Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Мелкомасштабная экстракция геномной ДНК Caenorhabditis elegans

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/63716
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Texas Woman’s University

Summary

Здесь представлено описание простого и относительно быстрого выделения геномной ДНК Caenorhabditis elegans от одного или нескольких животных с использованием коммерчески доступного набора тканей. Полученный препарат гДНК является подходящим шаблоном для ПЦР.

Abstract

Геномная экстракция ДНК из одного или нескольких Caenorhabditis elegans имеет много последующих применений, включая ПЦР для генотипирования линий, клонирования и секвенирования. Традиционные методы протеиназы на основе K для геномной экстракции ДНК из C. elegans занимают несколько часов. Коммерческие наборы для экстракции, которые эффективно разрывают кутикулу C. elegans и извлекают геномную ДНК, ограничены. Здесь сообщается о простом, быстром (~ 15 мин) и экономически эффективном методе извлечения геномной ДНК C. elegans , который хорошо подходит для классных и исследовательских приложений. Этот метод экстракции ДНК оптимизирован для использования одной или нескольких поздних личинок (L4) или взрослых нематод в качестве исходного материала для получения надежного шаблона для выполнения ПЦР. Результаты показывают, что качество ДНК подходит для амплификации генных мишеней разных размеров с помощью ПЦР, что позволяет генотипировать одного или нескольких животных даже при разведении до одной пятидесятой геномной ДНК от одного взрослого человека за реакцию. Сообщенные протоколы могут быть надежно использованы для быстрого получения шаблона ДНК из одного или небольшого образца C. elegans для приложений на основе ПЦР.

Introduction

Здесь представлены два связанных протокола для лизиса Caenorhabditis elegans, чтобы сделать ДНК доступной для приложений на основе ПЦР. ПЦР является широко используемым молекулярным методом, используемым для многих применений, включая генотипирование и амплиферацию фрагментов ДНК для клонирования и секвенирования, среди прочих. Маленький (1 мм), свободно живущий круглый червь C. elegans является популярной животной системой для биологических исследований. Получение подходящей геномной ДНК от одного животного или нескольких животных достаточно для амплиации последовательности с помощью ПЦР. Поздние личинки L4 и взрослые особи содержат только ~ 1000 соматических клеток (включая некоторые многоядерные, полиплоидные клетки), половые клетки и (если животное является гравидным гермафродитом) потомство в утробе матери1. Однако эти животные защищены кутикулой, которая должна быть нарушена для извлечения геномной ДНК2. Стандартные методы подготовки шаблона геномной ДНК нематоды для ПЦР включают в себя несколько шагов и занимают несколько часов. Животных сначала замораживают в буфере лизиса червей, содержащем протеиназу K (−70 °C или ниже) в течение не менее 15-45 мин (более длительный рекомендуется некоторыми протоколами)3,4,5,6. Этот шаг раскалывает животных.

После замораживания животных инкубируют в течение 1 ч при 60-65 °С для работы протеиназы К, затем фермент инактивируют в течение 15-30 мин при 95 °С. Протеиназа К разрушает нуклеазы, которые разрушают ДНК. Инактивация протеиназы К перед ПЦР важна для предотвращения деградации протеиназы К ДНК-полимеразы. Два описанных здесь протокола на основе наборов являются быстрыми, надежными и экономически эффективными методами извлечения геномной ДНК либо из одного животного, либо из нескольких нематод для повседневных исследований и обучения лабораторным приложениям. Используемый набор был первоначально оптимизирован производителем для извлечения ДНК из тканей животных, слюны и волос7. Он использует запатентованный раствор для подготовки тканей и экстракционный раствор для лизирования клеток и делает геномную ДНК доступной. Запатентованный нейтрализующий раствор затем нейтрализует компоненты, которые могут ингибировать ПЦР (например, соли, ионы и Mg2+-связывающие молекулы).

При генотипировании может быть протестировано одно животное. При определении того, является ли штамм гомозиготным, тестирование шести или более потомков от одного животного дает высокую уверенность в том, что линия гомозиготна или нет (существует 0,02% вероятность случайного выбора шести гомозиготных мутантных потомков от гетерозиготного родителя [(1/4)6 × 100% = 0,02%]). Этот метод 1) является простым, с меньшим количеством шагов, чем метод протеиназы К, и 2) сокращает время приготовления шаблона до 15 минут. Результаты этой работы демонстрируют, что разработанный протокол надежно работает при извлечении геномной ДНК из одного или нескольких червей, которые могут быть надежно использованы для последующих применений, не требующих высокоочищенной ДНК, включая ПЦР.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Обслуживание C. elegans

ПРИМЕЧАНИЕ: Штаммы N2 (дикий тип) и blmp-1(tm548) C. elegans поддерживались на стандартных пластинах среды роста нематод (NGM) при 20 °C.

  1. Приготовьте пластины NGM, растворив 23,005 г порошка NGM в 973 мл воды в колбе 2 л. Накройте отверстие колбы алюминиевой фольгой (или автоклавируемым колпачком, позволяющим вентиляцию) и закрепите покрытие автоклавной лентой. Автоклав для растворения порошка и стерилизации содержимого с циклом стерилизации не менее 30 мин.
  2. Охладите среду до 60 °C на водяной бане.
  3. К охлаждаемой среде добавляют 25 мл стерильного буфера 1 Мфосфата (KH2PO4), рН 6,0; 1 мл 1 М раствора кальция хлорида; и 1 мл 1 М раствора сульфата магния.
  4. Перемешайте среду на магнитной перемешиваемой пластине для получения однородной смеси и предотвращения неравномерного охлаждения и затвердевания (~5 мин). Убедитесь, что перемешивающий стержень вращается достаточно быстро, чтобы создать вихрь, но не так быстро, чтобы пузырьки вводились (~ 250-300 оборотов в минуту).
  5. Налейте ~ 25 мл среды в каждую 10 см пластину Петри (всего ~ 40 пластин). Высушите пластины при комнатной температуре в течение ночи (обычно 16-25 °C).
  6. Вырастите колонию Escherichia coli OP50 в 30-50 мл бульона LB в течение ночи при 37 °C.
  7. Посейте каждую пластину 500 мкл культуры E. coli OP50 и дайте им высохнуть при комнатной температуре перед использованием (обычно 16-25 °C)8. Хранить пластины при температуре 4 °C до 3 недель.
  8. Перенесите C. elegans на семенные пластины с помощью проволочного кирки или другого метода и дайте им вырасти до L4 или взрослой стадии при температуре, необходимой для штамма (обычно 16-25 ° C, 1-2 дня, если животные были покрыты голодом как дауэры, 3-4 дня, если животные были покрыты как эмбрионы)8.

2. Извлечение ДНК одного червя

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод полезен для извлечения ДНК из одного червя (одного червя на 1,8 мкл общего объема). Мастер-микс может быть сделан, если несколько червей будут лизироваться одновременно.

  1. Запрограммируйте термоциклер на один цикл при 55 °C в течение 10 мин с последующим 95 °C в течение 3 мин (программа лизиса).
  2. Аликвота 0,8 мкл экстракционного раствора из комплекта на внутреннюю стенку 0,2 мл ПЦР-трубки на льду. Добавьте 0,2 мкл раствора тканевого препарата из набора в каплю экстракционного раствора. Перемешать путем пипетки.
  3. Идентификация L4 или взрослого животного под рассекающим микроскопом9. Чтобы идентифицировать гермафродиты L4, ищите характерную вульву, которая видна как бледный полукруг в середине животного. Идентифицируйте взрослых гермафродитов, ища самых крупных животных на пластине, которые могут иметь овальные эмбрионы, видимые в их матке.
  4. С помощью платиновой проволоки переведите выбранное животное в раствор10.
  5. Центрифугируйте трубку ненадолго (2-3 с, ≤6000 об/мин/2000 × г) при комнатной температуре для сбора содержимого на дне трубки.
  6. Поместите трубку в термоциклер и запустите программу лизиса, установленную на шаге 2.1.
  7. Когда программа будет завершена, ненадолго центрифугируйте трубку и поместите ее на лед. Добавить в смесь 0,8 мкл нейтрализующего раствора из набора. Перемешать путем пипетки.
  8. Ненадолго центрифугируйте трубку при комнатной температуре (2-3 с, ≤6000 об/мин/2 000 × г).
  9. Непосредственно используйте лизат для ПЦР или храните его при 4 °C или −20 °C для будущего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экстрагированная ДНК стабильна при 4 °C или −20 °C в течение не менее 6 месяцев7.

3. Извлечение ДНК нескольких особей

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод полезен для извлечения ДНК из нескольких червей. Мастер-микс может быть приготовлен, если несколько штаммов будут лизироваться одновременно.

  1. Запрограммируйте термоциклер на один цикл при 55 °C в течение 10 мин с последующим 95 °C в течение 3 мин (программа лизиса).
  2. Aliquot 2,0 мкл экстракционного раствора из комплекта на внутреннюю стенку ПЦР-трубки 0,2 мл на льду. Добавьте 0,5 мкл раствора тканевого препарата из набора в каплю экстракционного раствора. Перемешать путем пипетки.
  3. Идентифицируйте L4 или взрослых животных под рассекающим микроскопом9. Гермафродиты L4 имеют характерную вульву, которая видна как бледный полукруг в середине животного. Взрослые гермафродиты являются самыми крупными животными на пластине и могут иметь овальные эмбрионы, видимые в их матке.
  4. Используя платиновый проволочный отбор, переведите несколько животных в раствор: 9 животных дают 1 животный эквивалент геномной ДНК на 0,5 мкл лизата, а 16 животных дают ~ 1 животный эквивалент геномной ДНК в 0,25 мкл (3,5 нематода/ мкл)10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трудно перенести в этот объем более 16 животных.
  5. Ненадолго центрифугируйте трубку при комнатной температуре (2-3 с, ≤6000 об/мин/2 000 × г).
  6. Поместите трубку в термоциклер и запустите программу лизиса, установленную на шаге 3.1.
  7. Когда программа будет завершена, ненадолго центрифугируйте трубку и поместите ее на лед. Добавить в смесь 2 мкл нейтрализующего раствора из набора. Перемешать путем пипетки.
  8. Ненадолго центрифугируйте трубку при комнатной температуре (2-3 с, ≤6000 об/мин/2 000 × г).
  9. Непосредственно используйте лизис для ПЦР или храните его при 4 °C или −20 °C для будущего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экстрагированная ДНК стабильна при 4 °C или −20 °C в течение не менее 6 месяцев7.

4. Реакция ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Описано одно последующее применение этого метода лизиса червей, обнаруживающее мутацию делеции с использованием быстрой полимеразы. Также продемонстрирована эффективность двух протоколов лизиса червей в получении геномной шаблонной ДНК для успешной ПЦР при разведении до 1/50-й доли червя за реакцию.

  1. Извлеките ДНК из одного червя и 16 червей, используя дикий тип N2 и мутантные штаммы, как описано выше в Шагах 2 и 3.
  2. Приготовьте 2-, 10-, 20- и 50-кратное разведение ДНК одного червя у диких животных N2 типа.
  3. Настраивайте реакции ПЦР в соответствии с протоколом производителя с использованием праймеров, специфичных для интересующей последовательности, и мастер-микса ПЦР с горячим запуском (Таблица 1 и Таблица 2). Используйте 1 мкл неразбавленной ДНК или 2 мкл разбавленной ДНК в качестве шаблона в каждой реакции.
  4. Подтвердите продукты ПЦР с помощью гелевого электрофореза и визуализации11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Геномная ДНК из одного или нескольких взрослых особей дикого типа была извлечена с использованием коммерческого набора или традиционного протокола лизиса для сравнения эффективности этих двух методов. Эти лизаты затем использовались в качестве шаблонов для ПЦР для усиления либо большей цели ~2 100 bp (кодирование blmp-1), либо меньшей цели ~500 bp (кодирование части sma-10). Оба метода успешно дали соответствующие продукты ПЦР (рисунок 1А).

Далее была продемонстрирована способность геномной ДНК, экстрагированной набором, служить шаблоном для различных ДНК-полимераз. Извлеченная геномная ДНК использовалась в качестве шаблона для амплификации продукта размером 0,5 кб с использованием четырех полимераз, которые обладают различными возможностями (включая скорость, точность и размер продукта). Продукты ожидаемых размеров были получены этими полимеразами с использованием шаблона из лизиса одного взрослого человека или лизиса с девятью взрослыми (рисунок 1B). Шаблонная последовательность и точность полимераз ПЦР для правильной амплификации шаблонной последовательности могут быть подтверждены секвенированием (дополнительный рисунок S1). Этот результат демонстрирует, что геномная ДНК, извлеченная из протоколов набора, обеспечивает подходящий шаблон для ряда полимераз.

Эффективность ПЦР была проверена с использованием различных концентраций геномной ДНК, извлеченной из одного животного с использованием коммерческого набора. ДНК разбавляли в 2, 10, 20 или 50 раз, и эквивалент примерно половины, одной десятой, двадцатой и одной пятидесятой червя за реакцию использовали для ПЦР. Эти концентрации шаблона ДНК поддерживали амплификацию либо большей цели ~2,1 кб, либо меньшей цели ~0,5 кб (рисунок 1C)12. В то время как наблюдался зависящий от концентрации ДНК выход продукта ПЦР 0,5 кб, выход продукта ПЦР 2,1 кб казался эквивалентным во всех реакциях.

Чтобы продемонстрировать, что эти протоколы производят геномную ДНК из C. elegans, подходящую для генотипирования ПЦР, геномная ДНК была извлечена из одного и 16 мутантов дикого типа и blmp-1 с потерей функции (blmp-1 (tm548)). Ген blmp-1 кодирует фактор транскрипции с важной ролью в миграции дистальных клеток кончика, размере тела и развитии 12,13,14,15,16. Мутант blmp-1 имеет делецию 810 bp, которая удаляет части экзона 3 и интрона 315. Были разработаны праймеры, которые приводят к продукту 2,134 bp при использовании шаблона ДНК дикого типа и продукту 1,324 bp, если используется ДНК blmp-1(-). Продукты ПЦР соответствующих размеров были обнаружены с использованием 1 мкл либо одного червя (около 0,5 червей на реакцию), либо лизиса 16 червей у животных, стадированных L4 (3,5 червя на реакцию) (рисунок 1D). Этот результат показывает, что извлеченная набором геномная ДНК с использованием любого протокола обеспечивает одинаково эффективные шаблоны для ПЦР и линий генотипа.

Эти результаты показывают, что препараты геномной ДНК C. elegans с использованием коммерческого набора для экстракции тканевой ДНК от одного и нескольких животных могут быть надежно использованы в качестве шаблонов для ПЦР.

Figure 1
Рисунок 1: Препараты ДНК с использованием коммерческого набора из одиночных нематод и нескольких нематод обеспечивают надежную амплификацию с помощью ПЦР. Продукты ПЦР нагружали 1% агарозным гелем в 1x TAE буфер (5 мкл (A,B) или 10 мкл (C,D) и запускали при 90-100 В в течение 30 мин до 2 ч. Для всех гелей использовалась 2-логарифмическая ЛЕСТНИЦА ДНК. (A) Сравнение лизиса ДНК по набору с традиционными методами протеиназы K для создания шаблона с использованием двух наборов праймеров. Взрослые особи дикого типа были лизированы, и эквивалент одного животного использовался в качестве шаблона для всех реакций. Дорожки 1-4, 2.1 kb изделие. Полоса 1, ПЦР из лизиса одного червя протеиназой К. Лейн 2, ПЦР из лизиса одного червя методом набора. Полоса 3, ПЦР из лизиса червей девяти червей протеиназой К. Лейн 4, ПЦР из лизиса червей девяти червей методом набора. Дорожки 5-8, 0.5 kb изделие. Полоса 5, ПЦР из лизиса одного червя протеиназой К. Лейн 6, ПЦР из лизиса одного червя методом набора. Полоса 7, ПЦР из лизиса червей девяти червей протеиназой K. Lane 8, ПЦР из лизиса червей девяти червей методом набора. (B) Метод набора для лизиса ДНК обеспечивает подходящий шаблон для ПЦР несколькими полимеразами. Взрослых особей дикого типа лизировали с использованием метода набора, а эквивалент половины животного использовался в качестве шаблона ПЦР для продукта размером 0,5 кб. Смотрите Таблицу материалов для деталей полимеразы. Полоса 1, ПЦР из лизиса одного червя с высокоскоростной полимеразой. Полоса 2, ПЦР из лизиса девяти червей с высокоскоростной полимеразой. Полоса 3, ПЦР из лизиса одного червя с taq-полимеразой . Полоса 4, ПЦР из лизиса девяти червей с taq-полимеразой . Полоса 5, ПЦР из лизиса одного червя с высокоточной полимеразой. Полоса 6, ПЦР из лизиса девяти червей с высокоточной полимеразой. Полоса 7, ПЦР из лизиса одного червя с высокоскоростной, высокоточной полимеразой. Полоса 8, ПЦР из лизиса девяти червей с высокоскоростной высокоточной полимеразой. (C) Разбавления одного лизиса червей L4 дикого типа служат образцом для ПЦР. Дорожки 1-5, 2.1 kb изделие. Полосы 6-10, 0,5 кб мишень. Полоса 1 и полоса 6, неразбавленная ДНК. Полоса 2 и полоса 7, 2-кратная разбавленная ДНК. Полоса 3 и полоса 8, 10-кратная разбавленная ДНК. Полоса 4 и полоса 9, 20-кратная разбавленная ДНК. Полоса 5 и полоса 10, 50-кратная разбавленная ДНК. (D) Генотипирование локуса blmp-1 методом ПЦР с использованием 1 мкл препаратов ДНК одного и 16 червей в качестве шаблона. Полоса 1, ПЦР из лизиса одного червя дикого типа. Полоса 2, ПЦР из лизиса одного червя blmp-1(-). Полоса 3, ПЦР из лизиса диких 16 червей. Полоса 4, ПЦР из blmp-1(-) 16-червячного лизиса. Сокращения: prep = способ приготовления; kb = килобаза; st. = стадия нематоды; dil. = разбавление ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Цель Название грунтовки Последовательность
блмп-1 вперёд GCGTCAGGTAAGTTGTGATA
обратный CAGTTATTGCGGCTGTTGTTTTTTTT
СМА-10 вперёд AATGTGTGGCAAGGAATCG
обратный TGTCTGTCCAACGAGAAGTG
секвенирование 1 CACATCCCGGACGCCTTAAT
2 CTAATTGTTTTCTACCTGGC

Таблица 1: Перечень грунтовок.

A. Пол А, Пол Б, Пол Д Пол Е
ПЦР Мастер Микс 12.5 мкл 12.5 мкл
Грунтовка вперед 0,2 мкМ (конечная концентрация) 0,5 мкМ (конечная концентрация)
Обратная грунтовка 0,2 мкМ (конечная концентрация) 0,5 мкМ (конечная концентрация)
шаблон ДНК переменная 1 мкл
Вода без нуклеаз до 25 мкл до 25 мкл
B. Пол С
ПЦР 5x буфер 2.5 мкл
10 мМ дНТП 2.0 мкл
Грунтовка вперед 0,2 мкМ (конечная концентрация)
Обратная грунтовка 0,2 мкМ (конечная концентрация)
шаблон ДНК переменная
полимераза 0.5 мкл
Вода без нуклеаз до 25 мкл
C. Программа ПЦР, используемая для рисунка 1B
температура Время Циклов
98 °С 2 мин 1
98 °С 1 мин 30
55 °С 1 мин
72 °С 1 мин
72 °С 1 мин 1
4 °С держать
D. Программа ПЦР, используемая для дополнительного рисунка S1
температура Время Циклов
98 °С 30 с 1
98 °С 10 с 30
57 °С 20 с
72 °С 50 с
72 °С 2 мин 1
4 °С держать

Таблица 2: Компоненты реакции ПЦР.

Дополнительный рисунок S1: Секвенирование для подтверждения качества геномной ДНК, полученной с помощью коммерческого набора. Результаты двух реакций секвенирования полностью соответствуют ожидаемой последовательности из более чем 1 600 нуклеотидов ДНК, амплифицированной высокоскоростной высокоточной полимеразой (Pol E) из лизиса 16 червей (Таблица 1, Таблица 2A и Таблица 2D). Концы чтения секвенирования были обрезаны, чтобы удалить некачественные базовые чтения. Выравнивание выполнялось с помощью инструмента выравнивания нескольких последовательностей EMBL-EBI MUSCLE (MUltiple Sequence Comparison by Log-Expectation)17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Определение генотипов C. elegans является важным шагом при выполнении генетических скрещиваний для создания новых штаммов C. elegans . Геномная экстракция ДНК с использованием одного или нескольких C. elegans является решающим шагом в генотипировании C. elegans. Этот протокол описывает извлечение геномной ДНК из C. elegans с использованием коммерческого набора. Этот метод является быстрым и надежно работает. Геномная ДНК, извлеченная с помощью этого метода, может быть использована для последующих применений, включая генотипирование, секвенирование и клонирование. Описанный метод экстракции ДНК был оптимизирован для генотипирования генетических скрещиваний C. elegans с использованием одиночных и нескольких L4 или взрослых животных в качестве исходного материала для шаблона ДНК. Эквивалент одной пятидесятой части животного (рисунок 1С) до 3,5 животных (рисунок 1D) обеспечил подходящий шаблон для амплификации целевых последовательностей ДНК с помощью ПЦР. Этот протокол (с разбавлением) дает достаточно шаблона (при 2 мкл/реакцию) для максимум 45 реакций от одного червя и для 100 реакций от 16 животных. Даже используя одного червя на реакцию, эти протоколы обеспечивают экономически эффективный способ извлечения ДНК из C. elegans. Учитывая простоту, надежность и быстроту протокола, он хорошо подходит как для исследований, так и для приложений в классе.

Поскольку протокол включает в себя пипетирование небольших объемов реагентов, для обеспечения согласованности рекомендуется приготовление мастер-смеси для нескольких реакций, хорошую технику пипетирования и использование хорошо откалиброванных пипеток. Использование 0,5-1 мкл неразбавленного шаблона ДНК из одно- или 9-16-животных лизов обычно работает для 25-мкл ПЦР-реакции с использованием мастер-смеси ПЦР с горячим запуском, но может потребоваться оптимизация концентрации шаблона. Реагенты необходимо держать на льду в течение всего эксперимента. Чтобы избежать повторного замораживания-оттаивания растворов для экстракции ДНК, которые могут снизить эффективность фермента, рекомендуется, чтобы реагенты были аликвотированы и сохранены при -20 °C.

Для последующих применений, требующих ПЦР, использование высокоскоростной мастер-смеси ПЦР с горячим запуском еще больше сокращает общее время по сравнению с реакционной смесью ПЦР, предоставляемой в коммерческом наборе тканей. Высокоскоростные полимеразы могут амплифицировать продукты размером менее 1 кб за 5-10 с (см. Таблицу материалов и Таблицу 2 для описания полимеразы), в то время как в реакционной смеси ПЦР набора используется ДНК-полимераза Taq со скоростью амплификации ~ 1 кб / мин7. Продукты из некоторых ПЦР могут быть непосредственно загружены в агарозный гель для электрофореза, что еще больше сокращает этапы и время. Этот реакционный буфер также совместим с перевариванием фермента рестрикции. Высокоточные ДНК-полимеразы также надежно работают с ДНК, извлеченной с использованием этого протокола (рисунок 1B). В то время как используемые полимеразы последовательно работали с использованием шаблона, извлеченного набором, использование других полимераз может обеспечить лучшие результаты в зависимости от шаблона, свойств набора грунтовки, размера продукта и требуемой точности. При возникновении проблем после ПЦР, таких как отсутствие амплодированной целевой полосы или дополнительных полос, может потребоваться дальнейшая оптимизация условий работы праймера или концентрации шаблона ДНК. Настоятельно рекомендуется использовать соответствующие средства контроля, включая шаблон ДНК дикого типа и использование праймеров, которые доказали свою эффективность.

Этот метод не будет подходить для применений, требующих высокоочищенного или высокого выхода шаблона ДНК. В то время как количество подготовленных животных и объем реакции могут быть увеличены, ДНК, полученная с использованием этого метода, не отделена от обломков организма и может быть недостаточно чистой для высокочувствительных применений, таких как секвенирование всего генома.

Основные преимущества этого метода по сравнению с существующими традиционными методами извлечения геномной ДНК включают более короткое время и более простые и легкие шаги. В будущем этот метод может быть расширен, адаптирован для извлечения геномной ДНК C. elegans для других последующих применений и использован для извлечения ДНК из других видов нематод.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Штамм N2 и бактерии E. coli OP50 были получены из Центра генетики Caenorhabditis (CGC), который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Штамм blmp-1(tm548) был получен в результате Национального проекта биоресурсов, Япония. Авторы благодарят WormBase. Эта работа была поддержана NIH R01GM097591 для T.L.G., внутренним финансированием Техасского женского университета для T.L.G и Центром студенческих исследований TWU для M.F.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoclave tape Defend 43237-2
aluminium foil, heavy duty Reynolds Wrap 2182934
calcium chloride Millipore Sigma 102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) Sigma-Aldrich Co. LLC XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer Fisher Scientific 11-100-495H
LB media, Lennox, capsules MP Biomedicals, LLC 3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous Thermo Scientific AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge Labnet International, Inc. PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs, Inc. M0515S "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder US Biological Life Sciences N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs, Inc. M0531S "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers Integrated DNA Technologies custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase Takara Bio Inc. R050B "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) New England Biolabs, Inc. N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix Takara Bio Inc. RR350A "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix Sigma-Aldrich Co. LLC P4600 "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler Applied Biosystems A24812
stir bar Fisher Scientific 14-512-126
vortex mixer Fisher Scientific 2215365
worm pick Genesee Scientific Corporation 59-AWP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
  2. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
  3. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
  4. Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
  5. Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
  6. Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
  7. Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).
  9. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
  11. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
  12. Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
  13. Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
  14. Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
  15. Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
  16. Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
  17. Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
  18. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).

Tags

Биология Выпуск 184 Извлечение ДНК Caenorhabditis elegans лизис червей генотипирование геномная ДНК ПЦР
Мелкомасштабная экстракция <em>геномной ДНК Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madhu, B., Lakdawala, M. F.,… More

Madhu, B., Lakdawala, M. F., Gumienny, T. L. Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA. J. Vis. Exp. (184), e63716, doi:10.3791/63716 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter