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Biology

विच्छेदन, फिक्सिंग, और ड्रोसोफिला Pupal Notum visualizing

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63682
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2
1Dept. Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 2Program in Developmental Biology, Vanderbilt University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला प्यूपल नोटम के निश्चित ऊतक की तैयारी और विज़ुअलाइज़ेशन का विवरण देता है। इसका उपयोग या तो बरकरार या घायल ऊतक के लिए किया जा सकता है, और ऊतक की मूल वास्तुकला को संरक्षित किया जाता है। विच्छेदन, फिक्सिंग और धुंधला करने के लिए प्रक्रियाओं सभी इस लेख में वर्णित हैं।

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के प्यूपे कायापलट के दौरान कई दिनों तक स्थिर होते हैं, जिसके दौरान वे एक पतली पारदर्शी वयस्क अखंडता के साथ एक नया शरीर विकसित करते हैं। उनकी अस्थिरता और पारदर्शिता उन्हें विवो लाइव इमेजिंग प्रयोगों के लिए आदर्श बनाती है। कई अध्ययनों ने इसकी पहुंच और अपेक्षाकृत बड़े आकार के कारण प्यूपल नोटम के पृष्ठीय उपकला मोनोलेयर पर ध्यान केंद्रित किया है। उपकला यांत्रिकी और विकास के अध्ययन के अलावा, नोटम घाव भरने का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श ऊतक रहा है। एक चोट के बाद, पूरी उपकला मरम्मत प्रक्रिया को 6-12 घंटे से अधिक लाइव इमेजिंग द्वारा कैप्चर किया जा सकता है। लाइव इमेजिंग के लिए नोटम की लोकप्रियता के बावजूद, बहुत कम प्रकाशित अध्ययनों ने निश्चित नोटम नमूनों का उपयोग किया है। निर्धारण और धुंधला लगभग सभी अन्य ड्रोसोफिला ऊतकों के लिए आम दृष्टिकोण हैं, जो सरल सेलुलर दाग और एंटीबॉडी के बड़े प्रदर्शनों की सूची का लाभ उठाते हैं। हालांकि, प्यूपल नोटम नाजुक है और शरीर से हटाने के बाद कर्लिंग और विरूपण के लिए प्रवण है, जिससे लाइव इमेजिंग को पूरक करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। यह प्रोटोकॉल प्यूपल नोटम को ठीक करने और धुंधला करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करता है, दोनों बरकरार और लेजर-घायल होने के बाद। इस तकनीक के साथ, प्यूपा के वेंट्रल पक्ष को प्यूपा को स्थिर करने के लिए एक कवरस्लिप से नीचे चिपकाया जाता है, और नोटम को सावधानीपूर्वक हटा दिया जाता है, तय किया जाता है, और दाग दिया जाता है। नोटम एपिथेलियम को एक स्लाइड पर या ऊतक के पृष्ठीय या वेंट्रल पक्ष से इमेजिंग की सुविधा के लिए दो कवरलिप्स के बीच रखा जाता है।

Introduction

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के प्यूपल नोटम का उपयोग पिछले दशक में लाइव इमेजिंग अध्ययनों के लिए तेजी से किया गया है क्योंकि जानवर दोनों स्थिर है और इस चरण में एक पारदर्शी छल्लीहै 1,2,3,4,5,6,7। हालांकि, प्यूपल नोटम विच्छेदन और ठीक करने के लिए चुनौतीपूर्ण है, जिससे एंटीबॉडी और सेल स्टेनिंग के साथ लाइव इमेजिंग अध्ययनों को पूरक करना मुश्किल हो जाता है। इस काम का समग्र लक्ष्य नए या पहले से लाइव-इमेज वाले नमूनों पर एंटीबॉडी और सेल स्टेनिंग के लिए प्यूपल नोटम को विच्छेदन और ठीक करने के लिए एक पुनरुत्पादक प्रोटोकॉल बनाना है।

जैसा कि लार्वा कायापलट शुरू करते हैं, एपिडर्मिस लार्वा छल्ली से दूर खींचता है, जिससे एक कठिन प्यूपल केस 8 बनताहै। लार्वा बॉडी प्लान को तोड़ दिया जाता है, और नई वयस्क शरीर योजना विकसित की जाती है। इस समय के दौरान, प्यूपे स्थिर होते हैं, जिससे उन्हें लाइव इमेजिंग के लिए आदर्श बनाया जाता है। एक आमतौर पर चित्रित ऊतक प्यूपल नोटम है, एक वयस्क मोनोलेयर उपकला जो पृष्ठीय वक्ष में बनती है। नोटम एक साधारण विच्छेदन के बाद नेत्रहीन रूप से सुलभ है प्यूपल केस9 को हटाने के लिए। तब पूरे जानवर को माउंट किया जा सकता है, और नोटम को घंटों या दिनों के लिए लाइव इमेज किया जा सकता है, जिससे यह विकास, होमियोस्टैसिस के दौरान उपकला सेल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श ऊतक बन जाता है, और 10,11,12,13,14 घायल होने के बाद। हालांकि, नोटम विच्छेदन और ठीक करने के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह नाजुक है और एक पतली पारदर्शी वयस्क छल्ली के साथ कवर किया गया है जो हाइड्रोफोबिक है। यह हाइड्रोफोबिक छल्ली इसे शरीर के बाकी हिस्सों से हटाए जाने पर जलीय समाधानों में कर्लिंग के लिए प्रवण बनाता है। इस प्रकार, नोटम विच्छेदन और निर्धारण को केवल शायद ही कभी रिपोर्ट किया गया है और विच्छेदन को अक्सर15,16,17,18 का वर्णन नहीं किया जाता है। साहित्य में एक विस्तृत प्रोटोकॉल के बिना, एक ड्रोसोफिला शोधकर्ता के लिए प्यूपे के दाग के साथ लाइव इमेजिंग को पूरक करना निषेधात्मक रूप से मुश्किल है।

इस तकनीक का उद्देश्य उन नमूनों को पुन: अनुक्रमित करना और ठीक करना है जो पहले लाइव-इमेज किए गए हैं, जिनमें वे भी शामिल हैं जो लेजर-घायल हो गए हैं। क्योंकि लाइव इमेजिंग को प्यूपल मामले को हटाने की आवश्यकता होती है, इस विच्छेदन तकनीक को पूर्वकाल प्यूपल मामले को हटाकर शुरू किया जाता है, पिछले प्रोटोकॉल के विपरीत जो प्यूपल केस 4,19,20 के भीतर पिन या द्विविभाजक प्यूपे को पिन करता है। नोटम एक नाजुक ऊतक है, और घायल होने से इसकी नाजुकता बढ़ सकती है। इस प्रकार, इस नाजुक ऊतक का समर्थन करने के लिए, नोटम और सिर और पेट के हिस्से के इंटेग्यूमेंट (उपकला और संलग्न पारदर्शी वयस्क छल्ली) को प्यूपा के बाकी हिस्सों से दूर विच्छेदित किया जाता है, जबकि हमेशा एक जलीय वातावरण में डूबा होता है। यह विधि ऊतक कर्लिंग और अनुपयोगी होने की संभावना को कम करती है। इस तकनीक ने 30 मिनट के बाद घायल नोटम ऊतक को सफलतापूर्वक दाग दिया है (चित्रा 1ई-एच) और 3 घंटे के बाद घायल होने के बाद (चित्रा 1आई-एल)। यह प्रोटोकॉल नोटम विकास या घाव की मरम्मत की अवधि के लिए प्रभावी होने की उम्मीद है। वर्तमान तकनीक उपलब्ध इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अभिकर्मकों की बहुतायत के साथ प्यूपल नोटम की लाइव-इमेजिंग क्षमताओं को एकजुट करने के इच्छुक शोधकर्ताओं के लिए सहायक होगी।

Protocol

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर (फल मक्खियों) को एक मानक कॉर्नमील-गुड़ माध्यम पर 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया था। अध्ययन ईजीएफपी-टैग किए गए हिस्टोन एच 2 ए प्यूपे (डब्ल्यू [*]) पर आयोजित किए गए थे; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). मक्खियों को एक सार्वजनिक स्टॉक केंद्र से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. Pupae immobilization

  1. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड के लिए डबल-साइडेड टेप की एक 2 "पट्टी लागू करें।
  2. 25 डिग्री सेल्सियस पर उठाए गए शीशियों में सफेद प्रीपपे की पहचान करें, और शीशी के बाहर अपने स्थान को इंगित करने के लिए एक मार्कर का उपयोग करें। शीशियों को 25 डिग्री सेल्सियस पर वापस करें।
    नोट: सफेद prepupae उनकी गतिशीलता, सफेद रंग, और everted spiracles की विशेषता है. ये प्यूपेरियम गठन (एपीएफ) के बाद 0-1 एच, या चरण पी 1 8 बनातेहैं।
  3. 12-15 घंटे बाद, ध्यान से एक विच्छेदन दायरे का उपयोग करके संकेतित प्यूपे के 3-4 को हटा दें (उन्हें पॉप किए बिना) और टेप के बगल में माइक्रोस्कोप स्लाइड पर उन्हें इकट्ठा करें।
    नोट: Pupae अब एक everted सिर थैली pupae पूर्वकाल अंत8 पर दिखाई देने के साथ चरण P5 हो जाएगा.
  4. Pupae को कम से कम एक प्यूपा चौड़ाई को टेप पर उनके वेंट्रल पक्षों के साथ नीचे रखें।
  5. एक पैराफिन फिल्म पर चिपकने वाला गोंद की एक बूंद रखें ( सामग्री की तालिका देखें) या एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब ढक्कन में। चिपकने वाला गोंद की बूंद में एक 0.1-10 μL पिपेट टिप (कोई पिपेट) के अंत को डुबोएं। एक 24 मिमी x 60 मिमी (1.5 मोटाई) coverslip पर दो बार पिपेट टिप नल, एक कोने से 1 सेमी x 1 सेमी दूर, चिपकने वाला गोंद ~ 1/2 pupa की लंबाई की एक पंक्ति बनाने.
  6. एक 0.2-2 μL (P2) पिपेट को 2 μL, और 200 μL (P200) पिपेट को 200 μL पर प्रीसेट करें, और उन्हें युक्तियों के साथ फिट करें ताकि वे 1x PBS + 0.1 mM Ca2+ से भरे होने के लिए तैयार हों, जो संपर्क पर चिपकने वाले गोंद को तेजी से मजबूत करेगा।
  7. सिर के किनारे के पास संदंश ( सामग्री की तालिका देखें) डालें और धीरे से मामले को पूर्वकाल से पीछे9 तक हटा दें। जितना संभव हो उतना मामला निकालें। कुंद संदंश की एक जोड़ी के साथ प्यूपा के विकासशील पैरों को समझें और ध्यान से प्यूपा को अपने मामले से खींचें।
    नोट: pupae के वेंट्रल भाग पर एक छोटा सा टूटना इस प्रक्रिया के लिए हानिकारक नहीं होगा।
  8. कवरस्लिप के कोने में प्यूपा बिछाएं।
  9. कुंद संदंश, लिफ्ट के साथ पीछे के पेट या विकासशील पंख पर प्यूपा को समझें, और चिपकने वाले गोंद की रेखा में नीचे प्यूपे के वेंट्रल पक्ष को रखें।
  10. जल्दी से 1x PBS के 2 μL के साथ P2 पिपेट को भरें + Ca2 + के 0.1 mM, और इसे हवा में पकड़कर, टिप (0.25-0.5 μL) पर एक छोटा सा बुलबुला बनाने के लिए पर्याप्त रूप से निष्कासित करें।
  11. वक्ष के आधार पर प्यूपे के एक तरफ समाधान के छोटे बुलबुले को स्पर्श करें, फिर दूसरी तरफ दोहराएं।
    नोट: यह जगह में pupa पकड़ चिपकने वाला गोंद की एक छोटी राशि को मजबूत करेगा। आम तौर पर, सभी समाधानों का उपयोग नहीं किया जाएगा।
  12. 1x PBS के 200 μL के साथ P200 पिपेट भरें + Ca2 + के 0.1 mM, फिर वक्ष पर पिपेट की नोक रखें और प्यूपे को पूरी तरह से डुबोने के लिए सामग्री को निष्कासित करें। चिपकने वाला गोंद के शेष तुरंत solidify जाएगा.
  13. पीबीएस समाधान के ~ 100 μL को हटा दें, इसलिए प्यूपा अगले चरण में तुरंत आगे बढ़ने से पहले मुश्किल से जलमग्न हो जाता है।
    नोट:: निराधार नमूनों के लिए, चरण 1.1 से प्रारंभ करें। घायल आंशिक रूप से विच्छेदित नमूनों के लिए, चरण 1.5 पर शुरू करें। लेजर एब्लेशन के माध्यम से घायल होने का वर्णन पहले14,21 किया गया है। स्थिरीकरण, विच्छेदन, और बढ़ते चरणों को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रदर्शन करने की आवश्यकता होती है।

2. नोटम विच्छेदन

  1. प्रमुख हाथ की तर्जनी उंगली और मध्य उंगली के खिलाफ हैंडल के एक तरफ ब्रेसिंग माइक्रोडिसेक्शन कैंची की एक जोड़ी को समझें, इसलिए प्रमुख हाथ का अंगूठा काटने के बल को लागू करता है (चित्रा 2 ए, बी)।
  2. गैर-प्रमुख हाथ की मध्य उंगली के खिलाफ कैंची की गर्दन को स्थिर करें, जबकि गैर-प्रमुख हाथ की अनामिका उंगली के साथ कवरस्लिप को ब्रेसिंग करें।
  3. पृष्ठीय पेट के बीच में स्निप एक छोटा सा छेद बनाने के लिए, ~ 0.2-0.5 मिमी। कुछ हेमोलिम्फ आमतौर पर बाहर फैल जाएगा और उल्लंघन का एक अच्छा संकेतक है।
  4. छोटे 0.5-0.75 मिमी कटौती पीछे से पूर्वकाल के लिए integument के माध्यम से कटौती, इसे अलग करने के लिए पृष्ठीय ऊतक को घेरने. जितना संभव हो उतना सपाट ऊतक बनाने के लिए, बहुत अधिक वेंट्रल रूप से काटने से बचें; केवल छाती के पृष्ठीय 'गुंबद' को सिर और पेट के छोटे वर्गों के साथ हटा दिया जाना चाहिए।
  5. प्यूपे के दूसरी तरफ पूर्वकाल कटौती के पीछे की ओर दोहराएं।
  6. यदि आवश्यक हो तो सिर के माध्यम से एक साफ कटौती के लिए अनुमति देने के लिए विच्छेदन चरण को घुमाएं।
    नोट: इस स्तर पर, पृष्ठीय integument, या notum, pupa के बाकी हिस्सों से अलग किया जाएगा। यदि यह अलग-अलग दिखाई देता है लेकिन आसानी से स्थानांतरित नहीं किया जाता है, तो नोटम के नीचे कुछ कटौती इसे हटाने में मदद कर सकती है।
  7. कवरस्लिप के केंद्र में 1x PBS के ~ 200 μL जोड़ें और इसे मूल विच्छेदन बूंद से जोड़ने वाला एक चैनल बनाएं जो इसे मूल विच्छेदन बूंद से जोड़ता है, धीरे से नई बूंद से कवर ग्लास के पार पिपेट टिप को खींचकर मूल रूप से।
  8. कुंद संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, धीरे से कवरस्लिप के केंद्र में अलग-थलग नोटम को धक्का दें या खींचें और घुमाएं, इसलिए आंतरिक पक्ष ऊपर की ओर सामना करता है। कभी भी ड्रॉपलेट से ऊतक को न निकालें।
    नोट: बाद में इमेजिंग के दौरान नमूना occluding चिपकने वाला गोंद के किसी भी अवशेष से बचने के लिए मूल विच्छेदन साइट से दूर notum ले जाने के लिए आवश्यक है।
  9. पेट या सिर के वर्गों में दबाकर कुंद संदंश के साथ नोटम को नीचे रखें। एक 200 μL पिपेट से 1x PBS के तेज संदंश और / या कोमल निष्कासन की एक जोड़ी का उपयोग करते हुए, मोनोलेयर उपकला को पूरी तरह से उजागर करने के लिए किसी भी शेष वसा शरीर, मांसपेशी बैंड, या हेमोलिम्फ (यदि मौजूद हो) को हटा दें और अंतिम धुंधला और भी अधिक बना दें। विच्छेदित नोटम चित्र 3A के रूप में दिखाई देना चाहिए।
  10. एक बार जब ऊतक साफ हो जाता है, तो पीबीएस समाधान के जितना संभव हो उतना हटाने के लिए 200 μL पिपेट का उपयोग करें (मलबे और प्यूपे के वेंट्रल भाग के साथ), नोटम को एस्पिरेट करने से बचने के लिए एक विच्छेदन गुंजाइश के साथ निगरानी।
  11. एक बार जब अधिकांश तरल को हटा दिया जाता है, तो एक अवशोषक ऊतक का उपयोग करने के लिए बाकी चिपकने वाले गोंद और प्यूपा को सावधानीपूर्वक पोंछने के लिए, साथ ही साथ किसी भी अन्य मलबे को जो कवरस्लिप पर रहता है।
    नोट: यदि कुछ चिपकने वाला गोंद coverslip पर रहता है, तो यह एक समस्या का कारण नहीं होगा जब तक कि यह पृष्ठीय ऊतक की तुलना में पतला है।
  12. 4% पीएफए (1x पीबीएस में) के 150-200 μL जोड़ें और कमरे के अस्थायी में 20 मिनट के लिए ठीक करें। विच्छेदन की गति के आधार पर, पहले प्यूपा के निर्धारण के दौरान 1 या अधिक प्यूपे को विच्छेदित किया जा सकता है।
  13. पीएफए को हटा दें और इसे 30 सेकंड के लिए एक बार नोटम को धोने के लिए 1x पीबीएस के साथ बदलें।
  14. यदि एंटीबॉडी धुंधला के साथ आगे बढ़ रहा है, तो एंटीजन इंट्रासेल्युलर होने पर ऊतक को पार करने के लिए 1x पीबीएस या 1x पीबीएसटी (पूरक फ़ाइल 1) में 5 मिनट वॉश (3 बार) करें।
  15. नमूने को 1x PBS + 0.02% NaN3 में एक humidified कक्ष में रात भर स्टोर करें, या यदि ऊतक को दागने की योजना बना रहे हैं, तो ब्लॉकिंग समाधान (पूरक फ़ाइल 1) में रात भर इनक्यूबेट करें।

3. नोटम धुंधला

नोट: एंटीबॉडी या सेलुलर दाग का उपयोग कर धुंधला करने के लिए नीचे दिए गए चरणों का पालन करें। नोटम को समाधान से नहीं हटाया जाना चाहिए, क्योंकि यह संभवतः ऊतक को कर्ल करने का कारण बनेगा। इस प्रकार, कवरस्लिप पर पूरी तरह से आयोजित किए जाने वाले धुंधला प्रोटोकॉल को अनुकूलित करें और 5 मिनट से अधिक समय तक किसी भी चरण के लिए एक ह्यूमिडिफाइड चैंबर में रखें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत नमूनों की निगरानी धोने के दौरान ऊतक की आकस्मिक आकांक्षा को रोकने में मदद कर सकती है।

  1. सेल सीमाओं की कल्पना करने के लिए, एंटी-FasIII प्राथमिक माउस IgG2a एंटीबॉडी के 200 μL में इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिका देखें) 1:8 एकाग्रता पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ब्लॉकिंग बफर + 0.02% NaN3 में पतला।
  2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे प्रति धोने के लिए 1x PBS + 0.02% NaN 3 के 200 μL के साथ अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी (3 बार) धोएं।
  3. द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन 200 μL के साथ 1:200 एकाग्रता विरोधी माउस IgGa2 Cy3 में अवरुद्ध बफर में + 0.02% NaN3 कमरे के अस्थायी में 2 ज के लिए.
  4. कमरे के तापमान पर 1 घंटे प्रति धोने के लिए 1x PBS + 0.02% NaN 3 के 200 μL के साथ अतिरिक्त माध्यमिक एंटीबॉडी (3 बार) धोएं।
  5. नाभिक की कल्पना करने के लिए, 45 मिनट के लिए DAPI के 1 μg / mL में नमूनों को इनक्यूबेट करें ताकि दाग को मांसपेशियों के बैंड के माध्यम से प्रवेश करने के लिए पर्याप्त समय मिल सके; एक DAPI-युक्त बढ़ते माध्यम में फिक्सिंग इस ऊतक के साथ प्रभावी नहीं है.
  6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट प्रति धोने के लिए 1x PBS + 0.02% NaN 3 के 200 μL के साथ अतिरिक्त DAPI (3 बार) को धो लें, फिर 200 μL में 1x PBS + 0.02% NaN3 को 4 °C पर रात भर छोड़ दें, या तुरंत माउंट करें।

4. बढ़ते और notum visualizing

  1. धुंधला होने के बाद, समर्थन के साथ एक नया 24 × 60 कवरस्लिप (टॉपर) तैयार करें।
    नोट: क्योंकि नोटम गुंबद के आकार का है, इसे पूरी तरह से समतल करने से विकृत झुर्रियों वाले ऊतक होते हैं। दो coverslips के बीच एक अंतर बनाने से नोटम अपने सामान्य आकार को बनाए रखने की अनुमति देता है।
  2. 22 x 22 coverslips (नंबर 0 मोटाई, ~ 100 μm मोटी) से बने स्पेसर्स का उपयोग करके ~ 200 μm का अंतर बनाएँ, टॉपर के बीच में नेल पॉलिश के साथ ~ 1 सेमी का पालन किया।
  3. पालन करने के लिए, टॉपर पर स्पेसर्स रखें और नेल पॉलिश की एक पतली परत के साथ स्पेसर्स के डिस्टल किनारों को पेंट करें। सूखने दें।
    नोट: केवल एक नेल पॉलिश का उपयोग करें जो पतली और बहती है; मोटी नेल पॉलिश कवरस्लिप और टॉपर के बीच अनावश्यक अतिरिक्त स्थान जोड़ देगा।
  4. नमूने से जितना संभव हो उतना जलीय घोल निकालें।
  5. तुरंत दो बूँदें (~ 100 μL) विरोधी फीका बढ़ते माध्यम के लागू ( सामग्री की तालिका देखें) नमूने के लिए.
  6. यदि आवश्यक हो, तो एंटी-फीका बढ़ते मध्यम बूंद के केंद्र में नोटम की स्थिति के लिए साफ, तेज संदंश का उपयोग करें।
  7. एक ~ 10 x 40 मिमी समर्थन पर नोटम के साथ coverslip जगह, जैसे कि पतली फोम का एक टुकड़ा (coverslip बक्से के अंदर पैकिंग सामग्री से कटौती), नमूना बढ़ाने के लिए तो यह काम की सतह का पालन नहीं करेगा.
  8. एक विच्छेदन दायरे के तहत, धीरे-धीरे नमूने पर टॉपर को कम करें। एक बार जब विरोधी फीका बढ़ते माध्यम टॉपर से मिलता है, तो धीरे से जारी करें और केशिका कार्रवाई को टॉपर को नीचे खींचने की अनुमति दें।
    नोट: पहले कुछ सेकंड के भीतर, मामूली समायोजन notum को नुकसान पहुंचाए बिना coverslip स्थिति के लिए किया जा सकता है।
  9. टॉपर पर फोम का एक और टुकड़ा रखें और एक वजन के रूप में एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करें ताकि नमूना कवरस्लिप, टॉपर और स्पेसर्स के बीच एंटी-फीका बढ़ते माध्यम को धीरे से समझा जा सके।
  10. 5-10 मिनट के बाद, कवरस्लिप के किनारों को धीरे से छूकर किसी भी अतिरिक्त एंटी-फीका बढ़ते माध्यम को दूर करने के लिए एक अवशोषक ऊतक का उपयोग करें।
  11. धीरे से उन्हें एक साथ पालन करने के लिए coverslips के प्रत्येक कोने के लिए नेल पॉलिश लागू करें। एक बार सूखने के बाद, सील करने के लिए कवरलिप्स के सभी किनारों को पेंट करें। पहले सभी किनारों को कोटिंग करने से बचें, क्योंकि यह अक्सर कवरस्लिप को स्थानांतरित कर सकता है और पृष्ठीय ऊतक को नुकसान पहुंचा सकता है।
  12. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत नोटम की कल्पना करें ( सामग्री की तालिका देखें) पृष्ठीय और / या वेंट्रल पक्ष के माध्यम से।

Representative Results

प्रस्तुत तकनीक निराधार नोटम (चित्रा 1 ए-डी) पर अच्छी तरह से काम करती है, जिससे ऊतक के विकास और होमोस्टेसिस की जांच की अनुमति मिलती है, उदाहरण के लिए, पॉलीप्लोइड मेचानोसेंसरी ब्रिसल कोशिकाओं का गठन18, या उपकला कोशिकाओं के पीछे के प्रवाह के पूर्वकाल10। यह प्रोटोकॉल एक लेजर-एब्लेटेड नोटम (चित्रा 1ई-एल) पर भी लागू होता है, जहां चोट के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का विश्लेषण अंतर्जात फ्लोरोफोरेस जैसे हिस्टोन 2-ईजीएफपी (चित्रा 1 बी, एफ, जे) के साथ किया जा सकता है। इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (चरण 3) के साथ पोस्ट-स्टेनिंग कई विशेषताओं को प्रकट कर सकती है, जैसे कि फासिक्लिन III, जो सेल बॉर्डर्स (चित्रा 1 सी, जी, के) को लेबल करता है। इसके अतिरिक्त, मात्रात्मक दाग जैसे कि DAPI (चित्रा 1A, E, I) का उपयोग डीएनए सामग्री परिवर्तनों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें घाव-प्रेरित पॉलीप्लॉइडी22 शामिल हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल विशेष रूप से फायदेमंद है क्योंकि इसका उपयोग दीर्घकालिक लाइव इमेजिंग प्रयोगों के बाद किया जा सकता है। चूंकि प्यूपे स्थिर होते हैं, इसलिए उन्हें घंटों के लिए चित्रित किया जा सकता है (चित्रा 4 ए, बी)। महत्वपूर्ण रूप से, यह प्रोटोकॉल विच्छेदन के बाद घाव उपकला की समग्र वास्तुकला या आकृति विज्ञान में काफी बदलाव नहीं करता है (चित्रा 4 बी, सी)। इस प्रकार, ऊतक के भीतर सुविधाओं को लंबे समय तक चित्रित किया जा सकता है और फिर आगे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या सेलुलर दाग के साथ जांच की जा सकती है।

ऊतकों के भीतर गहरी इमेजिंग उनकी अस्पष्टता के कारण जटिल है, और ड्रोसोफिला को एक मोमी छल्ली8 में लेपित किया जाता है जिससे गहरी इमेजिंग और भी कठिन हो जाती है। हालांकि, इस तकनीक के साथ, एक विच्छेदित नोटम को दो कवरलिप्स के बीच रखा जा सकता है जो दोनों तरफ से उपकला मोनोलेयर की इमेजिंग के लिए अनुमति देता है: छल्ली (चित्रा 5 ए-डी) के माध्यम से एपिकल पक्ष और / या उपकला का बेसल पक्ष जो शरीर गुहा का सामना करता है (चित्रा 5ई-एच)। ये अलग-अलग विचार ऊतक के भीतर विभिन्न संरचनाओं की कल्पना करने के लिए आदर्श रूप से अनुकूल हैं। उदाहरण के लिए, एपिकल दृश्य उपकला सेल सीमाओं और नाभिक की कल्पना करने के लिए आदर्श है जो छल्ली (चित्रा 5 ए-डी) के ठीक नीचे स्थित है। बेसल दृश्य के साथ, ये एपिकल सिग्नल कम दिखाई देते हैं (चित्रा 5ई-एच)। हालांकि, बेसल संरचनाओं को घाव के मार्जिन पर देखा जाता है (चित्रा 5 जे, एल पीला, सफेद तीर)। ये बेसल संरचनाएं बहुत उज्ज्वल हैं क्योंकि एपिकल दृश्य की तुलना में बेसल दृश्य में कम रोड़ा है।

Figure 1
चित्रा 1: विच्छेदित, निश्चित, और दाग ड्रोसोफिला प्यूपल नोटा(ए-डी) अनवाउंडेड नोटम। (ई-एच), लेजर एब्लेशन के 30 मिनट बाद घायल नोटम। (I-L) लेजर एब्लेशन के बाद घायल notum 3 ज. (A,E,I) DAPI दाग नाभिक दिखाता है। (B, F, J) ट्रांसजेनिक हिस्टोन 2-ईजीएफपी, लाइव इमेजिंग में उपयोग किया जाता है, फिक्सिंग और धुंधला होने के बाद दिखाई देता है। (C, G, K) एंटी-FasIII एंटीबॉडी से पता चलता है कि एंटीबॉडी दाग निश्चित नोटम पर अच्छी तरह से काम करते हैं। (D, H, L) मर्ज की गई छवि. छवियों को कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 40x उद्देश्य के साथ कैप्चर किया जाता है, जेड-स्टैक के अधिकतम तीव्रता अनुमानों को 0.3 μm Z-स्लाइस के साथ दिखाया गया है। A-D 263 Z-स्लाइस का प्रतिनिधित्व करता है। ई-एच 195 स्लाइस का प्रतिनिधित्व करता है। I-L 53 Z-स्लाइस का प्रतिनिधित्व करता है। नारंगी धराशायी रेखा घाव मार्जिन को दर्शाती है। एल में स्केल बार 25 μm है, जो ए-एल पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: नोटम विच्छेदन के लिए हाथ प्लेसमेंट( A-B) माइक्रोडिसेक्शन कैंची को पकड़ने के लिए हाथ प्लेसमेंट के बाएं और दाएं दृश्य। हाथ मिलाने से रोकने के लिए, कैंची की गर्दन को गैर-प्रमुख हाथ की मध्य उंगली के खिलाफ रखा जाता है। कैंची को नोटम ऊतक के वारपिंग से बचने के लिए माइक्रोस्कोप स्लाइड के समानांतर होने की आवश्यकता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सही ढंग से विच्छेदित नोटम बनाम कर्ल नोटम. (ए) Pupal notum पोस्ट विच्छेदन और सफाई uncurled और निर्धारण के लिए तैयार सफाई. (बी) 1x पीबीएस से हटाए जाने के बाद प्यूपल नोटम खुद पर कर्ल हो जाता है, इस प्रकार इसे अनुपयोगी बनाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पूर्व और बाद में निश्चित छवियां काफी हद तक समान हैं। नाभिक में हिस्टोन 2-ईजीएफपी को व्यक्त करने वाले एक प्यूपल नोटम को एब्लेशन से पहले (ए) लाइव और (बी) लेजर-एब्लेशन के बाद 3 घंटे की छवि बनाई गई थी। (सी) नोटम को पुनर्प्राप्त किया गया था, विच्छेदित किया गया था, और प्रोटोकॉल में उल्लिखित के रूप में तय किया गया था और फिक्सिंग के बाद फिर से चित्रित किया गया था। घाव साइट को एक लाल तारे के साथ लेबल किया गया है। छवियों को कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके 40x उद्देश्य के साथ कैप्चर किया गया था, जेड-स्लाइस को हर 0.3 μm पर लिया गया था। 34 जेड-स्लाइस पूर्व-घायल (ए), 48 जेड-स्लाइस (बी) के बाद 3 घंटे, और 103 जेड-स्लाइस पोस्ट विच्छेदन, निर्धारण और धुंधला (सी) की अधिकतम तीव्रता अनुमानदिखाए गए हैं। सी में स्केल बार 25 μm है, जो ए-सी पर लागू होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: इमेजिंग एपिकल और एक घायल नोटम के बेसल पक्षों। एक ही घायल pupal notum सभी पैनलों में दिखाया गया है। घाव को एक लाल तारे के साथ चिह्नित किया गया है। नारंगी बिंदीदार रेखा घाव मार्जिन को इंगित करती है। (A-D) नोटम को एपिकल पक्ष से, छल्ली के माध्यम से चित्रित किया जाता है। (E-H) नोटम को बेसल इंटीरियर साइड से चित्रित किया गया है। (I-L) शीर्ष पैनल एक सफेद त्रिभुज द्वारा नामित उपकला शीट के साथ नोटम, एपिकल साइड अप की एक एक्स-जेड छवि दिखाते हैं। नारंगी रेखा एक्स-वाई स्लाइस के एपिकल-बेसल प्लेन को दर्शाती है, जो निचले पैनलों में दिखाया गया है। निचले पैनलों के भीतर, नारंगी रेखा उपरोक्त एक्स-जेड छवि के विमान को दिखाती है। (I) एपिकल रूप से चित्रित नोटम - एपिकल स्लाइस। शीर्ष एक्स-जेड दृश्य एपिकल उपकला शीट (सफेद त्रिकोण) की सटीक इमेजिंग दिखाता है। यह दृश्य लाइव इमेजिंग दृश्य के बराबर है. (जे) एपिकली इमेज्ड नोटम - बेसल स्लाइस, आंशिक रूप से एपिकल ऊतक द्वारा बाधित। पीले तीर (संभावित मांसपेशी बैंड) और सफेद तीर (संभावित रक्त कोशिकाओं) द्वारा निरूपित अन्य ऊतक बेसल पक्ष पर दिखाई देते हैं। (के) बेसली इमेज्ड नोटम - एपिकल स्लाइस, आंशिक रूप से बेसल ऊतक और घाव स्कैब (अंधेरे केंद्रीय क्षेत्र) द्वारा बाधित। (एल) बेसली इमेज्ड नोटम - बेसल स्लाइस। यह दृश्य सबसे अच्छा बेसल ऊतकों को पीले और सफेद तीर के साथ निरूपित दिखाता है। A,E: DAPI दाग, B,F: हिस्टोन-EGFP, C,G: FasIII धुंधला. छवियों को कताई डिस्क माइक्रोस्कोपी के साथ 20x उद्देश्य के साथ कब्जा कर लिया गया था। जेड-स्लाइस हर 0.9 μm लिया गया था। ए-डी 19 स्लाइस की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण को दर्शाता है। ई-एच 17 स्लाइस की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण का प्रतिनिधित्व करता है। D, H, L में 25 μm स्केल बार क्रमशः A-D, E-H, I-L पर लागू होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक फ़ाइल 1: समाधान और बफ़र्स की तैयारी। निम्नलिखित समाधानों के लिए व्यंजनों को विस्तृत किया गया है: 1xPBS, 1x PBST, अवरुद्ध समाधान, और पैराफॉर्मेल्डिहाइड फिक्सेटिव। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

महत्वपूर्ण कदम
तीन चरणों का अनुकूलन नाटकीय रूप से इस प्रोटोकॉल की सफलता में वृद्धि करेगा। सबसे पहले, चरण 1.5 में, कवरस्लिप पर लागू चिपकने वाले गोंद के साथ बख्शना हो। यदि बहुत अधिक चिपकने वाला गोंद जोड़ा जाता है, तो प्यूपे ठोस चिपकने वाले गोंद की एक मोटी परत में संलग्न हो सकता है, जो विच्छेदन को असंभव बना देगा, और यदि यह नोटम को कवर करता है, तो चिपकने वाला गोंद नमूने से प्रकाश को रोक देगा। दूसरा, चरण 2.3-2.6 के दौरान, केवल नोटम के शीर्ष गुंबद को हटाने के लिए सुनिश्चित करें, जितना संभव हो उतना पार्श्व ऊतक को छोड़कर। यदि शामिल किया जाता है, तो पार्श्व ऊतक बढ़ते समय संकुचित हो जाएगा और नोटम के मध्य को अंदर की ओर बकसुआ करने का कारण बन जाएगा, अक्सर इसे उच्च संख्यात्मक एपर्चर उद्देश्यों की काम करने की दूरी के बाहर रखा जाता है। तीसरा, सफाई चरण 2.9 के दौरान, मोनोलेयर उपकला को नुकसान न पहुंचाने के लिए अत्यधिक सावधानी बरती जानी चाहिए। यदि ऊतक में बड़े हिस्से गायब हैं या कोई संकेत नहीं पाया जा सकता है, तो इस चरण को दोष देने की संभावना है।

समस्या निवारण
मुद्दा 1: बढ़ते के बाद, प्यूपा विच्छेदन के दौरान डबल-साइडेड टेप से दूर आता है। यह एक आम मुद्दा है, खासकर शुरुआती लोगों के लिए। सबसे अच्छा उपाय यह सुनिश्चित करना है कि प्यूपे मामले का बाहर पूरी तरह से सूखा / खाद्य मलबे से मुक्त है। कुंद संदंश की एक जोड़ी के साथ भोजन को हटाने और मामले को 10-15 मिनट के लिए हवा सूखने की अनुमति देने से टेप का पालन करने में मदद मिलेगी। वैकल्पिक रूप से, विच्छेदन के दौरान टेप के खिलाफ प्यूपे को नीचे रखने के लिए गैर-प्रमुख हाथ और कुंद संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। यदि समस्या बनी रहती है, तो मामले के पीछे के अंत के आधार पर नेल पॉलिश की एक छोटी, 5-10 μL बूंद को लागू करना और इसे कठोर करने की अनुमति देना आमतौर पर प्यूपे के सबसे खराब के लिए भी पर्याप्त आसंजन प्रदान करता है।

समस्या 2: Notum चरण 2.3 के दौरान ढह जाता है, या integument के माध्यम से प्रारंभिक उल्लंघन चिकनी नहीं है। यदि इंटेग्यूमेंट का उल्लंघन करना मुश्किल है, तो स्थिरीकरण चरणों से बहुत अधिक चिपकने वाला गोंद हो सकता है। कम चिपकने वाला गोंद में विच्छेदित pupae रखने से इस मुद्दे में सुधार होगा। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि microdissection कैंची तेज हैं। ब्लंट कैंची इंटेग्यूमेंट में कटौती करने में सक्षम नहीं होगी और इसे अंदर की ओर गिरने का कारण बनती है। एक बार हेमोलिम्फ प्यूपे से बाहर निकल जाता है, तो सुनिश्चित करें कि काटने वाले ब्लेड में से एक नोटम को विकृत किए बिना प्यूपा में प्रवेश कर सकता है। यदि नोटम ढह जाता है और ब्लेड प्यूपा में प्रवेश नहीं करता है, तो तब तक स्निपिंग जारी रखें जब तक कि ब्लेड प्यूपे में प्रवेश न करे।

समस्या 3: चरण 2.4 के दौरान, कैंची पकड़ या integument खींचें। यदि कैंची इंटेग्यूमेंट को पकड़ना या खींचना शुरू कर देती है, तो यह अक्सर प्यूपे के विपरीत पक्ष पर स्विच करने में मदद करती है और इंटेगुमेंट को 'ढीला' करने के लिए आगे बढ़ती है। आगे कुंद microdissection कैंची यह integument के माध्यम से साफ कटौती प्राप्त करने के लिए मुश्किल बना देगा, और तेज कैंची का उपयोग किया जाना चाहिए।

समस्या 4: नमूना गलती से धुंधला (चरण 3.1-3.6) के दौरान aspirated है। विच्छेदित नोटम देखने के लिए चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह पारदर्शी है। इसके विपरीत प्रदान करने के लिए कवरस्लिप के नीचे एक गहरे नीले या काले रंग की चादर रखने में मदद मिल सकती है (एक पुराना पिपेट टिप धारक रैक अच्छी तरह से काम करता है। इसके अतिरिक्त, सभी समाधान परिवर्तनएक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत किए जा सकते हैं।

समस्या 5: कोई संकेत का पता नहीं चला है / पैची सिग्नल का पता चला है। दाग-विशिष्ट समस्याओं को खारिज करने के बाद, यदि कोई संकेत नहीं पाया जाता है या यह पैची है, तो चरण 2.9 (सफाई) संभवतः अपराधी है। एक अनुपस्थित या पैची सिग्नल सफाई के दौरान उपकला ऊतक की क्षति और हटाने से उत्पन्न हो सकता है। इसके विपरीत, एक खराब संकेत मांसपेशियों के बैंड / वसा शरीर की कोशिकाओं से रोड़ा के कारण हो सकता है यदि उन्हें हटाया नहीं जाता है, क्योंकि वे आसपास के ऊतकों के सापेक्ष नोटम में दाग और एंटीबॉडी के प्रसार को सीमित कर सकते हैं। यदि ऊतक क्षतिग्रस्त हो जाता है, तो सफाई के दौरान कोमल होना सबसे अच्छा समाधान है। यदि, इसके बजाय, दाग दिखाई देता है लेकिन पैची है, तो सफाई चरण के लिए समर्पित उत्साह / समय को बढ़ाने के लिए मांसपेशियों और वसा शरीर को जितना संभव हो उतना हटाने की सिफारिश की जाती है। इसके अलावा, दाग की अवधि बढ़ाने से बेहतर सफाई के साथ इस समस्या को हल करने में मदद मिल सकती है।

मुद्दा 6: नोटम ऊतक इमेजिंग के दौरान एक विकृत / झुर्रीदार उपस्थिति है। ऊतक का वार्पिंग और झुर्रियां दो स्रोतों से आती हैं। सबसे पहले, बढ़ते के दौरान नोटम को संपीड़ित करने से यह बकसुआ और ताना का कारण बनेगा। सबसे अच्छा समाधान जितना संभव हो उतना पार्श्व ऊतकों को हटाना है ताकि गुंबद जितना संभव हो उतना छोटा हो और कवरस्लिप स्पेसर्स के बीच फिट हो सके। दूसरा, यदि विच्छेदन के दौरान नोटम मुड़ा हुआ है, तो यह मोड़ बढ़ते समय सीधा नहीं होगा, इसलिए विच्छेदन के दौरान नोटम को ताना न देने के लिए अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए। नोटम का आकस्मिक झुकना सबसे आम है जब इंटेग्यूमेंट को बाकी प्यूपे से दूर काट दिया जाता है। यह विच्छेदन कैंची को प्यूपे के सापेक्ष एक कोण पर रखने के बजाय उन्हें नमूना विमान में pupae के रूप में रखने के लिए मोहक है। हालांकि, कोण वाली कैंची के कारण इंटेग्यूमेंट फ्लैट रहने के बजाय कटने पर ऊपर की ओर बकसुआ हो जाता है।

मौजूदा विधियाँ, सीमाएँ, और भविष्य के अनुप्रयोग
वांग एट अल.20 ने प्यूपल एपिथेलियम के अलगाव के लिए एक तुलनीय विच्छेदन प्रोटोकॉल की सूचना दी। इस तकनीक की आवश्यकता है कि प्यूपा अपने मामले में रहता है और तेजी से एक स्केलपेल के साथ विभाजित हो जाता है। यह प्रोटोकॉल पहले से लाइव-इमेज किए गए नमूनों के साथ असंगत है, क्योंकि लाइव इमेजिंग को प्यूपल मामले के एक बड़े खंड को हटाने की आवश्यकता होती है। क्योंकि प्यूपे में कठोरता की कमी होती है, इसलिए मामले के बाहर प्यूपल बाइसेक्शन ने ऊतक को उलझा दिया, इस प्रोटोकॉल के निर्माण को प्रेरित किया। यहां विस्तृत तकनीक नोटम के अलगाव और निर्धारण के लिए अनुमति देती है, और इसका उपयोग अन्य तरीकों की एक विस्तृत सरणी के लिए पहले चरण के रूप में किया जा सकता है जैसे कि क्रायोसेक्शनिंग, सीटू संकरण, या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में ।

इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, नोटम को विच्छेदन, फिक्सिंग और धुंधला करना नोटम में लाइव-इमेजिंग फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन की तुलना में अधिक समय लेने वाला है, जिसके लिए प्यूपल केस 9,23 को हटाने के लिए केवल एक साधारण विच्छेदन की आवश्यकता होती है। दूसरे, अन्य ड्रोसोफिला ऊतकों के विच्छेदन की तुलना में, पतले, नाजुक ऊतक और हाइड्रोफोबिक छल्ली के कारण यह विच्छेदन अधिक कठिन है। ड्रोसोफिला एपिथेलिया में प्रोटीन की कल्पना करने के लिए, निश्चित भ्रूण, लार्वा विंग डिस्क, या अंडाशय पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री आसान है। हालांकि, यह तकनीक लाइव इमेजिंग की शक्ति को फिक्सेशन और स्टेनिंग के साथ जोड़ी बनाने की अनुमति देती है, जिससे यह एक बार महारत हासिल करने के बाद एक शक्तिशाली उपकरण बन जाता है।

एक विच्छेदन / निर्धारण तकनीक के लाइव इमेजिंग पर कुछ फायदे हैं। बेसल (इंटीरियर) संरचनाओं को बेसल दृश्य (चित्रा 5एल, जे) के साथ बेहतर ढंग से हल किया जा सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, लाइव इमेजिंग फ्लोरोफोरस तक सीमित है जिसे आनुवंशिक रूप से आपूर्ति की जानी चाहिए, अक्सर लंबी आनुवंशिक क्रॉसिंग योजनाओं की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, वर्तमान प्रोटोकॉल दाग, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और अन्य तकनीकों के आवेदन की अनुमति देता है, जिन्हें विच्छेदन और निर्धारण की आवश्यकता होती है। यह नाटकीय रूप से ऊतक में जांच किए गए संकेतों की संख्या को बढ़ाता है, जबकि संभावित रूप से प्रयोगात्मक परिणामों के लिए समय को कम करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक डॉ एम शेन हटसन को पिल्ला घाव के लिए उपयोग की जाने वाली लेजर एब्लेशन प्रणाली की स्थापना के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं और प्रोटोकॉल विकसित करने पर उनके योगदान और प्रतिक्रिया के लिए। इस काम को 1R01GM130130 द्वारा APM और M. शेन हट्सन को समर्थित किया गया था। JW 2T32HD007502-21 द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
½” Scotch Permanent Double-Sided tape Scotch 3M 665
0.1-10 µL uTIP pipette tip Biotix M-0011-9FC
22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips Thomas Scientific 1207Z28
24 x 60 mm coverslip Corning 2980-246
3M VetBond 3M 1469SB Called "adhesive glue" in protocol
Anti-FasIII primary Mouse IgG2a Developmental Studies Hybridoma Bank 7G10
Calcium Chloride Fisher Chemical c79-500
Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a Jackson ImmunoResearch 115-165-206
DAPI Sigma Aldrich D9542-1mg
Dumont #5 Fine Tip Forceps Fine Science Tools No. 11254-20
Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt Fine Science Tools No. 11254-20 Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone
Fisherbrand Double frosted microscope slides Fisher Scientific 22-034-486
Fluorescent Light Source Lumencor Celesta 90-10512
Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A Bloomington Drosophila Stock Center 24163
Fly Vial Foam Plugs "Flugs" Genesee Scientific 49-101
Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water Cole-Parmer 759075D A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water.
KimWipe KimTech 34155 Called "Absorbent Tissue" in protocol
Nikon Ti2 Eclipse Nikon Eclipse Ti2-E
NIS Elements Software Nikon AR
Parafilm Pechiney Plastic Packaging PM-996
Paraformaldehyde (PFA) 16% Ted Pella, Inc 18505
Plastic Vials Genesee Scientific 32-114
Sodium Azide (NaN3) Fisher Scientific 19038-1000
Stereo Microdissection Scope Carl Zeiss STEMI 2000
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-00 New or freshly sharpened scissors
Vecta Shield Vector Laboratories H-1000 Called " antifade mounting medium" in protocol
Vecta Shield with DAPI Vector Laboratories H-1200 Not ideal for pupal notum.
X-Light V2 Spinning Disc Crest Optics V2 L-FOV

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References

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जीव विज्ञान अंक 182 ड्रोसोफिला प्यूपा नोटम विच्छेदन निर्धारण इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री एपिथेलिया घायल मरम्मत
विच्छेदन, फिक्सिंग, और <em>ड्रोसोफिला</em> Pupal Notum visualizing
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White, J. S., LaFever, K. S., Page-McCaw, A. Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum. J. Vis. Exp. (182), e63682, doi:10.3791/63682 (2022).

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