Summary
Den nåværende protokollen beskriver forberedelse og visualisering av fast vev av Drosophila pupal notum. Den kan brukes til enten intakt eller såret vev, og vevets opprinnelige arkitektur er bevart. Prosedyrene for dissekering, fiksering og farging er alle beskrevet i denne artikkelen.
Abstract
Pupae av Drosophila melanogaster er immobile i flere dager under metamorfose, hvor de utvikler en ny kropp med en tynn gjennomsiktig voksen integument. Deres immobilitet og gjennomsiktighet gjør dem ideelle for in vivo live bildebehandling eksperimenter. Mange studier har fokusert på dorsal epitel monolayer av pupal notum på grunn av sin tilgjengelighet og relativt stor størrelse. I tillegg til studier av epitelmekanikk og utvikling, har notumet vært et ideelt vev for å studere sårheling. Etter en skade kan hele epitelreparasjonsprosessen fanges opp ved levende bildebehandling over 6-12 timer. Til tross for populariteten til notum for levende avbildning, har svært få publiserte studier brukt faste notumprøver. Fiksering og farging er vanlige tilnærminger for nesten alle andre Drosophila vev, og utnytter det store repertoaret av enkle cellulære flekker og antistoffer. Imidlertid er pupal notum skjøre og utsatt for krølling og forvrengning etter fjerning fra kroppen, noe som gjør det utfordrende å utfylle levende bildebehandling. Denne protokollen tilbyr en enkel metode for å fikse og farge puppe notum, både intakt og etter lasersår. Med denne teknikken limes den ventrale siden av puppen ned til en deksleslip for å immobilisere puppen, og notumet fjernes forsiktig, festes og farges. Notum epitelet er montert på et lysbilde eller mellom to deksler for å lette avbildning fra vevets dorsale eller ventrale side.
Introduction
Pupal notum av Drosophila melanogaster har blitt stadig mer brukt til levende bildestudier det siste tiåret fordi dyret er både immobilt og har en gjennomsiktig kutikal på dette stadiet 1,2,3,4,5,6,7. Imidlertid er pupal notum utfordrende å dissekere og fikse, noe som gjør det vanskelig å utfylle levende avbildningsstudier med antistoff og cellefarging. Det overordnede målet med dette arbeidet er å lage en reproduserbar protokoll for dissekering og fiksering av pupal notum for antistoff og cellefarging på nye eller tidligere levende bilder.
Når larver begynner metamorfose, trekker epidermis bort fra larval cuticle, og danner et hardt puppet tilfelle8. Larvalkroppsplanen er brutt ned, og den nye voksenkroppsplanen er utviklet. I løpet av denne tiden er pupper immobile, noe som gjør dem ideelle for levende bildebehandling. Et ofte avbildet vev er pupal notum, et voksenmonolayer epitel som dannes i dorsal thorax. Notumet er visuelt tilgjengelig etter en enkel disseksjon for å fjerne puppetuiet9. Hele dyret kan deretter monteres, og notumet kan leve i timer eller dager, noe som gjør det til et ideelt vev for å studere epitelcelleoppførsel under utvikling, homeostase og etter såring 10,11,12,13,14. Imidlertid er notumet utfordrende å dissekere og fikse fordi det er skjøre og dekket med en tynn gjennomsiktig voksen kutikal som er hydrofob. Denne hydrofobe kutiklen gjør den utsatt for krølling i vandige løsninger når den fjernes fra resten av kroppen. Notumavhandling og fiksering er derfor kun rapportert sjelden, og avhandlingen er ofte ikke beskrevet 15,16,17,18. Uten en detaljert protokoll i litteraturen er det uoverkommelig vanskelig for en Drosophila-forsker å utfylle levende avbildning med farging av pupper.
Denne teknikken tar sikte på å reprodusere og fikse prøver som tidligere har blitt live-avbildet, inkludert de som har blitt laserskadd. Fordi levende avbildning krever fjerning av puppetuiet, begynner denne disseksjonsteknikken ved å fjerne det fremre puppetuiet, i motsetning til tidligere protokoller som fester ned eller krysser pupper i puppetuiet 4,19,20. Notumet er et skjøre vev, og sår kan forverre skjørheten. For å støtte dette delikate vevet, blir integumentet (epitelet og festet gjennomsiktig voksen kutikel) av notum og en del av hodet og magen dissekert bort fra resten av puppen mens den alltid er nedsenket i et vandig miljø. Denne metoden reduserer sannsynligheten for at vevet krøller seg og er ubrukelig. Denne teknikken har med hell farget såret notumvev så tidlig som 30 min etter såring (figur 1E-H) og ved 3 timers ettersåring (figur 1I-L). Denne protokollen forventes å være effektiv så lenge notumutviklingen eller sårreparasjonen varer. Den nåværende teknikken vil være nyttig for forskere som ønsker å forene levende bildeegenskaper av pupal notum med overflod av tilgjengelige immunhiistokjemi reagenser.
Protocol
Drosophila melanogaster (fruktfluer) ble opprettholdt ved 25 °C på et standard maismelassemedium. Studiene ble utført på EGFP-merket histone H2A pupper (w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). Fluene ble hentet fra et offentlig arkivsenter (se Materialliste).
1. Pupae immobilisering
- Påfør en 2" stripe med dobbeltsidig tape på et mikroskopsklie.
- Identifiser hvit prepupae i hetteglass hevet ved 25 °C, og bruk en markør for å angi hvor de befinner seg utenfor hetteglasset. Lever hetteglassene til 25 °C.
MERK: Hvit prepupae er preget av deres immobilitet, hvite farge og everted spiracles. Disse danner 0-1 h etter pupariumdannelse (APF), eller stadium P18. - 12-15 timer senere, fjern forsiktig 3-4 av den angitte puppen (uten å poppe dem) ved hjelp av et disseksjonsomfang og samle dem på mikroskopets lysbilde ved siden av båndet.
MERK: Pupae vil nå være scene P5 med en everted hodesekk synlig på puppenes fremre ende8. - Plasser puppene minst en puppebredde fra hverandre på båndet med sine ventrale sider ned.
- Legg en dråpe lim på en parafinfilm (se Materialbord) eller i et sentrifugerørlokk. Dypp enden av en 0,1-10 μL pipettespiss (ingen pipette) i dråpen av lim lim. Trykk pipettespissen to ganger på en 24 mm x 60 mm (1,5 tykkelse) dekslerlip, 1 cm x 1 cm fra et hjørne, og lag en linje med lim lim ~ 1/2 lengden på puppen.
- Forhåndsinnstill en pipette på 0,2-2 μL (P2) til 2 μL, og en 200 μL (P200) pipette til 200 μL, og monter dem med spisser slik at de er klare til å fylles med 1x PBS + 0,1 mM Ca2+, som raskt vil størkne limlimet ved kontakt.
- Sett inn tang (se Materialfortegnelse) nær siden av hodet og fjern forsiktig saken fra fremre til bakre9. Fjern så mye av saken som mulig. Ta tak i puppens utviklende ben med et par stumpe tang og trekk forsiktig puppen fra saken.
MERK: Et lite brudd på den ventrale delen av puppene vil ikke være skadelig for denne prosedyren. - Legg puppen i hjørnet av dekslene.
- Ta tak i puppen i den bakre magen eller den utviklende vingen med stumpe tang, løft og legg den ventrale siden av puppene ned i limlinjen.
- Fyll P2-pipetten raskt med 2 μL 1x PBS + 0,1 mM ca2+, og hold den i luften, utvis akkurat nok til å danne en liten boble på spissen (0,25-0,5 μL).
- Berør den lille boblen av løsningen til den ene siden av puppene ved foten av thoraxen, og gjenta deretter på den andre siden.
MERK: Dette vil størkne en liten mengde lim for å holde puppen på plass. Generelt vil ikke alle løsningene bli brukt. - Fyll P200 pipetten med 200 μL 1x PBS + 0,1 mM ca2+, plasser pipettens spiss over thoraxen og utvis innholdet for å senke puppene helt ned. Resten av limlimet vil størkne umiddelbart.
- Fjern ~ 100 μL av PBS-løsningen, slik at puppen knapt er nedsenket før du fortsetter umiddelbart til neste trinn.
MERK: For ubrukte prøver starter du fra trinn 1.1. For sårede delvis dissekerte prøver, start på trinn 1.5. Sår via laserablasjon har tidligere blitt beskrevet14,21. Immobiliserings-, disseksjons- og monteringstrinn må utføres ved hjelp av et disseksjonsmikroskop.
2. Dissekere notumet
- Ta tak i en mikrodesisseksjonssaks som brager den ene siden av håndtaket mot den dominerende håndens pekefinger og langfinger, slik at tommelen på den dominerende hånden påfører skjærekraften (figur 2A, B).
- Stabiliser halsen på saksen mot langfingeren på den ikke-dominerende hånden mens du fester dekslene med ringfingeren på den ikke-dominerende hånden.
- Klipp midt i dorsallivet for å lage et lite hull, ~ 0,2-0,5 mm. Noen hemolymph vil vanligvis søle ut og er en god indikator på bruddet.
- Lag små 0,5-0,75 mm kutt gjennom integumentet fra bakre til fremre, og omkranser dorsalvevet for å isolere det. For å skape et vev så flatt som mulig, unngå å kutte for ventrally; bare thoraxens dorsale "kuppel" skal fjernes sammen med små deler av hodet og magen.
- Gjenta bakre til fremre kutt på den andre siden av puppene.
- Roter disseksjonsfasen for å tillate et rent kutt gjennom hodet om nødvendig.
MERK: På dette stadiet vil dorsal integument, eller notum, bli skilt fra resten av puppen. Hvis det ser ut til å være separert, men ikke lett flyttes, kan noen få kutt under notumet bidra til å løsne det. - Tilsett ~200 μL 1x PBS i midten av dekslene og lag en kanal som kobler den til den originale disseksjonsdråpen ved å dra pipettespissen forsiktig over dekkglasset fra det nye dråpet til originalen.
- Bruk et par stumpe tang, skyv eller dra forsiktig det isolerte notumet til midten av dekslene og roter, slik at den indre siden vender oppover. Fjern aldri vevet fra dråpen.
MERK: Det er viktig å flytte notumet bort fra det opprinnelige disseksjonsstedet for å unngå rester av limlimet som okkluderer prøven under senere bildebehandling. - Hold notumet nede med de stumpe tangene ved å trykke inn i buk- eller hodedelene. Bruk et par skarpe tang og/ eller milde utvisninger av 1x PBS fra en 200 μL pipette, fjern eventuell gjenværende fettlegeme, muskelbånd eller hemolymf (hvis tilstede) for å eksponere monolayerepitelet fullt ut og gjøre den endelige fargingen jevnere. Det dissekerte notumet skal vises som i figur 3A.
- Når vevet er rent, bruk en 200 μL pipette for å fjerne så mye av PBS-løsningen som mulig (sammen med rusk og den ventrale delen av puppene), overvåking med et disseksjonsomfang for å unngå å aspirere notumet.
- Når det meste av væsken er fjernet, bruk et absorberende vev for å tørke forsiktig bort resten av limet og puppen, samt andre rusk som ligger på dekslene.
MERK: Hvis det gjenstår noe lim på dekslene, vil det ikke forårsake et problem så lenge det er tynnere enn selve dorsalvevet. - Tilsett 150-200 μL 4% PFA (i 1x PBS) og fest i 20 min ved romtemperatur. Avhengig av disseksjonshastigheten kan 1 eller flere pupper dissekeres under den første puppens fiksering.
- Fjern PFA og erstatt den med 1x PBS for å vaske notumet en gang i 30 s.
- Hvis du fortsetter med antistofffarging, utfør 5 min vasker (3 ganger) i 1x PBS eller 1x PBST (Supplementary File 1) for å permeabilisere vevet hvis antigenet er intracellulært.
- Oppbevar prøven i 1x PBS + 0,02% NaN3 over natten i et fuktet kammer, eller hvis du planlegger å farge vevet, inkubere over natten i blokkeringsløsning (Tilleggsfil 1).
3. Farging av notumet
MERK: For farging ved bruk av antistoffer eller cellulære flekker følger du trinnene nedenfor. -Notumet må ikke fjernes fra oppløsningen, da dette sannsynligvis vil føre til at vevet krøller seg. Tilpass dermed fargeprotokollene slik at de utføres helt på dekslene og oppbevares i et fuktet kammer i trinn som er lengre enn 5 min. Overvåking av prøvene under et disseksjonsmikroskop kan bidra til å forhindre utilsiktet aspirasjon av vevet under vask.
- For å visualisere cellegrensene, inkubere i 200 μL anti-FasIII primærmus IgG2a antistoff (se Tabell over materialer) ved 1:8 konsentrasjon fortynnet i blokkering buffer + 0,02% NaN3 over natten ved 4 °C.
- Vask ut overflødig primært antistoff (3 ganger) med 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 i 1 time per vask ved romtemperatur.
- Utfør sekundær antistoffinkubasjon med 200 μL 1:200 konsentrasjon antimus IgGa2 i Cy3 i blokkering buffer + 0,02% NaN3 for 2 timer ved romtemperatur.
- Vask ut overflødig sekundært antistoff (3 ganger) med 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 i 1 time per vask ved romtemperatur.
- For å visualisere kjernene, inkubere prøver i 1 μg / ml DAPI i 45 min for å gi tilstrekkelig tid til at flekken kan trenge gjennom muskelbånd; feste i et DAPI-inneholdende monteringsmedium er ikke effektivt med dette vevet.
- Vask ut overflødig DAPI (3 ganger) med 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 i 5 minutter per vask ved romtemperatur, la det stå i 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 over natten ved 4 °C, eller monter umiddelbart.
4. Montering og visualisering av notumet
- Etter farging, lag en ny 24 × 60 dekslerlip (topper) med støtter.
MERK: Fordi notumet er kuppelformet, resulterer sammenslåing av det helt i forvrengt rynket vev. Hvis du oppretter et mellomrom mellom de to dekslene, kan notumet beholde sin normale form. - Lag et gap på ~ 200 μm ved å bruke avstandsstykker laget av 22 x 22 deksler (nr. 0 tykkelse, ~ 100 μm tykk), festet ~ 1 cm fra hverandre med neglelakk midt på topper.
- For å feste, plasser avstandsstykkene på topper og mal de distale kantene på avstandsstykkene med et tynt lag neglelakk. La tørke.
MERK: Bruk kun en neglelakk som er tynn og rennende; tykk neglelakk vil legge unødvendig ekstra plass mellom dekslenelip og topper. - Fjern så mye av den vandige løsningen som mulig fra prøven.
- Påfør umiddelbart to dråper (~100 μL) anti-fade monteringsmedium (se Materialtabell) på prøven.
- Bruk om nødvendig rene, skarpe tang for å plassere notumet i midten av anti-fade monteringsmediumdråpen.
- Plasser dekslene med notumet på en støtte på ~ 10 x 40 mm, for eksempel et stykke tynt skum (kuttet fra emballasjematerialet inne i deksler), for å heve prøven slik at den ikke fester seg til arbeidsflaten.
- Under et disseksjonsomfang må du sakte senke topperen ned på prøven. Når anti-fade monteringsmediet møter topper, forsiktig slippe og la kapillær handling trekke topper ned.
MERK: I løpet av de første sekundene kan det foretas mindre justeringer i deksleslipposisjonen uten å skade notumet. - Legg et annet skumstykke på topperen og bruk en standard mikroskopsklie som en vekt for å forsiktig koaksialisere anti-fade monteringsmediet mellom prøvedekslenelip, topper og avstandsstykker.
- Etter 5-10 min, bruk et absorberende vev for å transportere bort overflødig anti-fade monteringsmedium ved å berøre kantene på dekslene forsiktig.
- Påfør neglelakk forsiktig på hvert hjørne av dekslene for å feste dem sammen. Når de er tørre, mal alle kantene på dekslene for å forsegle. Unngå å belegge alle kanter først, da dette ofte kan skifte dekslene og skade dorsalvevet.
- Visualiser notumet under fluorescensmikroskopi (se Materialtabell) gjennom dorsal og/eller ventral side.
Representative Results
Den presenterte teknikken fungerer godt på det viklet notumet (figur 1A-D), noe som muliggjør undersøkelse av vevets utvikling og homeostase, for eksempel dannelsen av polyploid mekanosensoriske børsteceller18, eller fremre til den bakre strømmen av epitelceller10. Denne protokollen gjelder også for et laser-ablated notum (figur 1E-L), hvor den cellulære responsen på skade kan analyseres live med endogene fluoroforer som Histone2-EGFP (Figur 1B, F, J). Etterfarging med immunhiistokjemi (trinn 3) kan avsløre mange funksjoner, for eksempel Fasciclin III, som merker cellekantlinjer (figur 1C, G, K). I tillegg kan kvantitative flekker som DAPI (figur 1A, E, I) brukes til å vurdere ENDRINGER i DNA-innhold, inkludert sårindusert polyploidy22.
Den nåværende protokollen er spesielt gunstig, da den kan brukes etter langsiktige live bildebehandlingsforsøk. Siden pupper er immobile, kan de avbildes i timevis (figur 4A,B). Det er viktig at denne protokollen ikke fører til betydelige endringer i sårepitelets overordnede arkitektur eller morfologi etter disseksjon (figur 4B, C). Dermed kan funksjoner i vevet avbildes langsiktig og deretter undersøkes videre med immunhiokjemi eller cellulære flekker.
Avbildning dypt inne i vev er komplekst på grunn av deres opasitet, og Drosophila er belagt i en voksaktig kutikal8 som gjør dyp bildebehandling enda vanskeligere. Men med denne teknikken kan et dissekert notum plasseres mellom to deksler som tillater avbildning av epitelmonolayeren fra hver side: den apikale siden gjennom kutikalen (figur 5A-D) og / eller basalsiden av epitelet som vender mot kroppshulen (figur 5E-H). Disse forskjellige synspunktene er ideelle for å visualisere forskjellige strukturer i vevet. For eksempel er den apikale visningen ideell for visualisering av epitelcellekantlinjer og kjerner som ligger like under kutiklet (figur 5A-D). Med basalvisningen er disse apikale signalene mindre synlige (figur 5E-H). Imidlertid observeres basale strukturer ved sårmarginen (figur 5J, L gul, hvite piler). Disse basale strukturene er mye lysere, da det er mindre okklusjon i basalvisningen enn i den apikale utsikten.
Figur 1: Dissekert, fast og farget Drosophila pupal nota. (A-D) Unwounded notum. (E-H), Såret notum 30 min etter laser ablasjon. (I-L) Såret notum 3 h etter laser ablasjon. (A,E,I) DAPI-flekk viser kjerner. (B,F,J) Transgen Histone2-EGFP, brukt i levende bildebehandling, er synlig etter festing og farging. (C,G,K) Anti-FasIII-antistoffet viser at antistoffflekker fungerer godt på det faste notumet. (D,H,L) Sammenslått bilde. Bildene er tatt med 40x mål ved hjelp av spinnende platemikroskopi, maksimal intensitet projeksjoner av Z-stabler vises med 0,3 μm Z-skiver. A-D representerer 263 Z-stykker. E-H representerer 195 stykker. I-L representerer 53 Z-stykker. Den oransje stiplede linjen angir sårmargen. Skalastang i L er 25 μm, som gjelder for A-L. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Håndplassering for notum disseksjon. (A-B) Venstre og høyre syn på håndplassering for å holde mikrodeseksjonssaksen. For å forhindre hånd risting, er nakken på saksen plassert mot langfingeren på den ikke-dominerende hånden. Saks må være parallell med mikroskopet lysbilde for å unngå fordreining av notum vevet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Korrekt dissekert notum vs. krøllet notum. (A) Pupal notum post disseksjon og rengjøring usikret og klar til fiksering. (B) Pupal notum krøllet på seg selv etter å ha blitt fjernet fra 1x PBS, og dermed gjøre det ubrukelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Pre- og postfaste bilder er stort sett like. Et pupal notum som uttrykker Histone2-EGFP i kjernen ble avbildet (A) live før ablasjon og (B) 3 h etter laser-ablasjon. (C) Notumet ble hentet, dissekert og fikset som nevnt i protokollen og avbildet på nytt etter fiksering. Sårstedet er merket med en rød stjerne. Bildene ble tatt med 40x mål ved hjelp av spinnende skivemikroskopi, Z-skiver ble tatt hver 0,3 μm. Maksimal intensitetsprojeksjoner på 34 Z-skiver forsåring (A), 48 Z-skiver 3 timer etter såring (B) og 103 Z-skiver etter disseksjon, fiksering og farging (C) vises. Vektstang i C er 25 μm, som gjelder for A-C. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bildebehandling av apikale og basale sider av et såret notum. Den samme sårede pupal notum er vist i alle paneler. Såret er merket med en rød stjerne. Den oransje stiplede linjen angir sårmargen. (A-D) Notumet er avbildet fra den apikale siden, gjennom neglebåndet. (E-H) Notumet er avbildet fra basal innvendig side. (I-L) Topppanelene viser et X-Z-bilde av notumet, apikal side opp, med epitelarket utpekt av en hvit trekant. Den oransje linjen angir det apikale basalplanet til X-Y-stykket, vist i de nedre panelene. Innenfor de nedre panelene viser den oransje linjen planet til det ovennevnte X-Z-bildet. (I) Apically avbildet notum - apical stykke. Den øverste X-Z-visningen viser nøyaktig bildebehandling av det apikale epitelarket (hvit trekant). Denne visningen tilsvarer en visning for levende bilder. (J) Apically avbildet notum - basal skive, delvis blokkert av apikalt vev. Andre vev betegnet med gul pil (mulig muskelbånd) og hvite piler (mulige blodlegemer) er synlige på basalsiden. (K) Basally avbildet notum - apikal skive, delvis blokkert av basal vev og sår scab (mørkt sentralt område). (L) Basally avbildet notum - basal skive. Denne visningen viser best basalvevet betegnet med gule og hvite piler. A,E: DAPI flekk, B, F: Histone-EGFP, C, G: FasIII farging. Bildene ble tatt med 20x mål med spinnende platemikroskopi. Z-skiver ble tatt hver 0,9 μm. A-D viser den maksimale intensitetsprojeksjonen på 19 stykker. E-H representerer den maksimale intensitetsprojeksjonen på 17 skiver. 25 μm skalastenger i henholdsvis D, H, L gjelder henholdsvis A-D, E-H, I-L. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Utarbeidelse av løsninger og buffere. Oppskrifter for følgende løsninger er detaljerte: 1xPBS, 1x PBST, blokkeringsløsning og paraformaldehydfiksiv. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Kritiske trinn
Optimalisering av tre trinn vil dramatisk øke suksessen til denne protokollen. Først, i trinn 1,5, vær sparsom med limlimet påført dekslene. Hvis for mye lim er tilsatt, kan puppene bli innhyllet i et tykt lag av størknet lim lim, noe som vil gjøre disseksjon umulig, og hvis det dekker selve notumet, vil limlimet okkludere lyset fra prøven. For det andre, i trinn 2.3-2.6, sørg for å fjerne bare den øverste kuppelen på notumet, unntatt så mye av sidevevet som mulig. Hvis det er inkludert, vil sidevevet bli komprimert under montering og føre til at midten av notumet spennes innover, og plasserer det ofte utenfor arbeidsavstanden til høye numeriske blendermål. For det tredje, under rengjøringstrinnet 2.9, må det tas stor forsiktighet for ikke å skade monolayer-epitelet. Hvis vevet har store deler mangler eller ingen signal kan oppdages, er dette trinnet sannsynlig å klandre.
Feilsøking
Utgave 1: Etter montering kommer puppen bort fra det dobbeltsidige båndet under disseksjonen. Dette er et vanlig problem, spesielt for nybegynnere. Det beste middelet er å sikre at utsiden av puppene er helt tørr / fri for matrester. Fjerning av mat med et par stumpe tang og la saken lufttørke i 10-15 min, vil bidra til å holde seg til båndet. Alternativt kan du bruke den ikke-dominerende hånden og et par stumpe tang for å holde puppene ned mot båndet under disseksjonen. Hvis problemet vedvarer, gir det å bruke en liten 5-10 μL dråpe neglelakk til bunnen av den bakre enden av saken og la den herdes generelt nok vedheft til selv den unruliest av pupper.
Utgave 2: Notum kollapser i trinn 2.3, eller det første bruddet gjennom integumentet er ikke glatt. Hvis integumentet er vanskelig å bryte, kan det være for mye lim lim fra immobiliseringstrinnene. Å plassere de dissekerte puppene i mindre lim lim vil forbedre dette problemet. Videre må du sørge for at mikrodesisseksjonssaksen er skarp. Stump saks vil ikke kunne kutte inn i integumentet og har en tendens til å få det til å kollapse innover. Når hemolymfen søler ut av puppene, må du sørge for at et av skjærebladene kan komme inn i puppen uten å få notumet til å deformere. Hvis notumet kollapser og bladet ikke kommer inn i puppen, fortsett å klippe til et blad kommer inn i puppene.
Utgave 3: I trinn 2.4 fanger eller drar saksen integumentet. Hvis saksen begynner å fange eller dra integumentet, hjelper det ofte å bytte til motsatt side av puppene og fortsette å "løsne" integumentet. Ytterligere stump mikrodisseksjon saks vil gjøre det vanskelig å oppnå rene kutt gjennom integumentet, og skjerpet saks må brukes.
Problem 4: Prøven aspireres ved et uhell under farging (trinn 3.1-3.6). Det dissekerte notumet er utfordrende å se fordi det er gjennomsiktig. Det kan være nyttig å plassere et mørkblått eller svart ark under dekslene for å gi kontrast (et gammelt pipettespissholderstativ fungerer bra.) I tillegg kan alle løsningsendringer utføres under et disseksjonsmikroskop.
Problem 5: Finner ikke noe signal/lappete signal. Etter å ha utelukket flekkspesifikke problemer, hvis det ikke oppdages noe signal eller det er lappete, er trinn 2.9 (rengjøring) sannsynligvis skyldige. Et fraværende eller lappete signal kan stamme fra skade og fjerning av epitelvevet under rengjøring. Omvendt kan et dårlig signal skyldes okklusjon fra muskelbåndene / fettlegemer hvis de ikke fjernes, da de kan begrense spredningen av flekker og antistoffer i notumet i forhold til det omkringliggende vevet. Hvis vevet er skadet, er det å være mildere under rengjøring den beste løsningen. Hvis flekken i stedet er synlig, men lappete, anbefales det å øke kraften / tiden dedikert til rengjøringstrinnet for å fjerne så mye av muskel- og fettkroppen som mulig. Videre kan det å øke flekkvarigheten bidra til å løse dette problemet med bedre rengjøring.
Utgave 6: Notumvevet har et fordreid/rynket utseende under avbildning. Fordreining og rynke av vevet kommer fra to kilder. For det første vil komprimering av notumet under montering føre til at det spennes og fordreier. Den beste løsningen er å fjerne så mye av sidevevet som mulig, slik at kuppelen er så kort som mulig og kan passe mellom dekslene. For det andre, hvis notumet er bøyd under disseksjonen, vil denne bøyen ikke rettes ut under montering, så det må utvises ekstra forsiktighet for ikke å fordreie notumet under disseksjonen. Utilsiktet bøyning av notum er mest vanlig når du kutter integumentet bort fra resten av puppene. Det er fristende å ha disseksjonssaksen i en vinkel i forhold til puppene i stedet for å holde dem i prøveplanet som pupper. Vinklet saks fører imidlertid til at integumentet spennes oppover når den kuttes i stedet for å forbli flat.
Eksisterende metoder, begrensninger og fremtidige programmer
Wang et al.20 rapporterte en sammenlignbar disseksjonsprotokoll for isolering av pupal epitel. Denne teknikken krever at puppen forblir i sitt tilfelle og raskt blir krysset med en skalpell. Denne protokollen er ikke kompatibel med tidligere live-image-prøver, da live bildebehandling krever fjerning av en stor del av puppetuiet. Fordi pupper mangler stivhet, manglet pupal biseksjon utenfor saken vevet, og inspirerte opprettelsen av denne protokollen. Teknikken som er beskrevet her tillater isolering og fiksering av notumet, og det kan brukes som det første trinnet for et bredt spekter av andre metoder som kryooseksjon, in situ hybridisering eller elektronmikroskopi.
Denne teknikken har noen begrensninger. For det første er dissekering, festing og farging av notumet mer tidkrevende enn levende avbildning fluorescerende merkede proteiner i notumet, noe som bare krever en enkel disseksjon for å fjerne puppetuiet 9,23. For det andre, sammenlignet med disseksjoner av andre Drosophila vev, er denne disseksjonen vanskeligere på grunn av det tynne, skjøre vevet og hydrofob kutiklet. For bare å visualisere proteiner i Drosophila epithelia, er immunhiistokjemi på faste embryoer, larvevingeskiver eller eggstokkene lettere. Denne teknikken gjør det imidlertid mulig å pare kraften i levende bildebehandling med fiksering og farging, noe som gjør det til et kraftig verktøy når det er mestret.
En avhandlings-/fikseringsteknikk har noen fordeler i forhold til levende avbildning. Basale (innvendige) strukturer kan løses bedre med basalvisning (figur 5L,J). Viktigst av alt er levende avbildning begrenset til fluoroforer som må leveres genetisk, og krever ofte lange genetiske kryssingsordninger. I motsetning tillater den nåværende protokollen anvendelse av flekker, immunhiistokjemi og andre teknikker som krever avhandling og fiksering. Dette øker dramatisk antall signaler som er undersøkt i vevet, samtidig som tiden reduseres til eksperimentelle resultater.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Dr. M. Shane Hutson for å ha etablert laserablasjonssystemet som brukes til pupalsår og hans bidrag til og tilbakemeldinger på utviklingen av protokollen. Dette arbeidet ble støttet av 1R01GM130130 til APM og M. Shane Hutson. JW ble støttet av 2T32HD007502-21.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” Scotch Permanent Double-Sided tape | Scotch 3M | 665 | |
| 0.1-10 µL uTIP pipette tip | Biotix | M-0011-9FC | |
| 22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
| 24 x 60 mm coverslip | Corning | 2980-246 | |
| 3M VetBond | 3M | 1469SB | Called "adhesive glue" in protocol |
| Anti-FasIII primary Mouse IgG2a | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Chemical | c79-500 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | No. 11254-20 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt | Fine Science Tools | No. 11254-20 | Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone |
| Fisherbrand Double frosted microscope slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
| Fluorescent Light Source | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
| Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
| Fly Vial Foam Plugs "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water | Cole-Parmer | 759075D | A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water. |
| KimWipe | KimTech | 34155 | Called "Absorbent Tissue" in protocol |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
| NIS Elements Software | Nikon | AR | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
| Plastic Vials | Genesee Scientific | 32-114 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
| Stereo Microdissection Scope | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | New or freshly sharpened scissors |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Called " antifade mounting medium" in protocol |
| Vecta Shield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Not ideal for pupal notum. |
| X-Light V2 Spinning Disc | Crest Optics | V2 L-FOV |
References
- Valon, L., et al. Robustness of epithelial sealing is an emerging property of local ERK feedback driven by cell elimination. Developmental Cell. 56 (12), 1700-1711 (2021).
- Levayer, R., Dupont, C., Moreno, E. Tissue crowding induces caspase-dependent competition for space. Current Biology. 26 (5), 670-677 (2016).
- Couturier, L., et al. Regulation of cortical stability by RhoGEF3 in mitotic sensory organ precursor cells in Drosophila. Biology Open. 6 (12), 1851-1860 (2017).
- Couturier, L., Mazouni, K., Corson, F., Schweisguth, F. Regulation of Notch output dynamics via specific E(spl)-HLH factors during bristle patterning in Drosophila. Nature Communications. 10, 3486 (2019).
- Fujisawa, Y., Shinoda, N., Chihara, T., Miura, M. ROS regulate caspase-dependent cell delamination without apoptosis in the drosophila pupal notum. iScience. 23, 101413 (2020).
- Besson, C., et al. Planar cell polarity breaks the symmetry of par protein distribution prior to mitosis in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 25 (8), 1104-1110 (2015).
- Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. Apoptosis ensures spacing pattern formation of drosophila sensory organs. Current Biology. 21, 278-287 (2011).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Moreira, C., Regan, J., Zaidman-Rémy, A., Jacinto, A., Prag, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods in Molecular Biology. 769, Clifton, N.J. 249-260 (2011).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. Elife. 4, 08519 (2015).
- Cristo, I., Carvalho, L., Ponte, S., Jacinto, A. Novel role for Grainy head in the regulation of cytoskeletal and junctional dynamics during epithelial repair. Journal of Cell Science. 131 (17), 213595 (2018).
- Bellaïche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nature Cell Biology. 3 (1), 50-57 (2001).
- Shannon, E. K. Multiple mechanisms drive calcium signal dynamics around laser-induced epithelial wounds. Biophysical Journal. 113 (7), 1623-1635 (2017).
- O'Connor, J. T., et al. Proteolytic activation of Growth-blocking peptides triggers calcium responses through the GPCR Mthl10 during epithelial wound detection. Developmental Cell. 56 (15), 2160-2175 (2021).
- Hartenstein, V., Posakony, J. W. Development of adult sensilla on the wing and notum of Drosophila melanogaster. Development. 107 (2), 389-405 (1989).
- Yeh, E., Zhou, L., Rudzik, N., Boulianne, G. L. Neuralized functions cell autonomously to regulate Drosophila sense organ development. The EMBO Journal. 19 (17), 4827-4837 (2000).
- Loubéry, S., et al. Uninflatable and notch control the targeting of sara endosomes during asymmetric division. Current Biology. 24 (18), 2142-2148 (2014).
- Kawamori, A., Shimaji, K., Yamaguchi, M. Dynamics of endoreplication during Drosophila posterior scutellar macrochaete development. PLoS One. 7 (6), 38714 (2012).
- Couturier, L., Schweisguth, F. Notch Signaling: Methods and Protocols. Bellen, H. J., Yamamoto, S. , Springer. New York. 79-86 (2014).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (56), e3139 (2011).
- Kiehart, D. P., et al. Cell Biology (Third Edition). Celis, J. E., et al. , Academic Press. 87-103 (2006).
- Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila model to study wound-induced polyploidization. Journal of Visualized Experiments. (160), e61252 (2020).
- O’Connor, J. T., S, E. K., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Mounting Drosophila pupae for laser ablation and live imaging of the dorsal thorax. STAR Protocols. , (2022).
