Summary
Mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan izolasyonu ve iskelet kası soyuna farklılaşması için bir protokol tanımladık.
Abstract
Mezenkimal kök hücrelerin terapötik potansiyelini araştırmak, izolasyonun kolaylığına, farklılaşmaya yönelik potansiyele ve kaynağın güvenilirliğine ve sağlamlığına bağlıdır. Burada, mezenkimal kök hücrelerin insan göbek kordonu dokusundan (uMSC'ler) izolasyonu, immünofenotiplenmesi ve bu kültürlerin birkaç pasaj üzerinde yayılması için kademeli bir protokol tarif ediyoruz. Bu prosedürde, enzimatik sindirim olmadığı için uMSC'lerin yaşayabilirliği yüksektir. Ayrıca, göbek kordonu arterleri ve damar dahil olmak üzere kan damarlarının çıkarılması, endotel kökenli hücrelerin kirlenmemesini sağlar. Akış sitometrisi kullanılarak, izolasyon üzerine uMSC'ler CD45-CD34-'dür ve hematopoetik soydan hücrelerin yokluğunu gösterir. Önemli olarak, anahtar yüzey işaretleyicilerini, CD105, CD90 ve CD73'ü ifade ederler. Kültürlerin kurulmasından sonra, bu yazıda bu uMSC'lerde iskelet kası soyuna farklılaşmayı indüklemek için etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Diferansiye uMSC'lerde miyojenik progresyonun ayrıntılı bir analizi, uMSC'lerin farklılaşmanın ilk aşamalarında miyojenik progenitörler için bir belirteç olan Pax7'yi, ardından MyoD ve Myf5'in ekspresyonunu ve son olarak bir terminal farklılaşma belirteci olan miyozin ağır zincirini (MyHC) ekspresyonunu ifade ettiğini ortaya koymaktadır.
Introduction
İnsan göbek kordonunun, sağlam proliferasyon ve farklılaşma oranları, immünomodülatör özellikleri ve üç germ katmanının hepsinden hücre üretme yetenekleri nedeniyle şu anda rejeneratif tedaviler için araştırılmakta olan sağlam bir mezenkimal kök hücre rezervuarına sahip olduğu düşünülmektedir1. Göbek kordonu dokusu, göbek kordonu kanı, göbek damarı subendoteli ve Wharton'un jölesi (WJ) gibi kendi içinde üç belirsiz bölgeyi kapsayan çoklu bölmelerden oluşur - perivasküler bölge, intervasküler bölge ve alt amniyon veya kordon astarı (CL)2. uMSC'ler tüm bu farklı bölgelerden izole edilebilse ve anahtar MSC belirteçlerini geniş çapta ifade edebilse de, bu bölmelerin aynı uMSC popülasyonunu içerip içermediği veya farklılaşma potansiyellerinde farklılıklar gösterip göstermediği konusunda netlik yoktur3. Bu nedenle, uMSC'lerin izolasyonu için protokoller, izolasyon modlarında ve bölgelerinde daha büyük bir hassasiyet, farklılaşma potansiyellerinin sağlam karakterizasyonu ve son olarak, kablonun farklı bölmelerinden karşılaştırmalı bir analiz gerektirir.
Bu bağlamda, az sayıda çalışma, kordonun farklı kısımları arasındaki uMSC proliferatif ve farklılaştırıcı potansiyellerinde farklılıklar göstermiştir. Bunlardan CL ve WJ bölgelerinden izole edilen uMSC'ler arasındaki karşılaştırmalı analizler, CL kaynaklı uMSC'lerde daha büyük bir proliferatif potansiyel ortaya koymuştur 3,4. Ayrı bir çalışmada, WJ kaynaklı uMSC'ler, proliferasyon tahlillerinde perivasküler hücrelere (HUCPV) kıyasla daha iyi performans göstermiştir5. Kordon kanı kaynaklı uMSC'ler ile vasküler kontaminasyondan yoksun kordon dokusu kaynaklı uMSC'ler arasındaki farkların incelenmesinde, iki bölme arasında anahtar MSC belirteçlerinin diferansiyel ekspresyonunun yanı sıra kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerde proliferasyon oranlarının arttığı bildirilmiştir6.
uMSC'lerin öncelikle osteojenik, adipojenik ve kondrojenik soylar gibi mezoderm soyunun dokularına farklılaşma potansiyellerini inceleyen çeşitli çalışmalardan çok azı, miyojenik farklılaşma ve müteakip karakterizasyon için ayrıntılı protokollerin yanı sıra çeşitli kordon bölmeleri arasındaki karşılaştırmalı analizler sağlamıştır. Bu bağlamda sağlam bir kas farklılaşma protokolü geliştirdik ve kordon dokusu kaynaklı uMSC'lerin kordon kanı6'ya kıyasla daha üstün miyojenik farklılaşma yetenekleri gösterdiğini gözlemledik. Burada, uMSC'lerin vaskülatür ile ilişkili hücrelerden yoksun tüm kordon dokusundan izolasyonu, karakterizasyonu ve miyojenik soya farklılaşması için kademeli bir protokol detaylandırılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada göbek kordonu dokusunun kullanımı Kök Hücre Araştırmaları Kurumsal Komitesi (IC-SCR), Kurumsal Etik Komitesi, Translasyonel Sağlık Bilim ve Teknoloji Enstitüsü (IEC-THSTI), Sivil Hastane Kurumsal Etik Komitesi, Gurugram, Haryana ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi, THSTI tarafından onaylanmıştır. İnsan kordon dokusu örnekleri, doğum sırasında term doğumlardan toplandı. Deneklerden bilgilendirilmiş yazılı onam alınmıştır. Tüm yöntemler ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. MSC'lerin kordon dokusundan izolasyonu
- Doğum sırasında, tercihen plasentaya daha yakın olan en az 5 cm'lik kordonu kesin ve dış yüzeyi% 70 etanol ile süpürerek kordonu sterilize edin. Kordon dokusu parçasını, fosfat tamponlu salin (PBS) içeren bir 50 mL toplama tüpünden aynı şeyi içeren bir başkasına sırayla aktarın. Buz üzerinde deneğin adını taşıyan toplama tüpünü 1 saat içinde laboratuvara taşır.
NOT: Daha büyük bir etüt için, numunelerin etüt boyunca izlenmesini sağlamak için numunelerin barkodlanması yararlı olabilir. Önemli olarak, insan dokularını işleyen tüm personele hepatit B aşısının tam rejimi sunulmalıdır. - Laboratuvarda, kullanmadan önce otoklavlanmış aletleri ve pipetleri sterilize etmek için BSL-2 davlumbazda 25 dakika boyunca UV'yi açın.
- Kordon dokusu parçasını toplama tüpünden 5 g / L glikoz, 50 μg / mL gentamisin, 2.5 μg / mL amfoterisin B, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile zenginleştirilmiş PBS içeren 10cm2 doku kültürü ile muamele edilmiş bir kaba aktarın ( Şekil 1'de şematik).
- Bir neşter kullanarak, iki yarı silindirik parça elde etmek için kordon dokusunu uzunlamasına ekseni boyunca dikey olarak dilimleyin. Kordon burulması ve mukoid yüzey nedeniyle, diğer elde tutulan bir çift forseps ile dokuyu sabitleyin.
- Bu noktada, göbek damarlarını ve damarı gözlemleyin ve kan damarlarını yüzeyden bir yönde kazımak için bir neşter kullanarak çıkarın. Dokuyla ilişkili tüm artık kanı çıkarmak için kordon dokusunu PBS'de bir kez daha durulayın. Damarları çevreleyen WJ'deki hücrelerin bütünlüğünü korumak için kazımanın nazik olduğundan emin olun.
- Kordon dokusunun her bir yarısını 0,5cm3 büyüklüğünde parçalar halinde kesin ve parçaları ışık yüzeyi aşağı bakacak şekilde tabağın üzerine yerleştirin. Çanağı,% 5 CO 2 içeren 37 ° C nemlendirilmiş bir odada 10 dakika boyunca kısaca kuluçkayayatırın.
- Kuluçkadan sonra, kordon dokusu parçalarını içeren çanağı, L-glutamin, ribo- ve deoksiribonükleositler,% 15 fetal sığır serumu (ısıl inaktive değil) ve 50 μg / mL gentamisin-içermeyen MEM Alpha Modifikasyonu içeren 20 mL ortam ile doldurun. Doku eksplantlarının oryantasyonlarından çıkmasını önlemek için büyüme ortamını yanlar boyunca yavaşça ekleyin. Kuluçka sırasında doku eksplantları tarafından ıslatılacak bir fraksiyonu hesaba katmak için fazla ortam ekleyin.
- 3 günlük inkübasyondan sonra, kültürlere taze ortam ekleyin. Bulaşıkları tutarken kültürlerin şoklardan ve eksplantların hareketlerinden korunduğundan emin olun.
- 1 hafta sonra, steril forseps kullanarak doku parçalarını ayrı ayrı çıkarın ve bertaraf için uygun biyolojik tehlike torbaları kullanarak atın. Mevcut ortamı koruyun ve 10 mL taze büyüme ortamı ekleyin. Bireysel koloniler% 70'lik bir birleşime ulaşana kadar büyüme ortamını her 4 günde bir değiştirin.
NOT: Hücrelerin çanak boyunca eşit olarak dağılmaması muhtemeldir, çünkü zamanla birleşmesi için izlenmesi gereken bireysel proliferatif koloniler olacaktır. Genel olarak, bir ay içinde, 10cm2'lik bir çanak, ayrı bir kaba bölünmek için yeterli hücre üretir. - Tripsin / EDTA çözeltisi (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisinde [HBSS]'de% 1x% 0.25 tripsin ve% 0.02 EDTA) kullanarak yapışkan hücreleri toplayın. Hücre süspansiyonunu 470 × g'da 25 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin ve hücre peletini büyüme ortamında yeniden askıya alın.
2. uMSCS'nin immünofenotiplenmesi ve yayılması
- Yapışkan hücreler% 50-60 birleşimine ulaştığında ve iyi yayıldığında immünofenotiplemeye geçin. MSC işaretleyici analizini tam akıcı kültürler üzerinde yapmayın, çünkü bu anahtar MSC belirteçlerinin aşağı regülasyonuna neden olma eğilimindedir.
- Tripsinizasyondan sonra, FACS tüplerinde 1 × 106 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu dağıtın (1 × 105 hücre / tüp) ve uygun florofora bağlı antikorlarla (hepsi 1:50 seyreltme) kombinasyon halinde boyanın: lekelenmemiş; CD105 + CD90; CD105 + CD73; CD105; CD90; CD73; CD34 + CD45 (ortak florofor); Her florofor için izotip kontrolleri. Daha fazla analiz için akış sitometresine en az 10.000 toplam olay sayısı kaydedin.
NOT: Hücreler her yüzey işaretçisi için ayrı ayrı analiz edildiğinden, hücre alt kümeleri üzerinde geçit gerekli değildir. - Yukarıdaki belirteçlere ek olarak, bireysel kordon dokusu örneklerinden oluşturulan uMSC hatlarında pozitif ve negatif yüzey belirteçlerinin varlığını doğrulamaktadır (Tablo 1).
- Etiketli hücreleri akış sitometrisi ile analiz edin ve CD105 + CD90 + ve CD105 + CD73 + hücrelerinin yüzdesini belirleyin. CD105+ ve CD34−CD45− hücrelerini ayrı ayrı analiz edin.
3. uMSC'lerin iskelet kasına farklılaşması
- PBS'de %0.01 kollajen ve 20 μg/mL laminin içeren doku kültürü plakalarını kaplayın. Bu plakaları oda sıcaklığında en az 4 saat kaplayın.
- Büyüme ortamında 10.000 hücre/cm2 yoğunlukta plaka uMSC'ler.
- Hücreler% 70 birleştiğinde, büyüme ortamını aspire edin ve kültürleri PBS ile 2 kat durulayın. uMSC'lere DMEM +% 5 at serumu + 0.1 μM deksametazon + 50 μM hidrokortizondan oluşan miyojenik farklılaşma ortamı (M1) ekleyin. Miyojenik progresyonun kinetiğinin belirlenmesi için, kültürlere her gün M1 ortamı ekleyin.
- Miyojenik progresyonun kinetiğini belirlemek için, sırasıyla 2 gün, 4-5 gün, 6-7 gün ve 10-14 günde Pax7, MyoD, Myogenin ve MyHC ekspresyonu için uMSC'leri analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
uMSC'lerin kordon dokusundan izole edilmesinin başarısı, tam kordon kanından elde edilen zayıf başarı oranlarının aksine% >95'tir. uMSC'lerin başarılı bir şekilde izole edilmesi üzerine, FACS analizi tüm hücrelerin CD34-CD45-CD105 + CD90 + olduğunu ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, karşılaştırmalı analizde, kordon kanından izole edilen uMSC'ler, hücrelerin bir kısmının CD34 + CD45 + CD105 + (~% 15) gösterdiği heterojen popülasyonları gösterir. Ek olarak, çift pozitif CD105 + CD90 + sayıca daha azdır (~% 5) (Ek Şekil S1). Bu, kordon kanından uMSC'ler arasında miyojenik farklılaşma seviyelerinin azalmasına neden olur, çünkü miyogenezin indüksiyonu için hem CD105 hem de CD90 ekspresyonu gereklidir. uMSC'ler ayrıca Tablo 1'de listelenen işaretçilerin ifadesini de görüntüler. Kordon kanından türetilmiş uMSC'lerin kontaminasyonu varsa, CD34 + CD45 + hücrelerinin varlığı da olacaktır. Bu, miyojenik farklılaşma için kaplama için yanlış hücre sayımlarına neden olur. CD105 ve CD90 ekspresyonu için hücrelerin% >90'ının çift pozitif olduğunun bir göstergesi, uMSC'lerin herhangi bir mezodermal soya bağlı kalmaması ve hem CD105 hem de CD90 ekspresyonu farklılaşma üzerine aşağı regüle edildiğinden multipotent kalmaya devam etmesidir. Tek bir kesin uMSC belirteci olmadığından, uMSC fenotiplerinin doğrulanması için birden fazla belirteç kullanılması zorunludur. Bu analizde, laboratuvarda oluşturulan uMSC hatlarının her biri için Tablo 1'de listelenen tüm belirteçlerin varlığını değerlendirdik. Ek olarak, CD105 ve CD90'ın (Şekil 2A) yanı sıra CD105 ve CD73'ün (Şekil 2B) çift pozitif durumunu belirledik ve uMSC'lerin birden fazla anahtar belirteci eksprese etmesini sağladık. Bu,% 0.05'ten daha az sayıda bulunan tek pozitif hücrelerin kirlenmesini önlemek için gereklidir.
Şekil 1: uMSC'lerin kordon dokusundan kademeli izolasyonunu ve karakterizasyonunu gösteren şematik. Kısaltma: uMSC'ler = insan göbek kordonu dokusundan mezenkimal kök hücreler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerde MSC belirteci analizi . (A) uMSC'ler CD105 ve CD90 ekspresyonunu gösterir ve hematopoetik belirteçleri, CD34 ve CD45'i eksprese etmez. Üç uMSC çizgisinin (UCT15, UCT18 ve UCT26) temsili FACS grafikleri gösterilmiştir (N = 16). Üst panel sırası, CD105 ve CD90 ifadesi için Q2 kadranındaki üç uMSC satırının tümündeki hücreleri pozitif olarak gösterir. Panellerin alt sırası, CD105 ekspresyonu için pozitif ve CD34 ve CD45 ekspresyonu için negatif Q1 kadranındaki hücreleri gösterir. (B) uMSC'ler MSC işaretleyicisi CD73'ün ifadesini görüntüler (N = 16). Kısaltma: uMSC'ler = insan göbek kordonu dokusundan mezenkimal kök hücreler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| uMSC pozitif belirteçler | uMSC negatif belirteçleri |
| CD105 | CD34 |
| CD90 | CD45 |
| CD73 | CD106 |
| CD29 | HLA DR |
| CD44 | CD31 |
| HLA ABC | CD14 |
| CD49e | CD49e |
| CD54 | |
| CD13 |
Tablo 1: uMSC'ler için pozitif ve negatif belirteçlerin listesi. Kısaltma: uMSC'ler = insan göbek kordonu dokusundan mezenkimal kök hücreler.
uMSC'lerin miyojenik soya farklılaşması için, uMSC'ler tipik olarak M1 ilavesinden sonraki ilk 2 gün içinde öncü hücreler için bir belirteç olan Pax7'yi, ardından M1 ilavesinin ilk 4 günü içinde MyoD'yi eksprese eder (Şekil 3). 6 günlük farklılaşmada, hücreler Myogenin proteinini eksprese eder, bunu 10 gün ile 14 gün arasında farklılaşma indüksiyonunun 10 günü ile 14 günü arasında Myosin ağır zincirinin (MyHC) ekspresyonu izler. RNA dizilimi, akış sitometrisi, immünositokimya, RT-PCR ve batı leke analizi kullanılarak miyojenik ekspresyonun kinetiğini daha ayrıntılı olarak karakterize ettik ve miyojenik belirteçlerin aşamalı ekspresyonunu belgeleyerek bu protokolün sağlamlığını doğruladık. İskelet kasına farklılaşan farklılaşmamış uMSC'ler ve uMSC'ler arasındaki tüm genom transkriptomik dizilimi, miyojenik farklılaşmanın indüksiyonuna yanıt olarak 907 genin yukarı regülasyonunu ortaya koymuştur (Şekil 4).
Şekil 3: uMSC'lerin iskelet kasına farklılaşması . uMSC'ler 2 gün, 4 gün, 7 gün ve 10 gün boyunca M1 ortamında kültürlendi ve (A) 2 gün sonra Pax7, (B) 4 gün sonra MyoD, (C) 7 gün sonra T8, T12, T14 ve T25 ile gösterilen farklı uMSC hatlarından miyogenin ekspresyonu ve (D) 10 gün sonra MyHC olarak değerlendirildi. Ölçek çubukları = (B, D) 50 μm. Kısaltmalar: uMSC'ler = insan göbek kordonu dokusundan mezenkimal kök hücreler; GAPDH = gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz; MyoD = miyoblast tayini proteini 1; MyHC = miyozin ağır zinciri; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; Mb = miyoblast; MT = miyotüp. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kordon kanı ve iskelet kasına diferansiye kordon dokusundan türetilen uMSC'lerin karşılaştırmalı transkriptomik profillemesi. Kontrol uMSC'leri ve uMSC'ler arasındaki normalleştirilmiş 907 gen sayımının ısı haritası, kordon kanı ve kordon dokusundan 7 gün boyunca iskelet kasına farklılaştı. Venn diyagramı (solda), kordon kanı kaynaklı uMSC'lere kıyasla kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerde yukarı regüle edilmiş daha fazla sayıda miyojenik gen göstermektedir. Aşağıdaki tablo, hem kordon dokusunda hem de kordon kanında yukarı regüle edilen yaygın miyojenik genleri göstermektedir. Bu rakam Mishra ve ark.6'ya aittir. Kısaltmalar: 1, 2 = biyolojik çoğalır; CB1,2 = kordon kanının uMSC'lerinden türetilen miyojenik hücreler; CT1, 2 = kordon dokusunun uMSC'lerinden türetilen miyojenik hücreler; coB1,2 = kordon kanından farklılaşmamış uMSC'leri kontrol edin; coT1, 2 = kordon dokusundan farklılaşmamış uMSC'leri kontrol edin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Karşılaştırmalı bir analiz yapmak amacıyla, kordon kanı ve kordon dokusundan izole edilen uMSC'leri karşılaştırdık. RNA dizileme verileri, uMSC'lerde kordon dokusundan türetilmiş miyojenik hücrelerden, kordon kanından türetilenlere göre daha fazla miyojenik gen olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 4). Bu çalışmayı desteklemek için kullanılan RNA dizileme verileri NCBI'ye yüklenir (SRA katılımı GSE147114'tür). Kısaca, PANTHER GO-slim veri tabanı kullanılarak yapılan dokuya özgü transkriptomik analiz, aktin bağlama ve sarkomer montajı (TPM2, LDB3, PDLIM3, FHL1, NEXN, MYOM1) ile ilişkili sitoiskelet proteinlerini tanımladı (RTN2, SLC19A2, ACHE, SCN1B, SLC19A2, JPH2, KCNJ12, ANKRD1), kas kütlesi bakımı ( FBXO32, TRIM16L, GHR), kalsiyum sinyalizasyonu (FKBP5) ve enzimatik fonksiyon (COX7A1, PDK4) (Şekil 4). Toplamda, bu veriler kordon dokusundan türetilmiş uMSC'lerin sağlam miyojenik potansiyel gösteren bir bölmeyi temsil ettiğini göstermektedir.
İzolasyondaki verimliliklerden, uMSC bölmesindeki heterojenlikten, annenin yaşından ve annenin besin seviyeleri de dahil olmak üzere sağlık durumundan kaynaklanabilecek uMSC hatları arasındaki bireysel farklılıklar nedeniyle, yerleşik uMSC hatları arasında proliferasyon oranlarında ve miyojenik potansiyellerde farklılıklar olabilir. Bununla birlikte, ekspresyon kinetiğindeki farklılıklara rağmen, miyojenik belirteçlerin aşamalı ekspresyonu ile miyojenitenin artması genel eğilimi korunmaktadır.
Ek Şekil S1: Kordon kanı kaynaklı uMSC'lerde MSC belirteci analizi. uMSC'ler CD105 ve hematopoetik belirteçlerin, CD34 ve CD45'in ekspresyonunu gösterir. CD105+ popülasyonunun analizi, bu hücrelerin sadece küçük bir kısmının CD90'ı birlikte eksprese ettiğini göstermektedir (N = 5). Kısaltma: uMSC'ler = insan göbek kordonu dokusundan mezenkimal kök hücreler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritik adımlar
Bu protokoldeki kritik bir adım, tüm yayılma süresi boyunca, doğum anından steril kültürlerin bakımına kadar aseptik koşullar altında dokunun toplanmasıdır. Kordon toplama sırasında, kordonun sterilize edilmemiş herhangi bir yüzeye temas etmemesi ve antibiyotik takviyeli PBS içeren tüplerde toplanmadan önce% 70 etanol ile harici olarak temizlenmesi esastır. uMSC izolasyonu için kordon toplanması ve dokunun işlenmesi arasındaki süreyi sınırlamak önemlidir. Dokunun toplandığı yerden laboratuvara taşınmasına ihtiyaç duyulması durumunda, dokunun antibiyotik içeren tamponlarda tutulmasına ve buz üzerinde saklanmasına özen gösterilmelidir.
Yöntemin değiştirilmesi ve sorun giderme
uMSC'lerin miyojenik farklılaşmasını indüklemek için bu protokoldeki anahtar modifikasyon, bulaşıkların% 0.01 tip 1 kollajen ve 20 μg / mL laminin ile kaplanmasıdır. UMSC'lerde M1 ortamı varlığında miyojenik progresyonun, adezyon koşulları da modüle edildiğinde arttığını gözlemledik. Matrigel gibi pahalı da olsa diğer üstün matrislerin kullanımının bu protokolü daha da geliştirip geliştiremeyeceğinin test edilmesi gerekir. Tek tek numuneler arasındaki verimdeki değişiklikler, bazı dokuların daha düşük hücre sayısı üretmesine neden olabilir. Bu gibi durumlarda, >5 cm olan daha uzun bir kordon dokusu toplanması tercih edilebilir. Bu bağlamda, az sayıda rapor uMSC'lerin verimini artırmak için 10 cm'lik kordon dokusu kullanmıştır. uMSC'lerin kordon dokusundan izolasyonunu açıklayan raporların çoğu, hücrelerin kordon stromasından 3,5,7,8'den artan salınımı için hücre dışı matriks parçalayıcı enzimlerden yararlanmıştır. Bu rapor da dahil olmak üzere birkaç çalışma tarafından eksplant kültürlerinin kullanımı, hücresel canlılığın arttığını ve 6,9,10 verimin sürekli olarak arttığını göstermiştir. Ek olarak, uMSC'lerin kordon kanından arındırılmasında sıklıkla yer alan hücre popülasyonlarını saflaştırmak için hücre sıralama yapma ihtiyacının olmaması, hücresel sayıları ve bütünlüğü arttırır.
Yöntemin sınırlamaları
Yöntemin önemli bir sınırlaması, bireysel kordon dokusu örneklerinden uMSC hatlarının tam olarak kurulması için gereken süredir. Genellikle, bu protokolü kullanarak her uMSC hattını oluşturmak için 3 hafta gerekir. Bunu takiben, tam miyojenik farklılaşma için 2 hafta gereklidir. Bu uzun araştırma süresi, intrauterin ortam hakkında bilgi edinmek veya vücut kompozisyonu gibi yavru organ metabolik parametrelerini tahmin etmek amacıyla uMSC'lerin farklı katılımcılardan farklılaşma potansiyellerini inceleyen büyük kohortlarda hantal olabilir. İkinci bir sınırlama, çeşitli uMSC bölmeleri arasında içsel fenotipik farklılıklara sahip olabilen ve farklı kaynaklar arasındaki farklılaşma potansiyellerinden sorumlu olabilecek kordon dokusu matrisi içindeki heterojenliktir. Örneğin, WJ'den gelen uMSC'ler, CL kaynaklı uMSC'lere kıyasla daha düşük osteojenik potansiyel gösterir11. Bu nedenle, bu yöntem kordon dokusunun içindeki farklı bölmeler arasındaki doğal farklılıkları tanımlamaz.
Yöntemin mevcut yöntemlere göre önemi
Bu protokolü kullanarak, bireysel kordon dokusu örneklerinden 1 × 104 ila 1 × 106 uMSC'lik bir hücre sayısı elde edebiliyoruz. Bu uMSC hatları, en az 6-8 pasaj için tahliller için güvenilir bir şekilde kullanılabilir. İnsan popülasyonlarına özgü hücresel fenotiplerdeki varyasyonun derecesine rağmen, Kuzey Hindistan'dan 15 kadından oluşan kohortumuzda gözlenen uMSC'lerin ortalama iki katına çıkma süresi 2 günden azdı6. 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) dahil edilerek proliferatif oranlarının analizi, hücrelerin en az% 80'inin 6 saat6'lık bir sürede S-fazından geçtiğini göstermiştir. Ek olarak, kordon dokusundan gelen uMSC'ler de düşük yaşlanma oranları gösterir, bu da bu izolasyon yönteminin sağlamlığını gösterir6. Daha önce bu protokolü kullanan uMSC'lerdeki miyojenik indüksiyon derecesini, insan ve murin pluripotansiyel kök hücrelerinde miyogenezi indüklemek için kullanılanla karşılaştırdık 6,12. Bu protokolün mevcut protokollerden daha güçlü bir miyojenik farklılaşma indükleyicisi olduğunu bulduk.
Yöntem ve uygulamaların önemi
Başarılı hücresel ve rejeneratif tedaviler, hücresel canlılığa ve verime bağlıdır ve erken pasajlardan çok sayıda hücre gerektirir. Böylece, bu yöntem klinik uygulamalar için uygun bir alternatif sunar. Bu yazıda verilen sağlam miyojenik farklılaşma protokolü ve çalışmamızda bu protokolü kullanarak miyojenik progresyonun derinlemesine moleküler karakterizasyonu, fetal miyogenezi özetleme çabalarını tamamlamakta ve intrauterin ortamı taklit etmek ve doğum sonrası metabolizmayı yansıtmak için bir model olarak kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Sayın Ojas Tikoo'ya film çekimi ve video prodüksiyonu konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca, Gurugram Sivil Hastanesi'ndeki GARBH-Ini (İleri Araştırma ve Doğum Sonuçları Disiplinlerarası Grup-DBT Hindistan) personelinden, hemşirelerinden ve kıdemli araştırma görevlilerinden ve Dr. Pallavi Kshetrapal'dan lojistik konusunda yardım için alınan yardımı da kabul ediyoruz. Bu çalışma, Hindistan Biyoteknoloji Bölümü'nden Suchitra Gopinath'a verilen hibelerle desteklenmiştir (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
| Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
| Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
| Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
| Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
| Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
| Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
| APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
| Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
| D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
| FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
| FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
| FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
| FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
| FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
| FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
| FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
| FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
| FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
| FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
| FlowJo software | BD Biosciences | ||
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
| Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
| Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
| Laminin | Merck | L2020 | |
| MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
| PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
| PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
| PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
| PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
| PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
| Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |
References
- Kuroda, Y., et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8639-8643 (2010).
- Troyer, D. L., Weiss, M. L. Wharton's jelly-derived cells are a primitive stromal cell population. Stem Cells. 26 (3), 591-599 (2008).
- Karahuseyinoglu, S., et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: In situ and in vitro surveys. Stem Cells. 25 (2), 319-331 (2007).
- Kita, K., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Jeschke, M. G. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the sub-amniotic human umbilical cord lining membrane. Stem Cells and Development. 19 (4), 491-502 (2010).
- Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: A source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
- Mishra, S., et al. Umbilical cord tissue is a robust source for mesenchymal stem cells with enhanced myogenic differentiation potential compared to cord blood. Scientific Reports. 10 (1), 18978 (2020).
- Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
- Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton's Jelly of umbilical cord. Methods in Cell Biology. 86, 101-119 (2008).
- Sotiropoulou, P. A., Perez, S. A., Salagianni, M., Baxevanis, C. N., Papamichail, M. Characterization of the optimal culture conditions for clinical scale production of human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 462-471 (2006).
- Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. BioMed Research International. 2013, 428726 (2013).
- Ishige, I., et al. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton's jelly explants of human umbilical cord. International Journal of Hematology. 90 (2), 261-269 (2009).
- Chal, J., et al. Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nature Biotechnology. 33 (9), 962-969 (2015).
