Summary
Det nuvarande protokollet beskriver beredningen och visualiseringen av fast vävnad i Drosophila pupal notum. Den kan användas för antingen intakt eller sårad vävnad, och vävnadens ursprungliga arkitektur bevaras. Procedurerna för dissekering, fixering och färgning beskrivs alla i den här artikeln.
Abstract
Popparna av Drosophila melanogaster är immobila i flera dagar under metamorfos, under vilken de utvecklar en ny kropp med ett tunt transparent vuxenintegument. Deras orörlighet och transparens gör dem idealiska för in vivo levande avbildningsexperiment. Många studier har fokuserat på det dorsala epitelmonoskiktet i pupal notum på grund av dess tillgänglighet och relativt stora storlek. Förutom studierna av epitelmekanik och utveckling har notum varit en idealisk vävnad för att studera sårläkning. Efter en skada kan hela epitelreparationsprocessen fångas upp genom levande avbildning över 6-12 timmar. Trots populariteten hos notum för levande avbildning har väldigt få publicerade studier använt fasta notumprover. Fixering och färgning är vanliga metoder för nästan alla andra Drosophila-vävnader, och utnyttjar den stora repertoaren av enkla cellulära fläckar och antikroppar. Pupal notum är dock ömtålig och benägen att krulla och förvränga efter borttagning från kroppen, vilket gör det utmanande att komplettera levande avbildning. Detta protokoll erbjuder en enkel metod för fixering och färgning av pupal notum, både intakt och efter lasersårning. Med denna teknik limmas puppans ventrala sida ner till en täckglas för att immobilisera poppan, och notumet avlägsnas försiktigt, fixeras och färgas. Notumepitelet är monterat på en bild eller mellan två täckglas för att underlätta avbildning från vävnadens dorsala eller ventrala sida.
Introduction
Pupal notum av Drosophila melanogaster har i allt högre grad använts för levande avbildningsstudier under det senaste decenniet eftersom djuret är både orörligt och har en transparent nagelband i detta skede 1,2,3,4,5,6,7. Pupal notum är dock utmanande att dissekera och fixa, vilket gör det svårt att komplettera levande bildstudier med antikropps- och cellfärgning. Det övergripande målet med detta arbete är att skapa ett reproducerbart protokoll för dissekering och fixering av pupal notum för antikropps- och cellfärgning på nya eller tidigare levande bildprover.
När larver börjar metamorfos drar epidermis bort från larvens nagelband och bildar ett hårt pupalfall8. Larvkroppsplanen bryts ner och den nya vuxenkroppsplanen utvecklas. Under denna tid är puppor immobila, vilket gör dem idealiska för levande avbildning. En vanligt avbildad vävnad är pupal notum, ett vuxet monolagerepitel som bildas i ryggkorgen. Notum är visuellt tillgängligt efter en enkel dissektion för att ta bort pupalfallet9. Hela djuret kan sedan monteras, och notum kan levande avbildas i timmar eller dagar, vilket gör det till en idealisk vävnad för att studera epitelcellbeteenden under utveckling, homeostas och efter sår 10,11,12,13,14. Notum är dock utmanande att dissekera och fixa eftersom det är bräckligt och täckt med en tunn transparent vuxen nagelband som är hydrofob. Denna hydrofoba nagelband gör den benägen att krulla i vattenhaltiga lösningar när den tas bort från resten av kroppen. Således har notumdissektion och fixering rapporterats endast sällan och dissektion beskrivs ofta inte 15,16,17,18. Utan ett detaljerat protokoll i litteraturen är det oöverkomligt svårt för en Drosophila-forskare att komplettera levande avbildning med färgning av puppor.
Denna teknik syftar till att reproducera dissekera och fixa prover som tidigare har avbildats live, inklusive de som har laserskadats. Eftersom levande avbildning kräver borttagning av pupalfallet börjar denna dissektionsteknik med att ta bort det främre pupalfallet, till skillnad från tidigare protokoll som fäster eller bisekerar puppor inom pupalfallet 4,19,20. Notum är en ömtålig vävnad, och sår kan förvärra dess bräcklighet. För att stödja denna känsliga vävnad dissekeras således integumentet (epitelet och fäst transparent vuxen nagelband) i notum och en del av huvudet och buken bort från resten av poppan medan de alltid nedsänktes i en vattenhaltig miljö. Denna metod minskar sannolikheten för att vävnaden krullar och är oanvändbar. Denna teknik har framgångsrikt färgat sårad notumvävnad så tidigt som 30 min efter sårning (figur 1E-H) och vid 3 h efter sårning (figur 1I-L). Detta protokoll förväntas vara effektivt under hela notumutveckling eller sårreparation. Den nuvarande tekniken kommer att vara till hjälp för forskare som vill förena pupalnotumets levande avbildningskapacitet med överflödet av tillgängliga immunohistokemireagenser.
Protocol
Drosophila melanogaster (bananflugor) bibehölls vid 25 °C på ett vanligt majsmjölsmelassmedium. Studierna utfördes på EGFP-märkta histon H2A-puppor (w[*]; P{w+mC=His2Av-EGFP.C}2/SM6a). Flugorna erhölls från ett offentligt lagercenter (se materialtabell).
1. Puppa immobilisering
- Applicera en 2 "remsa dubbelsidig tejp på ett mikroskopglas.
- Identifiera vita prepupae i injektionsflaskor upphöjda vid 25 °C och använd en markör för att ange var de befinner sig utanför injektionsflaskan. Sätt tillbaka injektionsflaskorna till 25 °C.
OBS: Vita prepupae kännetecknas av deras orörlighet, vita färg och everted spiracles. Dessa bildar 0-1 h efter pupariumbildning (APF), eller steg P18. - 12-15 h senare, ta försiktigt bort 3-4 av de angivna popparna (utan att poppa dem) med ett dissektionsomfång och samla dem på mikroskopglaset bredvid tejpen.
OBS: Puppor kommer nu att vara steg P5 med en everted huvudsäck synlig vid puppans främre ände8. - Placera pupporna minst en puppa bred isär på tejpen med sina ventrala sidor nedåt.
- Placera en droppe självhäftande lim på en paraffinfilm (se materialtabell) eller i ett lock till centrifugröret. Doppa änden av en 0,1-10 μL pipettspets (ingen pipett) i droppen lim. Knacka på pipettspetsen två gånger på en 24 mm x 60 mm (1,5 tjocklek) täckglas, 1 cm x 1 cm från ett hörn, vilket skapar en linje med självhäftande lim ~ 1/2 längden på poppan.
- Förinställ en 0,2-2 μl (P2) pipett till 2 μL och en 200 μL (P200) pipett till 200 μL och montera dem med spetsar så att de är redo att fyllas med 1x PBS + 0,1 mM Ca2+, vilket snabbt stelnar limmet vid kontakt.
- Sätt i pincett (se materialtabell) nära sidan av huvudet och ta försiktigt bort höljet från det främre till bakre9. Ta bort så mycket av fodralet som möjligt. Ta tag i poppens framben med ett par trubbiga pincett och dra försiktigt poppan ur fodralet.
OBS: En liten bristning på den ventrala delen av popparna kommer inte att skada denna procedur. - Lägg poppan i hörnet av täckglaset.
- Ta tag i puppan vid den bakre buken eller den utvecklande vingen med trubbiga pincett, lyft och placera den ventrala sidan av pupporna ner i linjen med självhäftande lim.
- Fyll snabbt P2-pipetten med 2 μL 1x PBS + 0,1 mM Ca2+, och håll den i luften, tryck ut precis tillräckligt för att bilda en liten bubbla vid spetsen (0,25-0,5 μL).
- Rör den lilla bubblan av lösningen till ena sidan av popparna vid basen av bröstkorgen och upprepa sedan på andra sidan.
OBS: Detta kommer att stelna en liten mängd limmet för att hålla poppan på plats. I allmänhet kommer alla lösningar inte att användas. - Fyll P200-pipetten med 200 μL 1x PBS + 0,1 mM Ca2+, placera sedan pipettens spets över bröstkorgen och tryck ut innehållet för att sänka ner pupporna helt. Resten av limlimmet stelnar omedelbart.
- Ta bort ~ 100 μL av PBS-lösningen, så att poppan knappt är nedsänkt innan du fortsätter omedelbart till nästa steg.
OBS: För olindade prover, börja från steg 1.1. För sårade delvis dissekerade prover börjar du med steg 1.5. Sårbildning via laserablation har tidigare beskrivits14,21. Immobilisering, dissektion och monteringssteg måste utföras med hjälp av ett dissektionsmikroskop.
2. Dissekera notum
- Ta tag i en mikrodissektionssax som spänner ena sidan av handtaget mot den dominerande handens pekfinger och långfinger, så att tummen på den dominerande handen applicerar skärkraften (figur 2A,B).
- Stabilisera saxhalsen mot långfingret på den icke-dominerande handen medan du spänner täckglaset med ringfingret på den icke-dominerande handen.
- Klipp i mitten av ryggstödet för att skapa ett litet hål, ~0,2-0,5 mm. En del hemolymf kommer vanligtvis att spillas ut och är en bra indikator på överträdelsen.
- Gör små 0,5-0,75 mm skär genom integumentet från bakre till främre, omsluter dorsalvävnaden för att isolera den. För att skapa en vävnad så platt som möjligt, undvik att skära för ventralt; endast bröstkorgens dorsala "kupol" ska avlägsnas tillsammans med små delar av huvudet och buken.
- Upprepa bakre till främre snitt på andra sidan pupporna.
- Vrid dissektionssteget för att möjliggöra ett rent snitt genom huvudet om det behövs.
OBS: I detta skede kommer dorsalintegumentet, eller notum, att separeras från resten av puppan. Om den verkar separerad men inte lätt att flytta kan några snitt under notum hjälpa till att lossa den. - Tillsätt ~ 200 μL 1x PBS i mitten av täckglaset och gör en kanal som ansluter den till den ursprungliga dissektionsdroppen genom att försiktigt dra pipettspetsen över täckglaset från den nya droppen till originalet.
- Använd ett par trubbiga pincett, tryck försiktigt eller dra det isolerade notumet till mitten av täckglaset och rotera, så att den inre sidan vetter uppåt. Ta aldrig bort vävnaden från droppen.
OBS: Det är viktigt att flytta notumet bort från det ursprungliga dissektionsstället för att undvika rester av limmet som täcker provet under senare avbildning. - Håll ner notum med de trubbiga tångarna genom att trycka in i buk- eller huvudsektionerna. Använd ett par vassa pincett och / eller mjuka utvisningar av 1x PBS från en 200 μL pipett, ta bort eventuell kvarvarande fettkropp, muskelband eller hemolymf (om det finns) för att helt exponera monolagerepitelet och göra eventuell färgning jämnare. Det dissekerade notumet ska visas som i figur 3A.
- När vävnaden är ren, använd en 200 μL pipett för att ta bort så mycket av PBS-lösningen som möjligt (tillsammans med skräp och den ventrala delen av pupporna), övervaka med ett dissektionsomfång för att undvika att suga notum.
- När det mesta av vätskan har tagits bort, använd en absorberande vävnad för att försiktigt torka bort resten av limmet och poppan, liksom allt annat skräp som dröjer sig kvar på täckglaset.
OBS: Om något självhäftande lim finns kvar på täckglaset kommer det inte att orsaka problem så länge det är tunnare än själva ryggvävnaden. - Tillsätt 150-200 μl 4% PFA (i 1x PBS) och fixa i 20 min vid rumstemp. Beroende på dissektionshastigheten kan 1 eller fler puppor dissekeras under den första puppans fixering.
- Ta bort PFA och byt ut den mot 1x PBS för att tvätta notum en gång i 30 s.
- Om du fortsätter med antikroppsfärgning, utför 5 minuters tvätt (3 gånger) i 1x PBS eller 1x PBST (tilläggsfil 1) för att permeabilisera vävnaden om antigenet är intracellulärt.
- Förvara provet i 1x PBS + 0,02% NaN3 över natten i en fuktad kammare, eller om du planerar att fläcka vävnaden, inkubera över natten i blockeringslösning (tilläggsfil 1).
3. Färgning av notum
OBS: För färgning med antikroppar eller cellulära fläckar följ stegen nedan. -Notum får inte tas bort från lösningen, eftersom detta sannolikt kommer att leda till att vävnaden krullar sig. Anpassa således färgningsprotokoll som ska utföras helt på täckglaset och förvara i en fuktad kammare under alla steg längre än 5 minuter. Övervakning av proverna under ett dissektionsmikroskop kan hjälpa till att förhindra oavsiktlig aspiration av vävnaden under tvätt.
- För att visualisera cellgränserna, inkubera i 200 μL anti-FasIII primär Mus IgG2a-antikropp (se materialtabell) vid 1:8-koncentration utspädd i blockerande buffert + 0,02% NaN3 över natten vid 4 °C.
- Tvätta bort överskott av primär antikropp (3 gånger) med 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 i 1 timme per tvätt vid rumstemperatur.
- Utför sekundär antikroppsinkuation med 200 μL 1:200 koncentration antimus IgGa2 i Cy3 i Blockeringsbuffert + 0,02% NaN3 i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Tvätta bort överskott av sekundär antikropp (3 gånger) med 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 i 1 timme per tvätt vid rumstemperatur.
- För att visualisera kärnorna, inkubera prover i 1 μg / ml DAPI i 45 minuter för att ge tillräckligt med tid för fläcken att tränga igenom muskelband; fixering i ett DAPI-innehållande monteringsmedium är inte effektivt med denna vävnad.
- Tvätta bort överflödig DAPI (3 gånger) med 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 i 5 min per tvätt vid rumstemperatur, lämna sedan i 200 μL 1x PBS + 0,02% NaN3 över natten vid 4 °C, eller montera omedelbart.
4. Montering och visualisering av notum
- Efter färgning, förbered en ny 24 × 60 täckglas (topper) med stöd.
OBS: Eftersom notum är kupolformad resulterar det helt i förvrängd skrynklig vävnad om den plattas ut. Genom att skapa ett mellanrum mellan de två täckglasen kan notum behålla sin normala form. - Skapa ett mellanrum på ~ 200 μm genom att använda distanser gjorda av 22 x 22 täckglas (nr 0 tjocklek, ~ 100 μm tjock), fäst ~ 1 cm från varandra med nagellack i mitten av topper.
- För att fästa, placera distanserna på toppen och måla distansernas distala kanter med ett tunt lager nagellack. Låt torka.
OBS: Använd endast ett nagellack som är tunt och rinnande; tjockt nagellack kommer att lägga till onödigt extra utrymme mellan täckglaset och topper. - Avlägsna så mycket av vattenlösningen som möjligt från provet.
- Applicera omedelbart två droppar (~ 100 μL) anti-fade monteringsmedium (se materialtabell) på provet.
- Använd vid behov rena, vassa pincett för att placera notum i mitten av anti-fade monteringsmediet.
- Placera täckglaset med notum på ett ~ 10 x 40 mm stöd, till exempel en bit tunt skum (skuren från förpackningsmaterialet inuti täckglaslådor), för att höja provet så att det inte fäster vid arbetsytan.
- Under ett dissektionsomfång sänker du långsamt toppern på provet. När anti-fade monteringsmediet möter topper, släpp försiktigt och låt kapillärverkan dra ner topper.
OBS: Inom de första sekunderna kan mindre justeringar göras i täckglasets läge utan att skada notum. - Placera en annan bit skum på toppern och använd en vanlig mikroskopglas som en vikt för att försiktigt locka det anti-fade monteringsmediet mellan provöverdragen, topper och distanser.
- Efter 5-10 minuter, använd en absorberande vävnad för att transportera bort överflödigt anti-fade monteringsmedium genom att försiktigt röra vid kanterna på täckglaset.
- Applicera försiktigt nagellack i varje hörn av täckglasen för att fästa dem ihop. När det är torrt, måla alla kanter på täckglasen för att täta. Undvik att belägga alla kanter först, eftersom detta ofta kan flytta täckglaset och skada ryggvävnaden.
- Visualisera notum under fluorescensmikroskopi (se materialtabell) genom dorsal- och / eller ventralsidan.
Representative Results
Den presenterade tekniken fungerar bra på det olindade notumet (figur 1A-D), vilket möjliggör undersökning av vävnadens utveckling och homeostas, t.ex. bildandet av de polyploida mekanosensoriska borstcellerna18, eller det främre till det bakre flödet av epitelceller10. Detta protokoll är också tillämpligt på ett laserablat notum (figur 1E-L), där det cellulära svaret på skada kan analyseras levande med endogena fluoroforer såsom Histone2-EGFP (figur 1B, F, J). Efterfärgning med immunhistokemi (steg 3) kan avslöja många funktioner, såsom Fasciclin III, som märker cellgränser (figur 1C, G, K). Dessutom kan kvantitativa fläckar såsom DAPI (figur 1A,E,I) användas för att bedöma DNA-innehållsförändringar, inklusive sårinducerad polyploidi22.
Det nuvarande protokollet är särskilt fördelaktigt eftersom det kan användas efter långvariga levande avbildningsexperiment. Eftersom puppor är orörliga kan de avbildas i timmar (figur 4A,B). Viktigt är att detta protokoll inte orsakar betydande förändringar i sårepitelets övergripande arkitektur eller morfologi efter dissektion (figur 4B, C). Således kan funktioner i vävnaden avbildas på lång sikt och sedan undersökas vidare med immunohistokemi eller cellulära fläckar.
Avbildning djupt inne i vävnader är komplex på grund av deras opacitet, och Drosophila är belagda i en vaxartad nagelband8 vilket gör djup avbildning ännu svårare. Men med denna teknik kan ett dissekerat notum placeras mellan två täckglas som möjliggör avbildning av epitelialmonoskiktet från vardera sidan: den apikala sidan genom nagelbandet (figur 5A-D) och / eller den basala sidan av epitelet som vetter mot kroppshålan (figur 5E-H). Dessa olika vyer är idealiska för att visualisera olika strukturer i vävnaden. Till exempel är den apikala vyn idealisk för visualisering av epitelcellgränser och kärnor som ligger strax under nagelbandet (figur 5A-D). Med den basala vyn är dessa apikala signaler mindre synliga (figur 5E-H). Basala strukturer observeras emellertid vid sårmarginalen (Figur 5J,L gula, vita pilar). Dessa basala strukturer är mycket ljusare eftersom det finns mindre ocklusion i basalvyn än i den apikala vyn.
Figur 1: Dissekerad, fixerad och färgad Drosophila pupal nota. (E-H), Sårad notum 30 min efter laserablation. (I-L) Sårad notum 3 h efter laserablation. (A,E,I) DAPI-fläck visar kärnor. (B,F,J) Transgen Histone2-EGFP, som används vid levande avbildning, är synlig efter fixering och färgning. (C,G,K) Anti-FasIII-antikroppen visar att antikroppsfläckar fungerar bra på det fasta notumet. (D,H,L) Sammanslagen bild. Bilderna tas med 40x mål med snurrande skivmikroskopi, maximala intensitetsprojektioner av Z-stackar visas med 0,3 μm Z-skivor. AD representerar 263 Z-segment. E-H representerar 195 skivor. I-L representerar 53 Z-skivor. Den orange streckade linjen betecknar sårmarginal. Skalstrecket i L är 25 μm, tillämpligt på A-L. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Handplacering för notumdissektion. För att förhindra handskakningar placeras saxens hals mot långfingret på den icke-dominerande handen. Sax måste vara parallell med mikroskopglaset för att undvika vridning av notumvävnaden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Korrekt dissekerad notum kontra krökt notum. (B) Pupal notum krökt på sig själv efter att ha tagits bort från 1x PBS, vilket gör den oanvändbar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Bilder före och efter korrigeringar är i stort sett lika. Ett pupal notum som uttrycker Histone2-EGFP i kärnorna avbildades (A) live före ablation och (B) 3 h efter laserablation. (C) Notum hämtades, dissekerades och fixades som nämns i protokollet och avbildades igen efter fixering. Sårplatsen är märkt med en röd stjärna. Bilderna togs med 40x mål med snurrande skivmikroskopi, Z-skivor togs var 0,3 μm. Maximala intensitetsprojektioner på 34 Z-skivor försåret (A), 48 Z-skivor 3 timmar efter sårning (B) och 103 Z-skivor efter dissektion, fixering och färgning (C) visas. Skalstrecket i C är 25 μm, tillämpligt på A-C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Avbildning av apikala och basala sidor av en sårad notum. Samma sårade pupal notum visas i alla paneler. Såret är markerat med en röd stjärna. Den orange prickade linjen indikerar sårmarginalen. (A-D) Notum avbildas från den apikala sidan, genom nagelbandet. (E-H) Notum är avbildad från den basala insidan. (I-L) De övre panelerna visar en X-Z-bild av notum, apikal sida uppåt, med epitelarket betecknat med en vit triangel. Den orange linjen betecknar det apikal-basala planet för X-Y-skivan, som visas i de nedre panelerna. I de nedre panelerna visar den orange linjen planet för ovanstående X-Z-bild. (I) Apikalt avbildad notum - apikal skiva. Den övre X-Z-vyn visar exakt avbildning av det apikala epitelarket (vit triangel). Den här vyn motsvarar en levande bildvy. (J) Apikalt avbildad notum - basal skiva, delvis hindrad av apikal vävnad. Andra vävnader betecknade med gul pil (möjligt muskelband) och vita pilar (möjliga blodkroppar) är synliga på basalsidan. (K) Basalt avbildad notum - apikal skiva, delvis hindrad av basalvävnad och sårskorv (mörkt centralt område). (L) Basalt avbildad notum - basal skiva. Denna vy visar bäst de basala vävnaderna betecknade med gula och vita pilar. A,E: DAPI-fläck, B,F: Histone-EGFP, C,G: FasIII-färgning. Bilderna togs med 20x mål med snurrande skivmikroskopi. Z-skivor togs var 0,9 μm. A-D visar den maximala intensitetsprognosen på 19 segment. E-H representerar den maximala intensitetsprognosen på 17 segment. 25 μm skalstreck i D,H,L gäller för A-D, E-H, I-L. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tilläggsfil 1: Förberedelse av lösningar och buffertar. Recept för följande lösningar är detaljerade: 1xPBS, 1x PBST, blockeringslösning och paraformaldehydfixativ. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Kritiska steg
Optimering av tre steg kommer dramatiskt att öka framgången för detta protokoll. Först, i steg 1.5, var sparsam med limmet applicerat på täckglaset. Om för mycket limlim tillsätts kan popparna bli begravda i ett tjockt lager stelnat lim, vilket gör dissektion omöjlig, och om det täcker själva notumet kommer limlimmet att täppa till ljuset från provet. För det andra, under steg 2.3-2.6, se till att endast ta bort den övre kupolen i notum, exklusive så mycket av sidovävnaden som möjligt. Om den inkluderas kommer sidovävnaden att komprimeras under montering och få mitten av notum att spänna inåt, vilket ofta placerar den utanför arbetsavståndet för höga numeriska bländarmål. För det tredje, under rengöringssteget 2.9, måste extrem försiktighet vidtas för att inte skada monolagerepitelet. Om vävnaden har stora delar som saknas eller ingen signal kan detekteras, är detta steg sannolikt att skylla på.
Felsökning
Nummer 1: Efter montering kommer puppan bort från den dubbelsidiga tejpen under dissektion. Detta är en vanlig fråga, särskilt för nybörjare. Det bästa botemedlet är att se till att utsidan av puppfodralet är helt torrt/fritt från matrester. Att ta bort mat med ett par trubbiga pincett och låta fodralet lufttorka i 10-15 minuter hjälper till att fästa på tejpen. Alternativt kan du använda den icke-dominerande handen och ett par trubbiga pincett för att hålla ner pupporna mot tejpen under dissektion. Om problemet kvarstår, applicerar en liten, 5-10 μL droppe nagellack på basen av den bakre änden av höljet och låter det härda i allmänhet tillräckligt med vidhäftning för även de otuliste av puppor.
Problem 2: Notum kollapsar under steg 2.3, eller så är det första intrånget genom integumentet inte smidigt. Om integumentet är svårt att bryta kan det finnas för mycket limlim från immobiliseringsstegen. Att placera de dissekerade pupporna i mindre självhäftande lim kommer att förbättra denna fråga. Se vidare till att mikrodissektionssaxen är skarp. Trubbiga saxar kommer inte att kunna skära in i integumentet och tenderar att få det att kollapsa inåt. När hemolymfen har spillts ut ur pupporna, se till att ett av skärbladen kan komma in i puppan utan att få notum att deformeras. Om notum kollapsar och bladet inte kommer in i poppan, fortsätt snippa tills ett blad kommer in i popparna.
Problem 3: Under steg 2.4, sax fånga eller dra integumentet. Om saxen börjar fånga eller dra integumentet hjälper det ofta att byta till motsatt sida av popparna och fortsätta att "lossa" integumentet. Ytterligare trubbiga mikrodissektionssaxar gör det svårt att uppnå rena snitt genom integumentet, och vässad sax måste användas.
Problem 4: Provet aspireras av misstag under färgning (steg 3.1-3.6). Det dissekerade notumet är utmanande att se eftersom det är transparent. Det kan vara bra att placera ett mörkblått eller svart ark under täckglaset för att ge kontrast (ett gammalt pipettspetshållare fungerar bra.) Dessutom kan alla lösningsändringar utföras under ett dissektionsmikroskop.
Problem 5: Ingen signal detekteras/ojämn signal detekteras. Efter att ha uteslutit fläckspecifika problem, om ingen signal upptäcks eller om den är ojämn, är steg 2.9 (rengöring) sannolikt den skyldige. En frånvarande eller fläckig signal kan härröra från skador och avlägsnande av epitelvävnaden under rengöring. Omvänt kan en dålig signal orsakas av ocklusion från muskelbanden / fettkroppscellerna om de inte tas bort, eftersom de kan begränsa diffusionen av fläckar och antikroppar i notum i förhållande till den omgivande vävnaden. Om vävnaden är skadad är det den bästa lösningen att vara mildare under rengöringen. Om fläcken istället är synlig men fläckig rekommenderas att öka kraften / tiden som ägnas åt rengöringssteget för att ta bort så mycket av muskeln och fettkroppen som möjligt. Ytterligare kan en ökning av fläckens varaktighet hjälpa till att lösa detta problem med bättre rengöring.
Problem 6: Notumvävnaden har ett skevt / skrynkligt utseende under avbildning. Vridning och rynkor i vävnaden kommer från två källor. För det första kommer komprimering av notum under montering att få den att spänna och varpa. Den bästa lösningen är att ta bort så mycket av sidovävnaderna som möjligt så att kupolen är så kort som möjligt och kan passa mellan täckglasdistanserna. För det andra, om notumet är böjt under dissektion, kommer denna böjning inte att räta ut under montering, så extra försiktighet måste vidtas för att inte varpa notum under dissektion. Oavsiktlig böjning av notum är vanligast när man skär bort integumentet från resten av popparna. Det är frestande att ha dissektionssaxen i en vinkel i förhållande till pupporna istället för att hålla dem i provplanet som puppor. Vinklade saxar gör dock att integumentet spänns uppåt när det skärs istället för att förbli platt.
Befintliga metoder, begränsningar och framtida program
Wang et al.20 rapporterade ett jämförbart dissektionsprotokoll för isolering av pupalt epitel. Denna teknik kräver att poppan förblir i sitt fodral och snabbt skärs med en skalpell. Detta protokoll är inkompatibelt med tidigare live-avbildade prover, eftersom levande avbildning kräver att en stor del av pupalfallet tas bort. Eftersom puppor saknar styvhet manglade pupal bisection utanför fallet vävnaden, vilket inspirerade skapandet av detta protokoll. Tekniken som beskrivs här möjliggör isolering och fixering av notum, och den kan användas som det första steget för ett brett spektrum av andra metoder såsom kryosektion, in situ hybridisering eller elektronmikroskopi.
Denna teknik har vissa begränsningar. För det första är dissekering, fixering och färgning av notum mer tidskrävande än levande avbildning av fluorescerande märkta proteiner i notum, vilket endast kräver en enkel dissektion för att ta bort pupalfallet 9,23. För det andra, jämfört med dissektioner av andra Drosophila-vävnader, är denna dissektion svårare på grund av den tunna, bräckliga vävnaden och hydrofoba nagelbandet. För att helt enkelt visualisera proteiner i Drosophila-epitel är immunohistokemi på fasta embryon, larvvingskivor eller äggstockar lättare. Denna teknik gör det dock möjligt att para ihop kraften i levande avbildning med fixering och färgning, vilket gör det till ett kraftfullt verktyg när det väl behärskats.
En dissektions-/fixeringsteknik har vissa fördelar jämfört med levande avbildning. Basala (inre) strukturer kan lösas bättre med en basal vy (figur 5L,J). Viktigast av allt är levande avbildning begränsad till fluoroforer som måste levereras genetiskt, vilket ofta kräver långa genetiska korsningsscheman. Däremot tillåter det nuvarande protokollet applicering av fläckar, immunohistokemi och andra tekniker som kräver dissektion och fixering. Detta ökar dramatiskt antalet signaler som undersöks i vävnaden samtidigt som det potentiellt minskar tiden till experimentella resultat.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. M. Shane Hutson för att ha etablerat laserablationssystemet som används för pupal sår och hans bidrag till och feedback om att utveckla protokollet. Detta arbete stöddes av 1R01GM130130 till APM och M. Shane Hutson. JW stöddes av 2T32HD007502-21.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ½” Scotch Permanent Double-Sided tape | Scotch 3M | 665 | |
| 0.1-10 µL uTIP pipette tip | Biotix | M-0011-9FC | |
| 22 x 22 mm No. 0 thickness coverslips | Thomas Scientific | 1207Z28 | |
| 24 x 60 mm coverslip | Corning | 2980-246 | |
| 3M VetBond | 3M | 1469SB | Called "adhesive glue" in protocol |
| Anti-FasIII primary Mouse IgG2a | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | |
| Calcium Chloride | Fisher Chemical | c79-500 | |
| Cy3-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG2a | Jackson ImmunoResearch | 115-165-206 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542-1mg | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps | Fine Science Tools | No. 11254-20 | |
| Dumont #5 Fine Tip Forceps: Blunt | Fine Science Tools | No. 11254-20 | Heavily used and unsharpened forceps, or dulled with a whetstone |
| Fisherbrand Double frosted microscope slides | Fisher Scientific | 22-034-486 | |
| Fluorescent Light Source | Lumencor | Celesta 90-10512 | |
| Fly Stock: EGFP-tagged Histone H2A | Bloomington Drosophila Stock Center | 24163 | |
| Fly Vial Foam Plugs "Flugs" | Genesee Scientific | 49-101 | |
| Humidified Chamber: Foil-wrapped small container lined with filter paper saturated with water | Cole-Parmer | 759075D | A great humidified chamber can be made from the styrofoam box containing Cole-Parmer cuvettes, 759075D, filled with 50 ml water. |
| KimWipe | KimTech | 34155 | Called "Absorbent Tissue" in protocol |
| Nikon Ti2 Eclipse | Nikon | Eclipse Ti2-E | |
| NIS Elements Software | Nikon | AR | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) 16% | Ted Pella, Inc | 18505 | |
| Plastic Vials | Genesee Scientific | 32-114 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Fisher Scientific | 19038-1000 | |
| Stereo Microdissection Scope | Carl Zeiss | STEMI 2000 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | New or freshly sharpened scissors |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | Called " antifade mounting medium" in protocol |
| Vecta Shield with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Not ideal for pupal notum. |
| X-Light V2 Spinning Disc | Crest Optics | V2 L-FOV |
References
- Valon, L., et al. Robustness of epithelial sealing is an emerging property of local ERK feedback driven by cell elimination. Developmental Cell. 56 (12), 1700-1711 (2021).
- Levayer, R., Dupont, C., Moreno, E. Tissue crowding induces caspase-dependent competition for space. Current Biology. 26 (5), 670-677 (2016).
- Couturier, L., et al. Regulation of cortical stability by RhoGEF3 in mitotic sensory organ precursor cells in Drosophila. Biology Open. 6 (12), 1851-1860 (2017).
- Couturier, L., Mazouni, K., Corson, F., Schweisguth, F. Regulation of Notch output dynamics via specific E(spl)-HLH factors during bristle patterning in Drosophila. Nature Communications. 10, 3486 (2019).
- Fujisawa, Y., Shinoda, N., Chihara, T., Miura, M. ROS regulate caspase-dependent cell delamination without apoptosis in the drosophila pupal notum. iScience. 23, 101413 (2020).
- Besson, C., et al. Planar cell polarity breaks the symmetry of par protein distribution prior to mitosis in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 25 (8), 1104-1110 (2015).
- Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. Apoptosis ensures spacing pattern formation of drosophila sensory organs. Current Biology. 21, 278-287 (2011).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
- Moreira, C., Regan, J., Zaidman-Rémy, A., Jacinto, A., Prag, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods in Molecular Biology. 769, Clifton, N.J. 249-260 (2011).
- Guirao, B., et al. Unified quantitative characterization of epithelial tissue development. Elife. 4, 08519 (2015).
- Cristo, I., Carvalho, L., Ponte, S., Jacinto, A. Novel role for Grainy head in the regulation of cytoskeletal and junctional dynamics during epithelial repair. Journal of Cell Science. 131 (17), 213595 (2018).
- Bellaïche, Y., Gho, M., Kaltschmidt, J. A., Brand, A. H., Schweisguth, F. Frizzled regulates localization of cell-fate determinants and mitotic spindle rotation during asymmetric cell division. Nature Cell Biology. 3 (1), 50-57 (2001).
- Shannon, E. K. Multiple mechanisms drive calcium signal dynamics around laser-induced epithelial wounds. Biophysical Journal. 113 (7), 1623-1635 (2017).
- O'Connor, J. T., et al. Proteolytic activation of Growth-blocking peptides triggers calcium responses through the GPCR Mthl10 during epithelial wound detection. Developmental Cell. 56 (15), 2160-2175 (2021).
- Hartenstein, V., Posakony, J. W. Development of adult sensilla on the wing and notum of Drosophila melanogaster. Development. 107 (2), 389-405 (1989).
- Yeh, E., Zhou, L., Rudzik, N., Boulianne, G. L. Neuralized functions cell autonomously to regulate Drosophila sense organ development. The EMBO Journal. 19 (17), 4827-4837 (2000).
- Loubéry, S., et al. Uninflatable and notch control the targeting of sara endosomes during asymmetric division. Current Biology. 24 (18), 2142-2148 (2014).
- Kawamori, A., Shimaji, K., Yamaguchi, M. Dynamics of endoreplication during Drosophila posterior scutellar macrochaete development. PLoS One. 7 (6), 38714 (2012).
- Couturier, L., Schweisguth, F. Notch Signaling: Methods and Protocols. Bellen, H. J., Yamamoto, S. , Springer. New York. 79-86 (2014).
- Wang, W., Yoder, J. H. Drosophila pupal abdomen immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments. (56), e3139 (2011).
- Kiehart, D. P., et al. Cell Biology (Third Edition). Celis, J. E., et al. , Academic Press. 87-103 (2006).
- Bailey, E. C., Dehn, A. S., Gjelsvik, K. J., Besen-McNally, R., Losick, V. P. A Drosophila model to study wound-induced polyploidization. Journal of Visualized Experiments. (160), e61252 (2020).
- O’Connor, J. T., S, E. K., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Mounting Drosophila pupae for laser ablation and live imaging of the dorsal thorax. STAR Protocols. , (2022).
