Summary
Descrevemos um protocolo para o isolamento das células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano e sua diferenciação na linhagem muscular esquelética.
Abstract
Explorar o potencial terapêutico das células-tronco mesenquimais depende da facilidade de isolamento, potência em direção à diferenciação e confiabilidade e robustez da fonte. Descrevemos aqui um protocolo stepwise para o isolamento de células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano (uMSCs), sua imunofenofoteca, e a propagação de tais culturas ao longo de várias passagens. Neste procedimento, a viabilidade dos MOSCs é alta porque não há digestão enzimática. Além disso, a remoção dos vasos sanguíneos, incluindo as artérias do cordão umbilical e a veia, garante que não haja contaminação de células de origem endotelial. Usando citometria de fluxo, os uMSCs no isolamento são CD45-CD34−, indicando ausência de células da linhagem hematopoiética. É importante ressaltar que eles expressam marcadores de superfície chave, CD105, CD90 e CD73. Após o estabelecimento de culturas, este artigo descreve um método eficiente para induzir a diferenciação nesses FUSÕES na linhagem muscular esquelética. Uma análise detalhada da progressão miogênica em uMSCs diferenciados revela que os uMSCs expressam Pax7, um marcador para progenitores miogênicos nos estágios iniciais de diferenciação, seguido pela expressão de MyoD e Myf5, e, finalmente, um marcador de diferenciação terminal, cadeia pesada de miosina (MyHC).
Introduction
O cordão umbilical humano foi creditado por possuir um robusto reservatório de células-tronco mesenquimais, que atualmente estão sendo exploradas para terapias regenerativas devido às suas robustas taxas de proliferação e diferenciação, propriedades imunomodulatórias e capacidade de gerar células de todas as três camadas germinativas1. O tecido do cordão umbilical consiste em múltiplos compartimentos, como o sangue do cordão umbilical, o subendotélio da veia umbilical e a geleia de Wharton (WJ), que por si só abrange três regiões indistintas - a zona perivascular, a zona intervascular e o subameamento ou o revestimento do cordão (CL)2. Embora os MSCs possam ser isolados de todas essas diferentes regiões e expressem amplamente os principais marcadores MSC, não há clareza sobre se esses compartimentos contêm a mesma população de uMSCs ou apresentam diferenças em suas potências de diferenciação3. Assim, os protocolos para o isolamento dos UMSCs requerem maior precisão em seu modo e região de isolamento, a caracterização robusta de potenciais de diferenciação e, finalmente, uma análise comparativa de diferentes compartimentos do cabo.
Nesse contexto, poucos estudos demonstraram diferenças nos potenciais proliferativos e diferenciais do UMSC entre diferentes partes do cabo. Destes, análises comparativas entre os RCSS isolados das regiões cl e WJ revelaram maior potencial de proliferação em UMSCsderivados da CL 3,4. Em um estudo separado, os UMSCs derivados do WJ tiveram melhor desempenho em ensaios de proliferação em comparação com células perivasculares (HUCPV)5. Ao examinar diferenças entre os UMSCs derivados do sangue do cordão e os UMSCs derivados do tecido do cordão desprovidos de contaminação vascular, foi relatada expressão diferencial dos principais marcadores MSC entre os dois compartimentos, bem como o aumento das taxas de proliferação nos UMSCs derivados do tecido do cordão6.
Dos diversos estudos que examinam os potenciais de diferenciação dos MICOSCs principalmente em tecidos da linhagem de mesoderm, como linhagenia, adipogênica e linhagenia, muito poucos forneceram protocolos detalhados para diferenciação miogênica e caracterização subsequente, bem como análises comparativas entre vários compartimentos de cordão. Neste contexto, desenvolvemos um robusto protocolo de diferenciação muscular e observamos que os uMSCs derivados do tecido do cordão apresentam capacidades de diferenciação miogênica superiores em comparação com o sangue do cordãoumbilical 6. Aqui, um protocolo stepwise é detalhado para o isolamento de uMSCs de todo o tecido do cordão umbilical desprovido de células associadas à vasculatura, sua caracterização e sua diferenciação na linhagem miogênica.
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Protocol
O uso de tecido do cordão umbilical neste estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Pesquisa de Células-Tronco (IC-SCR), pelo Comitê de Ética Institucional, Instituto Translacional de Ciência e Tecnologia em Saúde (IEC-THSTI), pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Civil, Gurugram, Haryana e pelo Comitê de Biossegurança Institucional, THSTI. Amostras de tecido do cordão humano foram colhidas a partir de partos a termo no momento do nascimento. O consentimento por escrito informado foi obtido dos sujeitos. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos pertinentes.
1. Isolamento de MSCs do tecido do cordão umbilical
- No momento da entrega, corte pelo menos 5 cm de cabo, de preferência mais próximo da placenta, e esterilize o cabo limpando a superfície externa com 70% de etanol. Transfira o pedaço do tecido do cordão um tubo de coleta de 50 mL contendo soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para outro contendo o mesmo. Transporte o tubo de coleta com o nome do sujeito no gelo para o laboratório dentro de 1h.
NOTA: Para um estudo maior, pode ser útil fazer código de barras nas amostras para permitir seu rastreamento ao longo do estudo. É importante ressaltar que todo o pessoal que manuseia tecidos humanos deve ser oferecido o regime completo da vacina contra hepatite B. - No laboratório, ligue o UV por 25 min no capô BSL-2 para esterilizar instrumentos autoclaved e pipetas antes de usar.
- Transfira a peça do tecido do cabo do tubo de coleta para um prato tratado com cultura de tecido de 10 cm2 contendo PBS enriquecido com 5 g/L de glicose, 50 μg/mL gentamicina, 2,5 μg/mL de anfotoricina B, penicilina U/mL e 100 μg/mL streptomicy (esquema na Figura 1).
- Usando um bisturi, corte o tecido do cordão verticalmente ao longo de seu eixo longitudinal para obter duas peças cilíndricas. Devido à torção do cordão e à superfície mucoide, fixe o tecido com um par de fórceps presos na outra mão.
- Neste ponto, observe as artérias umbilicais e a veia e remova os vasos sanguíneos usando um bisturi para raspá-los em uma direção da superfície. Enxágüe o tecido do cordão umbilical mais uma vez em PBS para remover todo o sangue residual associado ao tecido. Certifique-se de que a raspagem é suave para preservar a integridade das células no WJ ao redor dos vasos.
- Pique cada metade do tecido do cordão em fragmentos do tamanho de 0,5 cm3 e coloque os fragmentos com a superfície luminal voltada para baixo sobre o prato. Incubar o prato brevemente por 10 min em uma câmara umidificada de 37 °C contendo 5% de CO2.
- Após a incubação, inunde o prato contendo as peças de tecido do cordão com 20 mL de médio contendo MEM Alpha Modification sem L-glutamina, ribo-e desoxyribonucleosídeos, 15% soro bovino fetal (não inativado pelo calor) e 50 μg/mL gentamicina. Adicione o meio de crescimento suavemente ao longo dos lados para evitar que as explantas teciduais sejam desalojadas de sua orientação. Adicione o excesso de meio para contabilizar uma fração que será absorvida pelas explantas teciduais durante a incubação.
- Após 3 dias de incubação, adicione meio fresco às culturas. Certifique-se de que as culturas estão protegidas contra choques e movimento das explantas enquanto manuseam os pratos.
- Após 1 semana, remova os fragmentos de tecido individualmente usando fórceps estéreis e descarte usando sacos de risco biológico apropriados para descarte. Mantenha o meio existente e adicione 10 mL de meio de crescimento fresco. Substitua o meio de crescimento a cada 4 dias até que colônias individuais atinjam uma confluência de 70%.
NOTA: É provável que as células não sejam distribuídas uniformemente por todo o prato, pois haverá colônias proliferativas individuais que precisam ser monitoradas para confluência com o tempo. Geralmente, dentro de um mês, um prato de 10 cm2 gera células suficientes para ser dividido em um prato separado. - Colher as células aderentes usando a solução trypsin/EDTA (1x 0,25% trypsin e 0,02% EDTA em Hanks Balanced Salt Solution [HBSS]). Centrifugar a suspensão celular a 470 × g por 5 min a 25 °C e resuspensar a pelota celular em meio de crescimento.
2. Imunofenoftipagem e propagação de uMSCS
- Prossiga para a imunofenoftipagem uma vez que as células aderentes atingiram 50%-60% de confluência e estão bem espalhadas. Não realize análises de marcadores MSC em culturas totalmente confluentes, pois isso tende a causar a queda dos principais marcadores MSC.
- Após a trypsinização, distribua uma suspensão celular de 1 × 106 células/mL em tubos FACS (1 × 105 células/tubo) e colorir com anticorpos ligados ao fluoróforo apropriados (todas as 1:50 diluição) em combinação: não manchadas; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (fluoróforo comum); controles de isótipo para cada fluoróforo. Registo de um número total de eventos de pelo menos 10.000 no citômetro de fluxo para análise posterior.
NOTA: Uma vez que as células são analisadas para cada marcador de superfície separadamente, o gating em subconjuntos celulares não é necessário. - Além dos marcadores acima, confirme a presença de marcadores de superfície positivos e negativos nas linhas uMSC criadas a partir de amostras individuais de tecido do cordão (Tabela 1).
- Analise as células rotuladas por citometria de fluxo e determine a porcentagem das células CD105+CD90+ e CD105+CD73++ Analise as células CD105+ e CD34-CD45− separadamente.
3. Diferenciação de uMSCs em músculo esquelético
- Placas de cultura de tecido de revestimento com 0,01% de colágeno e 20 μg/mL laminina na PBS. Cubra estas placas por um mínimo de 4h em temperatura ambiente.
- UMSCs de placa a uma densidade de 10.000 células/cm2 em meio de crescimento.
- Quando as células são 70% confluentes, aspiram o meio de crescimento e enxaguam as culturas 2x com PBS. Adicionar meio de diferenciação miogênica (M1) composto por DMEM + 5% de soro de cavalo + 0,1 μM dexametasona + 50 μM hidrocortisona aos uMSCs. Para determinar a cinética da progressão miogênica, adicione m1 médio a cada dois dias às culturas.
- Para determinar a cinética da progressão miogênica, analise uMSCs para pax7, myogenina e myhc expressão em 2 dias, 4-5 dias, 6-7 dias e 10-14 dias, respectivamente.
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Representative Results
O sucesso do isolamento dos UMSCs do tecido do cordão umbilical é >95%, ao contrário das baixas taxas de sucesso do sangue do cordão umbilical. Após o isolamento bem-sucedido dos uMSCs, a análise facs revela que todas as células são CD34−CD45−CD105+CD90+. No entanto, na análise comparativa, os ICSS isolados do sangue do cordão umbilical apresentam populações heterogêneas, em que uma proporção de células mostram CD34+CD45+CD105+ (~15%). Além disso, CD105+CD90+ duplo positivo são menores em número (~5%) (Figura Suplementar S1). Isso resulta em níveis reduzidos de diferenciação miogênica entre os UMSCs do sangue do cordão umbilical, uma vez que tanto a expressão CD105 quanto cd90 são necessárias para a indução da miogênese. os uMSCs também exibem a expressão dos marcadores listados na Tabela 1. Se houver contaminação dos uMSCs derivados do sangue do cordão um cordão, também haverá a presença de células CD34+CD45+ . Isso resulta em falsas contagens de células para chapeamento para diferenciação miogênica. Uma indicação de que >90% das células são o dobro positiva para a expressão CD105 e CD90 é que os uMSCs não se comprometeram com nenhuma linhagem mesodérmica e continuam a permanecer multipotentes, pois tanto a expressão CD105 quanto a CD90 são reguladas após a diferenciação. É imprescindível o uso de vários marcadores para a confirmação de fenótipos uMSC, pois não há um único marcador uMSC definitivo. Nesta análise, foram avaliados a presença de todos os marcadores listados na Tabela 1 para cada uma das linhas do UMSC estabelecidas em laboratório. Além disso, determinamos o status duplo-positivo de CD105 e CD90 (Figura 2A), bem como de CD105 e CD73 (Figura 2B), garantindo que os uMSCs expressem vários marcadores-chave. Isso é necessário para evitar contaminar células monopositivos que estão presentes em números inferiores a 0,05%.
Figura 1: Esquema mostrando o isolamento e a caracterização passo a passo dos UMSCs a partir do tecido do cordão umbilical. Abreviação: uMSCs = células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A análise do marcador MSC em uMSCs derivados do tecido do cordão (A) exibe a expressão de CD105 e CD90 e não expressa marcadores hematopoiéticos, CD34 e CD45. São mostradas tramas representativas facs de três linhas uMSC (UCT15, UCT18 e UCT26) (N = 16). A primeira fila de painéis mostra células nas três linhas uMSC no quadrante Q2 positivo para a expressão CD105 e CD90. A linha inferior dos painéis mostra as células do quadrante do 1º trimestre positivas para a expressão CD105 e negativas para a expressão CD34 e CD45. (B) uMSCs exibem a expressão do marcador MSC, CD73 (N = 16). Abreviação: uMSCs = células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| marcadores positivos uMSC | marcadores negativos uMSC |
| CD105 | CD34 |
| CD90 | CD45 |
| CD73 | CD106 |
| CD29 | HLA DR |
| CD44 | CD31 |
| HLA ABC | CD14 |
| CD49e | CD49e |
| CD54 | |
| CD13 |
Tabela 1: Lista de marcadores positivos e negativos para uMSCs. Abreviação: uMSCs = células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano.
Para a diferenciação dos uMSCs na linhagem miogênica, os uMSCs normalmente expressam Pax7, um marcador para células precursoras nos primeiros 2 dias da adição de M1, seguido por MyoD nos primeiros 4 dias da adição de M1 (Figura 3). Com 6 dias de diferenciação, as células expressam proteína miogenina, seguida pela expressão da cadeia pesada de Myosin (MyHC) entre 10 dias e 14 dias da indução da diferenciação. Caracterizamos com mais detalhes a cinética da expressão miogênica usando sequenciamento de RNA, citometria de fluxo, imunocitoquímica, RT-PCR e análise de manchas ocidentais para documentar a expressão de estágio dos marcadores miogênicos, confirmando a robustez deste protocolo. O sequenciamento transcriômico do genoma inteiro entre uMSCs não diferenciados e uMSCs que foram diferenciados em músculo esquelético revelou a regulação de 907 genes em resposta à indução da diferenciação miogênica (Figura 4).
Figura 3: Diferenciação de uMSCs em músculo esquelético. uMSCs foram cultivados em m1 médio por 2 dias, 4 dias, 7 dias e 10 dias e avaliado para (A) Pax7 após 2 dias, (B) MyoD após 4 dias, (C) expressão de miogenina de diferentes linhas uMSC, denotada por T8, T12, T14 e T25 após 7 dias, e (D) MyHC após 10 dias. Barras de escala = (B, D) 50 μm. Abreviaturas: uMSCs = células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano; GAPDH = glicealdeído 3-fosfato desidrogenase; MyoD = proteína de determinação myoblast 1; MyHC = cadeia pesada de minodes; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole; Mb = meublasto; MT = miotube. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Perfil transcriômico comparativo de uMSCs derivados do sangue do cordão umbilical e tecido do cordão umbilical diferenciados em músculo esquelético. Mapa de calor de contagens normalizadas de 907 genes entre uMSCs de controle e uMSCs diferenciados em músculo esquelético por 7 dias a partir de sangue do cordão umbilical e tecido do cordão umbilical. O diagrama de Venn (à esquerda) mostra um maior número de genes miogênicos regulados em uMSCs derivados do tecido do cordão em comparação com uMSCs derivados do sangue do cordão umbilical. A tabela abaixo mostra os genes miogênicos comuns regulados tanto no tecido do cordão umbilical quanto no sangue do cordão umbilical. Este número é de Mishra et al.6. Abreviaturas: 1, 2 = réplicas biológicas; CB1,2 = células miogênicas derivadas de uMSCs de sangue do cordão umbilical; CT1, 2 = células miogênicas derivadas de uMSCs do tecido do cordão umbilical; coB1,2 = controle de uMSCs indiferenciados do sangue do cordão umbilical; coT1, 2 = controle uMSCs indiferenciados do tecido do cordão umbilical. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para fins de realização de uma análise comparativa, comparamos os UMSCs isolados do sangue do cordão umbilical e do tecido do cordão umbilical. Dados de sequenciamento de RNA revelaram que havia mais genes miogênicos regulados em uMSCs de células miogênicas derivadas do tecido do cordão do que aquelas derivadas do sangue do cordão umbilical (Figura 4). Os dados de sequenciamento de RNA utilizados para apoiar este estudo são enviados ao NCBI (a adesão da SRA é GSE147114). Brevemente, a análise transcriômica específica do tecido usando o banco de dados PANTHER GO-slim identificou proteínas citoesquelletais associadas à ligação de actina e montagem de sarcomere (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) transportadores associados à função contítil (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), manutenção de massa muscular ( FBXO32, TRIM16L, GHR), sinalização de cálcio (FKBP5) e função enzimática (COX7A1, PDK4) (Figura 4). Ao todo, esses dados demonstram que os uMSCs derivados do tecido do cordão representam um compartimento que exibe um potencial miogênico robusto.
Devido à variação individual entre as linhas do MICOSC que podem surgir de eficiências isoladas, heterogeneidade dentro do compartimento do MICO, a idade da mãe e o estado de saúde da mãe, incluindo seus níveis de nutrientes, pode haver diferenças nas taxas de proliferação e potenciais miogênicos entre as linhas estabelecidas do UMSC. No entanto, apesar das diferenças na cinética da expressão, mantém-se a tendência global de aumento da miogenicidade com a expressão de estágio dos marcadores miogênicos.
Figura suplementar S1: Análise do marcador MSC em uMSCs derivados do sangue do cordão umbilical. os uMSCs exibem a expressão de marcadores CD105 e hematopoiéticos, CD34 e CD45. A análise da população cd105+ mostra que apenas uma pequena proporção dessas células co-expressam CD90 (N = 5). Abreviação: uMSCs = células-tronco mesenquimais do tecido do cordão umbilical humano. Clique aqui para baixar este Arquivo.
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Discussion
Passos críticos
Um passo crítico neste protocolo é a coleta de tecido em condições assépticas, desde o momento da entrega até a manutenção de culturas estéreis, durante toda a duração da propagação. Durante a coleta do cabo, é essencial que o cabo não toque em nenhuma superfície não esterilizada e seja examinado externamente com 70% de etanol antes da coleta em tubos contendo PBS complementados com antibióticos. É importante limitar o tempo entre a coleta do cabo e o processamento do tecido para o isolamento do UMSC. Caso haja necessidade de transportar tecido do local da coleta para o laboratório, deve-se tomar cuidado para manter o tecido em tampões contendo antibióticos e armazená-lo no gelo.
Modificações e solução de problemas do método
A principal modificação neste protocolo para induzir a diferenciação miogênica dos uMSCs é o revestimento de pratos com colágeno tipo 1 de 0,01% e 20 μg/mL laminina. Observamos que a progressão miogênica nos MICOSCs na presença do meio M1 é aprimorada quando as condições de adesão também são moduladas. Se o uso de outras matrizes superiores, embora caras, como Matrigel, pode melhorar ainda mais este protocolo precisa ser testado. Variações de rendimento entre amostras individuais podem resultar em alguns tecidos gerando uma menor contagem celular. Nesses casos, pode ser preferível coletar um comprimento maior do tecido do cordão um >5 cm. Neste contexto, poucos relatórios utilizaram 10 cm de tecido do cordão para aumentar o rendimento de uMSCs. A maioria dos relatórios que descrevem o isolamento de uMSCs do tecido do cordão umbilical fizeram uso de enzimas extracelulares degradantes para o aumento da liberação de células do estroma do cordão 3,5,7,8. O uso de culturas de explant por alguns estudos, incluindo este relatório, tem demonstrado continuamente aumento da viabilidade celular e rendimentode 6,9,10. Além disso, a ausência da necessidade de realizar a triagem celular para purificar populações celulares, que muitas vezes é incluída na purificação de UMSCs do sangue do cordão umbilical, aumenta o número de celulares e a integridade.
Limitações do método
Uma limitação fundamental do método é o tempo necessário para o estabelecimento completo de linhas uMSC a partir de amostras individuais de tecido de cordão. Normalmente, 3 semanas são necessárias para gerar cada linha uMSC usando este protocolo. Após isso, são necessárias 2 semanas para uma completa diferenciação miogênica. Essa longa duração da investigação pode ser complicada em grandes coortes que examinam os potenciais de diferenciação dos UMSCs de diferentes participantes, com a intenção de obter informações sobre o meio intrauterino ou prever parâmetros metabólicos de órgãos descendentes, como a composição corporal. Uma segunda limitação é a heterogeneidade dentro da matriz tecidual do cordão umbilical, que pode possuir diferenças fenotípicas intrínsecas entre os vários compartimentos do MICO e que poderiam ser responsáveis por potenciais de diferenciação entre as diferentes fontes. Por exemplo, os uMSCs do WJ apresentam menor potencial osteogênico em comparação com os uMSCsderivados do CL 11. Portanto, este método não descreve as diferenças inerentes entre diferentes compartimentos dentro do próprio tecido do cordão umbilical.
Significância do método em relação aos métodos existentes
Usando este protocolo, somos capazes de obter uma contagem celular de 1 × 104 a 1 × 106 uMSCs de amostras individuais de tecido do cordão umbilical. Estas linhas uMSC podem ser usadas de forma confiável para ensaios para pelo menos 6-8 passagens. Apesar da extensão da variação dos fenótipos celulares típicos das populações humanas, o tempo médio de duplicação dos RCS observados em nossa coorte de 15 mulheres do norte da Índia foi inferior a 2 dias6. Uma análise de suas taxas proliferativas utilizando a incorporação de 5-ethynyl-2'-desoxyuridina (EdU) mostrou que pelo menos 80% das células passaram pela fase S em um período de 6 h6. Além disso, os uMSCs do tecido do cordão também apresentam baixas taxas de senescência, indicando a robustez deste método de isolamento6. Anteriormente, comparamos o grau de indução miogênica em uMSCs usando este protocolo com o usado para induzir miogênese em células-tronco pluripotenciais humanas e murinas 6,12. Descobrimos que este protocolo é um indutor mais potente da diferenciação miogênica do que os protocolos existentes.
Importância do método e aplicações
Terapias celulares e regenerativas bem sucedidas dependem da viabilidade e rendimento celular, exigindo um grande número de células de passagens precoces. Assim, este método oferece uma alternativa conveniente para aplicações clínicas. O robusto protocolo de diferenciação miogênica fornecido neste relatório e a caracterização molecular aprofundada da progressão miogênica usando este protocolo em nosso trabalho complementam os esforços para recapitular a miogênese fetal e podem ser usados como modelo para imitar o ambiente intrauterino e refletir o metabolismo pós-natal.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses concorrentes.
Acknowledgments
Agradecemos ao Sr. Ojas Tikoo pela ajuda nas filmagens e produção de vídeo. Também reconhecemos a ajuda recebida da equipe do GARBH-Ini (Grupo Interdisciplinar de Pesquisa Avançada e Resultado de Nascimento-DBT-Índia), enfermeiros e altos oficiais de pesquisa do Gurugram Civil Hospital e do Dr. Pallavi Kshetrapal para ajudar na logística. Este trabalho foi apoiado por subvenções concedidas a Suchitra Gopinath do Departamento de Biotecnologia da Índia (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
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