Summary
Настоящий протокол детализирует подготовку и визуализацию фиксированной ткани Drosophila pupal notum. Его можно использовать как для неповрежденной, так и для раненой ткани, а оригинальная архитектура ткани сохраняется. Процедуры рассечения, фиксации и окрашивания описаны в этой статье.
Abstract
Куколки Drosophila melanogaster неподвижны в течение нескольких дней во время метаморфоза, во время которого у них развивается новое тело с тонким прозрачным взрослым покровом. Их неподвижность и прозрачность делают их идеальными для экспериментов in vivo с живой визуализацией. Многие исследования были сосредоточены на дорсальном эпителиальном монослое куколочного нотума из-за его доступности и относительно больших размеров. В дополнение к исследованиям механики и развития эпителия, нотум был идеальной тканью для изучения заживления ран. После травмы весь процесс восстановления эпителия может быть захвачен живой визуализацией в течение 6-12 ч. Несмотря на популярность notum для живой визуализации, очень немногие опубликованные исследования использовали фиксированные образцы notum. Фиксация и окрашивание являются общими подходами почти для всех других тканей дрозофилы, используя большой репертуар простых клеточных пятен и антител. Тем не менее, куколка является хрупкой и склонной к скручиванию и искажению после удаления из тела, что затрудняет его дополнение живой визуализации. Этот протокол предлагает простой метод фиксации и окрашивания куколочного нотума, как неповрежденного, так и после лазерного ранения. С помощью этой техники вентральная сторона куколки приклеивается к крышке, чтобы обездвижить куколку, а нотум тщательно удаляется, фиксируется и окрашивается. Эпителий notum устанавливается на слайде или между двумя крышками для облегчения визуализации с дорсальной или вентральной стороны ткани.
Introduction
Куколка Drosophila melanogaster все чаще используется для исследований живой визуализации в последнее десятилетие, потому что животное неподвижно и имеет прозрачную кутикулу на этой стадии 1,2,3,4,5,6,7. Тем не менее, куколочный нотум сложно препарировать и фиксировать, что затрудняет дополнение исследований живой визуализации антителами и окрашиванием клеток. Общей целью этой работы является создание воспроизводимого протокола для рассечения и фиксации куколочного нотума для окрашивания антител и клеток на новых или ранее живых образцах.
Когда личинки начинают метаморфоз, эпидермис оттягивается от личиночной кутикулы, образуя твердую куколку8. План тела личинок разбивается, и разрабатывается новый план тела взрослого человека. В течение этого времени куколки неподвижны, что делает их идеальными для живой визуализации. Одной из часто изображаемых тканей является куколочный нотум, взрослый монослойный эпителий, который образуется в дорсальной грудной клетке. Нотум визуально доступен после простого рассечения для удаления корпуса куколки9. Затем все животное может быть смонтировано, и нотум может быть вживую изображен в течение нескольких часов или дней, что делает его идеальной тканью для изучения поведения эпителиальных клеток во время развития, гомеостаза и после ранения 10,11,12,13,14. Тем не менее, нотум сложно рассечь и исправить, потому что он хрупкий и покрыт тонкой прозрачной взрослой кутикулой, которая является гидрофобной. Эта гидрофобная кутикула делает ее склонной к скручиванию в водных растворах при удалении из остальной части тела. Таким образом, о рассечении и фиксации нотума сообщалось лишь изредка, а рассечение часто не описывалось 15,16,17,18. Без подробного протокола в литературе исследователю дрозофилы непомерно трудно дополнить живую визуализацию окрашиванием куколок.
Этот метод направлен на воспроизводимое препарирование и исправление образцов, которые ранее были изображены в реальном времени, в том числе те, которые были ранены лазером. Поскольку живая визуализация требует удаления корпуса куколки, этот метод рассечения начинается с удаления переднего случая куколки, в отличие от предыдущих протоколов, которые зажимают или делят пополам куколки в корпусе куколки 4,19,20. Нотум является хрупкой тканью, и ранение может усугубить его хрупкость. Таким образом, чтобы поддержать эту нежную ткань, покров (эпителий и прикрепленная прозрачная взрослая кутикула) нотума и часть головы и живота рассекаются от остальной части куколки, при этом всегда погружаясь в водную среду. Этот метод снижает вероятность скручивания тканей и непригодности к использованию. Этот метод успешно окрашивал раненую ткань нотума уже через 30 мин после ранения (рисунок 1Е-Н) и через 3 ч после ранения (рисунок 1I-L). Ожидается, что этот протокол будет эффективен в течение всего периода развития нотума или заживления раны. Текущая методика будет полезна для исследователей, желающих объединить возможности живой визуализации куколочного нотума с обилием доступных иммуногистохимических реагентов.
Protocol
Drosophila melanogaster (плодовые мушки) поддерживали при 25 ° C на стандартной среде кукурузной муки и патоки. Исследования проводились на меченых EGFP гистоновых куколках H2A (w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). Мухи были получены из общественного складского центра (см. Таблицу материалов).
1. Иммобилизация куколок
- Нанесите 2-дюймовую полоску двусторонней ленты на предметное стекло микроскопа.
- Определите белые препупы во флаконах, поднятых при 25 °C, и используйте маркер, чтобы указать их местоположение за пределами флакона. Верните флаконы при температуре 25 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Белые препупы характеризуются неподвижностью, белым цветом и вечностными дыхальцами. Они образуются через 0-1 ч после образования пупариума (APF) или стадии P18. - Через 12-15 ч осторожно удалите 3-4 указанных куколки (не выскакивая их) с помощью рассеченного прицела и соберите их на предметном стекле микроскопа рядом с лентой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Куколки теперь будут стадией P5 с заколоченной головкой, видимой на переднем концекуколки 8. - Поместите куколок по крайней мере на одну ширину куколки на ленту их вентральными сторонами вниз.
- Поместите каплю клеевого клея на парафиновую пленку (см. Таблицу материалов) или в крышку центрифужной трубки. Окуните конец наконечника пипетки объемом 0,1-10 мкл (без пипетки) в каплю клеевого клея. Дважды нажмите наконечник пипетки на крышку размером 24 мм х 60 мм (1,5 толщины), на расстоянии 1 см х 1 см от угла, создавая линию клеевого клея ~ 1/2 длины куколки.
- Предварительно установите пипетку 0,2-2 мкл (P2) на 2 мкл и пипетку 200 мкл (P200) на 200 мкл и установите на них наконечники, чтобы они были готовы к заполнению 1x PBS + 0,1 мМ Ca2+, которые быстро затвердеют клеевой клей при контакте.
- Вставьте щипцы (см. Таблицу материалов) рядом с боковой частью головы и аккуратно снимите корпус с передней на заднюю9. Удалите как можно больше корпуса. Схватите развивающиеся ноги куколки парой тупых щипцов и осторожно вытащите куколку из футляра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой разрыв на вентральной части куколок не будет вредным для этой процедуры. - Положите куколку в угол крышки.
- Схватите куколку за заднее брюшко или развивающееся крыло тупыми щипцами, поднимите и поместите вентральную сторону куколки вниз в линию клеевого клея.
- Быстро заполните пипетку P2 2 мкл 1x PBS + 0,1 мМ Ca2+, и, удерживая ее в воздухе, выталкивайте ровно столько, чтобы образовался небольшой пузырьок на кончике (0,25-0,5 мкл).
- Прикоснитесь мелким пузырьком раствора к одной стороне куколок у основания грудной клетки, затем повторите на другой стороне.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это затвердеет небольшое количество клеевого клея, чтобы удерживать куколку на месте. Как правило, все решения не будут использоваться. - Наполните пипетку P200 200 мкл 1x PBS + 0,1 мМ Ca2+, затем поместите опрокидывание пипетки над грудной клеткой и изгоните содержимое, чтобы полностью погрузить куколки. Оставшаяся часть клеевого клея сразу затвердеет.
- Удалите ~ 100 мкл раствора PBS, чтобы куколка едва погрузилась, прежде чем перейти к следующему шагу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для размотанных образцов начните с шага 1.1. Для раненых частично рассеченных образцов начните с шага 1.5. Ранение с помощью лазерной абляции было описано ранее14,21. Этапы иммобилизации, рассечения и монтажа должны быть выполнены с помощью рассеченного микроскопа.
2. Вскрытие нотума
- Схватите пару микродиссекционных ножниц, прикрепляющих одну сторону ручки к указательному и среднему пальцам доминирующей руки, чтобы большой палец доминирующей руки применял режущую силу (рисунок 2A, B).
- Стабилизируйте шейку ножниц к среднему пальцу недоминирующей руки, одновременно укрепляя обшивку безымянным пальцем недоминирующей руки.
- Срезать в середине спинного брюшка, чтобы создать небольшое отверстие, ~0,2-0,5 мм. Некоторая гемолимфа обычно выплескивается наружу и является хорошим показателем нарушения.
- Делают небольшие 0,5-0,75 мм надрезами через покров от заднего к переднему, опоясывая дорсальную ткань для ее выделения. Чтобы создать ткань как можно более плоской, избегайте слишком вентрального разрезания; только спинной «купол» грудной клетки должен быть удален вместе с небольшими участками головы и живота.
- Повторите задние и передние надрезы на другой стороне куколок.
- Поверните стадию рассечения, чтобы при необходимости обеспечить чистый разрез через голову.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе дорсальный покров, или notum, будет отделен от остальной части куколки. Если он кажется отделенным, но его нелегко перемещать, несколько разрезов ниже нотума могут помочь выбить его. - Добавьте ~200 мкл 1x PBS к центру крышки и сделайте канал, соединяющий его с исходной каплей рассечения, осторожно перетащив наконечник пипетки по стеклу крышки от новой капли к оригиналу.
- Используя пару тупых щипцов, осторожно нажмите или перетащите изолированный нотум к центру крышки и поверните, чтобы внутренняя сторона была обращена вверх. Никогда не удаляйте ткань из капли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно переместить нотум подальше от исходного места рассечения, чтобы избежать каких-либо остатков клеевого клея, закупоривающих образец во время последующей визуализации. - Удерживайте нотум тупыми щипцами, вдавливая в брюшную или головную части. Используя пару острых щипцов и / или мягкое изгнание 1x PBS из пипетки 200 мкл, удалите все оставшиеся жировые тела, мышечные полосы или гемолимфу (если они присутствуют), чтобы полностью обнажить монослойный эпителий и сделать возможное окрашивание более ровным. Рассеченный нотум должен выглядеть так, как показано на рисунке 3А.
- Как только ткань будет очищена, используйте пипетку объемом 200 мкл, чтобы удалить как можно больше раствора PBS (вместе с мусором и вентральной частью куколок), контролируя с помощью рассечения, чтобы избежать аспирации нотума.
- После того, как большая часть жидкости была удалена, используйте абсорбирующую ткань, чтобы тщательно вытереть остальную часть клеевого клея и куколки, а также любой другой мусор, который задерживается на крышке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если на крышке остается клейкий клей, это не вызовет проблемы, если оно тоньше, чем сама дорсальная ткань. - Добавьте 150-200 мкл 4% PFA (в 1x PBS) и зафиксируйте в течение 20 мин при комнатной температуре. В зависимости от скорости рассечения во время фиксации первой куколки может быть рассечено 1 или более куколок.
- Снимите PFA и замените его на 1x PBS, чтобы мыть нотум один раз в течение 30 с.
- Если продолжается окрашивание антителами, выполните 5-минутные промывки (3 раза) в 1x PBS или 1x PBST (дополнительный файл 1) для пермеабилизации ткани, если антиген внутриклеточный.
- Храните образец в 1x PBS + 0,02% NaN3 на ночь в увлажненной камере или, если планируете окрашивать ткань, инкубируйте на ночь в блокирующем растворе (дополнительный файл 1).
3. Окрашивание нотума
ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания с использованием антител или клеточных пятен выполните следующие действия. Нотум не должен быть удален из раствора, так как это, вероятно, приведет к скручиванию ткани. Таким образом, адаптируйте протоколы окрашивания, которые должны проводиться полностью на крышке и хранить в увлажненной камере в течение любых этапов более 5 минут. Мониторинг образцов под рассеченным микроскопом может помочь предотвратить случайное аспирирование ткани во время промывания.
- Для визуализации клеточных границ инкубируют в 200 мкл антифасiII первичного мышиного антитела IgG2a (см. Таблицу материалов) в концентрации 1:8, разведенной в блокирующем буфере + 0,02% NaN3 в течение ночи при 4 °C.
- Вымывайте избыток первичных антител (3 раза) 200 мкл 1x PBS + 0,02% NaN3 в течение 1 ч на стирку при комнатной температуре.
- Проводят вторичную инкубацию антител с 200 мкл концентрации 1:200 против мышиного IgGa2 в Cy3 в блокирующем буфере + 0,02%NaN3 в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Вымывайте излишки вторичных антител (3 раза) с 200 мкл 1x PBS + 0,02% NaN3 в течение 1 ч на стирку при комнатной температуре.
- Для визуализации ядер инкубируют образцы в 1 мкг/мл DAPI в течение 45 мин, чтобы дать достаточно времени для проникновения пятна через мышечные полосы; фиксация в DAPI-содержащей монтажной среде не эффективна с этой тканью.
- Вымойте избыток DAPI (3 раза) 200 мкл 1x PBS + 0,02% NaN3 в течение 5 мин на стирку при комнатной температуре, затем оставьте в 200 мкл 1x PBS + 0,02% NaN3 на ночь при 4 °C или немедленно смонтируйте.
4. Монтаж и визуализация нотума
- После окрашивания подготовьте новый 24 × 60 чехлов (топпер) с опорами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку нотум имеет куполообразную форму, его полное сплющивание приводит к искажению морщинистой ткани. Создание зазора между двумя крышками позволяет нотуму сохранять свою нормальную форму. - Создайте зазор ~200 мкм с помощью распорок, изготовленных из 22 х 22 чехлов (толщина No 0, толщина ~ 100 мкм), приклеенных ~ 1 см друг от друга лаком для ногтей в середине топпера.
- Чтобы прилипнуть, поместите распорки на топпер и покрасьте дистальные края распорок тонким слоем лака для ногтей. Дайте высохнуть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только тонкий и жидкий лак для ногтей; густой лак для ногтей добавит ненужного дополнительного пространства между чехлом и топпером. - Извлеките из образца как можно больше водного раствора.
- Немедленно нанесите на образец две капли (~100 мкл) антивядающей монтажной среды (см. Таблицу материалов).
- При необходимости используйте чистые, острые щипцы, чтобы расположить нотум в центре анти-выцветающей монтажной средней капли.
- Поместите крышку с нотом на опору ~10 x 40 мм, такую как кусок тонкой пены (вырезанный из упаковочного материала внутри облицовочных коробок), чтобы поднять образец, чтобы он не прилип к рабочей поверхности.
- Под областью рассечения медленно опустите верхнюю часть на образец. Как только анти-выцветающая монтажная среда встретится с топпером, осторожно отпустите и позвольте капиллярному действию потянуть топпер вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение первых нескольких секунд могут быть внесены незначительные корректировки в положение крышки без повреждения нотума. - Поместите еще один кусок пены на топпер и используйте стандартный предметный предмет микроскопа в качестве веса, чтобы осторожно уговорить антивядающую монтажную среду между крышкой образца, топпером и распорками.
- Через 5-10 мин используйте абсорбирующую ткань, чтобы удалить любую лишнюю анти-выцветающую монтажную среду, осторожно коснувшись краев крышки.
- Аккуратно нанесите лак для ногтей на каждый угол покровных пластинок, чтобы склеить их вместе. После высыхания покрасьте все края обшивки, чтобы запечатать. Сначала избегайте покрытия всех краев, так как это часто может сместить покров и повредить дорсальную ткань.
- Визуализируйте нотум под флуоресцентной микроскопией (см. Таблицу материалов) через спинную и/или вентральную сторону.
Representative Results
Представленная методика хорошо работает на нераненом нотуме (фиг.1A-D), позволяя исследовать развитие и гомеостаз ткани, например, образование полиплоидных механосенсорных щетинистых клеток18 или переднего к заднему потоку эпителиальных клеток10. Этот протокол также применим к лазерно-абляционному нотуму (рисунок 1E-L), где клеточный ответ на повреждение может быть проанализирован вживую с эндогенными флуорофорами, такими как Histone2-EGFP (Рисунок 1B, F, J). Постокрасление с помощью иммуногистохимии (стадия 3) может выявить многие особенности, такие как Фасчиклин III, который маркирует границы клеток (рисунок 1C, G, K). Кроме того, количественные пятна, такие как DAPI (рисунок 1A, E, I), могут быть использованы для оценки изменений содержания ДНК, включая раневую полиплоидию22.
Текущий протокол особенно полезен, поскольку его можно использовать после долгосрочных экспериментов с визуализацией в реальном времени. Поскольку куколки неподвижны, их можно визуализировать в течение нескольких часов (рисунок 4A, B). Важно отметить, что этот протокол не вызывает значительных изменений в общей архитектуре или морфологии раневого эпителия после рассечения (рисунок 4B, C). Таким образом, особенности внутри ткани могут быть визуализированы в долгосрочной перспективе, а затем дополнительно исследованы с помощью иммуногистохимии или клеточных пятен.
Визуализация глубоко внутри тканей сложна из-за их непрозрачности, а дрозофилы покрыты восковой кутикулой8, что делает глубокую визуализацию еще более сложной. Однако с помощью этого метода рассеченный нотум может быть помещен между двумя покровными пластинками, позволяющими визуализировать эпителиальный монослой с любой стороны: апикальной стороны через кутикулу (рисунок 5A-D) и / или базальной стороны эпителия, которая обращена к полости тела (рисунок 5E-H). Эти различные виды идеально подходят для визуализации различных структур внутри ткани. Например, апикальный вид идеально подходит для визуализации границ эпителиальных клеток и ядер, которые лежат чуть ниже кутикулы (рисунок 5A-D). С базальным видом эти апикальные сигналы менее заметны (рисунок 5E-H). Однако базальные структуры наблюдаются на крае раны (рисунок 5J,L желтый, белые стрелки). Эти базальные структуры намного ярче, так как в базальном представлении меньше окклюзии, чем в апикальном.
Рисунок 1: Рассеченный, фиксированный и окрашенный Drosophila pupal nota. (A-D) Неперемотанный нотум. (E-H), Раненый нотум через 30 мин после лазерной абляции. (И-Л) Раненый нотум через 3 ч после лазерной абляции. (А,Е,И) Пятно DAPI показывает ядра. (Б,Ф,Дж) Трансгенный Histone2-EGFP, используемый в живой визуализации, виден после фиксации и окрашивания. (С,Г,К) Анти-FasIII антитело показывает, что пятна антител хорошо работают на фиксированном нотуме. (Д,Н,Л) Объединенное изображение. Изображения захватываются с 40-кратным объективом с помощью вращающейся дисковой микроскопии, проекции максимальной интенсивности Z-стеков показаны с Z-срезами 0,3 мкм. A-D представляет 263 Z-среза. E-H представляет собой 195 срезов. I-L представляет собой 53 Z-среза. Оранжевая пунктирная линия обозначает намотанное поле. Шкала в L составляет 25 мкм, применима к A-L. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Размещение рук для рассечения нотума. (A-B) Левый и правый виды размещения рук для удержания ножниц микродиссекции. Чтобы предотвратить дрожание рук, шейку ножниц помещают против среднего пальца недоминирующей руки. Ножницы должны быть параллельны слайду микроскопа, чтобы избежать деформации ткани нота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Правильно рассеченный нотум против свернувшегося нотума. (А) Pupal notum после рассечения и очистки необработанный и готовый к фиксации. (B) Pupal notum скручивался сам по себе после удаления из 1x PBS, что делало его непригодным для использования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: До- и постфиксированные изображения во многом похожи. Куколочный нотум, экспрессирующий Histone2-EGFP в ядрах, был сфотографирован (A) живым до абляции и (B) через 3 ч после лазерной абляции. (C) Нотум был извлечен, препарирован и исправлен, как указано в протоколе, и повторно изображен после исправления. Место раны помечено красной звездой. Изображения были сделаны с 40-кратным объективом с помощью вращающейся дисковой микроскопии, Z-срезы были сделаны каждые 0,3 мкм. Показаны проекции максимальной интенсивности 34 Z-ломтиков до намотки (A), 48 Z-срезов через 3 ч после ранения (B) и 103 Z-срезов после рассечения, фиксации и окрашивания (C). Шкала в C составляет 25 мкм, применима к A-C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Визуализация апикальной и базальной сторон раненого нотума. Один и тот же раненый куколочный нотум показан на всех панелях. Рана отмечена красной звездочкой. Оранжевая пунктирная линия указывает на крае раны. (А-Д) Нотум изображен с апикальной стороны, через кутикулу. (Э-Н) Нотум изображен с базальной внутренней стороны. (И-Л) Верхние панели показывают X-Z изображение нотума, апикальной стороной вверх, с эпителиальным листом, обозначенным белым треугольником. Оранжевая линия обозначает апикально-базальную плоскость среза X-Y, показанную на нижних панелях. Внутри нижних панелей оранжевая линия показывает плоскость приведенного выше изображения X-Z. (I) Апикально изображенный notum - апикальный срез. Верхний вид X-Z показывает точное изображение апикального эпителиального листа (белый треугольник). Это представление эквивалентно представлению изображений в реальном времени. (J) Апикально изображенный notum - базальный срез, частично закупоренный апикальной тканью. Другие ткани, обозначаемые желтой стрелкой (возможная мышечная полоса) и белыми стрелками (возможные клетки крови), видны на базальной стороне. (К) Базально изображенный нотум - апикальный срез, частично закупоренный базальной тканью и раневой паршой (темная центральная область). (L) Базально изображенный нотум - базальный срез. На этом снимке лучше всего показаны базальные ткани, обозначенные желтыми и белыми стрелками. A,E: Окрашивание DAPI, B,F: Гистон-ЭГФП, С,Г: Окрашивание FasIII. Изображения были сделаны с 20-кратным объективом с помощью вращающейся дисковой микроскопии. Z-ломтики брали через каждые 0,9 мкм. A-D показывает проекцию максимальной интенсивности в 19 срезов. E-H представляет собой проекцию максимальной интенсивности в 17 срезов. 25 мкм шкалы в D,H,L применяются к A-D, E-H, I-L соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Подготовка растворов и буферов. Подробно описаны рецепты следующих растворов: 1xPBS, 1x PBST, блокирующий раствор и параформальдегидное фиксирующее средство. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Discussion
Критические шаги
Оптимизация трех шагов значительно повысит успех этого протокола. Во-первых, на этапе 1.5 будьте щадящими с клеевым клеем, нанесенным на крышку. Если добавить слишком много клеевого клея, куколки могут проникнуть в толстый слой затвердевшего клеевого клея, что сделает невозможным рассечение, а если он покроет сам нотум, клеевой клей закроет свет от образца. Во-вторых, во время шагов 2.3-2.6 убедитесь, что удаляется только верхний купол нотума, исключая как можно больше боковой ткани. Если включить, боковая ткань будет сжиматься во время монтажа и заставит середину ноты сгибаться внутрь, часто помещая ее за пределы рабочего расстояния целей с высокой числовой апертурой. В-третьих, во время этапа очистки 2.9 необходимо проявлять крайнюю осторожность, чтобы не повредить однослойный эпителий. Если в ткани отсутствуют большие участки или сигнал не может быть обнаружен, этот шаг, вероятно, виноват.
Устранение неполадок
Проблема 1: После монтажа куколка отрывается от двусторонней ленты во время рассечения. Это распространенная проблема, особенно для начинающих. Лучшим средством является обеспечение того, чтобы внешняя сторона корпуса куколки была полностью сухой / без остатков пищи. Удаление пищи парой тупых щипцов и предоставление корпусу высохнуть на воздухе в течение 10-15 мин поможет прилипнуть к ленте. В качестве альтернативы, используйте недоминирующую руку и пару тупых щипцов, чтобы удерживать куколки против ленты во время рассечения. Если проблема сохраняется, нанесение небольшой капли лака размером 5-10 мкл на основание заднего конца корпуса и предоставление ему затвердевания обычно обеспечивает достаточную адгезию даже для самых нечистых куколок.
Проблема 2: Notum сворачивается во время шага 2.3, или первоначальное нарушение через покров не является гладким. Если покров трудно прорвать, может быть слишком много клеевого клея от этапов иммобилизации. Помещение рассеченных куколок в менее клейкий клей улучшит эту проблему. Кроме того, убедитесь, что ножницы микродиссекции острые. Тупые ножницы не смогут врезаться в кожный покров и будут иметь тенденцию вызывать его коллапс внутрь. Как только гемолимфа выплеснется из куколок, убедитесь, что одна из режущих лезвий может войти в куколку, не вызывая деформации нотума. Если нотум разрушается и лезвие не входит в куколку, продолжайте отрезать до тех пор, пока лезвие не войдет в куколки.
Проблема 3: На шаге 2.4 ножницы захватывают или перетаскивают покров. Если ножницы начинают ловить или тащить кожные покровы, часто помогает переключиться на противоположную сторону куколок и приступить к «ослаблению» покрова. Дальнейшие тупые микродиссекционные ножницы затруднят достижение чистых разрезов через покров, а заточенные ножницы необходимо использовать.
Проблема 4: Образец случайно аспирируется во время окрашивания (шаги 3.1-3.6). Рассеченный нотум трудно увидеть, потому что он прозрачен. Может быть полезно поместить темно-синий или черный лист под крышкой, чтобы обеспечить контраст (старая стойка для держателя наконечника пипетки работает хорошо). Кроме того, все изменения раствора могут быть выполнены под рассеченным микроскопом.
Проблема 5: Сигнал не обнаружен/обнаружен неоднородный сигнал. После исключения проблем, связанных с пятнами, если сигнал не обнаружен или он неоднородный, шаг 2.9 (очистка), вероятно, является виновником. Отсутствующий или пятнистый сигнал может возникнуть из-за повреждения и удаления эпителиальной ткани во время очистки. И наоборот, плохой сигнал может быть вызван окклюзией от мышечных полос / клеток жирового тела, если они не удалены, поскольку они могут ограничить диффузию пятен и антител в нотум относительно окружающих тканей. Если ткань повреждена, быть более мягким во время чистки является лучшим решением. Если вместо этого пятно заметное, но пятнистое, рекомендуется увеличить энергию / время, отведенное на этап очистки, чтобы удалить как можно больше мышц и жира тела. Кроме того, увеличение продолжительности пятна может помочь решить эту проблему с лучшей очисткой.
Проблема 6: Ткань нотума имеет искривленный / морщинистый вид во время визуализации. Деформация и сморщивание ткани происходят из двух источников. Во-первых, сжатие нотума во время монтажа приведет к его сгибанию и деформации. Лучшим решением является удаление как можно большего количества боковых тканей, чтобы купол был как можно короче и мог поместиться между проставками. Во-вторых, если нотум согнут во время рассечения, этот изгиб не будет выпрямляться во время монтажа, поэтому необходимо проявлять особую осторожность, чтобы не деформировать нотум во время рассечения. Случайный изгиб нотума наиболее распространен при отрезании покрова от остальных куколок. Заманчиво иметь ножницы для рассечения под углом относительно куколок вместо того, чтобы держать их в плоскости образца в виде куколок. Тем не менее, угловые ножницы заставляют покров пристегиваться вверх при разрезании, а не оставаться плоским.
Существующие методы, ограничения и будущие приложения
Wang et al.20 сообщили о сопоставимом протоколе рассечения для выделения эпителия куколки. Этот метод требует, чтобы куколка оставалась в своем корпусе и быстро делилась пополам скальпелем. Этот протокол несовместим с ранее взятыми образцами с живым изображением, так как живая визуализация требует удаления большого участка корпуса куколки. Поскольку куколкам не хватает жесткости, бисекция куколки вне корпуса искажала ткань, вдохновляя на создание этого протокола. Метод, подробно описанный здесь, позволяет изолировать и фиксировать нотум, и он может быть использован в качестве первого шага для широкого спектра других методов, таких как криосечение, гибридизация in situ или электронная микроскопия.
Этот метод имеет некоторые ограничения. Во-первых, рассечение, фиксация и окрашивание нотума занимает больше времени, чем флуоресцентно помеченные белки в нотуме, что требует только простого рассечения для удаления корпуса куколки 9,23. Во-вторых, по сравнению с рассечениями других тканей дрозофилы, это рассечение сложнее из-за тонкой, хрупкой ткани и гидрофобной кутикулы. Для простой визуализации белков в эпителии Drosophila проще, иммуногистохимия на фиксированных эмбрионах, дисках личиночного крыла или яичниках. Тем не менее, этот метод позволяет сочетать мощь живой визуализации с фиксацией и окрашиванием, что делает его мощным инструментом после освоения.
Техника рассечения / фиксации имеет некоторые преимущества перед живой визуализацией. Базальные (внутренние) структуры могут быть лучше разрешены с базальным видом (рисунок 5L,J). Самое главное, живая визуализация ограничена флуорофорами, которые должны быть генетически обеспечены, часто требуя длительных схем генетического скрещивания. Напротив, настоящий протокол допускает нанесение пятен, иммуногистохимию и другие методы, которые требуют рассечения и фиксации. Это резко увеличивает количество сигналов, исследуемых в ткани, потенциально уменьшая время до экспериментальных результатов.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить доктора М. Шейна Хатсона за создание системы лазерной абляции, используемой для ран куколки, а также за его вклад и отзывы о разработке протокола. Эта работа была поддержана 1R01GM130130 APM и М. Шейном Хатсоном. JW поддерживался 2T32HD007502-21.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” Scotch Permanent Double-Sided tape | Scotch 3M | 665 | |
| 0.1-10 µL uTIP pipette tip | Biotix | M-0011-9FC | |
| 22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
| 24 x 60 mm coverslip | Corning | 2980-246 | |
| 3M VetBond | 3M | 1469SB | Called "adhesive glue" in protocol |
| Anti-FasIII primary Mouse IgG2a | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Chemical | c79-500 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | No. 11254-20 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt | Fine Science Tools | No. 11254-20 | Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone |
| Fisherbrand Double frosted microscope slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
| Fluorescent Light Source | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
| Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
| Fly Vial Foam Plugs "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water | Cole-Parmer | 759075D | A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water. |
| KimWipe | KimTech | 34155 | Called "Absorbent Tissue" in protocol |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
| NIS Elements Software | Nikon | AR | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
| Plastic Vials | Genesee Scientific | 32-114 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
| Stereo Microdissection Scope | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | New or freshly sharpened scissors |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Called " antifade mounting medium" in protocol |
| Vecta Shield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Not ideal for pupal notum. |
| X-Light V2 Spinning Disc | Crest Optics | V2 L-FOV |
References
- Valon, L., et al. Robustness of epithelial sealing is an emerging property of local ERK feedback driven by cell elimination. Developmental Cell. 56 (12), 1700-1711 (2021).
- Levayer, R., Dupont, C., Moreno, E. Tissue crowding induces caspase-dependent competition for space. Current Biology. 26 (5), 670-677 (2016).
- Couturier, L., et al. Regulation of cortical stability by RhoGEF3 in mitotic sensory organ precursor cells in Drosophila. Biology Open. 6 (12), 1851-1860 (2017).
- Couturier, L., Mazouni, K., Corson, F., Schweisguth, F. Regulation of Notch output dynamics via specific E(spl)-HLH factors during bristle patterning in Drosophila. Nature Communications. 10, 3486 (2019).
- Fujisawa, Y., Shinoda, N., Chihara, T., Miura, M. ROS regulate caspase-dependent cell delamination without apoptosis in the drosophila pupal notum. iScience. 23, 101413 (2020).
- Besson, C., et al. Planar cell polarity breaks the symmetry of par protein distribution prior to mitosis in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 25 (8), 1104-1110 (2015).
- Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. Apoptosis ensures spacing pattern formation of drosophila sensory organs. Current Biology. 21, 278-287 (2011).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Moreira, C., Regan, J., Zaidman-Rémy, A., Jacinto, A., Prag, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods in Molecular Biology. 769, Clifton, N.J. 249-260 (2011).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. Elife. 4, 08519 (2015).
- Cristo, I., Carvalho, L., Ponte, S., Jacinto, A. Novel role for Grainy head in the regulation of cytoskeletal and junctional dynamics during epithelial repair. Journal of Cell Science. 131 (17), 213595 (2018).
- Bellaïche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nature Cell Biology. 3 (1), 50-57 (2001).
- Shannon, E. K. Multiple mechanisms drive calcium signal dynamics around laser-induced epithelial wounds. Biophysical Journal. 113 (7), 1623-1635 (2017).
- O'Connor, J. T., et al. Proteolytic activation of Growth-blocking peptides triggers calcium responses through the GPCR Mthl10 during epithelial wound detection. Developmental Cell. 56 (15), 2160-2175 (2021).
- Hartenstein, V., Posakony, J. W. Development of adult sensilla on the wing and notum of Drosophila melanogaster. Development. 107 (2), 389-405 (1989).
- Yeh, E., Zhou, L., Rudzik, N., Boulianne, G. L. Neuralized functions cell autonomously to regulate Drosophila sense organ development. The EMBO Journal. 19 (17), 4827-4837 (2000).
- Loubéry, S., et al. Uninflatable and notch control the targeting of sara endosomes during asymmetric division. Current Biology. 24 (18), 2142-2148 (2014).
- Kawamori, A., Shimaji, K., Yamaguchi, M. Dynamics of endoreplication during Drosophila posterior scutellar macrochaete development. PLoS One. 7 (6), 38714 (2012).
- Couturier, L., Schweisguth, F. Notch Signaling: Methods and Protocols. Bellen, H. J., Yamamoto, S. , Springer. New York. 79-86 (2014).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (56), e3139 (2011).
- Kiehart, D. P., et al. Cell Biology (Third Edition). Celis, J. E., et al. , Academic Press. 87-103 (2006).
- Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila model to study wound-induced polyploidization. Journal of Visualized Experiments. (160), e61252 (2020).
- O’Connor, J. T., S, E. K., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Mounting Drosophila pupae for laser ablation and live imaging of the dorsal thorax. STAR Protocols. , (2022).
