Summary
ここで提示されるのは、市販の組織キットを用いた1匹または数匹の動物からの Caenorhabditisエレガンス ゲノムDNAの単純かつ比較的迅速な単離の説明である。得られたgDNA調製物は、PCRに好適な鋳型である。
Abstract
単一または少数の Caenorhabditis elegans からのゲノムDNA抽出は、ジェノタイピングライン用のPCR、クローニング、シーケンシングなど、多くの下流アプリケーションを持っています。 C. elegans からのゲノムDNA抽出のための伝統的なプロテイナーゼKベースの方法は数時間かかる。 C. elegans キューティクルを効果的に開封し、ゲノム DNA を抽出する市販の抽出キットは限られています。 C. elegans のゲノムDNAを抽出する簡単で高速(約15分)、費用対効果の高い方法が、教室や研究用途によく適していることがここで報告されています。このDNA抽出方法は、PCRを実行するための信頼性の高い鋳型を得るための出発物質として、単一または少数の後期幼虫(L4)または成虫線虫を使用するように最適化されています。この結果は、DNA品質がPCRによって異なるサイズの遺伝子標的を増幅するのに適しており、1反応あたり成人1人のゲノムDNAの50分の1に希釈しても、単一または数匹の動物のジェノタイピングを可能にすることを示している。報告されたプロトコルは、PCRベースのアプリケーション向けに、単一または少量の C. elegans サンプルからDNAテンプレートを迅速に製造するために確実に使用できます。
Introduction
ここでは、PCRベースのアプリケーションのためにDNAをアクセス可能にするために、Caenorhabditis elegansの溶解のための2つの関連するプロトコルが提示されています。PCRは、クローニングやシーケンシングのためのDNA断片のジェノタイピングや増幅など、多くの用途で使用される一般的に使用される分子技術です。小型(1mm)の自由生活型回虫C. elegansは、生物学的研究に人気のある動物システムです。単一の動物または数匹の動物から適切なゲノムDNAを得ることは、PCRによって配列を増幅するのに十分である。後期L4幼虫および成虫は、子宮内に〜1,000個の体細胞(いくつかの多核、倍数体細胞を含む)、生殖細胞、および(動物が雌雄同体である場合)子孫のみを含む1。しかしながら、これらの動物は、ゲノムDNA2を抽出するために破壊されなければならないキューティクルによって保護されている。PCR用の線虫ゲノムDNAテンプレートを調製するための標準的な方法は、複数のステップを伴い、数時間かかる。動物を最初にプロテイナーゼKを含むワーム溶解緩衝液(−70°C以下)中で少なくとも15〜45分間凍結する(いくつかのプロトコルではより長いことが推奨される)3、4、5、6。このステップは動物をひび割れさせます。
凍結後、動物をプロテイナーゼKが機能するために60〜65°Cで1時間インキュベートし、次いで酵素を95°Cで15〜30分間失活させる。 プロテイナーゼKは、DNAを分解するヌクレアーゼを破壊する。PCR前のプロテイナーゼKの不活性化は、プロテイナーゼKがDNAポリメラーゼを分解するのを防ぐために重要である。ここで説明する2つのキットベースのプロトコルは、日常の研究および教育ラボアプリケーションのために、単一の動物または少数の線虫のいずれかからゲノムDNAを抽出するための迅速で信頼性が高く、費用対効果の高い方法です。使用されたキットは、もともと動物組織、唾液、および毛髪からDNAを抽出するために製造業者によって最適化されました7。独自の組織調製溶液と抽出溶液を使用して細胞を溶解し、ゲノムDNAをアクセス可能にします。その後、独自の中和溶液がPCRを阻害する可能性のある成分(塩、イオン、Mg2+結合分子など)を中和します。
ジェノタイピングの際、1匹の動物を試験することができる。株がホモ接合性かどうかを判断する場合、1匹の動物から6匹以上の子孫を試験すると、系統がホモ接合性であるかどうかの高い信頼性が得られます(ヘテロ接合性の親から6つのホモ接合型変異体子孫をランダムに摘み取る確率は0.02%です[(1/4)6 × 100% = 0.02%])。この方法は1)簡単で、プロテイナーゼK法よりも少ないステップで、および2)鋳型調製時間を15分に短縮する。この研究の結果は、開発されたプロトコルが単一または少数のワームからゲノムDNAを抽出する際に堅牢に機能し、PCRを含む高度に精製されたDNAを必要としない下流アプリケーションに確実に使用できることを示しています。
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Protocol
1. C.エレガンスの メンテナンス
注:N2(野生型)および blmp-1(tm548)C.エレガン ス株を、標準線虫増殖培地(NGM)プレート上で20°Cで維持した。
- 2Lフラスコ内の973 mLの水に23.005 gのNGM粉末を溶解してNGMプレートを調製する。フラスコの開口部をアルミホイル(または通気可能なオートクレーブ可能なキャップ)で覆い、オートクレーブテープでカバーを固定します。オートクレーブは、粉末を溶解し、少なくとも30分の滅菌サイクルで内容物を滅菌する。
- 水浴中で培地を60°Cに冷却する。
- 冷却した培地に、25mLの滅菌1Mリン酸(KH2PO4)緩衝液、pH6.0;1mLの1M塩化カルシウム溶液;1mLの1M硫酸マグネシウム溶液を含む。
- マグネチックスタープレート上で媒体を攪拌して均一な混合物を得、不均一な冷却および固化を防止する(〜5分)。攪拌子が渦を作るのに十分な速さで回転するが、気泡が導入されるほど速くないことを確認してください(〜250-300rpm)。
- 各10cmのペトリプレート(合計で約40枚のプレート)に約25mLの培地を注ぎます。プレートを室温で一晩乾燥させます(通常16〜25°C)。
- エシェリヒア・コリOP50のコロニーを30-50 mLのLBブロス中で37°Cで一晩成長させる。
- 各プレートに500 μLの 大腸菌 OP50培養物を種まきし、使用前に室温(典型的には16〜25°C)で乾燥させる8。プレートを4°Cで最大3週間保管してください。
- C. elegansをワイヤーピックまたは他の方法を用いて播種プレートに移し、株に必要な温度でL4または成体段階まで成長させる(典型的には16〜25°C、ダウアーとして飢えた動物を播種した場合は1〜2日、動物を胚として播種した場合は3〜4日)8。
2. シングルワームDNA抽出
注:この方法は、単一のワーム(総容量1.8μL中に1つのワーム)からDNAを抽出するのに有用である。一度に複数のワームが溶解する場合は、マスターミックスを作成できます。
- サーモサイクラーを55°Cで10分間、続いて95°Cで3分間1サイクルプログラムします(溶解プログラム)。
- キットから抽出溶液0.8 μLを氷上の0.2 mL PCRチューブの内壁にアリコートします。キットから0.2 μLの組織調製溶液を抽出溶液の液滴に加える。ピペッティングで混ぜる。
- 解剖顕微鏡9でL4または成体動物を同定する。L4雌雄同体を特定するには、動物の真ん中に淡い半円として見える特徴的な外陰部を探します。成体の雌雄同体を特定するには、プレート上で最大の動物を探し、子宮内に楕円形の胚が見える可能性があります。
- 白金ワイヤーピックを用いて、選択された動物を溶液10に移す。
- チューブを室温で短時間(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)遠心分離し、チューブの底にある内容物を回収する。
- チューブをサーモサイクラーに置き、ステップ2.1で設定した溶解プログラムを実行します。
- プログラムが完了したら、チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。キットから0.8 μLの中和溶液を混合物に加える。ピペッティングで混ぜる。
- チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
- 溶解液をPCRに直接使用するか、将来の使用のために4°Cまたは-20°Cで保存してください。
注:抽出されたDNAは、少なくとも6ヶ月間、4°Cまたは−20°Cで安定である7。
3. 少数の個人のDNA抽出
注:この方法は、いくつかのワームからDNAを抽出するのに便利です。マスターミックスは、複数の株が一度に溶解される場合に調製することができる。
- サーモサイクラーを55°Cで10分間、続いて95°Cで3分間1サイクルプログラムします(溶解プログラム)。
- キットから抽出溶液 2.0 μL を氷上の 0.2 mL PCR チューブの内壁にアリコートします。キットから0.5 μLの組織調製溶液を抽出溶液の液滴に加える。ピペッティングで混ぜる。
- 解剖顕微鏡9下でL4または成体動物を同定する。L4雌雄同体は、動物の真ん中に淡い半円として見える特徴的な外陰部を有する。成体の雌雄同体はプレート上で最大の動物であり、子宮内に楕円形の胚が見えることがあります。
- 白金ワイヤーピックを用いて、数匹の動物を溶液に移す:9匹の動物は0.5 μLの溶解物あたり1匹相当のゲノムDNAを、16匹の動物は0.25 μL(3.5線虫/μL)で約1匹相当のゲノムDNAを収穫する10。
注:このボリュームに16匹を超える動物を移すことは困難です。 - チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
- チューブをサーモサイクラーに入れ、ステップ3.1で設定した溶解プログラムを実行します。
- プログラムが完了したら、チューブを短時間遠心分離し、氷の上に置きます。キットから2 μLの中和溶液を混合物に加える。ピペッティングで混ぜる。
- チューブを室温(2〜3秒、≤6,000rpm/2,000× g)で短時間遠心分離する。
- 溶解液をPCRに直接使用するか、将来の使用のために4°Cまたは-20°Cで保存してください。
注:抽出されたDNAは、少なくとも6ヶ月間、4°Cまたは−20°Cで安定である7。
4. PCR反応
注:このワーム溶解技術の1つの下流のアプリケーション、すなわち高速ポリメラーゼを使用して欠失変異を検出することが記載されている。1反応あたりのワームの1/50までの 希釈でPCRを成功させるためのゲノム鋳型DNAの産生における2つのワーム溶解プロトコルの有効性も実証されています。
- ステップ2およびステップ3で前述したように、野生型N2および変異株を用いて、単一のワームおよび16個のワームからDNAを抽出する。
- 野生型N2動物からシングルワームDNAの2倍、10倍、20倍、および50倍希釈液を調製する。
- 目的の配列に固有のプライマーとホットスタート PCR マスターミックスを使用して、メーカーのプロトコールに従って PCR 反応を設定します (表 1 および 表 2)。各反応では、1 μL の希釈されていない DNA または 2 μL の希釈 DNA を鋳型として使用します。
- ゲル電気泳動およびイメージング11によりPCR産物を確認する。
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Representative Results
単一または少数の野生型成虫からのゲノムDNAを、市販のキットまたは従来の溶解プロトコールを用いて抽出し、これら2つの方法の有効性を比較した。次いで、これらの溶解物をPCRのテンプレートとして使用し、〜2,100 bpのより大きな標的( blmp−1をコードする)または〜500 bpのより小さい標的( sma−10の一部をコードする)のいずれかを増幅した。どちらの方法も、適切なPCR産物を首尾よく得た(図1A)。
次に、キット抽出されたゲノムDNAが様々なDNAポリメラーゼの鋳型として機能する能力が実証された。抽出したゲノムDNAを鋳型として、異なる能力(速度、忠実度、製品サイズを含む)を有する4つのポリメラーゼを用いて0.5kbの産物を増幅した。予想されるサイズの生成物は、単成体溶解または9成人溶解からのテンプレートを使用して、これらのポリメラーゼによって生成された(図1B)。テンプレート配列を正しく増幅するPCRポリメラーゼのテンプレート配列および忠実度は、シークエンシングによって確認することができる(補足図S1)。この結果は、キットプロトコルから抽出されたゲノムDNAが、様々なポリメラーゼに適切な鋳型を提供することを示している。
PCR有効性は、市販のキットを用いて単一の動物から抽出された異なる濃度のゲノムDNAを用いて試験した。DNAを2倍、10倍、20倍、または50倍に希釈し、1反応あたりワームの約2分の1、10分の1、20分の1、および50分の1に相当するものをPCRに使用しました。これらのDNA鋳型濃度は、約2.1 kbのより大きな標的または約0.5 kbのより小さい標的のいずれかの増幅を支持した(図1C)12。0.5 kb PCR産物のDNA濃度依存的な収率は観察されたが、2.1 kb PCR産物の収率はすべての反応において同等に見えた。
これらのプロトコールがPCRジェノタイピングに適したC. elegansからゲノムDNAを産生することを実証するために、単一および16の野生型およびblmp-1機能喪失変異体(blmp-1(tm548))からゲノムDNAを抽出した。blmp-1遺伝子は、遠位先端細胞遊走、体の大きさ、および発生において重要な役割を有する転写因子をコードする12、13、14、15、16。blmp-1変異体は、エクソン3およびイントロン315の一部を除去する810 bp欠失を有する。プライマーは、野生型DNAテンプレートを使用すると2,134 bpの産物、blmp-1(-) DNAを使用すると1,324 bpの産物が得られるように設計されました。適切なサイズのPCR産物を、L4ステージ動物からのシングルワーム(反応あたり約0.5ワーム)または16ワーム溶解(反応あたり3.5ワーム)のいずれかの1 μLを使用して検出しました(図1D)。この結果は、いずれかのプロトコルを用いてキット抽出されたゲノムDNAが、遺伝子型株に対するPCRのための同様に有効なテンプレートを提供することを示している。
これらの結果は、単一および複数の動物からの市販の組織DNA抽出キットを用いた C. elegans ゲノムDNA調製物が、PCRのテンプレートとして確実に使用できることを示している。
図1:単一線虫および複数の線虫からの市販キットを用いたDNA調製物は、PCRによる堅牢な増幅を可能にする。 PCR 産物を 1x TAE バッファー (5 μL (A,B) または 10 μL (C,D) の 1% アガロースゲルにロードし、90 ~ 100 V で 30 分から 2 時間実行しました。2対数DNAラダーをすべてのゲルに使用した。(a)2つのプライマーセットを用いて鋳型を作成する従来のプロテイナーゼK法とキットによるDNA溶解の比較。野生型成虫を溶解し、1匹の動物に相当するものをすべての反応のテンプレートとして使用した。レーン 1 ~ 4、2.1 kb 製品。レーン1は、プロテイナーゼKによるシングルワーム溶解からのPCR、レーン2はキット法によるシングルワーム溶解からのPCR。レーン3は、プロテイナーゼKによる9匹のワーム溶解からのPCR、レーン4はキット法による9匹のワーム溶解からのPCR。レーン 5 ~ 8、0.5 KB 製品。レーン5は、プロテイナーゼKによるシングルワーム溶解からのPCR、レーン6はキット法によるシングルワーム溶解からのPCR。レーン7は、プロテイナーゼKによる9匹のワーム溶解からのPCR、レーン8はキット法による9匹のワーム溶解からのPCR。(B)DNA溶解のためのキット法は、複数のポリメラーゼによるPCRのための適切な鋳型を提供する。野生型成虫をキット法を用いて溶解し、0.5kb産物のPCRテンプレートとして動物の半分に相当するものを用いた。ポリメラーゼの詳細については、 材料表 を参照してください。レーン1は、高速ポリメラーゼによるシングルワーム溶解からのPCRである。レーン2は、高速ポリメラーゼによる9匹のワーム溶解からのPCRである。レーン3は、 Taq ポリメラーゼによるシングルワーム溶解からのPCRである。レーン4は、 Taq ポリメラーゼによる9匹のワーム溶解からのPCRである。レーン5は、高フィデリティポリメラーゼによるシングルワーム溶解からのPCRである。レーン6は、高忠実度ポリメラーゼによる9匹のワーム溶解からのPCRである。レーン7は、高速、高忠実度ポリメラーゼによるシングルワーム溶解からのPCRである。レーン8は、高速、高忠実度ポリメラーゼによる9匹のワーム溶解からのPCRである。(C)1つの野生型L4ワーム溶解の希釈物は、PCRのためのテンプレートを提供する。レーン 1 ~ 5、2.1 kb 製品。レーン 6 ~ 10、0.5 KB ターゲット。レーン1およびレーン6は、希釈されていないDNA。レーン2およびレーン7は、DNAを2倍希釈した。レーン3およびレーン8は、DNAを10倍希釈した。レーン4およびレーン9は、DNAを20倍希釈した。レーン5およびレーン10は、DNAを50倍希釈した。(D)1 μLの単一および16-ワームDNA調製物を鋳型として用いたPCRにより blmp-1 遺伝子座をジェノタイピングする。レーン1は、野生型シングルワーム溶解からのPCRである。レーン2、 blmp−1(−) シングルワーム溶解からのPCR。レーン3は、野生型16-ワーム溶解からのPCRである。レーン4は、 blmp−1(−)16 −ワーム溶解からのPCRである。略語:準備=調製方法;kb = キロベース;st. = 線虫期;dil. = DNAの希釈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| ターゲット | プライマー名 | 順序 | ||
| blmp-1 | フォワード | GCGTCAGGTAAGTTGTGATA | ||
| 逆 | CAGTTATTGCGGCTGTTGTT | |||
| SMA-10 | フォワード | AATGTGTGGCAAGGAATCG | ||
| 逆 | TGTCTGTCCAACGAGAAGTG | |||
| シークエンシング | 1 | CACATCCCGGACGCCTTAAT | ||
| 2 | CTAATTGTTTTCTACCTGGC | |||
表1:プライマーのリスト。
| ある。 | ポル A, ポル B, ポル D | ポル E |
| PCR マスターミックス | 12.5 μL | 12.5 μL |
| フォワードプライマー | 0.2 μM (最終濃度) | 0.5 μM (最終濃度) |
| リバースプライマー | 0.2 μM (最終濃度) | 0.5 μM (最終濃度) |
| 鋳型DNA | 変数 | 1 μL |
| ヌクレアーゼフリーの水 | 25 μL まで | 25 μL まで |
| B. | ポルC |
| PCR 5x バッファー | 2.5 ミリリットル |
| 10 mM dNTP | 2.0 μL |
| フォワードプライマー | 0.2 μM (最終濃度) |
| リバースプライマー | 0.2 μM (最終濃度) |
| 鋳型DNA | 変数 |
| ポリメラーゼ | 0.5 μL |
| ヌクレアーゼフリーの水 | 25 μL まで |
| C. 図1Bに使用したPCRプログラム | ||
| 温度 | 時間 | サイクル |
| 98°C | 2分 | 1 |
| 98°C | 1分 | 30 |
| 55°C | 1分 | |
| 72 °C | 1分 | |
| 72 °C | 1分 | 1 |
| 4°C | 持つ | |
| D. 補足図S1に用いたPCRプログラム | ||
| 温度 | 時間 | サイクル |
| 98°C | 30秒 | 1 |
| 98°C | 10秒 | 30 |
| 57 °C | 20秒 | |
| 72 °C | 50秒 | |
| 72 °C | 2分 | 1 |
| 4°C | 持つ | |
表2:PCR反応成分。
補足図S1:市販キットで調製したゲノムDNAの品質の確認のためのシークエンシング。 2つのシーケンシング反応の結果は、16-ワーム溶解からの高速、高忠実度ポリメラーゼ(Pol E)によって増幅された1,600ヌクレオチド以上のDNAの予想される配列と完全に一致します(表1、 表2A、および 表2D)。シーケンシング読み取り端は、低品質のベース読み取りを除去するためにトリミングされました。アラインメントは、EMBL-EBIマルチプル配列アラインメントツールMUSCLE(MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17を用いて行った。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
C. elegansの遺伝子型を決定することは、新しいC. elegans株を作成するための遺伝子交配を行う際の重要なステップです。単一または少数のC.エレガンスを用いたゲノムDNA抽出は、C.エレガンスのジェノタイピングにおける重要なステップである。このプロトコールは、市販のキットを用いたC. elegansからのゲノムDNA抽出を記載する。この方法は高速で、堅牢に機能します。この方法を使用して抽出されたゲノムDNAは、ジェノタイピング、シーケンシング、クローニングなどの下流アプリケーションに使用できます。記載されたDNA抽出方法は、DNAテンプレートの出発物質として単一および数匹のL4または成体動物を使用するC. elegans遺伝子交配のジェノタイピングに最適化されている。1匹の動物の50分の1(図1C)から3.5匹の動物(図1D)に相当するものが、PCRによって標的DNA配列を増幅するための適切な鋳型を提供しました。このプロトコール(希釈付き)は、1匹のワームから最大45回の反応、および16匹の動物から100回の反応に対して十分なテンプレート(2μL/反応で)を生成します。反応ごとに1つのワームを使用しても、これらのプロトコルはC. elegansからDNAを抽出する費用対効果の高い方法を提供します。プロトコルのシンプルさ、堅牢性、迅速性を考えると、研究用と教室用の両方のアプリケーションに適しています。
このプロトコルには少量の試薬のピペッティングが含まれるため、一貫性を確保するために、複数の反応のためのマスターミックスの調製、優れたピペッティング技術、および十分に較正されたピペットの使用が推奨されます。単一または 9-16 匹のライズから 0.5 ~ 1 μL の希釈されていない DNA テンプレートを使用すると、通常、ホットスタート PCR マスターミックスを使用した 25 μL の PCR 反応で機能しますが、テンプレート濃度の最適化が必要な場合があります。試薬は、実験の間、氷上に保たれなければならない。酵素性能を低下させる可能性のあるDNA抽出溶液の凍結融解の繰り返しを避けるために、試薬を小分けして−20°Cで保存することをお勧めします。
PCR を必要とするダウンストリームアプリケーションでは、ホットスタートの高速 PCR マスターミックスを使用すると、市販のティッシュキットで提供される PCR 反応ミックスと比較して合計時間がさらに短縮されます。高速ポリメラーゼは 5 ~ 10 秒で 1 kb 未満の生成物を増幅できますが (ポリメラーゼの説明については材料表および表 2 を参照)、キットの PCR 反応ミックスは、増幅速度が約 1 kb/分7 の Taq DNA ポリメラーゼを使用します。一部のPCRからの製品は、電気泳動のためにアガロースゲルに直接ロードすることができ、ステップと時間をさらに短縮することができます。この反応緩衝液は、制限酵素消化とも適合する。ハイフィデリティDNAポリメラーゼは、このプロトコルを使用して抽出されたDNAでも堅牢に動作します(図1B)。使用されるポリメラーゼは、キット抽出されたテンプレートを使用して一貫して機能しましたが、他のポリメラーゼを使用すると、テンプレート、プライマーセットの特性、製品サイズ、および必要な忠実度に応じて、より良い結果が得られる場合があります。PCR後に、増幅されたターゲットバンドがない、または追加のバンドが増幅されないなどの問題が発生した場合は、プライマー作業条件またはDNAテンプレート濃度のさらなる最適化が必要な場合があります。野生型DNAテンプレートや、機能することが証明されているプライマーの使用など、適切なコントロールを使用することを強くお勧めします。
この方法は、高純度の精製または高収率のDNAテンプレートを必要とする用途には適していません。調製された動物の数および反応量はスケールアップされ得るが、この方法を使用して調製されたDNAは生物の破片から分離されず、全ゲノムシーケンシングなどの高感度用途には十分に純粋ではない可能性がある。
既存の従来のゲノムDNA抽出法と比較して、この方法の主な利点は、より短い時間とより簡単で簡単なステップを含む。将来的には、この方法はスケールアップされ、他の下流用途のために C. elegans ゲノムDNAを抽出するために適応され、他の線虫種からDNAを抽出するために使用することができる。
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Disclosures
著者らは、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
N2株および 大腸菌 OP50細菌は、NIH研究基盤プログラム局(P40 OD010440)から資金提供を受けている Caenorhabditis Genetics Center(CGC)から入手した。 blmp-1(tm548) 株は、国立生物資源プロジェクトから入手した。著者らはWormBaseに感謝している。この研究は、NIH R01GM097591からT.L.G.、テキサス女子大学からT.L.G.への内部資金提供、およびTWUの学生研究センターからM.F.L.への資金提供によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
References
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