voor het verwonden van poppen en zijn bijdragen aan en feedback over het ontwikkelen van het protocol. Dit werk werd ondersteund door 1R01GM130130 aan APM en M. Shane Hutson. JW werd ondersteund door 2T32HD007502-21.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” Scotch Permanent Double-Sided tape | Scotch 3M | 665 | |
| 0.1-10 µL uTIP pipette tip | Biotix | M-0011-9FC | |
| 22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
| 24 x 60 mm coverslip | Corning | 2980-246 | |
| 3M VetBond | 3M | 1469SB | Called "adhesive glue" in protocol |
| Anti-FasIII primary Mouse IgG2a | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Chemical | c79-500 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | No. 11254-20 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt | Fine Science Tools | No. 11254-20 | Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone |
| Fisherbrand Double frosted microscope slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
| Fluorescent Light Source | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
| Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
| Fly Vial Foam Plugs "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water | Cole-Parmer | 759075D | A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water. |
| KimWipe | KimTech | 34155 | Called "Absorbent Tissue" in protocol |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
| NIS Elements Software | Nikon | AR | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
| Plastic Vials | Genesee Scientific | 32-114 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
| Stereo Microdissection Scope | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | New or freshly sharpened scissors |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Called " antifade mounting medium" in protocol |
| Vecta Shield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Not ideal for pupal notum. |
| X-Light V2 Spinning Disc | Crest Optics | V2 L-FOV |
References
- Valon, L., et al. Robustness of epithelial sealing is an emerging property of local ERK feedback driven by cell elimination. Developmental Cell. 56 (12), 1700-1711 (2021).
- Levayer, R., Dupont, C., Moreno, E. Tissue crowding induces caspase-dependent competition for space. Current Biology. 26 (5), 670-677 (2016).
- Couturier, L., et al. Regulation of cortical stability by RhoGEF3 in mitotic sensory organ precursor cells in Drosophila. Biology Open. 6 (12), 1851-1860 (2017).
- Couturier, L., Mazouni, K., Corson, F., Schweisguth, F. Regulation of Notch output dynamics via specific E(spl)-HLH factors during bristle patterning in Drosophila. Nature Communications. 10, 3486 (2019).
- Fujisawa, Y., Shinoda, N., Chihara, T., Miura, M. ROS regulate caspase-dependent cell delamination without apoptosis in the drosophila pupal notum. iScience. 23, 101413 (2020).
- Besson, C., et al. Planar cell polarity breaks the symmetry of par protein distribution prior to mitosis in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 25 (8), 1104-1110 (2015).
- Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. Apoptosis ensures spacing pattern formation of drosophila sensory organs. Current Biology. 21, 278-287 (2011).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Moreira, C., Regan, J., Zaidman-Rémy, A., Jacinto, A., Prag, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods in Molecular Biology. 769, Clifton, N.J. 249-260 (2011).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. Elife. 4, 08519 (2015).
- Cristo, I., Carvalho, L., Ponte, S., Jacinto, A. Novel role for Grainy head in the regulation of cytoskeletal and junctional dynamics during epithelial repair. Journal of Cell Science. 131 (17), 213595 (2018).
- Bellaïche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nature Cell Biology. 3 (1), 50-57 (2001).
- Shannon, E. K. Multiple mechanisms drive calcium signal dynamics around laser-induced epithelial wounds. Biophysical Journal. 113 (7), 1623-1635 (2017).
- O'Connor, J. T., et al. Proteolytic activation of Growth-blocking peptides triggers calcium responses through the GPCR Mthl10 during epithelial wound detection. Developmental Cell. 56 (15), 2160-2175 (2021).
- Hartenstein, V., Posakony, J. W. Development of adult sensilla on the wing and notum of Drosophila melanogaster. Development. 107 (2), 389-405 (1989).
- Yeh, E., Zhou, L., Rudzik, N., Boulianne, G. L. Neuralized functions cell autonomously to regulate Drosophila sense organ development. The EMBO Journal. 19 (17), 4827-4837 (2000).
- Loubéry, S., et al. Uninflatable and notch control the targeting of sara endosomes during asymmetric division. Current Biology. 24 (18), 2142-2148 (2014).
- Kawamori, A., Shimaji, K., Yamaguchi, M. Dynamics of endoreplication during Drosophila posterior scutellar macrochaete development. PLoS One. 7 (6), 38714 (2012).
- Couturier, L., Schweisguth, F. Notch Signaling: Methods and Protocols. Bellen, H. J., Yamamoto, S. , Springer. New York. 79-86 (2014).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (56), e3139 (2011).
- Kiehart, D. P., et al. Cell Biology (Third Edition). Celis, J. E., et al. , Academic Press. 87-103 (2006).
- Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila model to study wound-induced polyploidization. Journal of Visualized Experiments. (160), e61252 (2020).
- O’Connor, J. T., S, E. K., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Mounting Drosophila pupae for laser ablation and live imaging of the dorsal thorax. STAR Protocols. , (2022).
