Summary
본 프로토콜은 초파리 번데기 노툼의 고정 조직의 준비 및 시각화를 자세히 설명합니다. 그것은 손상되지 않았거나 상처 입은 조직에 사용할 수 있으며 조직의 원래 구조는 보존됩니다. 해부, 고정 및 염색 절차는 모두이 기사에서 설명합니다.
Abstract
Drosophila melanogaster의 번데기는 변형 중에 며칠 동안 움직이지 않으며, 그 동안 얇은 투명한 성인 외피를 가진 새로운 몸을 개발합니다. 그들의 부동성과 투명성은 생체 내 라이브 이미징 실험에 이상적입니다. 많은 연구가 번데기 노툼의 등쪽 상피 단층에 초점을 맞추었는데, 그 이유는 접근성과 상대적으로 큰 크기 때문입니다. 상피 역학 및 발달에 대한 연구 외에도, notum은 상처 치유를 연구하는 데 이상적인 조직이었습니다. 부상 후, 전체 상피 복구 과정은 6-12 시간 이상의 라이브 이미징으로 캡처 할 수 있습니다. 라이브 이미징을위한 notum의 인기에도 불구하고, 고정 된 notum 샘플을 활용 한 출판 된 연구는 거의 없습니다. 고정 및 염색은 거의 모든 다른 초파리 조직에 대한 일반적인 접근법으로, 간단한 세포 얼룩 및 항체의 큰 레퍼토리를 활용합니다. 그러나 번데기 노툼은 깨지기 쉽고 몸에서 제거 한 후 말리거나 왜곡되기 쉽기 때문에 라이브 이미징을 보완하기가 어렵습니다. 이 프로토콜은 번데기 노텀을 손상되지 않고 레이저 상처 후에 고정하고 염색하는 간단한 방법을 제공합니다. 이 기술을 사용하면 번데기의 복부 쪽을 덮개 슬립에 붙여서 번데기를 고정시키고 유골을 조심스럽게 제거하고 고정하고 얼룩 지게합니다. notum 상피는 슬라이드 또는 두 개의 커버 슬립 사이에 장착되어 조직의 등쪽 또는 복부 쪽에서 이미징을 용이하게합니다.
Introduction
Drosophila melanogaster의 번데기 notum은 동물이 움직이지 않고이 단계에서 투명한 큐티클을 가지고 있기 때문에 지난10 년 동안 라이브 이미징 연구에 점점 더 많이 사용되었습니다 1,2,3,4,5,6,7. 그러나 번데기 노툼은 해부하고 고치는 것이 어렵 기 때문에 항체 및 세포 염색으로 라이브 이미징 연구를 보완하기가 어렵습니다. 이 작업의 전반적인 목표는 새로운 또는 이전에 살아있는 이미지 샘플에서 항체 및 세포 염색에 대한 번데기 노툼을 해부하고 고정하기위한 재현 가능한 프로토콜을 만드는 것입니다.
유충이 변태를 시작함에 따라, 표피는 애벌레 큐티클에서 벗어나 단단한 번데기 케이스8을 형성합니다. 애벌레 몸 계획이 무너지고 새로운 성인 신체 계획이 개발됩니다. 이 기간 동안 번데기는 움직이지 않아 라이브 이미징에 이상적입니다. 일반적으로 이미지화 된 조직 중 하나는 번데기 노툼, 등쪽 흉부에서 형성되는 성인 단층 상피입니다. 노툼은 번데기 케이스(9)를 제거하기 위한 간단한 해부 후에 시각적으로 접근할 수 있다. 그런 다음 전체 동물을 장착 할 수 있으며 노툼은 몇 시간 또는 며칠 동안 살아있는 이미징 될 수 있으므로 발달, 항상성 및 상처 10,11,12,13,14 이후의 상피 세포 행동을 연구하는 데 이상적인 조직입니다. 그러나 notum은 깨지기 쉽고 소수성 인 얇은 투명한 성인 큐티클로 덮여 있기 때문에 해부하고 고치는 것이 어렵습니다. 이 소수성 큐티클은 신체의 나머지 부분에서 제거 할 때 수용액에서 말리는 경향이 있습니다. 따라서, 노툼 해부 및 고정은 드물게 보고되었으며, 해부(15,16,17,18)는 종종 기술되지 않는다. 문헌에 상세한 프로토콜이 없다면, Drosophila 연구원이 번데기 염색으로 라이브 이미징을 보완하는 것은 엄청나게 어렵습니다.
이 기술은 레이저 부상을 포함하여 이전에 생중계 된 샘플을 재현 가능하게 해부하고 수정하는 것을 목표로합니다. 라이브 이미징은 번데기 케이스의 제거가 필요하기 때문에,이 해부 기술은 번데기 케이스 4,19,20 내에서 번데기를 고정하거나 양분하는 이전의 프로토콜과 달리 전방 번데기 케이스를 제거하는 것으로 시작됩니다. notum은 깨지기 쉬운 조직이며, 상처는 취약성을 악화시킬 수 있습니다. 따라서이 섬세한 조직을 지원하기 위해 노툼의 외피 (상피 및 부착 된 투명한 성인 큐티클)와 머리와 복부의 일부는 번데기의 나머지 부분으로부터 멀리 해부되고 항상 수성 환경에 잠겨 있습니다. 이 방법은 조직이 말리고 사용할 수 없을 가능성을 줄입니다. 이 기술은 상처 후 30 분 (그림 1E-H) 및 상처 후 3 시간 (그림 1I-L)에서 상처 입은 노툼 조직을 성공적으로 염색했습니다. 이 프로토콜은 notum 발달 또는 상처 복구 기간 동안 효과적 일 것으로 예상됩니다. 현재의 기술은 번데기 노툼의 라이브 이미징 기능을 사용 가능한 면역 조직 화학 시약의 풍부함과 결합하고자하는 연구원에게 도움이 될 것입니다.
Protocol
초파리 멜라노가스터 (초파리)는 표준 옥수수밀-당밀 배지 상에서 25°C로 유지되었다. 연구는 EGFP 태깅된 히스톤 H2A 번데기(w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). 파리는 공공 재고 센터에서 구입했습니다 ( 자료 표 참조).
1. 번데기 고정화
- 2" 스트립의 양면 테이프를 현미경 슬라이드에 바릅니다.
- 25°C에서 상승된 바이알에서 백색 prepupae를 확인하고, 마커를 사용하여 바이알 외부의 그들의 위치를 표시한다. 바이알을 25°C로 되돌립니다.
참고 : 흰색 prepupae는 부동성, 흰색 색상 및 상한 나선형이 특징입니다. 이들은 번데기 형성 (APF) 또는 단계 P18 후에 0-1 h를 형성한다. - 12-15 시간 후, 해부 범위를 사용하여 표시된 번데기 3-4 개를 조심스럽게 제거하고 테이프 옆의 현미경 슬라이드에 수집하십시오.
참고 : 번데기는 이제 번데기의 앞쪽 끝8에서 볼 수있는 상한 머리 낭이있는 P5 단계가 될 것입니다. - 번데기를 적어도 하나의 번데기 너비를 복부 측면을 아래로 내려 테이프 위에 놓습니다.
- 접착제 한 방울을 파라핀 필름 ( 재료 표 참조) 또는 원심 분리기 튜브 뚜껑에 놓습니다. 0.1-10 μL 피펫 팁(피펫 없음)의 끝을 접착제 방울에 담그십시오. 모서리에서 1cm x 1cm 떨어진 24mm x 60mm (1.5 두께) 커버 슬립에 피펫 팁을 두 번 탭하여 번데기 길이의 ~ 1/2 접착 접착제 라인을 만듭니다.
- 0.2-2 μL(P2) 피펫을 2 μL로 미리 설정하고, 200 μL(P200) 피펫을 200 μL로 미리 설정하고, 이들이 1x PBS + 0.1 mMCa2+로 충전될 준비가 되도록 팁으로 맞추고, 이는 접촉시 접착제를 신속하게 고형화시킬 것이다.
- 포셉( 재료 표 참조)을 머리 측면 근처에 삽입하고 케이스를 앞쪽에서 뒤쪽으로 부드럽게 분리합니다(9). 가능한 한 많은 케이스를 제거하십시오. 한 쌍의 무딘 포셉으로 번데기의 발달하는 다리를 잡고 조심스럽게 번데기를 케이스에서 당깁니다.
참고 : 번데기의 복부 부분에 작은 파열이이 절차에 해롭지 않습니다. - 번데기를 커버 슬립의 구석에 놓습니다.
- 후부 복부의 번데기 또는 무딘 포셉으로 발달하는 날개를 잡고 들어 올리고 번데기의 복부 쪽을 접착제 라인에 내려 놓습니다.
- P2 피펫을 2 μL의 1x PBS + 0.1 mM의Ca2+ 로 빠르게 채우고, 이를 공기 중에 유지하고, 팁(0.25-0.5 μL)에서 작은 기포를 형성하기에 충분히 충분히 배출한다.
- 흉부 바닥에있는 번데기의 한쪽면에 용액의 작은 거품을 만진 다음 다른쪽에서 반복하십시오.
참고 : 이것은 번데기를 제자리에 고정시키기 위해 소량의 접착제를 굳히게됩니다. 일반적으로 모든 솔루션은 사용되지 않습니다. - P200 피펫을 200 μL의 1x PBS + 0.1 mM의Ca2+로 채운 다음, 피펫의 끝을 흉부 위에 놓고 내용물을 배출하여 번데기를 완전히 잠수시킨다. 접착제의 나머지 부분은 즉시 응고됩니다.
- PBS 용액을 ~100 μL로 제거하여 번데기가 다음 단계로 즉시 진행하기 전에 간신히 잠기도록하십시오.
참고: 상처 입지 않은 샘플의 경우 1.1단계부터 시작하십시오. 상처 입은 부분적으로 해부된 샘플의 경우, 단계 1.5에서 시작한다. 레이저 절제를 통한 상처는 이전에14,21 기술되었다. 고정, 해부 및 장착 단계는 해부 현미경을 사용하여 수행해야합니다.
2. 노텀 해부
- 핸들의 한쪽을 지배적인 손의 검지 손가락과 가운데 손가락에 대고 구부리는 한 쌍의 미세 해부 가위를 잡으면 지배적인 손의 엄지 손가락이 절삭력을 가합니다(그림 2A,B).
- 비 지배적 인 손의 가운데 손가락에 대해 가위의 목을 안정시키고 비 지배적 인 손의 반지 손가락으로 커버 슬립을 구부리십시오.
- 등쪽 복부의 중앙을 저격하여 ~ 0.2-0.5mm의 작은 구멍을 만듭니다. 일부 용혈림프는 일반적으로 쏟아져 나오며 위반의 좋은 지표입니다.
- 후방에서 전방으로 외피를 통해 0.5-0.75mm의 작은 컷을 만들고 등쪽 조직을 감싸서 분리하십시오. 가능한 한 평평한 조직을 만들려면 너무 심실로 절단하지 마십시오. 흉부의 등쪽 '돔'만 머리와 복부의 작은 부분과 함께 제거해야합니다.
- 번데기의 다른쪽에있는 앞쪽 상처에 후방을 반복하십시오.
- 필요한 경우 헤드를 깨끗하게 절단할 수 있도록 해부 단계를 회전시킵니다.
참고 :이 단계에서 등쪽 외피 또는 notum은 번데기의 나머지 부분과 분리됩니다. 분리 된 것처럼 보이지만 쉽게 움직이지 않으면 notum 아래의 몇 컷이 그것을 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. - 커버슬립의 중앙에 ~200μL의 1x PBS를 추가하고 피펫 팁을 커버 글래스를 가로질러 새 액적에서 원본으로 부드럽게 드래그하여 원래의 해부 액적에 연결하는 채널을 만듭니다.
- 한 쌍의 무딘 포셉을 사용하여 분리 된 노텀을 커버 슬립의 중심으로 부드럽게 밀거나 드래그하고 회전하여 내부 측면이 위쪽을 향하게합니다. 물방울에서 조직을 제거하지 마십시오.
참고 : 나중에 이미징하는 동안 접착 접착제의 잔해가 샘플을 가리는 것을 피하기 위해 노툼을 원래 해부 부위에서 멀리 이동해야합니다. - 무딘 포셉으로 노텀을 내려 복부 또는 머리 부분을 눌러 누릅니다. 한 쌍의 날카로운 포셉 및/또는 200μL 피펫에서 1x PBS의 부드러운 배출을 사용하여 남아있는 지방체, 근육 밴드 또는 용혈림프(존재하는 경우)를 제거하여 단층 상피를 완전히 노출시키고 최종 염색을 더욱 균일하게 만듭니다. 해부된 노툼은 도 3A와 같이 나타나야 한다.
- 조직이 깨끗해지면 200 μL 피펫을 사용하여 PBS 용액 (번데기의 파편 및 복부 부분과 함께)을 가능한 한 많이 제거하고 노툼을 흡입하지 않도록 해부 범위로 모니터링하십시오.
- 대부분의 액체가 제거되면 흡수 조직을 사용하여 접착제와 번데기의 나머지 부분뿐만 아니라 커버 슬립에 남아있는 다른 파편을 조심스럽게 닦아냅니다.
참고 : 일부 접착 접착제가 커버 슬립에 남아 있으면 등쪽 조직 자체보다 얇은 한 문제가 발생하지 않습니다. - 150-200 μL의 4 % PFA (1x PBS 중)를 넣고 실내 온도에서 20 분 동안 고정하십시오. 해부 속도에 따라 첫 번째 번데기가 고정되는 동안 1 개 이상의 번데기를 해부 할 수 있습니다.
- PFA를 제거하고 이를 1x PBS로 교체하여 30초 동안 노툼을 1회 세척한다.
- 항체 염색을 진행하는 경우, 항원이 세포내 있는 경우 조직에 투과하기 위해 1x PBS 또는 1x PBST(보충 파일 1)에서 5분 세척(3회)을 수행하십시오.
- 샘플을 가습된 챔버에서 하룻밤 동안 1x PBS + 0.02%NaN3 에 저장하거나, 조직을 염색할 계획인 경우, 블로킹 용액에서 밤새 인큐베이션한다(보충 파일 1).
3. 노텀 염색
참고: 항체 또는 세포 얼룩을 이용한 염색의 경우 아래 단계를 따르십시오. - 노툼은 용액에서 제거해서는 안되며, 이로 인해 조직이 말릴 가능성이 큽니다. 따라서, 염색 프로토콜이 커버슬립 상에서 전적으로 수행되도록 적응시키고, 5분 이상 임의의 단계 동안 가습된 챔버에 보관한다. 해부 현미경으로 샘플을 모니터링하면 세척 중 조직의 우발적 인 흡인을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 세포 경계를 시각화하기 위해, 4°C에서 하룻밤 동안 블로킹 버퍼 + 0.02%NaN3에 희석된 1:8 농도에서 200 μL의 항-FasIII 일차 마우스 IgG2a 항체 (물질 표 참조)에서 인큐베이션한다.
- 과량의 일차 항체 (3회)를 실온에서 세척 당 1시간 동안 200 μL의 1x PBS + 0.02%NaN3 로 세척한다.
- 블로킹 완충액 + 0.02%NaN3 중의 1:200 농도의 항-마우스 IgGa2 200 μL와 함께 실온에서 2시간 동안 2차 항체 인큐베이션을 수행한다.
- 과량의 이차 항체 (3배)를 실온에서 세척 당 1 h 동안 200 μL의 1x PBS + 0.02%NaN3 로 세척한다.
- 핵을 시각화하기 위해, 얼룩이 근육 밴드를 통해 침투하기에 충분한 시간을 허용하기 위해 45분 동안 1 μg/mL의 DAPI에서 샘플을 인큐베이션한다; DAPI 함유 장착 매질에서의 고정은 이러한 조직에는 효과적이지 않다.
- 실온에서 세척 당 5분 동안 200 μL의 1x PBS + 0.02% NaN3로 과량의 DAPI (3 회)를 세척한 다음, 4°C에서 하룻밤 동안 1x PBS + 0.02%NaN3 의 200 μL에 두거나, 즉시 장착한다.
4. 노텀 장착 및 시각화
- 염색 후, 지지체로 새로운 24 × 60 커버슬립 (토퍼)을 준비하십시오.
참고 : notum은 돔 모양이기 때문에 완전히 평평하게하면 주름진 조직이 왜곡됩니다. 두 커버슬립 사이에 간격을 만들면 노텀이 정상적인 모양을 유지할 수 있습니다. - 토퍼 중앙에 매니큐어로 ~1cm 떨어진 곳에 부착한 22 x 22 커버슬립(0번 두께, ~100μm 두께)으로 만든 스페이서를 사용하여 ~200μm의 틈새를 만듭니다.
- 접착하려면 스페이서를 토퍼에 놓고 스페이서의 원위 가장자리를 얇은 매니큐어 층으로 칠하십시오. 말리십시오.
참고 : 얇고 콧물이있는 매니큐어 만 사용하십시오. 두꺼운 매니큐어는 커버 슬립과 토퍼 사이에 불필요한 추가 공간을 추가합니다. - 시료에서 가능한 한 많은 수용액을 제거하십시오.
- 즉시 두 방울 (~ 100 μL)의 페이드 방지 장착 배지 ( 재료 표 참조)를 샘플에 적용하십시오.
- 필요한 경우 깨끗하고 날카로운 포셉을 사용하여 페이드 방지 장착 매체 액적의 중앙에 노텀을 배치하십시오.
- 노툼이 있는 커버슬립을 얇은 폼 조각(커버슬립 박스 내부의 포장재에서 잘라내기)과 같은 ~10 x 40mm 지지대 위에 올려 놓고 시료가 작업 표면에 부착되지 않도록 상승시킵니다.
- 해부 범위 아래에서 토퍼를 샘플에 천천히 내립니다. 페이드 방지 장착 매체가 토퍼를 만나면 부드럽게 풀고 모세관 작용으로 토퍼를 아래로 당깁니다.
참고: 처음 몇 초 이내에 노텀을 손상시키지 않고 커버슬립 위치를 약간 조정할 수 있습니다. - 다른 거품 조각을 토퍼 위에 놓고 표준 현미경 슬라이드를 무게로 사용하여 샘플 커버슬립, 토퍼 및 스페이서 사이에 페이드 방지 장착 매체를 부드럽게 동축시킵니다.
- 5-10분 후, 흡수 조직을 사용하여 커버슬립의 가장자리를 부드럽게 만져서 과도한 페이드 방지 장착 매체를 윅 제거합니다.
- 커버 슬립의 각 모서리에 매니큐어를 부드럽게 발라서 함께 부착하십시오. 일단 건조되면 커버 슬립의 모든 가장자리를 밀봉하도록 페인트하십시오. 모든 가장자리를 먼저 코팅하지 마십시오.이 경우 종종 커버 슬립을 이동시키고 등쪽 조직을 손상시킬 수 있습니다.
- 등쪽 및 / 또는 복부 측을 통해 형광 현미경 검사 ( 재료 표 참조)에서 노툼을 시각화하십시오.
Representative Results
제시된 기술은 상처 없는 노툼(도 1A-D)에서 잘 작동하여, 조직의 발달 및 항상성, 예를 들어, 다발성 중추감각 강모 세포(18)의 형성, 또는 상피 세포(10)의 후부 유동에 대한 전방의 형성을 허용한다. 이 프로토콜은 레이저 절제 노툼 (도 1E-L)에도 적용 가능하며, 손상에 대한 세포 반응은 Histone2-EGFP와 같은 내인성 형광단으로 생방송으로 분석 될 수 있습니다 (그림 1B, F, J). 면역조직화학을 이용한 염색 후(단계 3)는 세포 경계를 표지하는 파시클린 III와 같은 많은 특징을 나타낼 수 있다(도 1C, G, K). 추가적으로, DAPI (도 1A, E, I)와 같은 정량적 염색은 상처 유발 폴리플로이드22를 포함하는 DNA 함량 변화를 평가하는데 사용될 수 있다.
현재의 프로토콜은 장기 라이브 이미징 실험 후에 사용될 수 있기 때문에 특히 유익하다. 번데기는 움직이지 않기 때문에 몇 시간 동안 이미징 할 수 있습니다 (그림 4A, B). 중요하게도, 이 프로토콜은 해부 후 상처 상피의 전체 구조 또는 형태학에 상당한 변화를 일으키지 않는다는 것이다(그림 4B,C). 따라서, 조직 내의 특징은 장기간 영상화될 수 있고, 이어서 면역조직화학 또는 세포 염색으로 추가로 조사될 수 있었다.
조직 내 깊은 곳에서 이미징하는 것은 불투명도로 인해 복잡하며, 초파리는 왁스 큐티클8에 코팅되어 깊은 이미징을 더욱 어렵게 만듭니다. 그러나, 이 기술을 이용하면, 해부된 노툼을 두 개의 커버슬립 사이에 배치할 수 있어서, 양쪽에서 상피 단층의 이미징을 가능하게 할 수 있다: 큐티클을 통한 정점 측면(그림 5A-D) 및/또는 체강을 향하는 상피의 기저면(그림 5E-H). 이러한 다양한 뷰는 조직 내의 다른 구조를 시각화하는 데 이상적입니다. 예를 들어, 정점 뷰는 표피 바로 아래에있는 상피 세포 경계와 핵을 시각화하는 데 이상적입니다 (그림 5A-D). 기본 뷰에서는 이러한 정점 신호가 덜 보입니다(그림 5E-H). 그러나 상처 여백에서 기저 구조가 관찰됩니다 (그림 5J, L 노란색, 흰색 화살표). 이 기저 구조는 정점보기보다 기저부에서 폐색이 적기 때문에 훨씬 밝습니다.
그림 1: 해부, 고정 및 염색된 초파리 번데기 노타. (A-D) 상처 없는 노툼. (E-H), 레이저 절제 후 30분 후에 부상당한 노툼. (I-L) 레이저 절제 후 3 시간 동안 부상을 입었습니다. (A, E, I) DAPI 염색은 핵을 나타낸다. (B, F, J) 라이브 이미징에 사용되는 형질전환 Histone2-EGFP는 고정 및 염색 후에 볼 수 있습니다. (C, G, K) 항-FasIII 항체는 항체 염색이 고정된 노툼에서 잘 작용한다는 것을 보여준다. (D, H, L) 병합된 이미지. 이미지는 회전 디스크 현미경을 사용하여 40x 대물로 캡처되며, Z 스택의 최대 강도 투영은 0.3μm Z 슬라이스로 표시됩니다. A-D는 263개의 Z-슬라이스를 나타냅니다. E-H는 195개의 슬라이스를 나타낸다. I-L은 53개의 Z-슬라이스를 나타낸다. 주황색 파선은 상처 여백을 나타냅니다. L의 스케일 바는 25 μm이며 A-L에 적용 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 노툼 해부를 위한 손 배치. (A-B) 미세 해부 가위를 잡기 위한 손 배치의 왼쪽 및 오른쪽 보기. 손이 흔들리는 것을 방지하기 위해 가위의 목을 비 지배적 인 손의 가운데 손가락에 놓습니다. 가위는 노툼 조직의 뒤틀림을 피하기 위해 현미경 슬라이드와 평행해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 정확하게 해부된 노툼 대 구부러진 노툼. (A) 번데기 노툼 후 해부 및 청소 후 말리지 않고 고정 준비. (B) 번데기 노툼은 1x PBS에서 제거 된 후 스스로 구부러져 사용할 수 없게되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 사전 고정 이미지와 사후 고정 이미지는 대체로 유사합니다. 핵에서 Histone2-EGFP를 발현하는 번데기 노툼을 (A) 절제 전에 살고, (B) 레이저 절제 후 3시간 후에 영상화하였다. (C) 노툼은 프로토콜에 언급된 바와 같이 검색, 해부 및 고정되었고, 고정 후 다시 이미지화되었다. 상처 부위는 붉은 별표로 표시되어 있습니다. 이미지는 방사 디스크 현미경을 사용하여 40x 대물로 캡처되었고, Z-슬라이스는 0.3 μm마다 촬영되었다. 34개의 Z-슬라이스 전감(A), 48개의 Z-슬라이스 3시간 후 상처(B), 및 해부, 고정 및 염색 후 103개의 Z-슬라이스(C)의 최대 강도 돌기가 도시되어 있다. C의 스케일 바는 25 μm이며 A-C에 적용 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 상처 입은 노텀의 정점 및 기저 측면 이미징. 동일한 부상당한 번데기 노툼이 모든 패널에 표시됩니다. 상처는 붉은 별표로 표시됩니다. 주황색 점선은 상처 여백을 나타냅니다. (A-D) 노툼은 정점 쪽에서 큐티클을 통해 이미지화됩니다. (E-H) 노툼은 기저 내부 측면에서 이미지화됩니다. (I-L) 상단 패널은 노툼의 X-Z 이미지를 보여 주며, 정점 쪽은 위쪽으로, 상피 시트는 흰색 삼각형으로 지정되어 있습니다. 주황색 선은 아래쪽 패널에 표시된 X-Y 슬라이스의 정점-기저 평면을 나타냅니다. 아래쪽 패널 내에서 주황색 선은 위의 X-Z 이미지의 평면을 표시합니다. (I) Apically imaged notum - apical slice. 상단 X-Z 뷰는 정점 상피 시트 (흰색 삼각형)의 정확한 이미징을 보여줍니다. 이 뷰는 라이브 이미징 뷰와 동일합니다. (J) Apically imaged notum - 기저 슬라이스, 부분적으로 정점 조직에 의해 막힌. 노란색 화살표 (가능한 근육 밴드)와 흰색 화살표 (가능한 혈액 세포)로 표시된 다른 조직은 기저면에서 볼 수 있습니다. (K) Basally imaged notum - 정점 조각, 부분적으로 기저 조직과 상처 딱지 (어두운 중앙 영역)에 의해 막혀 있습니다. (L) Basally imaged notum - basal slice. 이 뷰는 노란색과 흰색 화살표로 표시된 기저 조직을 가장 잘 보여줍니다. A,E: DAPI 염색, B,F: 히스톤-EGFP, C,G: FasIII 염색. 이미지는 회전하는 디스크 현미경으로 20x 대물로 캡처되었습니다. Z-슬라이스는 0.9 μm마다 취하였다. A-D는 19개의 슬라이스의 최대 강도 투영을 보여줍니다. E-H는 17개의 슬라이스의 최대 강도 투영을 나타낸다. D,H,L 의 25μm 스케일 바는 각각 A-D, E-H, I-L에 적용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 용액 및 버퍼 준비. 다음 솔루션에 대한 조리법은 자세히 설명되어 있습니다 : 1xPBS, 1x PBST, 블로킹 용액 및 파라 포름 알데히드 고정제. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
중요한 단계
세 단계를 최적화하면 이 프로토콜의 성공이 크게 향상됩니다. 먼저, 단계 1.5에서, 커버슬립에 도포된 접착제로 보존한다. 너무 많은 접착 접착제가 첨가되면 번데기가 고형화 된 접착 접착제의 두꺼운 층에 묻혀 해부가 불가능해질 수 있으며 notum 자체를 덮으면 접착제 접착제가 샘플의 빛을 차단합니다. 둘째, 2.3-2.6 단계에서 가능한 한 많은 측면 조직을 제외한 노텀의 상단 돔 만 제거해야합니다. 포함 된 경우, 측면 조직은 장착 중에 압축되어 노툼의 중간이 안쪽으로 휘어지게하여 종종 높은 수치 조리개 목표의 작동 거리 외부에 배치됩니다. 셋째, 세척 단계 2.9 동안, 단층 상피를 손상시키지 않도록 극도의주의를 기울여야합니다. 조직에 많은 부분이 누락되었거나 신호를 감지 할 수없는 경우이 단계가 비난받을 수 있습니다.
문제 해결
문제 1 : 장착 후, 번데기는 해부 중에 양면 테이프에서 멀어집니다. 이것은 특히 초보자에게 공통적 인 문제입니다. 가장 좋은 치료법은 번데기 케이스의 외부가 완전히 건조하거나 음식물 찌꺼기가 없는지 확인하는 것입니다. 한 쌍의 무딘 포셉으로 음식을 제거하고 케이스를 10-15 분 동안 공기 건조시키는 것은 테이프를 부착하는 데 도움이됩니다. 또는 비 지배적 인 손과 한 쌍의 무딘 포셉을 사용하여 해부 중에 번데기를 테이프에 대고 고정하십시오. 문제가 지속되면 케이스의 후부 끝 바닥에 5-10 μL의 작은 매니큐어 방울을 적용하고 경화시킬 수있게하면 일반적으로 번데기의 가장 무례한 경우에도 충분한 접착력을 제공합니다.
문제 2: 2.3단계에서 노텀이 붕괴되거나 외피를 통한 초기 위반이 원활하지 않습니다. 외피가 위반하기 어려운 경우 고정화 단계에서 접착제가 너무 많을 수 있습니다. 해부 된 번데기를 덜 접착 접착제에 넣으면이 문제가 개선됩니다. 또한 미세 해부 가위가 날카로운지 확인하십시오. 무딘 가위는 외피에 절단 할 수 없으며 안쪽으로 붕괴되는 경향이 있습니다. 일단 용혈림프가 번데기에서 쏟아져 나오면, 절단 블레이드 중 하나가 노툼을 변형시키지 않고 번데기에 들어갈 수 있는지 확인하십시오. 노툼이 붕괴되고 블레이드가 번데기에 들어 가지 않으면 블레이드가 번데기에 들어갈 때까지 저격을 계속하십시오.
문제 3: 2.4단계에서 가위가 외피를 잡거나 드래그합니다. 가위가 외피를 잡거나 끌기 시작하면 번데기의 반대편으로 전환하여 외피를 '느슨하게'진행하는 것이 종종 도움이됩니다. 더 무딘 미세 해부 가위는 외피를 통해 깨끗한 절단을 달성하기가 어렵고 날카로운 가위를 사용해야합니다.
문제 4: 염색 중에 샘플이 실수로 흡인됩니다(단계 3.1-3.6). 해부 된 노툼은 투명하기 때문에 보는 것이 어렵습니다. 대비를 제공하기 위해 커버슬립 아래에 진한 파란색 또는 검은색 시트를 놓는 것이 도움이 될 수 있습니다(오래된 피펫 팁 홀더 랙이 잘 작동합니다). 또한 모든 용액 변경은 해부 현미경으로 수행 할 수 있습니다.
문제 5: 신호가 감지되지 않거나 패치가 있는 신호가 감지되지 않습니다. 얼룩 관련 문제를 배제 한 후 신호가 감지되지 않거나 패치가 있으면 2.9 단계 (청소)가 범인일 가능성이 큽니다. 부재 또는 패치 신호는 청소 중 상피 조직의 손상 및 제거로 인해 발생할 수 있습니다. 반대로, 불량한 신호는 근육 밴드 / 지방 신체 세포가 제거되지 않으면 주변 조직에 비해 얼룩과 항체의 유골로의 확산을 제한 할 수 있기 때문에 폐색으로 인해 발생할 수 있습니다. 조직이 손상된 경우 청소하는 동안 더 부드럽게하는 것이 가장 좋은 해결책입니다. 대신 얼룩이 보이지만 패치가 많은 경우 청소 단계에 전념하는 활력 / 시간을 늘리면 가능한 한 많은 근육과 지방을 제거하는 것이 좋습니다. 또한, 얼룩 지속 시간을 늘리면 더 나은 청소로이 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.
문제 6: 이미징 중에 노툼 조직이 뒤틀리거나 주름진 모양입니다. 조직의 뒤틀림과 주름은 두 가지 근원에서 비롯됩니다. 첫째, 장착 중에 노툼을 압축하면 버클과 워프가 발생합니다. 가장 좋은 해결책은 돔이 가능한 한 짧고 커버 슬립 스페이서 사이에 들어갈 수 있도록 가능한 한 많은 측면 조직을 제거하는 것입니다. 둘째, 해부 중에 노툼이 구부러진 경우,이 굴곡은 장착 중에 곧게 펴지지 않으므로 해부 중에 노텀이 뒤틀리지 않도록 특별한주의를 기울여야합니다. notum의 우발적 인 굽힘은 번데기의 나머지 부분으로부터 외피를 절단 할 때 가장 흔합니다. 번데기처럼 샘플 평면에 보관하는 대신 번데기에 비해 해부 가위를 비스듬히 두는 것이 유혹적입니다. 그러나 각진 가위는 평평하게 유지되는 대신 절단 할 때 외피가 위쪽으로 구부러지게합니다.
기존 방법, 제한 사항 및 향후 응용 프로그램
Wang et al.20 은 번데기 상피의 분리에 대한 비교 가능한 해부 프로토콜을보고했다. 이 기술은 번데기가 케이스 내에 남아 있고 메스로 빠르게 양분되어야합니다. 이 프로토콜은 라이브 이미징이 번데기 케이스의 큰 부분을 제거해야하기 때문에 이전에 라이브 이미지 샘플과 호환되지 않습니다. 번데기는 강성이 부족하기 때문에 케이스 외부의 번데기 이절편이 조직을 엉망으로 만들어서이 프로토콜의 생성에 영감을 불어 넣었습니다. 여기에 자세히 설명 된 기술은 노툼의 분리 및 고정을 허용하며, 냉동 절제, 계내 혼성화 또는 전자 현미경과 같은 다양한 다른 방법의 첫 번째 단계로 사용될 수 있습니다.
이 기술에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 노툼을 해부, 고정 및 염색하는 것은 노툼 내의 형광 태깅된 단백질을 생영상화하는 것보다 더 많은 시간이 소요되며, 이는 번데기 케이스(9,23)를 제거하기 위한 간단한 해부만을 필요로 한다. 둘째, 다른 초파리 조직의 해부와 비교할 때,이 해부는 얇고 깨지기 쉬운 조직과 소수성 큐티클 때문에 더 어렵습니다. Drosophila epithelia에서 단백질을 단순히 시각화하기 위해 고정 배아, 애벌레 날개 디스크 또는 난소에 대한 면역 조직 화학이 더 쉽습니다. 그러나이 기술을 사용하면 라이브 이미징의 힘을 고정 및 염색과 결합 할 수 있으므로 일단 마스터되면 강력한 도구가 될 수 있습니다.
해부 / 고정 기술은 라이브 이미징보다 몇 가지 장점이 있습니다. 기저 (내부) 구조는 기저면으로 더 잘 해결할 수 있습니다 (그림 5L, J). 가장 중요한 것은, 살아있는 영상은 유전적으로 공급되어야하는 형광단으로 제한되며, 종종 긴 유전 적 교차 계획이 필요하다는 것입니다. 대조적으로, 본 프로토콜은 해부 및 고정을 필요로 하는 얼룩, 면역조직화학, 및 다른 기술의 적용을 허용한다. 이것은 조직에서 프로브되는 신호의 수를 극적으로 증가시키면서 실험 결과에 대한 시간을 잠재적으로 감소시킵니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 번데기 상처에 사용되는 레이저 절제 시스템을 확립하고 프로토콜 개발에 대한 그의 공헌과 피드백에 대해 M. Shane Hutson 박사에게 감사하고 싶습니다. 이 작업은 APM과 M. Shane Hutson에게 1R01GM130130에 의해 지원되었습니다. JW는 2T32HD007502-21에서 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” Scotch Permanent Double-Sided tape | Scotch 3M | 665 | |
| 0.1-10 µL uTIP pipette tip | Biotix | M-0011-9FC | |
| 22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
| 24 x 60 mm coverslip | Corning | 2980-246 | |
| 3M VetBond | 3M | 1469SB | Called "adhesive glue" in protocol |
| Anti-FasIII primary Mouse IgG2a | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Chemical | c79-500 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | No. 11254-20 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt | Fine Science Tools | No. 11254-20 | Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone |
| Fisherbrand Double frosted microscope slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
| Fluorescent Light Source | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
| Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
| Fly Vial Foam Plugs "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water | Cole-Parmer | 759075D | A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water. |
| KimWipe | KimTech | 34155 | Called "Absorbent Tissue" in protocol |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
| NIS Elements Software | Nikon | AR | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
| Plastic Vials | Genesee Scientific | 32-114 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
| Stereo Microdissection Scope | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | New or freshly sharpened scissors |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Called " antifade mounting medium" in protocol |
| Vecta Shield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Not ideal for pupal notum. |
| X-Light V2 Spinning Disc | Crest Optics | V2 L-FOV |
References
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