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Analyse du type de fibre et de la teneur en gouttelettes lipidiques dans le muscle squelettique

Published: June 8, 2022 doi: 10.3791/63718
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Endocrinology, Diabetes and Nutrition Unit, Institute of Experimental and Clinical Research, Medical Sector, Université Catholique de Louvain, 2Departamento de Fisiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla

Summary

De plus en plus de preuves indiquent qu’une infiltration excessive de lipides à l’intérieur du muscle squelettique entraîne une lipotoxicité et un diabète. Ici, nous présentons un protocole complet, y compris le traitement des tissus, la coloration avec Bodipy, l’acquisition d’images et l’analyse, pour quantifier la taille, la densité et la distribution subcellulaire des gouttelettes lipidiques d’une manière spécifique au type de fibre.

Abstract

L’infiltration lipidique des muscles squelettiques, connue sous le nom de myostéatose, augmente avec l’obésité et le vieillissement. La myostéatose a également été récemment découverte comme facteur pronostique négatif pour plusieurs autres troubles tels que les maladies cardiovasculaires et le cancer. Une infiltration lipidique excessive diminue la masse musculaire et la force. Il en résulte également une lipotoxicité et une résistance à l’insuline en fonction de la teneur totale en lipides intramyocellulaires, de la morphologie des gouttelettes lipidiques (LD) et de la distribution subcellulaire. Le type de fibre (oxydatif vs glycolytique) est également important, car les fibres oxydatives ont une plus grande capacité à utiliser les lipides. En raison de leurs implications cruciales en physiopathologie, des études approfondies sur la dynamique et la fonction des TA d’une manière spécifique au type de fibre sont justifiées.

Ici, un protocole complet est présenté pour la quantification de la teneur en lipides intramyocellulaires et l’analyse de la morphologie de la LD et de la distribution subcellulaire d’une manière spécifique au type de fibre. À cette fin, des cryosections musculaires en série ont été colorées avec le colorant fluorescent Bodipy et des anticorps contre les isoformes de chaîne lourde de myosine. Ce protocole permet le traitement simultané de différents muscles, ce qui permet de gagner du temps et d’éviter d’éventuels artefacts et, grâce à une macro personnalisée créée aux Fidji, l’automatisation de l’analyse LD est également possible.

Introduction

L’infiltration lipidique des muscles squelettiques, connue sous le nom de myostéatose, augmente avec l’obésité et le vieillissement. La myostéatose est négativement corrélée à la masse musculaire et à la force et à la sensibilité à l’insuline1. De plus, des études récentes indiquent que le degré de myostéatose pourrait être utilisé comme facteur pronostique pour d’autres affections telles que lesmaladies cardiovasculaires 2, la stéatose hépatique non alcoolique3 ou le cancer4. Les lipides peuvent s’accumuler dans le muscle squelettique entre les fibres musculaires sous forme de lipides extramyocellulaires ou dans les fibres, sous forme de lipides intramyocellulaires (IMCL). Les IMCL sont principalement stockés sous forme de triglycérides dans des gouttelettes lipidiques (LD) qui sont utilisées comme carburant métabolique pendant l’exercice physique 5,6. Cependant, lorsque l’offre de lipides dépasse la demande ou lorsque les mitochondries deviennent dysfonctionnelles, les IMCL seront impliqués dans la résistance musculaire à l’insuline, comme on le voit chez les personnes métaboliquement malsaines, obèses et chez les patients diabétiques de type 27. Curieusement, les athlètes d’endurance ont des niveaux similaires, sinon plus élevés, de MCMC que ceux trouvés chez les patients obèses atteints de diabète sucré de type 2, tout en maintenant une sensibilité élevée à l’insuline. Ce phénomène est décrit comme le « paradoxe de l’athlète »8,9, et s’explique par une évaluation plus nuancée des TA musculaires, liée à leur taille, leur densité, leur localisation, leur dynamique et la composition des espèces lipidiques.

Tout d’abord, la taille de la LD est inversement corrélée à la sensibilité à l’insuline et à la forme physique10,11. En fait, les LD plus petites présentent une surface relativement plus grande pour l’action de la lipase et, par conséquent, ont potentiellement une plus grande capacité à mobiliser les lipides12. Deuxièmement, la densité LD (nombre/surface) joue un rôle controversé dans l’actionde l’insuline 8,10; pourtant, il semble être augmenté chez les athlètes. Troisièmement, la localisation subcellulaire des LD est importante, car les LD situées juste sous la membrane superficielle (sous-sarmateuse ou périphérique) exercent un effet plus délétère sur la sensibilité à l’insuline que les LD centrales 8,9,13. Ces dernières fournissent du carburant aux mitochondries centrales, qui ont une plus grande activité respiratoire et sont plus spécialisées pour répondre à la forte demande d’énergie requise pour la contraction14. En revanche, les TA périphériques fournissent des mitochondries sous-sarmateuses, qui sont impliquées dans les processus liés à la membrane8. Enfin, au-delà des triglycérides, des lipides complexes spécifiques dans le muscle peuvent être plus délétères que d’autres. Par exemple, le diacylglycérol, l’acyl-CoA à longue chaîne et les céramides peuvent s’accumuler dans les muscles lorsque le taux de renouvellement des triglycérides est faible, altérant ainsi la signalisation de l’insuline 9,15. Pour en revenir au « paradoxe de l’athlète », les athlètes d’endurance ont un nombre élevé de TA centrales plus petites avec des taux de renouvellement élevés dans les fibres de type I (oxydatives), tandis que les patients obèses et diabétiques ont des TA périphériques plus importants avec de faibles taux de renouvellement dans les fibres de type II (glycolytiques) 8,15,16. En plus de leur rôle dans le stockage et la libération de l’énergie, les LD via des acides gras dérivés (FA) et une protéine de pelage (périlamine 5) pourraient également fonctionner comme des acteurs critiques impliqués dans la régulation transcriptionnelle de l’oxydation de l’AF et de la biogenèse mitochondriale8. En raison de leurs implications cruciales en physiologie et en physiopathologie, des études approfondies sur la dynamique et les fonctions des TA sont justifiées.

Bien qu’il existe plusieurs techniques pour étudier les IMCL, elles ne sont pas toutes adaptées pour quantifier avec précision la taille, la densité et la distribution des DA DL d’une manière spécifique à la fibre. Par exemple, l’évaluation des NML par spectroscopie par résonance magnétique, tout en étant non invasive, offre un niveau de résolution qui n’est pas suffisant pour étudier la taille et l’emplacement précis des LD dans la fibre, et ce n’est pas spécifique au type de fibre17,18. De même, les techniques biochimiques effectuées sur des homogénats musculaires entiers19 ne peuvent pas évaluer l’emplacement et la taille des lipides. Par conséquent, la méthode la plus adéquate pour analyser la morphologie et l’emplacement de la LD est la microscopie électronique à transmission quantitative13, mais cette technique est coûteuse et prend beaucoup de temps. Par conséquent, l’imagerie par fluorescence confocale sur des préparations avec des colorants tels que Oil Red O (ORO)20,21, monodansylpentane (MDH)22 ou Bodipy 23,24,25, est apparue comme le meilleur outil pour ces études.

Ici, un protocole complet est décrit, y compris l’échantillonnage et le traitement des tissus, la coloration corporelle et l’acquisition et l’analyse d’images confocales pour quantifier la taille, le nombre et la localisation des TA dans les cryosections musculaires de souris. Étant donné que les IMCL ne sont pas répartis uniformément entre les fibres oxydatives et glycolytiques, et que chaque type de fibre régule différemment la dynamique de la LD, l’étude des IMCL doit être spécifique au type de fibre 16,25,26,27. Par conséquent, ce protocole utilise l’immunofluorescence sur des sections en série pour identifier les isoformes de chaîne lourde de myosine (MyHC) exprimées par chaque fibre. Un autre avantage de ce protocole est le traitement simultané d’un muscle glycolytique (extenseur digitorum longus, EDL) et d’un muscle oxydatif (soléaire) placé côte à côte avant la congélation (Figure 1). Ce traitement simultané permet non seulement de gagner du temps, mais aussi d’éviter la variabilité due au traitement séparé des échantillons.

Figure 1
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique de la procédure. Après la dissection musculaire (1), des muscles sélectionnés de taille similaire sont préparés et congelés ensemble (2). Les sections transversales en série de 10 μm sont obtenues à l’aide d’un cryostat et directement montées sur des lames d’adhérence (3). À partir de deux diapositives en série, la première (4A) est immunomarquée pour la laminine et colorée avec Bodipy pour reconnaître les LD et la seconde (4B) est immunocolorée avec des anticorps contre les MyHC pour la reconnaissance des types de fibres musculaires. Les images sont acquises à l’aide d’un microscope confocal pour Bodipy (5A) et d’un microscope à épifluorescence pour les types de fibres musculaires (5B). Les images sont analysées aux Fidji en appliquant un seuil et en quantifiant les particules (6A) pour obtenir le nombre, la taille moyenne, la densité et le pourcentage de la surface totale occupée par les TA (7) ou en comptant les cellules (6B) pour obtenir le pourcentage de fibres de chaque type dans la section (7). Abréviations : LD = gouttelettes lipidiques ; EDL = extenseur digitorum longus; MyHC = isoformes de chaîne lourde de myosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

Toutes les procédures menées sur des souris ont été approuvées par le Comité d’éthique pour l’expérimentation animale du secteur médical de l’Université catholique de Louvain (2019/UCL/MD/013).

1. Dissection et préparation des échantillons pour la congélation

  1. Étiquetez un morceau de liège de 3 mm d’épaisseur pour chaque paire de muscles.
  2. À travers une petite incision faite avec une lame au centre du liège, insérez perpendiculairement un morceau rectangulaire de plastique rigide (0,5 cm W, 1 cm H) qui servira de support (Figure 2B).
    REMARQUE: La taille de la pièce en plastique rectangulaire dépendra de la taille du muscle. Ici, les dimensions décrites sont adaptées à la taille du soléaire (~9 mg, 1 cm L, 2-3 mm L) et EDL (~5 mg, 1 cm L, 2-3 mm L) d’une souris mâle C57BL/6J de 3 mois.
  3. Au moment de la dissection, retirez le soléaire et l’EDL du membre postérieur de la souris. Pour éviter que les échantillons ne se dessèchent pendant la dissection, placez-les sur une compresse légèrement humidifiée avec une solution saline dans une boîte de Pétri placée sur de la glace.
    NOTE: Voir Wang et al.28 pour des explications sur la façon de disséquer ces deux muscles des membres.
  4. Placez une petite goutte de composé de température de coupe optimale (OCT) à la jonction liège/plastique, en évitant les bulles d’air.
  5. Éliminez l’excès d’humidité des échantillons en les séchant doucement avec une serviette en papier (Figure 2A) et placez les deux muscles sur le plastique perpendiculairement au liège (Figure 2C).
  6. Vérifiez l’orientation des myofibres musculaires au stéréomicroscope (Figure 2D).
    REMARQUE: Il est important de ne pas couvrir le muscle avec de l’OCT, car son effet isolant empêcherait le gel rapide et produirait des artefacts de congélation.

2. Congélation d’échantillons de muscles squelettiques pour la cryosection

ATTENTION : La congélation du muscle doit se faire sous une cagoule chimique, en portant l’équipement de protection individuelle approprié (voir le Tableau des matériaux).

  1. Utilisez un gobelet en acier inoxydable (~8 cm H, 6 cm Ø) avec deux sangles latérales attachées à lui d’au moins 25 cm de long (Figure 2F), et remplissez le gobelet jusqu’à 2/3 de sa capacité avec de l’isopentane.
  2. En saisissant le gobelet par les sangles, immergez-le doucement dans une boîte en polystyrène remplie d’azote liquide afin que le niveau d’azote à l’extérieur du récipient soit supérieur au niveau d’isopentane à l’intérieur (Figure 2F, G).
    ATTENTION : Lorsque le gobelet entre en contact avec l’azote, le choc thermique peut provoquer des tourbillons. Assurez-vous que le gobelet est suffisamment immergé mais évitez l’entrée d’azote car cela provoquerait des précipitations d’isopentane. Si cela se produit, laissez l’isopentane refroidir, remplissez le gobelet avec un nouvel isopentane et recommencez.
  3. Lorsque l’intérieur du gobelet est complètement recouvert d’une couche solide blanche d’isopentane, sortez-le de la boîte d’azote liquide (Figure 2H).
    REMARQUE: La température de fusion de l’isopentane étant de -159 ° C, les bords du gobelet deviendront blancs lorsqu’il fera assez froid.
  4. Remuez doucement les morceaux d’isopentane solide dans l’isopentane liquide restant avec une pince jusqu’à ce que tout le volume redevienne liquide.
  5. Réassurez le gobelet dans l’azote liquide jusqu’à ce que l’isopentane forme des cailloux blancs sur tout le fond et les bords du gobelet (Figure 2G,H).
    REMARQUE: Cette deuxième étape de refroidissement assure la température de congélation appropriée de l’isopentane.
  6. Retirez le gobelet de l’azote liquide et plongez rapidement les muscles dans le fond du gobelet, en tenant le bouchon avec une pince à dents de rat. Faire tourbillonner le liège pendant 15 s dans l’isopentane et le conserver à -80 °C jusqu’au traitement (Figure 2I).
    REMARQUE: Pour un stockage à court terme, les échantillons peuvent être conservés dans un congélateur à -20 ° C. Le protocole complet pour la congélation rapide du muscle squelettique a déjà été publié ailleurs. Pour des références détaillées et le dépannage, voir: Meng et al.29, Kumar et al.30, et Leiva-Cepas et al.31.

3. Cryosection

  1. Apportez les échantillons dans la chambre d’un cryostat préalablement refroidi à -20 °C et la température de la lame réglée à -25 °C.
    REMARQUE: Transporter les échantillons du congélateur de -20 °C/-80 °C au cryostat dans une boîte en polystyrène remplie de glace carbonique et permettre aux échantillons de s’équilibrer pendant au moins 20 à 30 minutes à la température de la chambre avant la coupe.
  2. Retirez le plastique du liège avec une pince à épiler fine et placez le disque d’échantillon de cryostat sur la plaque de congélation rapide pour refroidir. Une fois que la plaque a atteint -50 °C, placez un peu d’OCT sur le disque et placez rapidement le liège sur le dessus du disque en appuyant fermement. Attendez que l’OCT se solidifie et que le bouchon soit bien fixé sur le disque.
  3. Placez le disque sur la tête de l’objet dans l’orientation de coupe souhaitée (Figure 2J, K) et coupez le bloc musculaire au-delà d’au moins 1/3 de la longueur des muscles et jusqu’à ce que les deux sections transversales des muscles soient visibles.
  4. Réglez l’épaisseur de coupe à 10 μm et placez une section sur une lame d’adhérence pour vérifier l’orientation correcte des fibres sur un microscope à fond clair.
    REMARQUE: Il est essentiel de vérifier l’orientation transversale des fibres. Si les fibres ne sont pas correctement orientées, ajustez l’angle de la tête de l’objet, coupez une autre section et vérifiez à nouveau.
  5. Placez deux coupes transversales en série sur deux lames d’adhérence prémarquées : une lame pour déterminer les types de fibres, l’autre pour quantifier la teneur en lipides (Figure 2L).
    REMARQUE: Des coupes transversales en série supplémentaires peuvent être obtenues et maintenues à -80 °C pour d’autres études histologiques. Cependant, pour éviter de modifier la teneur en lipides et la morphologie intracellulaire24, il est essentiel de traiter les deux premières lames immédiatement après la coupe pour éviter le séchage à l’air. La congélation et la décongélation des lames pour la quantification de la TA auraient le même effet et sont donc très déconseillées.

4. Typage des fibres et coloration corporelle

  1. Détection immunohistochimique du type de fibre musculaire
    REMARQUE: Pour le protocole suivant, un volume de solution totale de 250 μL est suffisant pour couvrir toute la section musculaire entourée d’un cercle dessiné avec un stylo hydrophobe de la taille approximative d’une pièce de 1 cent.
    1. Entourez les sections d’un contour dessiné avec un stylo hydrophobe et rincez avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée de 0,1 M pendant 1 min à température ambiante (RT). Placer la lame dans une chambre humide et bloquer pendant 90 min à 37 °C dans une solution bloquante (sérum de chèvre normal à 10 % (NGS) et réactif bloquant 1:30 souris sur souris (MOM) dans PBS).
    2. Retirer la solution bloquante et incuber les lames pendant 90 min à 37 °C avec la solution contenant les anticorps primaires (5 % NGS, réactif bloquant MOM 1:30, les anticorps primaires de souris pour reconnaître les fibres de type I (IgG2b, à 1:10), de type IIa (IgG1, à 1:10) et de type IIx (IgM, à 1:5) et une anti-laminine de rat (chaîne α2, 1:1 000) dans PBS.
    3. Lavez les diapositives avec PBS 3 x 5 min à RT.
    4. Incuber les lames dans l’obscurité pendant 1 h à RT avec la solution contenant les anticorps secondaires (chèvre anti-IgG2b AF405 (1:500), chèvre anti-IgG1 AF488 (1:500), chèvre anti-IgM AF568 (1:1 000) et chèvre anti-laminine AF647 (1:500) dans PBS).
      ATTENTION : Pour le reste du protocole, assurez-vous de garder les lames à l’écart de la lumière pour préserver la fluorescence.
    5. Laver à nouveau 3 x 5 min dans du PBS, rincer dans duH2O double distillé, éliminer l’excès d’eau et monter avec un réactif antifade.
      REMARQUE: Stockez les diapositives à 4 ° C, à l’abri de la lumière pour préserver la fluorescence jusqu’à l’acquisition de l’image. Comme les lames ne sont pas fixes, il est recommandé d’utiliser des solutions fraîchement préparées pour chaque expérience, d’autoclaver le PBS et d’acquérir les images dès que possible pour éviter la contamination des sections.
  2. Coloration des TA avec Bodipy
    REMARQUE: Semblable à l’étape 4.1., un volume de solution totale de 250 μL est suffisant pour couvrir toute la section musculaire entourée d’un cercle dessiné avec un stylo hydrophobe de la taille approximative d’une pièce de 1 cent.
    1. Entourez les sections d’un contour dessiné par un stylo hydrophobe et rincez avec du PBS glacé de 0,1 M pendant 10 min à TA. Utilisez du PBS glacé pour tous les rinçages et lavages.
    2. Fixer avec du paraformaldéhyde (PFA) froid à 4% sans méthanol pendant 10 min à TA. Après un premier rinçage rapide, laver les lames avec PBS 3 x 5 min à RT.
      ATTENTION : Effectuez cette étape sous une hotte chimique.
    3. Placez la glissière dans une chambre humide et bloquez pendant 1 h à RT avec 5% de NGS en PBS.
    4. Incuber les lames pendant 90 min à 37 °C avec la solution de l’anticorps primaire (2 % de NGS et anti-laminine de rat (chaîne α2, 1:1 000) dans du PBS). Lavez les diapositives avec PBS 3 x 5 min à RT.
      ATTENTION : Pour le reste du protocole, assurez-vous de garder les lames à l’écart de la lumière pour préserver la fluorescence.
    5. Incuber pendant 1 h à TA avec la solution d’anticorps secondaire contenant l’anticorps anti-rat de chèvre AF647 (1:500) dans le PBS. Lavez les diapositives avec PBS 3 x 5 min à RT.
    6. Incuber pendant 20 min à RT avec une solution de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 0,5 μg/mL) et de BODIPY (1 μg/mL) dans du PBS.
      REMARQUE: Pour préparer la solution mère BODIPY, dissoudre dans le DMSO à une concentration de 1 mg / mL. Différentes formulations Bodipy sont disponibles dans le commerce pour la coloration LD. Selon le choix effectué, la méthode de coloration est la même (mêmes étapes, concentration et temps d’incubation); cependant, la méthode d’acquisition sera légèrement différente.
    7. Après un premier rinçage rapide, laver les lames avec PBS 3 x 5 min à TA, rincer dans H2O double distillé, éliminer l’excès d’eau et monter avec un réactif antifade.
      REMARQUE: Stockez les lames à 4 °C, à l’abri de la lumière, pour préserver la fluorescence jusqu’à l’acquisition de l’image.

5. Acquisition d’images

REMARQUE: Une fois les protocoles de coloration terminés, il est important de procéder immédiatement à l’acquisition d’images (dans les 24 heures suivantes), non seulement pour éviter la contamination, mais aussi pour préserver la morphologie, la taille et le nombre de LD.

  1. Acquisition d’images pour évaluer les types de fibres de chaque muscle échantillonné
    REMARQUE: Cette étape pourrait être réalisée avec un microscope à balayage à fluorescence à lames entières ou avec un microscope à épifluorescence conventionnel. Avec ce dernier, l’assemblage manuel ou automatisé des images doit être effectué pour reconstruire la section.
    1. Pour la reconnaissance de type fibre, utilisez un microscope à épifluorescence avec un objectif 10x/0.3. Sélectionnez des filtres d’excitation pour DAPI (405 nm), FITC, TRITC et Cy5 pour détecter les fibres de type I, IIa, IIx et la laminine, respectivement.
      REMARQUE: Les fibres de type IIb ne seront pas immunomarquées. Ils seront reconnus comme des fibres colorées par la laminine aux limites du sarcolemme avec un sarcoplasme noir.
    2. Ajustez le temps d’exposition approprié pour chaque canal.
    3. Lorsque vous utilisez un microscope à épifluorescence conventionnel, acquérez toujours les images de l’ensemble du muscle en suivant le même ordre pour faciliter la reconstruction musculaire. Assurez-vous que les fibres sur le bord droit d’une image apparaissent également sur le bord gauche de l’image suivante. Il en va de même pour les parties supérieure et inférieure des images (Figure 3A).
      REMARQUE: À titre de référence, pour une section de l’EDL ou du soléaire disséqué d’une souris de 3 mois, une moyenne de six et huit images, respectivement, couvrira toute la section transversale musculaire.
    4. Une fois le muscle scanné, téléchargez les images numériques capturées dans n’importe quel logiciel de traitement d’image pour la reconstruction (couture), en fonction de la morphologie de la fibre (laminine) et de l’histologie de la section musculaire, et enregistrez-les en tant que fichier TIFF, PNG ou JPG avec tous les canaux (couleurs) fusionnés (Figure 3A).
  2. Acquisition d’images avec laminine et co-coloration Bodipy
    REMARQUE: Pour reconnaître le type de fibre et avoir une estimation du nombre de fibres pour chaque type capturé, il est essentiel d’avoir la section de type fibre déjà scannée et les muscles reconstruits avant de commencer l’acquisition d’image de Bodipy-laminin (Figure 3B).
    1. Pour l’observation et l’acquisition d’images corporelles, utilisez un microscope confocal avec un objectif à immersion dans l’huile 40x avec une ouverture numérique de 1,4.
    2. Utilisez les paramètres suivants : sténopé à 1 UA, résolution de 2 048 pixels x 2 048 pixels, taille des pixels à 0,08 μm, mode unidirectionnel, vitesse de numérisation à 4 (~ 4 μs/pixel), moyenne des lignes réglée sur 4x et zoom numérique réglé sur 1.
    3. Pour éviter la diaphonie entre Bodipy-558/568 et laminin-AF647, utilisez le mode de balayage séquentiel sur le logiciel confocal.
      REMARQUE: Lorsque le colorant choisi est Bodipy-493/503, le balayage laser confocal simultané est possible sans diaphonie entre le canal Bodipy et le canal laminine-AF647. Cela accélérera l’acquisition d’images.
    4. Excitez Bodipy-493/503 à l’aide de la ligne laser 488 nm ou de la ligne laser argon, et excitez Bodipy-555/568 à l’aide de la ligne laser à diode 561 nm. Enfin, détectez la laminine-AF647 avec une ligne laser à diode de 640 nm.
      ATTENTION: Gardez à l’esprit que les molécules Bodipy sont très sensibles au photoblanchiment, évitez donc le balayage laser inutile. Pour reconnaître les fibres, utilisez uniquement le laser pour la laminine.
    5. Selon le colorant choisi, réglez les plages d’émission à 570-650 nm pour Bodipy-493/50324 et à 565-620 nm pour Bodipy-558/568. Réglez la plage d’émission de la laminine à 656-700 nm.
    6. Réglez le gain et le gain numérique de manière appropriée afin qu’aucun pixel saturé ne soit détecté sur l’indicateur de plage. Corrigez le signal d’arrière-plan en ajustant le décalage.
      REMARQUE: La sélection du filtre et les autres paramètres de balayage mentionnés ci-dessus doivent être optimisés pour chaque microscope confocal. Il est important que tous les paramètres mentionnés ci-dessus soient maintenus constants pour que toutes les images capturées à partir d’échantillons soient comparées.
    7. Pour identifier le type de fibre parmi celles visualisées au microscope confocal, utilisez un ordinateur portable personnel sur lequel l’image de la section reconstruite après une immunodétection de type fibre est vérifiée (Figure 3B).
    8. Une fois qu’un groupe de fibres est correctement identifié, acquérez l’image avec les canaux Bodipy et Laminin.
      REMARQUE: Il est recommandé de noter le nom de l’image Bodipy-laminin sur la région du muscle où ces fibres sont situées sur l’image acquise pour la reconnaissance MyHC afin de faciliter l’analyse ultérieure des LD spécifiques aux fibres.

6. Analyse des images

  1. Analyse des types de fibres sur chaque échantillon musculaire
    1. Dans Fidji (ou ImageJ)32, ouvrez le fichier TIFF, PNG ou JPG avec le muscle reconstruit obtenu à partir de la fusion de tous les canaux utilisés pour détecter les isoformes de fibres.
    2. Pour démarrer l’outil Cell Counting , cliquez sur Plugins | Analyser | Compteur de cellules | Compteur de cellules.
    3. Dans la fenêtre Compteur de cellules , cliquez sur Actions | Initialiser.
    4. Sous Compteurs dans la même fenêtre, sélectionnez Type 1.
    5. Dans la fenêtre principale de Fidji, sélectionnez l’outil Baguette .
    6. Pour quantifier le nombre de fibres de chaque type, cliquez sur chaque fibre du même type, de sorte que le programme enregistre le nombre de fibres cliquées.
    7. Une fois terminé, sélectionnez le type de fibre suivant et répétez les mêmes étapes.
    8. Lorsque toutes les fibres de l’image ont été affectées à un type de fibre donné, cliquez sur Résultats dans la fenêtre Compteur de cellules pour afficher les résultats dans un tableau.
    9. Enregistrez ce tableau en tant que table de feuille de calcul en cliquant sur Fichier | Enregistrer sous dans la fenêtre Résultats .
    10. Enregistrez et rechargez les sélections sur la même image à tout moment en cliquant sur Enregistrer les marqueurs ou Charger les marqueurs, respectivement, dans la fenêtre Comptage des cellules .
  2. Analyse des gouttelettes lipidiques en fonction du type de fibre
    1. Analyser les images de Bodipy et de laminine obtenues sur le confocal en utilisant Fidji pour la quantification des TA.
      REMARQUE : Les auteurs ont conçu une macro personnalisée pour automatiser l’analyse. Cette macro, ainsi qu’une explication étape par étape sur la façon de l’utiliser, est disponible en tant que fichier supplémentaire 1 et fichier supplémentaire 2, respectivement.
    2. Ouvrez chaque image à l’aide de l’importateur de bioformats des Fidji. Sous l’option Afficher la pile avec , sélectionnez Hyperstack | Mode couleur, par défaut. Assurez-vous que la fenêtre Mise à l’échelle automatique est sélectionnée.
      REMARQUE: Les étapes suivantes décriront le protocole d’analyse d’une fibre sur l’image, mais il doit être répété autant de fois que le nombre de fibres entières apparaît sur l’image.
    3. Utilisez l’outil de sélection à main levée pour sélectionner manuellement le sarcolemme de la fibre en fonction du canal de laminine (Figure 4A) et appuyez sur T sur le clavier pour enregistrer la sélection ou la région d’intérêt (ROI) dans la fenêtre ROI .
    4. Allez dans la fenêtre principale de Fidji et cliquez sur Analyser | Définissez Mesures, puis dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Zone et diamètre de Feret. Laissez les cases restantes décochées et les autres paramètres tels qu’ils apparaissent par défaut.
    5. Cliquez sur Mesurer dans la fenêtre ROI pour obtenir la surface et le diamètre minimal de la férète (MF) de la fibre sélectionnée, et notez-les pour une utilisation ultérieure.
      REMARQUE: Lors de l’analyse des LD, il est important de garder à l’esprit que leur taille et leur densité varient entre le centre et la périphérie (région sous-sarpolymale-SS) de la fibre. Par conséquent, l’analyse doit être effectuée séparément.
    6. Calculez la valeur de 1/6 du MF pour délimiter la partie centrale de la fibre.
      REMARQUE : Dans la macro, la valeur MF par défaut est définie sur 6, ce qui signifie que la réduction appliquée sera définie sur 1/6 de la MF. Cette valeur a été choisie sur la base des données empiriques obtenues à partir de la soleus d’animaux nourris avec un régime riche en graisses. Cependant, chaque chercheur doit modifier ce nombre en fonction des données empiriques et du muscle analysé, du type de fibre et de l’état de l’animal.
    7. Dans la fenêtre ROI , cliquez sur Ajouter pour avoir un duplicata du premier ROI et sélectionnez le deuxième ROI qui apparaît sur la fenêtre.
    8. Dans la fenêtre principale des Fidji, cliquez sur Modifier | Sélection | Agrandissez et introduisez la valeur précédemment calculée (à partir de l’étape 6.2.6.) avec un signe moins avant le nombre et cliquez sur OK. Dans la fenêtre ROI, cliquez sur Ajouter[t] (un troisième ROI doit apparaître) et Supprimer, pour supprimer le deuxième ROI.
      REMARQUE: Le chercheur peut vérifier les résultats en cliquant sur la case Afficher tout dans la fenêtre ROI . À ce stade, deux ROI doivent apparaître, l’un qui entoure tout le périmètre de la fibre (Figure 4B) et l’autre qui est placé au centre (Figure 4C).
    9. Sélectionnez les deux ROI dans la fenêtre ROI et cliquez sur Plus | | XOR Ajouter[t]. Attendez qu’un troisième ROI apparaisse, qui correspond à la périphérie de la fibre (Figure 4D).
    10. Enregistrez le retour sur investissement en cliquant sur Plus | Enregistrer pour enregistrer les rois au cas où une réanalyse ultérieure des mêmes fibres serait nécessaire.
    11. Sélectionnez le canal Bodipy et ouvrez l’outil Seuil en cliquant sur Image | Ajuster | Seuil sur la fenêtre principale des Fidji.
    12. Dans la fenêtre contextuelle Seuil , définissez les valeurs sur 70/255, sélectionnez Yen | Méthode N&B, et cliquez sur Fond sombre | Postulez.
      REMARQUE : Les valeurs appliquées sur le seuil peuvent varier en fonction des conditions de l’expérience et le seuil doit être défini de manière appropriée pour optimiser l’analyse. Une fenêtre N&B avec le signal Bodipy au-dessus de la limite de seuil affichée en blanc et l’arrière-plan en noir doit apparaître (comparez l’image Bodipy originale de la Figure 4E avec celle de la Figure 4F).
    13. Allez dans la fenêtre principale de Fidji et cliquez sur Analyser | Définissez Mesures et, dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez Zone, Fraction d’aire et Limite au seuil. Laissez les cases restantes décochées et les autres paramètres tels qu’ils apparaissent par défaut.
      REMARQUE: Si le chercheur veut analyser la « circularité » des LD, qui est un index de la morphologie sphérique allant de 1 pour une sphère parfaite à 0 pour une ligne, cliquez sur la boîte descripteurs de forme de la fenêtre contextuelle Définir les mesures .
    14. Accédez à la fenêtre ROI et sélectionnez le premier ROI. Dans la fenêtre principale des Fidji, cliquez sur Analyser | Outil Analyser les particules.
      REMARQUE: Cet outil quantifie le nombre, la taille, la zone couverte et le pourcentage de la surface totale couverte par les particules à chaque sélection et enregistre les résultats sous forme de fichier de feuille de calcul.
    15. Définissez les valeurs de 2 à Infinity (2-Infinity) dans la fenêtre Analyser les particules , cochez la case Pixels , conservez les valeurs de circularité par défaut, sélectionnez Résumer, puis cliquez sur OK.
      REMARQUE: Pour vérifier les résultats sur la fibre, sous l’option Afficher , sélectionnez l’une des options disponibles. Pour que les informations de chaque LD soient reconnues sur la sélection d’un tableau, cochez l’option Afficher les résultats dans la fenêtre Analyser les particules . Les résultats de l’analyse de la surface totale de la fibre sont moyennés et résumés dans un tableau à plusieurs colonnes (Nombre, Superficie totale, Taille moyenne, % Superficie ; celles-ci correspondent au nombre de particules [LD], à la surface occupée par ces particules, à leur taille moyenne, et au pourcentage de la surface totale de la sélection occupée par les particules, respectivement). Pour calculer la densité, divisez le nombre de particules par la surface totale de chaque sélection.
    16. Pour obtenir les valeurs du centre et de la périphérie de la fibre, répétez les étapes 6.2.14 et 6.2.15, en sélectionnant le deuxième (centre) et le troisième ROI (périphérie) à chaque fois.
    17. Enregistrez les résultats en cliquant sur Fichier | Enregistrer sous dans la fenêtre Résumé .
      REMARQUE: Incluez le type de fibre, la condition et le nom de l’image sur le nom attribué des résultats pour faciliter l’unification ultérieure et l’analyse statistique des données. Pour analyser le reste des fibres dans la même image, répétez les étapes 6.2.3 à 6.2.17. Pour l’analyse statistique, au moins 10 à 15 fibres de chaque type doivent être analysées par animal.

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Representative Results

Le protocole décrit ici fournit une méthode efficace pour quantifier facilement les LD d’une manière spécifique à un type de fibre et à un niveau subcellulaire. Il montre comment, en congelant ensemble deux muscles de taille similaire, tels que l’EDL et le soleus, le temps et les ressources consacrés aux étapes suivantes sont réduits de moitié.

Un protocole complet est fourni pour l’immunocoloration, l’acquisition d’images et l’analyse des différentes isoformes de MyHC exprimées dans les muscles de souris adultes. Ce protocole est basé sur celui conçu pour la première fois par Schiaffino et al. en 198933, avec quelques ajustements tels que l’utilisation d’un anticorps supplémentaire pour marquer la laminine. Cette modification ultérieure est essentielle pour l’emplacement des fibres de type IIb, qui seront noires car elles ne sont pas colorées avec un anticorps. Comme le montre la figure 5, ce protocole immunohistochimique permet non seulement la reconnaissance des fibres à oxydation lente (type I et IIa) et à glycolytique rapide (type IIx et IIb) de souris, mais également la présence de fibres hybrides (voir astérisque à la figure 5D). De plus, le fait d’avoir les sections transversales des deux muscles sur la même lame permet de comparer les proportions de chaque type de fibre entre les deux muscles sélectionnés, garantissant ainsi que les conditions expérimentales étaient identiques sur les deux sections.

Pour l’étiquetage LD, les résultats présentés ici sont basés sur l’utilisation de Bodipy-558/568 C12 comme colorant lipidique; cependant, le lecteur est référé à un excellent document de protocole détaillant l’utilisation du colorant classique Bodipy-493/503 sur les sections musculaires23. Le protocole présenté combinait la coloration des LDs basée sur l’immunohistochimie contre l’α2-laminine pour distinguer la fibre sarcolemme. Comme pour l’expérience de type fibre, cette étape est essentielle, non seulement pour la reconnaissance des fibres individuelles, mais aussi pour l’analyse ultérieure des lipides dans les régions centrale et périphérique des fibres (Figure 4). L’une des étapes critiques de ce protocole est l’identification et le marquage des mêmes fibres sur les deux diapositives. Comme expliqué précédemment, il est important de scanner la diapositive avec des types de fibres et d’avoir la reconstruction des sections transversales musculaires avec les couleurs fusionnées avant l’acquisition d’images pour les LD (Figure 3B). Les structures remarquables de chaque section musculaire, telles que les brindilles axonales ou les fuseaux musculaires, sont de bons repères qui pourraient aider le chercheur à localiser les mêmes fibres sur les deux lames (Figure 6). Rappelez-vous que parce que la diapositive est placée à l’envers sur la plupart des microscopes confocaux, il est recommandé d’inverser l’image reconstruite de type fibre sur l’ordinateur personnel pour faciliter la tâche de localisation.

Les paramètres décrits pour l’acquisition de la coloration à la laminine corporelle par microscopie confocale permettent la visualisation et l’analyse ultérieure de la taille, du nombre et de la distribution des TA de trois à six fibres simultanément (Figure 6 et Figure 7). Un protocole détaillé étape par étape pour analyser les TA avec le logiciel d’analyse d’images Fiji est également fourni ici. Comme le montre le protocole, l’analyse complète de chacune des fibres présentes sur une image est longue et fastidieuse. Cependant, Fidji a l’avantage de permettre la conception de programmes personnalisés, appelés macros, basés sur le langage Java. Les auteurs ont conçu une macro qui permet l’automatisation de la série de commandes individuelles décrites ci-dessus qui est automatiquement exécutée en boucle pour analyser en quelques minutes - non seulement chacune des fibres présentes sur une image, mais aussi un grand ensemble d’images. La seule entrée du chercheur est la sélection manuelle du périmètre de la fibre à analyser à chaque fois, la sélection du type de fibre et l’inspection visuelle de l’image résultante après application du seuil et quantification des particules.

Ici, l’analyse des TA en fonction de l’emplacement est mise en œuvre. En mesurant préalablement la surface et le diamètre MF de la fibre, une réduction dépendante de la taille (non fixe comme décrit par Strauss et al.25) est appliquée pour obtenir les zones centrales et périphériques de chaque fibre (Figure 4 et Figure 7). Comme le montrent les histogrammes de la figure 7, cette méthode permet de quantifier trois paramètres importants : le pourcentage de la surface fibreuse occupée par les LD (figure 7E), la densité des LD , le nombre de LD par μm2 (figure 7F) et la taille moyenne des LD (figure 7G). Par conséquent, chez les souris de 3 mois (N = 5), les fibres de type IIa (contour vert) et de type IIx (contour rouge) présentent la plus grande proportion de la surface occupée par les TA en périphérie (Figure 7E). En ce qui concerne la densité des particules, les fibres EDL présentent toujours une densité plus élevée que les fibres soleus indépendamment de l’emplacement subcellulaire (Figure 7F). Enfin, la taille moyenne de ces LD est toujours plus grande à la périphérie qu’au centre (Figure 7G).

Les différentes méthodes utilisées par d’autres groupes pour évaluer l’accumulation de TA dans le muscle squelettique des rongeurs34,35 rendent difficile la comparaison de ces résultats avec ceux des études précédentes. Cependant, conformément aux résultats de Komiya et al.34, le pourcentage de surface de fibre occupée par les LD est plus élevé dans les fibres soleus de type IIa et EDL de type IIx. Plus important encore, les fibres de type IIb présentaient le pourcentage le plus faible de surface occupée par les TA (Figure 7E, histogrammes gris). Étant donné que le type de fibre IIb est le type de fibre le plus prédominant de l’EDL (75%, Figure 5E), ces résultats confirment ce que d’autres groupes ont précédemment décrit: l’accumulation globale de lipides est plus faible dans l’EDL que dans le soleus34,35.

Contrairement à ce qui a été décrit chez l’homme25, et également en ligne avec les résultats de Komiya et al.34, les résultats présentés ici montrent que l’accumulation de LD dans les fibres soleus de type I est relativement faible. Cela pourrait s’expliquer par des différences inter-espèces de type fibre entre les souris et les humains36, puisque les propriétés métaboliques des fibres humaines de type I sont plus similaires à celles des rongeurs de type IIa et IIx, tandis que celles des fibres de type humain IIx sont proches des rongeurs de type IIb37. En résumé, les différentes techniques décrites ici fournissent une méthode reproductible, fiable et rapide pour étudier et comparer plusieurs paramètres liés aux LD et à leur distribution dans la cellule d’une manière dépendante du type de fibre.

Expériences sous-optimales
Si la procédure de congélation n’est pas effectuée correctement et que l’isopentane n’est pas à la bonne température, des cristaux de glace se formeront à l’intérieur des fibres (Figure 8A). Ces artefacts de congélation ne sont détectables qu’après la préparation histologique de l’échantillon et peuvent être reconnus comme des trous dans les fibres. Pour une quantification correcte des TA, ces artefacts doivent être évités. Il a été démontré que la décongélation et la recongélation appropriée du bloc musculaire peuvent réduire considérablement ces artefacts29.

Un autre problème est rencontré lorsque les fibres ne sont pas coupées perpendiculairement à l’axe longitudinal (figure 8B). La quantification de la LD et la comparaison entre les fibres, les muscles ou les animaux ne peuvent pas être effectuées lorsque les sections ne sont pas transversales. Pour cette raison, il est essentiel de placer correctement les muscles sur le liège à l’aide d’un stéréomicroscope avant de congeler et d’avoir un microscope à fond clair près du cryostat. Ce dernier permettra au chercheur de trouver l’alignement correct de l’échantillon sur le cryostat.

Dans de rares cas, le marquage des isoformes MyHC est très faible sur un ou plusieurs types de fibres (Figure 8C). Si cela se produit, l’analyse des TA sera incomplète. Dans ce cas, l’expérience doit être répétée à partir de la coupe des muscles. Enfin, Bodipy pourrait s’accumuler à la périphérie de la section transversale musculaire (Figure 8D). Si cela se produit, la coloration sera très forte sur ces fibres produisant un résultat artificiel. Évitez l’acquisition d’images à partir de ces fibres.

Figure 2
Figure 2: Préparation des échantillons pour la congélation et la cryosection. (A-D) Les muscles du soléus de souris et de l’EDL sont disséqués et placés sur un liège maintenu par un plastique rigide avec une goutte d’OCT. (E-G) Un gobelet en acier inoxydable est rempli d’isopentane et refroidi à sa température de fusion dans de l’azote liquide. (H,I) Le gobelet avec l’isopentane froid est retiré de l’azote liquide et l’échantillon est immergé jusqu’au fond du gobelet, tourbillonnant pendant 15 s. (J-L) Le liège avec les échantillons est placé sur le disque du support du cryostat sans support en plastique, et des sections transversales en série de 10 μm sont directement montées sur des lames d’adhérence. Deux sections transversales en série adjacentes sont immédiatement traitées pour la coloration des LD et la détection des MyHC. Abréviations : LD = gouttelettes lipidiques ; EDL = extenseur digitorum longus; MyHC = isoformes à chaîne lourde de myosine; OCT = température de coupe optimale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Acquisition d’images corporelles après avoir identifié le type de fibre à partir de l’image composite reconstruite vue sur un autre ordinateur. (A) Reconstruction de l’ensemble de la section soleus immunomarquée pour le type de fibre (MyHC) à partir de sept images fusionnées indépendantes (rectangles en pointillés) assemblées à l’aide d’un logiciel de traitement d’image. Les flèches blanches et les chiffres représentent l’ordre suivi lors de l’acquisition d’images à l’aide d’un microscope à épifluorescence conventionnel. (B) Pour l’acquisition d’images Bodipy, (1) un champ contenant la section musculaire immunocolorée avec de la laminine-AF647 et Bodipy-555/568 est visualisé sur l’écran d’un ordinateur connecté au microscope confocal. (2) Ces fibres sont situées sur l’image reconstruite de la section musculaire immunocolorée pour détecter le type de fibres (MyHC). (3) L’image est acquise à l’aide d’un microscope confocal. Abréviations : LD = gouttelettes lipidiques ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole; MyHC = isoformes de chaîne lourde de myosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Analyse des gouttelettes lipidiques avec Fidji. (A,B) Le sarcolemme de la fibre est reconnu sur la base de l’image de la laminine et sélectionné comme ROI. La superficie totale et la MF sont mesurées. (C) Pour reconnaître la partie centrale de la fibre, la sélection est réduite de 1/6 de la valeur de la MF. (D) La zone située entre la sélection centrale et la sélection totale est définie comme la périphérie ou la zone sous-sarmate. (E) Pour l’analyse des TA colorées avec Bodipy, un seuil est appliqué, (F) et l’outil Analyser les particules est utilisé pour quantifier différents paramètres liés aux LD (voir tableau). Ces valeurs sont obtenues pour la fibre complète (All), pour la partie centrale (Center) et pour la zone sous-sarmate (Periphery), indépendamment. Barres d’échelle = 12 μm. Abréviations : LD = gouttelettes lipidiques ; ROI = région d’intérêt; MF = Diamètre minimal de Feret. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Immunocoloration représentative des types de fibres dans les muscles de souris EDL (glycolytiques) et soléaire (oxydatifs). Images de fluorescence fusionnées d’EDL (A, B) et de soleus (C, D) obtenues avec un microscope numérique à fluorescence à lames entières. Des anticorps dirigés contre le type I (bleu-AF405), le type IIa (vert-AF488), le type IIx (rouge-AF568) et la laminine (blanc-AF647) ont été utilisés. Les fibres noires correspondent au type de fibre IIb. B et D montrent les détails des fibres à l’intérieur des rectangles blancs des panneaux A et C, respectivement. L’astérisque (*) dans le panneau D montre une fibre hybride IIa/IIx. (E,F) Quantification représentative de la distribution du type de fibre dans l’EDL et le soléaire de souris âgées de 3 mois (N = 5). L’EDL était principalement composé de fibres de type IIb, puis IIx et IIa (~75%, 15% et 5%, respectivement). En revanche, soleus était principalement composé de fibres de type IIa (>50%) et de type I (30%). Les proportions de fibres de type IIx étaient assez similaires dans les deux muscles, tandis que celles des fibres hybrides étaient très faibles. Barres d’échelle = 200 μm (A,C), 100 μm (B,D). Abréviation : EDL = extenseur digitorum longus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Coloration représentative des LD avec Bodipy sur des coupes transversales en série précédemment immunomarquées pour les isoformes MyHC. Images fusionnées par fluorescence de souris EDL (A) et soleus (B) acquises à l’aide d’un microscope à épifluorescence montrant des fibres de type I (bleu), IIa (vert), IIx (rouge), IIb (noir) et la laminine (signal blanc entourant les fibres). (C-F) Images de fluorescence confocale de l’EDL (C, D) et du soléaire (E, F) co-marquées avec la laminine (cyan) et Bodipy (rouge). Notez que les fibres indiquées en C-F sont les mêmes que celles à l’intérieur des rectangles blancs des panneaux A et B. Sur le coin droit du rectangle blanc en A, on peut distinguer une brindille axonale (pointe de flèche blanche). Barres d’échelle = 200 μm (A,B), 20 μm (C-F). Abréviations : LD = gouttelettes lipidiques ; EDL = extenseur digitorum longus; MyHC = isoformes de chaîne lourde de myosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Quantification des TA d’une manière spécifique au type de fibre et au subcellulaire. Images confocales de fluorescence représentatives de fibres de type I et de type IIa provenant de fibres de soléaire (A, B) et de fibres de type IIx et de type IIb provenant d’EDL (C, D) obtenues après co-marquage avec Bodipy (rouge) et α2-laminine (non montrée). La teneur en LD (% de la surface occupée par Bodipy et la densité) et la morphologie (taille) ont été analysées d’une manière spécifique aux subcellulaires. Le périmètre de la fibre a été défini par coloration à la laminine et les zones centrales ou périphériques ont été définies en fonction du diamètre MF. Pourcentage de la surface de fibre occupée par Bodipy (LDs) (E), densité LD (nombre/μm2) (F) ou taille moyenne LD (G) dans les régions centrales ou périphériques pour chaque type de fibre. Les résultats sont représentés sous forme de moyenne ± MEB. Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : LD = gouttelettes lipidiques ; EDL = extenseur digitorum longus; C = central; P = périphérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Images correspondant à des résultats sous-optimaux. (A) Image en champ lumineux d’une section transversale musculaire colorée pour l’hématoxyline-éosine montrant des cristaux de glace formés pendant le processus de congélation. (B) Image fusionnée par fluorescence d’une section de soléaire immunocolorée pour les MyHC et la laminine, montrant que la majorité des fibres sont coupées le long de l’axe longitudinal. (C) Image de fluorescence d’une section EDL immunocolorée pour les MyHC et la laminine. La faible coloration des fibres de type IIa (vert) entrave la quantification correcte de chaque type de fibre. (D) Image confocale montrant une forte coloration artifactuelle de Bodipy (rouge) sur les fibres situées à la périphérie de la section transversale musculaire. Barres d’échelle = 50 μm (A,B), 200 μm (C,D). Abréviations : EDL = extensor digitorum longus ; MyHC = isoformes de chaîne lourde de myosine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1: Coloration LD avec de l’huile Rouge O sur les sections transversales musculaires. (A,B) Images confocales montrant le motif de coloration obtenu avec de l’huile rouge O dans le soléaire et l’EDL, respectivement. Le protocole utilisé pour cette coloration est décrit en détail par Prats et al.24. Notez que l’accumulation de LD est plus élevée dans la région sous-sarpolymique des myofibres, comme décrit précédemment pour Bodipy. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations: LD = gouttelette lipidique; EDL = extenseur digitorum longus. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2: Co-coloration des LD et des mitochondries dans le muscle soléaire. (A) Image fusionnée confocale montrant l’immunomarquage de Tomm20, une protéine présente sur la membrane mitochondriale (vert), DAPI (bleu) et Bodipy-558/568 marqué LDs (rouge). L’encart dans A montre plusieurs mitochondries (vertes) liées à des LD (rouge). Cette image a été obtenue en appliquant la microscopie confocale à superrésolution Airyscan. (B,C) Images monocanaux correspondantes des LD et des mitochondries, respectivement. Barres d’échelle = 10 μm (A-C), 5 μm (A, encart). Abréviations : LD = gouttelettes lipidiques ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Fidji macro pour l’analyse automatisée des LD sur plusieurs images laminine + Bodipy. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Explication étape par étape de l’utilisation de la macro Bodipy_JoVE.ijm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Le protocole détaillé ici décrit une méthode efficace pour quantifier les LD marquées avec Bodipy sur une base spécifique au type de fibre et au subcellulaire. Au cours des dernières années, les colorants lipidiques classiques, tels que l’ORO ou le Sudan Black B, ont été remplacés par une nouvelle gamme de colorants fluorescents lipophiles perméables aux cellules qui se lient aux lipides neutres (par exemple, Bodipy). Disponible sous différents conjugués, Bodipy s’est avéré très efficace pour marquer les LD afin d’étudier leur morphologie, leur dynamique et leur interaction avec d’autres organites, non seulement dans différents tissus et cellules fixes 23,38,39,40 mais aussi dans des cellules vivantes41,42.

Dans le protocole, il y a plusieurs aspects critiques que le chercheur doit prendre en compte pour obtenir des résultats optimaux. Il est essentiel de placer correctement les muscles choisis sur le liège pour assurer un alignement et une orientation parfaits des myofibres musculaires, car une fois gelés, seuls de légers réajustements du support peuvent être effectués sur le cryostat. De plus, il est essentiel de commencer le protocole d’immunocoloration immédiatement après la coupe des sections, car les cryosections de séchage à l’air (pendant seulement 15 minutes) ont de graves effets indésirables sur les TA, entraînant une diminution de 66% de la densité de LD et une diminution de 37% de la taille moyenne24. De même, la congélation et la décongélation des lames auraient des effets néfastes et ne sont donc pas recommandées. Une troisième caractéristique importante de ce protocole est liée à la fixation des échantillons. Pour l’identification des différentes isoformes de MyHC avec les anticorps cités ici, la fixation tissulaire doit être évitée car elle perturbe la liaison des anticorps choisis à leurs épitopes. Si les échantillons musculaires ont déjà été fixés, le lecteur est référé à un article récemment publié utilisant différents anticorps43. Seul le PFA sans méthanol est recommandé pour l’étiquetage et la quantification des LD, car l’utilisation de méthanol ou d’acétone perturbe la morphologie desLDs 23,44. De plus, une étape de perméabilisation n’est pas nécessaire pour la quantification des TA sur des lames immunomarquées avec de la laminine. Étant donné que certains groupes ont montré que la perméabilisation avec des détergents tels que TritonX-100, la saponine ou la glycine peut réduire la taille ou le nombre de DL 44,45, la perméabilisation est fortement déconseillée. Enfin, le réglage fin des réglages du microscope confocal est crucial pour ne reconnaître que les lipides neutres présents dans les LD et non ceux des membranes d’autres organites24.

Ici, Bodipy-558/568 C12 a été utilisé comme marqueur LD. Cependant, le Bodipy le plus fréquemment utilisé pour marquer les TA et étudier leur morphologie et leur emplacement dans les myofibres musculaires squelettiques est Bodipy-493/503. Les deux colorants sont similaires dans leur temps d’incubation, leur concentration de travail et leurs spectres d’émission étroits, bien que leurs plages d’excitation et d’émission soient légèrement différentes. Pour un protocole complet sur l’utilisation de Bodipy-493/503, le lecteur est référé aux travaux de Listenberger et Brown46 ou Spangenburg et al.23. Bodipy-558/568 C12 a été utilisé pour colorer les LD dans d’autres tissus tels que le tissu adipeux47, la rétine dégénérée48, les reins fibrotiques49 ou les fibroblastes50. Ce Bodipy donne une coloration similaire à celle obtenue avec ORO (voir la figure supplémentaire S1) mais avec beaucoup moins de charge technique et plus de spécificité24,51. De plus, Bodipy-558/568 C12 a l’avantage de permettre la quantification des LD en combinaison avec la détection de protéines ou d’organites marqués avec un anticorps secondaire à spectre vert (voir la figure supplémentaire S2 et Yan et al.49) ou avec des modèles génétiquement modifiés GFP52. Ces deux applications sont des outils très puissants pour démêler la dynamique et les interactions des LD avec d’autres organites et protéines cellulaires. Néanmoins, lorsqu’aucun comarquage des protéines dans les cellules n’est prévu, les auteurs recommandent l’utilisation du colorant LD le mieux caractérisé Bodipy-493/503.

L’une des limites de ce protocole est liée à l’acquisition d’images et à la quantification des caractéristiques morphologiques de la TA. Les progrès technologiques de la microscopie confocale à balayage laser ont considérablement amélioré la résolution plane par rapport aux microscopes à grand champ et permettent la reconstruction 3D d’objets lors de la numérisation de l’échantillon dans le plan Z. Cela a été très utile pour l’étude de la morphologie de la LD24 et de l’interaction avec d’autres protéines dans les myofibres squelettiques 38,53, mais a augmenté le temps d’acquisition et de traitement de l’image, car chaque image reconstruite en 3D est composée de plusieurs images 2D indépendantes. Dans le protocole ci-dessus, les images confocales ont été acquises avec un objectif 40x et uniquement en 2D. Cette méthode permet l’acquisition de trois à six myofibres par image au lieu d’un seul comme ce serait le cas avec un objectif 63x. Il en résulte une résolution plus faible et une estimation globale de la taille et de la morphologie de la LD qui n’est pas complètement précise. Néanmoins, il permet l’analyse d’un plus grand nombre de fibres par échantillon, ce qui est également un fait important à considérer, en particulier dans les expériences sur les animaux, dans lesquelles un grand nombre de muscles et de conditions doivent être comparés.

Ici, il est démontré qu’en congelant deux muscles de taille similaire qui sont adjacents l’un à l’autre34, le temps de traitement des échantillons est considérablement réduit et les différences artifactuelles possibles dérivées de leur traitement indépendant sont réduites. De plus, cette méthode d’analyse des TA prend en considération les différences entre la distribution subcellulaire des LD dans et entre les types de fibres54. La sélection du périmètre du myofiber et la réduction de cette sélection par rapport au diamètre minimal de la fibre facilitent l’étude de la taille et de la densité des LD centrales et périphériques (sous-sarcommateuses) indépendamment. L’application de cette méthode est extrêmement importante car il a été démontré que l’accumulation sous-sarcommateuse de LD contribue directement à la résistance à l’insuline. Alors que certains rapports chez l’homme ont étudié les TA d’une manière dépendante du type de fibre et de l’emplacement 11,16,25, c’est la première fois, à notre connaissance, que cette méthode a été appliquée aux muscles des rongeurs. En outre, la quantification des TA à l’aide d’une macro auto-conçue pour les Fidji a considérablement réduit et simplifié le temps d’analyse de l’image. La macro et une explication étape par étape sur la façon de l’utiliser sont disponibles en tant que fichier supplémentaire 1 et fichier supplémentaire 2, respectivement.

Dans l’ensemble, les auteurs considèrent que le protocole décrit ici pourrait être un outil utile pour d’autres chercheurs étudiant le métabolisme des lipides dans le muscle squelettique. Les techniques expliquées peuvent être appliquées à différents muscles et dans des conditions distinctes (à jeun / suralimenté, entraîné / sédentaire, jeune / âgé, maigre / obèse) et aideront, espérons-le, à mieux comprendre la dynamique des TA, l’importance de leurs interactions avec d’autres composants de la cellule, comment les lipides sont stockés et métabolisés dans les fibres glycolytiques et oxydatives, et leur rôle dans l’apparition de la résistance à l’insuline dans le diabète de type 2.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) et de la Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. est titulaire d’une bourse de doctorat du FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. a reçu une bourse du Programme d’Excellence Internationale Wallonie-Bruxelles.

Les auteurs remercient Alice Monnier pour sa contribution au développement de ce protocole et Caroline Bouzin pour son expertise et son aide technique dans le processus d’acquisition d’images. Nous remercions également la plateforme d’imagerie 2IP-IREC pour l’accès au cryostat et aux microscopes (2IP-IREC Imaging Platform, Institut de recherche expérimentale et clinique, Université Catholique de Louvain, 1200 Bruxelles, Belgique). Enfin, les auteurs tiennent à remercier Nicolas Dubuisson, Romain Versele et Michel Abou-Samra pour leur critique constructive du manuscrit. Certaines des figures de cet article ont été créées avec BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AxioCam 506 mono 6 Mpix camera Zeiss
AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera  Zeiss
Chemical hood Potteau Labo EN-14175
Confocal microscope Zeiss LSM800
Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick)  Electron Microscopy Sciences 63305
Cryo-Gloves Tempshield 16072252
Cryostat  Thermo Scientific  Microm Cryo Star HM 560
Dissecting Stereo Microscope SMZ745 Nikon
Dry Ice
Dumont Forceps F.S.T 11295-10
Epifluorescence microscope Zeiss AxioImage-Apotome Z1
Extra Fine Bonn Scissors F.S.T 14084-08
FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) ThermoFisher 22-363-552 Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing
Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) BRAND Petri dish, MERK BR455751 Used to place the muscles on ice during dissection
ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen Vector Labs H-4000 Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections
Incubator MMM Medcenter Incucell 707 
Microscope Cover Glasses (24x50 mm) Assistent  40990151
Microscope Slide Boxes  Kartell 278 Used as humid chambers for immunohistochemistry
Neck holder Linie zwo SB-035X-02 Used as strap to hold the stainless steel tumbler
No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade Swann-Morton 0205
Paint brushes Van Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X Used to handle cryosections
Permanent Marker Pen Black Klinipath/VWR 98307-R Used to label slides
Pierce Fixation Forceps F.S.T 18155-13
Polystyrene Box  H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat
Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 Aesculap BB073R
Stainless Steel Cup 10oz  Eboxer B07GFCBPFH Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing
Superfrost Ultra Plus slides ThermoFisher J1800AMNZ
Surgical tweezers 1/2 teeth Medische Vakhandel 1303152 Also called "Rat teeth tweezers"
Vannas Spring Scissors - 3 mm Cutting Edge F.S.T 15000-00
Weighing boats VWR international 611-2249
Whole-Slide Scanner for Fluorescence Zeiss Axio Scan.Z1
Reagents
Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b Sigma-Aldrich SAB4600477 Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 ThermoFisher A-21121 Used at a final concentration of 1:500
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM Abcam ab175702 Used at a final concentration of 1:1,000
Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody ThermoFisher A-21247 Used at a final concentration of 1:500
BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) ThermoFisher D3922 Used at a final concentration of 1 µg/mL
BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) ThermoFisher D3835 Used at a final concentration of 1 µg/mL
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) ThermoFisher D1306 Used at a final concentration of 0.5 µg/mL
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D-8418 Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 Sigma-Aldrich 1004969011 CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Isopentane GPR RectaPur VWR international 24872.298 CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection.
Liquid Nitrogen CAUTION:  Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids.
Mouse on mouse Blocking Reagent  Vector Labs MKB-2213-1 Used at concentration of 1:30
Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b DSHB University of Iowa BA-D5-supernatant Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene:  MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 DSHB University of Iowa SC-71-supernatant Used at a final concentration of 1:10
Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene:  MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa 6H1-supernatant Used at a final concentration of 1:5
Normal Goat Serum (NGS) Vector Labs S-1000
PBS 0.1 M Commonly used on histology laboratories
ProLong Gold Antifade Mountant Invitrogen  P36930
Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) Sigma-Aldrich L0663 Used at a final concentration of 1:1,000
Tissue-Tek O.C.T compound Sakura  4583
Software
Adobe Illustrator CC Adobe Inc. Used to design the figures
Adobe Photoshop Adobe Inc. Confocal software
BioRender https://biorender.com/ Used to design the figures
Fiji/ImageJ https://imagej.net/software/fiji/ Used to analyse the acquired images
Microsoft PowerPoint Microsoft Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types
Zen Blue 2.6 Zeiss Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types

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Médecine numéro 184
Analyse du type de fibre et de la teneur en gouttelettes lipidiques dans le muscle squelettique
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Selvais, C. M., De Cock, L. L.,… More

Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-López de Carrizosa, M. A. Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (184), e63718, doi:10.3791/63718 (2022).

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