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Neuroscience

एक्स वीवो कृन्तकों में ट्राइजेमिनोवस्कुलर सिस्टम से कैल्सीटोनिन जीन-संबंधित पेप्टाइड की रिहाई

Published: May 16, 2022 doi: 10.3791/63723
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3, 1
1Danish Headache Center, Department of Neurology, Rigshospitalet, University of Copenhagen, 2EHESP, Irset (Institut de Recherche en Santé, Environnement et Travail), Univ Rennes, Inserm, 3Department of Biology, Section of Cell Biology and Physiology, University of Copenhagen

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक्स विवो कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) रिलीज मॉडल और कृन्तकों में ट्राइजेमिनोवास्कुलर सिस्टम से जारी सीजीआरपी की मात्रा पर फार्माकोलॉजिकल एजेंटों के प्रभाव को निर्धारित करने की रणनीति का वर्णन करता है।

Abstract

कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) को पहली बार 1980 के दशक में कैल्सीटोनिन जीन से एक स्प्लिस संस्करण के रूप में खोजा गया था। इसकी खोज के बाद से, माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी में इसकी भूमिका अच्छी तरह से स्थापित की गई है, पहले इसके शक्तिशाली वासोडिलेटर गुणों द्वारा और बाद में संवेदी ट्राइजेमिनोवास्कुलर सिस्टम में न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में इसकी उपस्थिति और कार्य द्वारा। सीजीआरपी की माइग्रेन-उत्तेजक क्षमता ने फार्मा उद्योग को मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विकसित करने और सीजीआरपी के प्रभाव को रोकने वाले विरोधी को समर्थन दिया। माइग्रेन के रोगनिरोधी उपचार में एक नया उपचार प्रतिमान प्रभावी साबित हुआ है। माइग्रेन तंत्र को और समझने के लिए उपयोगी उपकरणों में से एक ट्राइजेमिनोवास्कुलर सिस्टम से सीजीआरपी रिलीज का पूर्व विवो मॉडल है। यह एक अपेक्षाकृत सरल विधि है जिसका उपयोग विभिन्न औषधीय उपकरणों के साथ किया जा सकता है ताकि नए प्रभावी माइग्रेन उपचार ों को और विकसित किया जा सके। वर्तमान प्रोटोकॉल एक सीजीआरपी रिलीज मॉडल और कृन्तकों में ट्राइजेमिनोवास्कुलर सिस्टम से जारी सीजीआरपी की मात्रा पर औषधीय एजेंटों के प्रभाव को निर्धारित करने की तकनीक का वर्णन करता है। इच्छामृत्यु से प्रोटीन के स्तर के माप के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करने वाली एक प्रक्रिया प्रदान की गई है। चूहों और चूहों दोनों से ट्राइजेमिनल गैंग्लियन और ट्राइजेमिनल न्यूक्लियस कौडालिस के आवश्यक अलगाव और चूहे ड्यूरा मेटर की तैयारी को विस्तार से वर्णित किया गया है। इसके अलावा, दोनों प्रजातियों (चूहों और चूहों) के प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं। तकनीक विभिन्न औषधीय यौगिकों और आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों का उपयोग करके माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी में शामिल आणविक तंत्र की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

Introduction

माइग्रेन एक न्यूरोलॉजिकल विकार है, जो डब्ल्यूएचओ के अनुसार, 1 बिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करने का अनुमान हैऔर दुनिया भर में विकलांगता के प्रमुख कारणों में से एक है। इस प्रकार, माइग्रेन का रोगियों और समाज दोनों पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। सीजीआरपी विरोधी दवाओं की हालिया नैदानिक सफलता के बावजूद, रोगियों के एक बड़े अनुपात को बेहतर उपचारविकल्पों 2,3,4,5 की आवश्यकता होती है। माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी की व्याख्या जो नए प्रभावी उपचार के लिए अग्रणी है, की आवश्यकता है। ट्राइजेमिनोवास्कुलर सिस्टम के भीतर सिग्नलिंग जिसमें मेनिंगेस, ट्राइजेमिनल गैन्ग्लिया (टीजी), और ट्राइजेमिनल न्यूक्लियस कॉडालिस (टीएनसी) शामिल हैं, माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी 6,7 के लिए केंद्रीय है।

37 एमिनो एसिड न्यूरोपैप्टाइड कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) को पहली बार 1980 के दशक की शुरुआत में खोजा गया था जब अमारा और सहकर्मियों ने प्रदर्शित किया था कि कैल्सीटोनिन जीन के प्राथमिक आरएनए-प्रतिलेख को कैल्सीटोनिन 8,9 के अलावा सीजीआरपी के लिए एमआरएनए कोडिंग देने के लिए संसाधित किया जा सकता है। बाद के शोध ने माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी10 के लिए एक लिंक का सुझाव दिया। सीजीआरपी एक न्यूरोट्रांसमीटर है जिसमें शक्तिशाली वासोडिलेटिंग गुण 11,12,13,14,15,16,17 हैं, और यह व्यापक रूप से केंद्रीय और परिधीय तंत्रिका तंत्र 13,14,18,19,20,21,22 में वितरित किया जाता है . माइग्रेन में सीजीआरपी की भागीदारी को मनुष्यों में माइग्रेन के हमलों के दौरान एक्स्ट्रासेरेब्रल परिसंचरण में सीजीआरपी के स्तर में वृद्धि की खोज के साथ रेखांकित किया गया था, और सीजीआरपी के जलसेक सेरोगियों 24 में माइग्रेन जैसा दर्द होता है। दो साल बाद, माइग्रेन के इलाज में सीजीआरपी विरोधी ओल्सेगेपेंट की प्रभावशीलता का पहला प्रमाण-अवधारणाअध्ययन प्रकाशित किया गया था।

सीजीआरपी ट्राइजेमिनोवस्कुलर सिस्टम में प्रचुर मात्रा में है जैसा कि टीजी21,26 में दिखाया गया है, संवेदी तंत्रिका फाइबर ड्यूरा मेटर27,28,29 और टीएनसी30 को आंतरिक करते हैं। ट्राइजेमिनोवास्कुलर प्रणाली में, सीजीआरपी टीजी के छोटे से मध्यम आकार के न्यूरॉन्स में, अनमाइलिनेटेड सी-फाइबर में पाया जाता है, और टीजी की न्यूरोनल आबादी के लगभग 50% में व्यक्त किया जाता है। सीजीआरपी रिसेप्टर मुख्य रूप से बड़े न्यूरॉन्स में व्यक्त किया जाता है और माइलिनेटेड ए-फाइबर31,32 में पाया जाता है। सीजीआरपी रासायनिक या विद्युत उत्तेजना33,34 पर न्यूरॉन्स से जारी किया जाता है। माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी को समझने के लिए सीजीआरपी की रिहाई और इस सक्रियण के स्थान की ओर जाने वाले मार्गों का अध्ययन महत्वपूर्ण है। पिछले 5 दशकों के दौरान, प्रीक्लिनिकल अध्ययनों ने माइग्रेन से संबंधित सिग्नलिंग पर व्यापक ज्ञान प्राप्त करने में योगदान दिया है और नएउपचारों के विकास में योगदान दिया है। संवहनी और न्यूरोजेनिक भागीदारी पर विचार करने वाले कई तरीकों को माइग्रेन अनुसंधान में संशोधित और लागू किया गया है। जैविक यौगिकों या औषधीय उपचारों के लिए धमनी प्रतिक्रियाओं के विवो और इन विट्रो मॉडल में 17,36,37, और विद्युत तंत्रिका-उत्तेजना38,39 का उल्लेख किया जा सकता है। इसके अलावा, टीएनसी में सक्रिय न्यूरॉन्स को सी-फॉस अभिव्यक्ति40,41,42 और इस क्षेत्र में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग43,44 द्वारा पता लगाया जा सकता है। दोनों विधियां सिर से मस्तिष्क को प्रेषित नोसिसेप्टिव संकेतों को मापती हैं, उदाहरण के लिए, ड्यूरा मेटर। केवल एक प्रीक्लिनिकल मॉडल का उपयोग माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी की पूरी तस्वीर पेश नहीं करता है। इसलिए, माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी के कई पहलुओं को कवर करने वाले विभिन्न मॉडलों को जोड़ना महत्वपूर्ण है। नए मॉडलों का निरंतर विकास माइग्रेन तंत्र के विभिन्न पहलुओं को कवर करेगा, और समय के साथ माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी के रहस्य को उजागर किया जाएगा।

यहां, सीजीआरपी रिलीज विधि का एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है, जो रासायनिक उत्तेजना के बाद चूहों से पृथक टीजी और टीएनसी में पूर्व विवो किया गया है। सीजीआरपी रिलीज का अध्ययन चूहों से ड्यूरा मेटर में भी किया जा सकता है। इस प्रकार, चूहों के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में, ड्यूरा मेटर को टीजी और टीएनसी के साथ वर्णित किया गया है। सीजीआरपी रिलीज विधि का आधार पहली बार 1999 में वर्णित किया गया था, जहां एबर्सबर्गर और सहकर्मियों ने अग्रणी शोध किया और पाया कि चूहों में ड्यूरल अभिवाही के रासायनिक और विद्युत उत्तेजना के बाद सीजीआरपी को ड्यूरा मेटर से जारी किया गयाथा। बाद में, इस दृष्टिकोण को टीजी46 और टीएनसी47 से सीजीआरपी रिलीज तक बढ़ा दिया गया था। इसके बाद, चूहों में टीजी और टीएनसी पर लागू करने के लिए विधि को संशोधित किया गया था। अब तक, ड्यूरा मेटर से सीजीआरपी रिलीज चूहों में चुनौतीपूर्ण रहा है।

Protocol

सभी पशु देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को जानवरों की देखभाल और उपयोग (2010/63 / यूई) के लिए यूरोपीय समुदाय गाइड के अनुपालन में किया गया था। इस प्रोटोकॉल को प्रदर्शित करने के लिए 10 सप्ताह की आयु के नर C57BL/6JBomTac चूहों और 10 सप्ताह की आयु के नर स्प्राग डॉवले चूहों का उपयोग किया गया था।

1. सिंथेटिक अंतरालीय द्रव की तैयारी

  1. निम्नलिखित नुस्खा के अनुसार सिंथेटिक अंतरालीय द्रव (एसआईएफ) तैयार करें: 108 एमएम एनएसीएल, 3.48 एमएम केसीएल, 3.50 एमएम एमजीएसओ4, 26 एमएम एनएएचसीओ3, 11.70 एमएम एनएएच2पीओ4, 1.50 एमएम सीएसीएल2, 9.60 एमएम एनए-ग्लूकोनेट, 5.50 एमएम ग्लूकोज और 7.60 एमएम सुक्रोज ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: एसआईएफ उत्तेजना लक्ष्य के आधार पर विविध हो सकता है, उदाहरण के लिए, कैल्शियम चैनलों का अध्ययन करते समय कैल्शियम मुक्त समाधान का उपयोग किया जा सकता है।
  2. पीएच को 7.4 में समायोजित करें और कार्बोजेन गैसिंग (5% सीओ2 और 95% ओ2)46 द्वारा पीएच को स्थिर करें।

2. इच्छामृत्यु

  1. 70% सीओ 2 और 30% ओ 2 के मिश्रण के साथ वयस्क चूहों और चूहों को एनेस्थेटाइज करें। कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके चूहों को और गिलोटिन का उपयोग करके चूहों को हटा दें (सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: एक तनाव और उम्र का उपयोग करें जो अनुसंधान के उद्देश्य को फिट करता है। इस मॉडल में पुरुषों और महिलाओं दोनों का उपयोग किया जा सकता है।
  2. रीढ़ की हड्डी के सी 3-सी 4 स्तर पर सिर को शरीर से अलग करें।
    नोट: इच्छामृत्यु को पेंटोबार्बिटल (100-150 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन के साथ भी किया जा सकता है।

3. विच्छेदन

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए चूहे के ऊतक तैयार करें।
    1. कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके सिर और गर्दन के आसपास की त्वचा और मांसपेशियों को हटा दें (चित्रा 1 ए)।
    2. निचले जबड़े को सिर से अलग करने के लिए हड्डी ट्रिमर और कैंची का उपयोग करें (चित्रा 1 बी-सी)।
    3. रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय भाग में हड्डी के ट्रिमर को सम्मिलित करके रीढ़ की हड्डी खोलें और रीढ़ की हड्डी और ब्रेनस्टेम को उजागर करने के लिए कशेरुक के पृष्ठीय भाग को हटा दें (चित्रा 1 डी)।
    4. सेरिबैलम को उजागर करने वाली इन हड्डी संरचनाओं को हटाने के लिए ओसीसीपिटल और इंटरपेराइटल हड्डियों की सीमाओं द्वारा क्रैनियम के पुच्छल भाग को काटें (चित्रा 1 ई)।
      नोट: कशेरुक को काटने और हटाने के दौरान ब्रेनस्टेम और रीढ़ की हड्डी को नुकसान नहीं पहुंचाना महत्वपूर्ण है।
    5. स्प्रिंग कैंची के साथ ब्रेनस्टेम के डोरसोलेटरल हिस्से को काटकर प्रत्येक तरफ ब्रेग्मा से लगभग 13-16 मिमी तक चलने वाले टीएनसी (एसपी 5 सी) को अलग करें। बाईं और दाईं ओर टीएनसी को एसआईएफ में डुबोएं (चित्रा 1 ई-आई)।
      नोट: विवरण वयस्क चूहों से मेल खाता है।
    6. एक आरी का उपयोग करके क्रैनियम को दो में विभाजित करने के लिए सिर को बीच में काटें (चित्र 1 जे-एल)।
    7. स्पैटुला का उपयोग करके क्रैनियम से जुड़े ड्यूरा मेटर को स्पर्श किए बिना और ट्राइजेमिनल तंत्रिका को काटने के बिना मस्तिष्क को सावधानीपूर्वक हटा दें जहां यह ब्रेनस्टेम में प्रवेश करता है (चित्रा 1 एम-पी)।
    8. टीजी को अलग करने के लिए, इसे काट लें, जिसमें दृश्य सीमाओं के आसपास इसकी शाखाएं शामिल हैं। मैंडिबुलर शाखा को काटें जहां यह फोरमेन ओवल में प्रवेश करता है। खोपड़ी में प्रवेश करने वाली नेत्र और मैक्सिलरी शाखाओं को काटें क्योंकि वे मैक्रोस्कोपिक रूप से विभाजित नहीं हैं। टीजी का विच्छेदन करते समय, टीजी को कवर करने वाले ड्यूरा मेटर को हटा दें (चित्रा 1क्यू-टी)।
    9. एसआईएफ में क्रैनियम के आधे हिस्से और टीजी को डुबोएं।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए माउस ऊतक तैयार करें।
    1. छोटी कैंची का उपयोग करके सिर और गर्दन के आसपास की त्वचा और मांसपेशियों को हटा दें (चित्रा 2 ए-बी)।
    2. रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय भाग में छोटी कैंची की एक जोड़ी डालकर रीढ़ की हड्डी खोलें और रीढ़ की हड्डी और ब्रेनस्टेम को उजागर करने के लिए कशेरुक के पृष्ठीय भाग को हटा दें (चित्रा 2 सी)।
      नोट: कशेरुक को काटते और हटाते समय रीढ़ की हड्डी को नुकसान नहीं पहुंचाना महत्वपूर्ण है।
    3. सेरिबैलम को उजागर करने वाली इन हड्डी संरचनाओं को हटाने के लिए ओसीसीपिटल और इंटरपेराइटल हड्डियों की सीमाओं से क्रैनियम को काटें (चित्रा 2 डी-एफ)।
    4. फिर, पार्श्विका हड्डी को बीच-बीच में काट लें और सेरेब्रम को उजागर करने के लिए हड्डी को हटा दें (चित्रा 2 जी-आई)।
    5. ब्रेनस्टेम को उजागर करने के लिए सेरिबैलम को एक स्पैटुला के साथ सावधानीपूर्वक हटा दें (चित्रा 2 जे)।
    6. स्प्रिंग कैंची (चित्रा 2के-एन) का उपयोग करके ब्रेनस्टेम के टीएनसी युक्त हिस्से को अलग करें। एसआईएफ में टीएनसी के साथ ब्रेनस्टेम को डुबोएं (चित्रा 2 ओ)।
    7. मस्तिष्क को हटा दें और ट्राइजेमिनल तंत्रिका को काट दें जहां यह ब्रेनस्टेम में प्रवेश करता है (चित्रा 2 पी-क्यू)।
    8. टीजी को अलग करने के लिए, इसे काट लें, जिसमें दृश्य सीमाओं के आसपास इसकी शाखाएं शामिल हैं। मैंडिबुलर शाखा को काटें जहां यह फोरमेन ओवल में प्रवेश करता है। खोपड़ी में प्रवेश करने वाली नेत्र और मैक्सिलरी शाखाओं को काटें क्योंकि वे मैक्रोस्कोपिक रूप से विभाजित नहीं हैं। टीजी का विच्छेदन करते समय, टीजी (चित्रा 2 आर-एस) को कवर करने वाले ड्यूरा मेटर को हटा दें।
    9. एसआईएफ में टीजी को डुबोएं (चित्रा 2 टी)।

4. धोना

  1. कमरे के तापमान पर हर 5 मिनट में एसआईएफ को बदलते हुए 30 मिनट के लिए एसआईएफ में खोपड़ी के आधे हिस्से, टीएनसी और टीजी धोएं।
    नोट: आसान एसआईएफ विनिमय (चित्रा 3 ए-बी) को सक्षम करने के लिए ट्यूल ढक्कन के साथ प्लास्टिक के कंटेनरों में ऊतक को रखते हुए धोने के चरण किए जा सकते हैं।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए चूहे के ऊतक तैयार करें।
    1. टीएनसी को एसआईएफ के 350 μL के साथ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब कैप को अलग करने के लिए स्थानांतरित करें (चित्रा 3 सी)।
    2. टीजी को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब कैप्स में स्थानांतरित करें - एसआईएफ के 350 μL के साथ एक TG प्रति माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब कैप (चित्रा 3 सी)।
    3. खोपड़ी के हिस्सों को मिट्टी या 6-वेल कल्चर प्लेट से बने प्लेटफार्मों पर रखें और खोपड़ी को 400 μL SIF (चित्रा 3C) से भरें।
  3. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए माउस ऊतक तैयार करें।
    1. टीएनसी के साथ ब्रेनस्टेम को एसआईएफ के 250 μL के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब कैप में स्थानांतरित करें (चित्रा 3 डी)।
    2. दो टीजी को एसआईएफ के 250 μL के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब कैप में स्थानांतरित करें (चित्रा 3 डी)।
      नोट: चूहों से ऊतक का उपयोग करते समय प्रति माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब कैप पर दो टीजी रखें।
  4. चूहे की खोपड़ी और माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब कैप को चूहे और माउस ऊतक के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में रखें। 20 मिनट के लिए हर 5 मिनट में एक पिपेट का उपयोग करके एसआईएफ को बदलें।
    नोट: एसआईएफ को जोड़ते और हटाते समय ऊतक को स्पर्श नहीं करना महत्वपूर्ण है।

5. दवा परीक्षण

  1. बेसल सीजीआरपी रिलीज स्तर निर्धारित करें।
    1. अंतिम धोने के बाद, माउस टीजी और टीएनसी में एसआईएफ के 250 μL जोड़ें। चूहे टीजी और टीएनसी में 350 μL और प्रत्येक चूहे की खोपड़ी में 400 μL जोड़ें।
    2. इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद, एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 200 μL नमूना एकत्र करें और बेसल CGRP रिलीज (चरण 6) के माप की अनुमति देने के लिए 10x EIA बफर (CGRP एंजाइम इम्यूनोसे किट के साथ प्रदान किया गया, सामग्री की तालिका देखें) के 50 μL जोड़ें। शेष तरल को त्याग दें।
      नोट: इनक्यूबेशन समय सभी नमूनों के लिए समान होना चाहिए।
    3. तुरंत, नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. बेसल सीजीआरपी रिलीज स्तरों के नमूने के बाद, तीन तरीकों में से एक का पालन करें: (ए) एकल उत्तेजना (चरण 5.2); (बी) एकाग्रता-प्रतिक्रिया उत्तेजना (चरण 5.3); और (सी) उत्तेजना का निषेध (चरण 5.4) (चित्रा 4)।
      नोट: उपयोग किए गए परीक्षण यौगिक और सांद्रता अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करते हैं।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए एकल उत्तेजना करें।
    1. ऊतक में परीक्षण यौगिक या वाहन जोड़ें और इसे 10 मिनट के लिए छोड़ दें (मात्रा: माउस टीजी और टीएनसी के लिए 250 μL, चूहे TG और TNC के लिए 350 μL, और प्रत्येक चूहे की खोपड़ी के लिए 400 μL)।
    2. इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद, 10x EIA बफर के 50 μL के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 200 μL नमूना एकत्र करें। शेष तरल को त्याग दें और तुरंत नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: इनक्यूबेशन समय सभी नमूनों के लिए समान होना चाहिए।
  3. नीचे दिए गए चरणों के बाद एकाग्रता-प्रतिक्रिया उत्तेजना करें।
    1. परीक्षण यौगिक या वाहन को वांछित सांद्रता में पतला करें। सबसे कम सांद्रता से शुरू होने वाली सांद्रता बढ़ाने में परीक्षण यौगिक जोड़ें।
      नोट: उपयोग किए गए परीक्षण यौगिक और सांद्रता अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करते हैं। उदाहरण के लिए, वर्तमान अध्ययन के लिए 1 μM, 10 μM, और 100 μM सुपरसिनामेल्डिहाइड का उपयोग किया गया था।
    2. परीक्षण यौगिक और संबंधित वाहन की सबसे कम सांद्रता (वर्तमान अध्ययन के लिए 1 μM) को दो समान ऊतक तैयारी में जोड़ें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (मात्रा: माउस ऊतक के लिए 250 μL, चूहे TG और TNC के लिए 350 μL, और प्रत्येक चूहे की खोपड़ी के लिए 400 μL)।
    3. इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद, 10x EIA बफर के 50 μL के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 200 μL नमूना एकत्र करें।
    4. शेष तरल को त्याग दें और ऊतक में दूसरी सबसे कम सांद्रता (वर्तमान अध्ययन के लिए 10 μM) जोड़ें।
    5. तुरंत, नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. शेष सांद्रता (वर्तमान अध्ययन के लिए 100 μM) के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएं।
  4. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए उत्तेजना का निषेध करें।
    1. ऊतक में अवरोधक या वाहन जोड़ें और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें (मात्रा: माउस ऊतक के लिए 250 μL, चूहे TG और TNC के लिए 350 μL, और प्रत्येक चूहे की खोपड़ी के लिए 400 μL)।
      नोट: उपयोग किए गए अवरोधक और एकाग्रता अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करते हैं। उदाहरण के लिए, चित्रा 5 में प्रतिनिधि परिणाम के लिए 3 μM ग्लिबेनक्लामाइड का उपयोग किया गया था।
    2. इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद, 10x EIA बफर के 50 μL के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 200 μL नमूना एकत्र करें। शेष तरल को त्याग दें और तुरंत नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. ऊतक में एगोनिस्ट या एगोनिस्ट + ब्लॉकर जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: उपयोग किए गए एगोनिस्ट, ब्लॉकर और सांद्रता अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करते हैं। वर्तमान अध्ययन में, ग्लिबेनक्लामाइड के 3 μM और कैप्साइसिन के 1 μM का उपयोग किया गया था, चित्रा 5।
    4. इनक्यूबेशन के 10 मिनट के बाद, 10x EIA बफर के 50 μL के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 200 μL नमूना एकत्र करें। शेष तरल को त्याग दें और तुरंत नमूने को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. प्रयोग के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण करें।
    1. उपयुक्त होने पर, प्रोटोकॉल के अंत में ऊतक में एक सकारात्मक नियंत्रण (उदाहरण के लिए, कैप्साइसिन का 1-10 μM, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें और 10 मिनट की इनक्यूबेशन अवधि के बाद 10x EIA बफर के 50 μL के साथ एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 200 μL नमूना एकत्र करें।
      नोट: सेटअप और ऊतकों के काम करने को सुनिश्चित करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण शामिल करना फायदेमंद है। कैप्साइसिन 48,49,50 या पोटेशियम के विध्रुवण उत्तेजना (केसीएल का 40-60 एमएम) 46,47,49 नियमित रूप से ट्राइजेमिनोवास्कुलर सिस्टम से सीजीआरपी की रिहाई का कारण बनने के लिए उपयोग किया जाता है। केसीएल एसआईएफ के 40-60 एमएम को एसआईएफ के रूप में तैयार किया जाता है, सिवाय इसके कि एनएसीएल को समान आधार पर केसीएल के लिए आदान-प्रदान किया जाता है।

6. सीजीआरपी सांद्रता का विश्लेषण

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एंजाइम इम्यूनोएसे (ईआईए) किट का उपयोग करके जारी सीजीआरपी की मात्रा को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. प्लेट फोटोमीटर का उपयोग करके 410 एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें। यदि एक अलग सीजीआरपी ईआईए किट का उपयोग किया जाता है, तो निर्माता के प्रोटोकॉल में प्रदान की गई तरंग दैर्ध्य पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें।
    नोट: मानक वक्र से मेल खाने के लिए नमूने को पतला किया जाना चाहिए।
  3. डेटा विश्लेषण करें.
    1. डेटा को या तो पूर्ण सांद्रता के रूप में प्रस्तुत करें या विशिष्ट ऊतक से बेसल सीजीआरपी रिलीज को सामान्य करें।

Representative Results

यह तकनीक माइग्रेन में शामिल सीजीआरपी से संबंधित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए एक उपकरण है। इसमें ट्राइजेमिनोवास्कुलर सिस्टम के विभिन्न स्तरों से सीजीआरपी रिलीज का आकलन करने का लाभ है और इसे विभिन्न औषधीय यौगिकों के साथ संयोजन में जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक चूहों और चूहों दोनों पर लागू किया जा सकता है। यहां, चूहों से एकाग्रता-प्रतिक्रिया और अवरुद्ध प्रयोग और जंगली-प्रकार और ट्रांसजेनिक चूहों से एकाग्रता-प्रतिक्रिया परिणाम प्रस्तुत किए जाते हैं।

सीजीआरपी रिलीज विधि का उपयोग महिला सहज ट्राइजेमिनल एलोडाइनिक (एसटीए) चूहों में टीजी और ड्यूरा मेटर से सीजीआरपी रिलीज पर केएटीपी चैनल अवरोधक ग्लिबेनक्लामाइड के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया गया था। सबसे पहले, कैप्साइसिन की इष्टतम एकाग्रता एक एकाग्रता-प्रतिक्रिया अध्ययन डिजाइन का उपयोग करके पाई गई थी। कैप्साइसिन एक्सपोजर ने वाहन की तुलना में ड्यूरा मेटर और टीजी से एक महत्वपूर्ण सीजीआरपी रिलीज को प्रेरित किया (चित्रा 5)। ड्यूरा मेटर में, सीजीआरपी की अधिकतम रिलीज कैप्साइसिन के 1 μM पर पाई गई थी, और टीजी में, अधिकतम CGRP रिलीज कैप्साइसिन के 10 μM पर पाया गया था (चित्रा 5A-B)। एकाग्रता-प्रतिक्रिया प्रयोगों के आधार पर, प्रयोगों को अवरुद्ध करने के लिए कैप्साइसिन के 1 μM और ग्लिबेनक्लामाइड के 3 μM का उपयोग किया गया था। ग्लिबेनक्लामाइड ने ड्यूरा मेटर (पी = 0.441) और टीजी (पी = 0.881) से बेसल सीजीआरपी रिलीज पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया, जब एक तरफ़ा एनोवा51 के साथ विश्लेषण किया गया। ग्लिबेनक्लैमाइड ने एक तरफा एनोवा (चित्रा 5 सी-डी)51 के साथ विश्लेषण किए जाने पर वाहन के साथ कैप्साइसिन की तुलना में ड्यूरा मेटर में कैप्साइसिन-प्रेरित सीजीआरपी रिलीज को 40% (पी = 0.031) और टीजी को 39% (पी = 0.003) तक काफी कम कर दिया।

चूहों में, प्रोटोकॉल का उपयोग माइग्रेन के जीटीएन माउस मॉडल में क्षणिक रिसेप्टर पोटेंशियल एंकिरिन 1 (टीआरपीए 1) आयन चैनल की भागीदारी की जांच करने के लिए किया गया था, जहां जीटीएन-प्रेरित अतिसंवेदनशीलता पूरी तरह से टीआरपीए 1 चैनलों पर निर्भर थी। टीआरपीए 1 एगोनिस्ट सुपरसिनामेल्डिहाइड (एससीए) को टीजी से खुराक-निर्भर तरीके से सीजीआरपी को 1 μM, 10 μM, और 100 μM SCA के साथ जारी करने के लिए पाया गया, जिसके परिणामस्वरूप 9% (P = 0.23), 51% (P = 0.011), और 69% (P = 0.0097) ने दो-तरफ़ा ANOVA के साथ विश्लेषण करने पर क्रमशः वाहन की तुलना में CGRP की रिहाई में वृद्धि की। यह रिलीज Trpa1 शून्य चूहों से TG में अनुपस्थित थी, जहां एससीए के 1 μM, 10 μM और 100 μM के संपर्क में आने से क्रमशः 11% (P > 0.99), -13% (P > 0.99) और 9% (P = 0.97) वाहन की तुलना में CGRP की रिहाई में 9% (P = 0.97) प्रतिशत परिवर्तन हुआ, जब दो-तरफ़ा ANOVA के साथ विश्लेषण किया गया। कैप्साइसिन (सकारात्मक नियंत्रण) के 10 μM के साथ बाद की उत्तेजना से पता चलता है कि सभी ऊतक नमूने CGRP (चित्रा 6)50 जारी कर सकते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: चूहों से ऊतक का चरण-दर-चरण विच्छेदन। (ए-टी) विवरण प्रोटोकॉल अनुभाग (चरण 3.1) में प्रदान किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: चूहों से ऊतक का चरण-दर-चरण विच्छेदन। (ए-टी) विवरण प्रोटोकॉल अनुभाग (चरण 3.2) में प्रदान किए गए हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: कृंतक ऊतक की धुलाई और इनक्यूबेशन। (A-B) एसआईएफ के साथ प्लास्टिक कंटेनरों में ताजा पृथक ऊतक। एसआईएफ के आसान परिवर्तन को सक्षम करने के लिए कंटेनरों को ट्यूल के साथ कवर किया गया है। (सी) चूहे के ऊतक - 6-वेल कल्चर प्लेट पर रखी गई खोपड़ी के आंतरिक अस्तर को कवर करने वाले ड्यूरा मेटर के साथ दो खोपड़ी आधे होते हैं। अलग-अलग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब ढक्कन (ढक्कन की शीर्ष पंक्ति) में दाएं और बाएं ट्राइजेमिनल न्यूक्लियस कॉडेलिस। अलग-अलग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब ढक्कन (ढक्कन की निचली पंक्ति) में दो ट्राइजेमिनल गैन्ग्लिया। (डी) माउस ऊतक - एक अलग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब ढक्कन (शीर्ष) में ब्रेनस्टेम का ट्राइजेमिनल न्यूक्लियस कॉडालिस युक्त हिस्सा। दो माउस ट्राइजेमिनल गैन्ग्लिया एक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब ढक्कन (नीचे) में हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: सीजीआरपी रिलीज के लिए अध्ययन डिजाइन। सीजीआरपी रिलीज प्रयोगों को करने के लिए तीन अलग-अलग प्रोटोकॉल। दवाओं को सिंथेटिक अंतरालीय द्रव (एसआईएफ) में पतला किया जाना है। (ए) एकल उत्तेजना। (बी) एकाग्रता-प्रतिक्रिया उत्तेजना। (सी) उत्तेजना का निषेध। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: ग्लिबेनक्लामाइड चूहे ड्यूरा मेटर और ट्राइजेमिनल गैंग्लियन से कैप्साइसिन-प्रेरित सीजीआरपी रिलीज को रोकता है। मूल रूप से थॉमस जेफरसनविश्वविद्यालय 52 से प्राप्त महिला सहज ट्राइजेमिनल एलोडीनिक (एसटीए) चूहों (215-318 ग्राम) से अलग ट्राइजेमिनल गैंग्लियन और ड्यूरा मेटर से सीजीआरपी स्तर वाणिज्यिक मानव सीजीआरपी ईआईए किट के साथ मापा गया था। (A-B) कैप्साइसिन (10 एनएम, 100 एनएम, 1 μM और 10 μM) (n = 4) की बढ़ती सांद्रता के बाद (A) ड्यूरा मेटर और (B) ट्राइजेमिनल गैंग्लियन से सीजीआरपी रिलीज होता है। डेटा को व्यक्तिगत बिंदुओं के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और दो-तरफा एनोवा के साथ विश्लेषण किया गया था। पी < 0.0001 (सी-डी) वाहन के संपर्क में आने के बाद (सी) ड्यूरा मेटर और (डी) ट्राइजेमिनल गैंग्लियन से जारी सीजीआरपी के स्तर, 3 μM ग्लिबेनक्लामाइड (ग्लिब), 1 μM कैप्साइसिन और 1 μM कैप्साइसिन + 3 μM glib (n = 6-11)। डेटा को व्यक्तिगत बिंदुओं और माध्य मूल्यों के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और एक-तरफ़ा एनोवा के साथ विश्लेषण किया गया था। * वाहन की तुलना में। कैप्साइसिन + ग्लिब की तुलना में # कैप्साइसिन। #P < 0.05, ** और ##P < 0.01, ****P < 0.0001. विश्लेषण के बाद बोनफेरोनी के कई तुलना परीक्षण किए गए। सभी परीक्षणों के लिए α = 0.05 का एक महत्वपूर्ण स्तर उपयोग किया गया था। इस आंकड़े को क्रिस्टेनसेन एट अल से संशोधित किया गया है। 51. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: एससीए एक्सपोजर के परिणामस्वरूप माउस ट्राइजेमिनल गैंग्लियन से टीआरपीए 1 निर्भर सीजीआरपी रिलीज होता है। डब्ल्यूटी और टीआरपीए 1 नल (Trpa1tm1/Dpc) से पृथक ट्राइजेमिनल गैंग्लियन से जारी CGRP स्तर 53 नर चूहों (8-10 सप्ताह) को चूहे CGRP EIA किट के साथ 1 μM, 10 μM, और 100 μM और कैप्साइसिन को 10 μM पर सकारात्मक नियंत्रण (n = 6) के रूप में मापा गया था। प्रत्येक माउस से डेटा को अलग-अलग बिंदुओं के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, और सलाखों औसत मूल्यों को इंगित करते हैं। आंकड़े: प्रत्येक एकाग्रता पर एससीए और वाहन के बीच और बेसल और सकारात्मक नियंत्रण के बीच तुलना दो-तरफा दोहराए गए एनोवा के साथ की गई थी। α का एक महत्वपूर्ण स्तर = 0.05। * पी < 0.05, ** पी < 0.01। इस आंकड़े को क्रिस्टेनसेन एट अल से संशोधित किया गया है। 50. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वर्णित विधि माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी में सीजीआरपी के महत्व को दिखाने वाले अध्ययनों के बाद विकसित की गई थी। यह ट्राइजेमिनोवास्कुलर सिस्टम से सीजीआरपी की रिहाई में शामिल तंत्र की जांच के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जो सिर क्षेत्र में दर्द सिग्नलिंग के लिए महत्वपूर्ण है। इस मॉडल में प्राप्त सीजीआरपी की मात्रा सीधे ट्राइजेमिनल नसों से सीजीआरपी रिलीज को मापती है जो ड्यूरा मेटर, टीजी और टीएनसी को प्रभावित करती है। सीजीआरपी रिलीज की मात्रा मात्रात्मक रूप से मनुष्यों में थर्मोकोग्यूलेशन के बाद प्लाज्मा में मापी गई रिहाई, बिल्ली 39,55,56 में ट्राइजेमिनल उत्तेजना और माइग्रेन के हमलों के दौरान23 से अधिक है। एक स्पष्टीकरण यह हो सकता है कि सीजीआरपी रक्तमें पतला और अवक्रमित होता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि रसायनों के साथ प्रत्यक्ष उत्तेजना पैथोफिजियोलॉजिकल सक्रियण से बेहतर हो सकती है। आगे के फायदे यह हैं कि ट्राइजेमिनोवास्कुलर सिस्टम के भीतर तीन अलग-अलग साइटों से रिलीज का पता लगाना संभव है और इसका उपयोग औषधीय हेरफेर और आनुवंशिक रूप से संशोधित कृन्तकों के ऊतक में किया जा सकता है।

हाल ही में, कई प्रीक्लिनिकल कृंतक मॉडल पदार्थों के प्रणालीगत प्रशासन और बाद में दर्द या माइग्रेन से संबंधित रीड-आउट पर ध्यान केंद्रित करते हैं, जिसमें वॉन फ्रे परीक्षण57,58, 59,60,61 या प्रकाश विचलन62,63,64 शामिल हैं। ये विधियाँ विभिन्न पदार्थों के दर्द-उत्प्रेरण और दर्द से राहत देने वाले गुणों को समझने में उपयोगी हैं। हालांकि, ये दृष्टिकोण शामिल विशिष्ट लक्ष्य ऊतकों पर कोई जानकारी नहीं देते हैं। वर्तमान विधि में, ट्राइजेमिनोवस्कुलर सिस्टम को तीन संरचनाओं में विभाजित किया गया है: ड्यूरा मेटर, टीजी और टीएनसी। यह प्रत्येक संरचना के स्थानीय प्रदर्शन और एक विशिष्ट पदार्थ की कार्रवाई के स्थान के मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। इसका उपयोग 2011 के एक अध्ययन में किया गया था, जहां चूहों में वोल्टेज-गेटेड कैल्शियम चैनलों की भूमिका का पता लगाया गया था, और इन चैनलों का निषेध ट्राइजेमिनोवास्कुलर मार्ग47 की तीन संरचनाओं में अलग पाया गया था। तंत्रिका तंत्र की संरचनाओं का विच्छेदन करते समय, एक्सोटॉमी अपरिहार्य है। एक्सोटॉमी को विभिन्नजीनों के प्रतिलेखन को बदलने के लिए दिखाया गया है। ये ट्रांसक्रिप्शनल परिवर्तन इस विधि के परिणामों को प्रभावित करने के लिए बहुत धीमे हैं, लेकिन विवो स्थितियों46 की तुलना में फॉस्फोराइलेशन में परिवर्तन को बाहर नहीं रखा जा सकता है। यद्यपि सीजीआरपी जैसे न्यूरोपैप्टाइड सेल सोमा में बनते हैं, न्यूरोपैप्टाइड्स की रिहाई और कार्रवाई आमतौर पर केंद्रीय या परिधीय तंत्रिका टर्मिनलों पर होती है। इस प्रकार, टर्मिनलों सहित बरकरार न्यूरॉन्स के अध्ययन, न्यूरोपैप्टाइड रिलीज का अध्ययन करते समय दिलचस्प हैं। इसलिए, पृथक गैन्ग्लिया से न्यूरॉन्स की संस्कृतियों का अध्ययन करने के तरीकों को टर्मिनलों के मॉडल के रूप में सेवा करने के लिए स्थापित किया गया है। हालांकि, न्यूरोनल सेल संस्कृतियां कई समस्याओं के अधीन हैं क्योंकि यांत्रिक पृथक्करण एक संस्कृति46 में न्यूरॉन्स को नष्ट कर सकता है। कोशिकाओं के संवर्धन से जुड़ी लंबी समय सीमा इस विधि को एक्सोटॉमी और संस्कृति स्थितियों के कारण ट्रांसक्रिप्टोमिकपरिवर्तनों के प्रति संवेदनशील छोड़ देती है। इसके अलावा, विकास कारकों के अलावा और सतह कोटिंग्स पर संवर्धन ने ट्रांसमीटर और रिसेप्टर अभिव्यक्ति66,67,68,69 के रूप में न्यूरोनल गुणों को बदल दिया है। न्यूरोनल सेल संस्कृतियों के बजाय ताजा पृथक बरकरार गैन्ग्लिया का अध्ययन करते समय इन समस्याओं से बचा जाता है।

पूर्व विवो सीजीआरपी रिलीज विधि के साथ एक चुनौती प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणामों के लिए आवश्यक ऊतक का सटीक विच्छेदन है। विशेष रूप से टीएनसी का सटीक विच्छेदन चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह ब्रेनस्टेम के भीतर एक संरचना है जिसमें कोई दिखाई देने वाली सीमा नहीं है। इसके अलावा, ड्यूरा मेटर नाजुक है, और एक बरकरार संरचना सुनिश्चित करने के लिए मस्तिष्क को हटाने की सावधानीपूर्वक की जानी चाहिए। इन बाधाओं के परिणामस्वरूप ऊतक का आकार अलग-अलग हो सकता है और इस प्रकार, बेसल और उत्तेजना-प्रेरित सीजीआरपी स्तर अलग-अलग हो सकते हैं। हालांकि, इस भिन्नता को बेसल सीजीआरपी रिलीज के सामान्यीकरण द्वारा जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि चूहों से टीएनसी को अलग करते समय, ब्रेनस्टेम का पूरा निचला हिस्सा अलग हो जाता है और चूहों में किए गए अधिक विशिष्ट टीएनसी युक्त भाग नहीं होता है। सामान्य तौर पर, चूहे के ऊतकों का उपयोग करना एक फायदा हो सकता है, क्योंकि यह ड्यूरा मेटर से सीजीआरपी रिलीज के माप और टीएनसी के अधिक सटीक विच्छेदन की अनुमति देता है। इसके अलावा, ऊतक का आकार भी अपने वाहन नियंत्रण के रूप में एक चूहे के उपयोग को सक्षम बनाता है, क्योंकि एक चूहे के परिणामस्वरूप दो क्रैनियम हाफ, दो टीजी और दो टीएनसी होते हैं जहां ऊतक का एक टुकड़ा पदार्थ उत्तेजना के लिए और दूसरा वाहन के लिए उपयोग किया जाता है। चूहों का उपयोग करते समय, एक प्रयोग के लिए दो जानवरों की आवश्यकता होती है क्योंकि दोनों टीजी को एक नमूने में पूल किया जाता है, और टीएनसी को एक ब्रेनस्टेम के रूप में विच्छेदित किया जाता है। इसलिए, पदार्थ उत्तेजना के लिए दो टीजी और एक ब्रेनस्टेम का उपयोग किया जाता है, और वाहन नियंत्रण के लिए दूसरे माउस से दो टीजी और एक ब्रेनस्टेम का उपयोग किया जाता है। इसके परिणामस्वरूप समान संख्या में प्रतिकृति प्राप्त करने के लिए चूहों की तुलना में दोगुने चूहों का उपयोग किया जाता है। उपयोग किए गए चूहों की संख्या को कम करने के लिए, ब्रेनस्टेम स्लाइस से सीजीआरपी रिलीज को मापने की एकविधि का सुझाव दिया गया है। यह एक फायदा है कि चूहों के उपयोग को सक्षम करने के लिए विधि को संशोधित किया गया है। यह पहले से ही उपलब्ध कई ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों के उपयोग की अनुमति देता है, अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण, उदाहरण के लिए, सिग्नलिंग मार्ग। एक प्रयोग के अंत में एक सकारात्मक नियंत्रण को यह सुनिश्चित करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए कि प्रयोग में उपयोग किया जाने वाला ऊतक सीजीआरपी जारी कर सकता है। सकारात्मक नियंत्रण टीआरपीवी 1 एगोनिस्ट कैप्साइसिन या डिपोलराइजिंग स्टिमुलस पोटेशियम (केसीएल) हो सकता है, जो चूहों और चूहों दोनों में ट्राइजेमिनोवास्कुलर सिस्टम से सीजीआरपी जारी करने के लिए पाया गया है। इसके अलावा, विधि को पिट्यूटरी एडेनिलेट साइक्लेज-एक्टिविंग पेप्टाइड (पीएसीएपी) के रूप में अन्य प्रासंगिक पेप्टाइड्स की रिहाई को मापने के लिए भी अनुकूलित किया गया है - माइग्रेन अनुसंधान70 के भीतर बहुत रुचि का एक और पेप्टाइड।

विधि चूहों और चूहों में विशिष्ट लक्ष्य ऊतकों से सीजीआरपी रिलीज की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करती है। यह एक अपेक्षाकृत तेज़ विधि है जो न्यूरॉन्स की खेती से जुड़ी समस्याओं से बचती है। विधि प्रोटोकॉल को आसानी से विभिन्न औषधीय यौगिकों द्वारा प्रतिक्रिया के एकाग्रता-प्रतिक्रिया संबंध या निषेध का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। एक्स विवो सीजीआरपी रिलीज विधि माइग्रेन पैथोफिज़ियोलॉजी में सीजीआरपी रिलीज से संबंधित सीजीआरपी और अन्य तंत्रों की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपयोगी कई प्रीक्लिनिकल तरीकों में से एक है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को कैंडीज फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-well culture plate NUNC 140675
Calcium chloride dihydrate Merck 1.02382.1000 For SIF buffer
Caps for plastic containers ThermoFisher Scientific 536617
Capsaicin Merck M2028
CGRP kits AH Diagnostics A05482.96
CO2 Strandmøllen 4.6 For carbogen gassing of SIF
Delicate Bone Trimmer Fine Science Tools 16109-14
Glibenclamide Tocris 911
Glucose Merck G7021 For SIF buffer
Guillotine for rats Scandidact NS-802
Magnesium sulfate heptahydrate Merck M5921 For SIF buffer
Microcenrifuge tubes + lids/caps VWR 700-5239
Mini Hacksaw BAHCO 208
O2 Strandmøllen 4.5 For carbogen gassing of SIF
Pentobarbital Glostrup pharmacy NA Magistral formula
Plastic containers ThermoFisher Scientific 536455
Plate photometer - Infinite M200 Tecan NA Infinite M200 is discontinued. A Infinite 200 PRO is available at Tecan.
Software: SW Magellan v.6.3
Potassium chloride Merck P9333 For SIF buffer
Scissor Allgaier Instruments 307-156-170
Small scissor Allgaier Instruments 04-520-115
Sodium bicarbonate Merck S6014 For SIF buffer
Sodium chloride Merck S9888 For SIF buffer
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 1.06346.1000 For SIF buffer
Sodium gluconate Merck S2054 For SIF buffer
Spatula Bochem Lab Supply 3018
Spring scissor Fine Science Tools 15024-10
Sucrose Merck 84097 For SIF buffer
Supercinnamaldehyde Merck S3322
Tulle (fabrics) NA NA Bought in the local fabrics store

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References

  1. GBD 2016 Collaborators. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).
  2. Dodick, D. W. CGRP ligand and receptor monoclonal antibodies for migraine prevention: Evidence review and clinical implications. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 445-458 (2019).
  3. Sacco, S., et al. European headache federation guideline on the use of monoclonal antibodies acting on the calcitonin gene related peptide or its receptor for migraine prevention. The Journal of Headache and Pain. 20 (1), 6 (2019).
  4. Moreno-Ajona, D., Pérez-Rodríguez, A., Goadsby, P. J. Gepants, calcitonin-gene-related peptide receptor antagonists: what could be their role in migraine treatment. Current Opinion in Neurology. 33 (3), 309-315 (2020).
  5. Khan, S., Olesen, A., Ashina, M. CGRP, a target for preventive therapy in migraine and cluster headache: Systematic review of clinical data. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 374-389 (2019).
  6. Edvinsson, L., Haanes, K. A., Warfvinge, K., Krause, D. N. CGRP as the target of new migraine therapies - successful translation from bench to clinic. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 338 (2018).
  7. Goadsby, P. J., et al. Pathophysiology of migraine: A disorder of sensory processing. Physiological Reviews. 97 (2), 553-622 (2017).
  8. Amara, S. G., Jonas, V., Rosenfeld, M. G., Ong, E. S., Evans, R. M. Alternative RNA processing in calcitonin gene expression generates mRNAs encoding different polypeptide products. Nature. 298 (5871), 240-244 (1982).
  9. Rosenfeld, M. G., et al. Production of a novel neuropeptide encoded by the calcitonin gene via tissue-specific RNA processing. Nature. 304 (5922), 129-135 (1983).
  10. Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Discovery of CGRP in relation to migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 331-332 (2019).
  11. Brain, S. D., Williams, T. J., Tippins, J. R., Morris, H. R., MacIntyre, I. Calcitonin gene-related peptide is a potent vasodilator. Nature. 313 (5997), 54-56 (1985).
  12. Fisher, L. A., et al. Stimulation of noradrenergic sympathetic outflow by calcitonin gene-related peptide. Nature. 305 (5934), 534-536 (1983).
  13. Hanko, J., Hardebo, J. E., Kåhrström, J., Owman, C., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide is present in mammalian cerebrovascular nerve fibres and dilates pial and peripheral arteries. Neuroscience Letters. 57 (1), 91-95 (1985).
  14. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekblad, E., Håkanson, R., Sundler, F. Calcitonin gene-related peptide (CGRP): perivascular distribution and vasodilatory effects. Regulatory Peptides. 15 (1), 1-23 (1986).
  15. Edvinsson, L. Functional role of perivascular peptides in the control of cerebral circulation. Trends in Neurosciences. 8, 126-131 (1985).
  16. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., Ottosson, A., Uddman, R. Peptide-containing nerve fibers in human cerebral arteries: Immunocytochemistry, radioimmunoassay and in vitro pharmacology. Annals of Neurology. 21 (5), 431-437 (1987).
  17. Edvinsson, L., Fredholm, B. B., Hamel, E., Jansen, I., Verrecchia, C. Perivascular peptides relax cerebral arteries concomitant with stimulation of cyclic adenosine monophosphate accumulation or release of an endothelium-derived relaxing factor in the cat. Neuroscience Letters. 58 (2), 213-217 (1985).
  18. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  19. Skofitsch, G., Jacobowitz, D. M. Calcitonin gene-related peptide: Detailed immunohistochemical distribution in the central nervous system. Peptides. 6 (4), 721-745 (1985).
  20. Suzuki, N., Hardebo, J. E., Owman, C. Origins and pathways of cerebrovascular nerves storing substance P and calcitonin gene-related peptide in rat. Neuroscience. 31 (2), 427-438 (1989).
  21. Uddman, R., Edvinsson, L., Ekman, R., Kingman, T., McCulloch, J. Innervation of the feline cerebral vasculature by nerve fibers containing calcitonin gene-related peptide: trigeminal origin and co-existence with substance P. Neuroscience Letters. 62 (1), 131-136 (1985).
  22. Warfvinge, K., Edvinsson, L. Distribution of CGRP and CGRP receptor components in the rat brain. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 39 (3), 342-353 (2019).
  23. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  24. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 22 (1), 54-61 (2002).
  25. Olesen, J., et al. Calcitonin gene-related peptide receptor antagonist BIBN 4096 BS for the acute treatment of migraine. New England Journal of Medicine. 350 (11), 1104-1110 (2004).
  26. Eftekhari, S., et al. Localization of CGRP, CGRP receptor, PACAP and glutamate in trigeminal ganglion. Relation to the blood-brain barrier. Brain Research. 1600, 93-109 (2015).
  27. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  28. Edvinsson, L., et al. Innervation of the human middle meningeal artery: immunohistochemistry, ultrastructure, and role of endothelium for vasomotility. Peptides. 19 (7), 1213-1225 (1998).
  29. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: Differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  30. Eftekhari, S., Edvinsson, L. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) and its receptor components in human and rat spinal trigeminal nucleus and spinal cord at C1-level. BMC Neuroscience. 12, 112 (2011).
  31. Eftekhari, S., et al. Differential distribution of calcitonin gene-related peptide and its receptor components in the human trigeminal ganglion. Neuroscience. 169 (2), 683-696 (2010).
  32. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  33. Spitzer, M. J. S., Reeh, P. W., Sauer, S. K. Mechanisms of potassium- and capsaicin-induced axonal calcitonin gene-related peptide release: Involvement of L- and T-type calcium channels and TRPV1 but not sodium channels. Neuroscience. 151 (3), 836-842 (2008).
  34. Evans, A. R., Nicol, G. D., Vasko, M. R. Differential regulation of evoked peptide release by voltage-sensitive calcium channels in rat sensory neurons. Brain Research. 712 (2), 265-273 (1996).
  35. Gupta, S., Villalón, C. M. The relevance of preclinical research models for the development of antimigraine drugs: Focus on 5-HT 1B/1D and CGRP receptors. Pharmocology & Therapeutics. 128 (1), 170-190 (2010).
  36. Williamson, D. J., Hargreaves, R. J., Hill, R. G., Shepheard, S. L. Intravital microscope studies on the effects of neurokinin agonists and calcitonin gene-related peptide on dural vessel diameter in the anaesthetized rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 17 (4), 518-524 (1997).
  37. Gupta, S., Bhatt, D. K., Boni, L. J., Olesen, J. Improvement of the closed cranial window model in rats by intracarotid infusion of signalling molecules implicated in migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (1), 27-36 (2010).
  38. Knight, Y. E., Edvinsson, L., Goadsby, P. J. Blockade of calcitonin gene-related peptide release after superior sagittal sinus stimulation in cat: a comparison of avitriptan and CP122, 288. Neuropeptides. 33 (1), 41-46 (1999).
  39. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  40. Tassorelli, C., Joseph, S. A. Systemic nitroglycerin induces Fos immunoreactivity in brainstem and forebrain structures of the rat. Brain Research. 682 (1-2), 167-181 (1995).
  41. Ramachandran, R., et al. A naturalistic glyceryl trinitrate infusion migraine model in the rat. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 32 (1), 73-84 (2012).
  42. Hoskin, K. L., Zagami, A. S., Goadsby, P. J. Stimulation of the middle meningeal artery leads to Fos expression in the trigeminocervical nucleus: a comparative study of monkey and cat. Journal of Anatomy. 194, Pt 4 579-588 (1999).
  43. Charbit, A. R., Akerman, S., Goadsby, P. J. Comparison of the Effects of Central and Peripheral Dopamine Receptor Activation on Evoked Firing in the Trigeminocervical Complex. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 331 (2), 752-763 (2009).
  44. Koulchitsky, S., Fischer, M., Messlinger, K. Calcitonin gene-related peptide receptor inhibition reduces neuronal activity induced by prolonged increase in nitric oxide in the rat spinal trigeminal nucleus. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 29 (4), 408-417 (2009).
  45. Ebersberger, A., Averbeck, B., Messlinger, K., Reeh, P. W. Release of substance P, calcitonin gene-related peptide and prostaglandin E2 from rat dura mater encephali following electrical and chemical stimulation in vitro. Neuroscience. 89 (3), 901-907 (1999).
  46. Eberhardt, M., et al. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides. 42 (3), 311-317 (2008).
  47. Amrutkar, D. V., Ploug, K. B., Olesen, J., Jansen-Olesen, I. Role for voltage gated calcium channels in calcitonin gene-related peptide release in the rat trigeminovascular system. Neuroscience. 172, 510-517 (2011).
  48. Gupta, S., et al. Evidence for CGRP re-uptake in rat dura mater encephali. British Journal of Pharmacology. 161 (8), 1885-1898 (2010).
  49. Kageneck, C., Nixdorf-Bergweiler, B. E., Messlinger, K., Fischer, M. J. M. Release of CGRP from mouse brainstem slices indicates central inhibitory effect of triptans and kynurenate. Journal of Headache and Pain. 15 (1), 1-9 (2014).
  50. Christensen, S. L., et al. CGRP-dependent signalling pathways involved in mouse models of GTN- cilostazol- and levcromakalim-induced migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (14), 1413-1426 (2021).
  51. Christensen, S. L., et al. ATP sensitive potassium (KATP) channel inhibition: A promising new drug target for migraine. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (7), 650-664 (2020).
  52. Oshinsky, M. L., et al. Spontaneous trigeminal allodynia in rats: A model of primary headache. Headache. 52 (9), 1336 (2012).
  53. Kwan, K. Y., et al. TRPA1 contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction. Neuron. 50 (2), 277-289 (2006).
  54. Eltorp, C., Jansen-Olesen, I., Hansen, A. J. Release of calcitonin gene-related peptide (CGRP) from guinea pig dura mater in vitro is inhibited by sumatriptan but unaffected by nitric oxide. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 20 (9), 838-844 (2000).
  55. Zagami, A. S., Goadsby, P. J., Edvinsson, L. Stimulation of the superior sagittal sinus in the cat causes release of vasoactive peptides. Neuropeptides. 16 (2), 69-75 (1990).
  56. Goadsby, P. J., Edvinsson, L. The trigeminovascular system and migraine: studies characterizing cerebrovascular and neuropeptide changes seen in humans and cats. Annals of Neurology. 33 (1), 48-56 (1993).
  57. Bates, E. A., et al. Sumatriptan alleviates nitroglycerin-induced mechanical and thermal allodynia in mice. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 30 (2), 170-178 (2010).
  58. Pradhan, A. A., et al. Characterization of a novel model of chronic migraine. Pain. 155 (2), 269-274 (2014).
  59. Mogil, J. S., Pang, D. S. J., Silva Dutra, G. G., Chambers, C. T. The development and use of facial grimace scales for pain measurement in animals. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 116, 480-493 (2020).
  60. Sotocinal, S. G., et al. The rat grimace scale: A partially automated method for quantifying pain in the laboratory rat via facial expressions. Molecular Pain. 7, 55 (2011).
  61. Langford, D. J., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nature Methods. 7 (6), 447-449 (2010).
  62. Mahmoudi, J., et al. Cerebrolysin attenuates hyperalgesia, photophobia, and neuroinflammation in a nitroglycerin-induced migraine model in rats. Brain Research Bulletin. 140, 197-204 (2018).
  63. Farajdokht, F., Babri, S., Karimi, P., Mohaddes, G. Ghrelin attenuates hyperalgesia and light aversion-induced by nitroglycerin in male rats. Neuroscience Letters. 630, 30-37 (2016).
  64. Kuburas, A., et al. PACAP Induces Light Aversion in Mice by an Inheritable Mechanism Independent of CGRP. Journal of Neuroscience. 41 (21), 4697-4715 (2021).
  65. Buschmann, T., et al. Expression of Jun, Fos, and ATF-2 proteins in axotomized explanted and cultured adult rat dorsal root ganglia. Neuroscience. 84 (1), 163-176 (1998).
  66. Lee, Y. J., Zachrisson, O., Tonge, D. A., McNaughton, P. A. Upregulation of bradykinin B2 receptor expression by neurotrophic factors and nerve injury in mouse sensory neurons. Molecular and Cellular Neuroscience. 19 (2), 186-200 (2002).
  67. Hari, A., Djohar, B., Skutella, T., Montazeri, S. Neurotrophins and extracellular matrix molecules modulate sensory axon outgrowth. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 113-117 (2004).
  68. Skoff, A. M., Resta, C., Swamydas, M., Adler, J. E. Nerve Growth Factor (NGF) and Glial Cell Line-Derived Neurotrophic Factor (GDNF) regulate substance P release in adult spinal sensory neurons. Neurochemical Research. 28 (6), 847-854 (2003).
  69. Lindsay, R. M., Harmar, A. J. Nerve growth factor regulates expression of neuropeptide genes in adult sensory neurons. Nature. 337 (6205), 362-364 (1989).
  70. Edvinsson, J. C. A., et al. Differences in pituitary adenylate cyclase-activating peptide and calcitonin gene-related peptide release in the trigeminovascular system. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 40 (12), 1296-1309 (2020).

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तंत्रिका विज्ञान अंक 183
<em>एक्स वीवो</em> कृन्तकों में ट्राइजेमिनोवस्कुलर सिस्टम से कैल्सीटोनिन जीन-संबंधित पेप्टाइड की रिहाई
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Rasmussen, R. H., Jansen-Olesen, I., … More

Rasmussen, R. H., Jansen-Olesen, I., Kristensen, D. M., Christensen, S. L. Ex Vivo Release of Calcitonin Gene-Related Peptide from the Trigeminovascular System in Rodents. J. Vis. Exp. (183), e63723, doi:10.3791/63723 (2022).

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