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Biochemistry

मानव अग्नाशय के ऊतकों से एन-ग्लाइकोपेप्टाइड्स और फॉस्फोपेप्टाइड्स के एक साथ विश्लेषण के लिए एक स्पिन-टिप संवर्धन रणनीति

Published: May 4, 2022 doi: 10.3791/63735
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

Summary

पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) प्रोटीन संरचनाओं और कार्यों को बदलते हैं। कई पीटीएम प्रकारों के एक साथ संवर्धन के तरीके विश्लेषण में कवरेज को अधिकतम कर सकते हैं। हम अग्नाशयी ऊतकों में प्रोटीन एन-ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन के एक साथ संवर्धन और विश्लेषण के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री के बाद दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

मास स्पेक्ट्रोमेट्री पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) का गहरा कवरेज प्रदान कर सकता है, हालांकि जटिल जैविक मैट्रिक्स से इन संशोधनों का संवर्धन अक्सर गैर-संशोधित विश्लेषणों की तुलना में उनके कम स्टोइकोमेट्री के कारण आवश्यक होता है। बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स वर्कफ़्लो में पेप्टाइड्स पर पीटीएम के अधिकांश संवर्धन वर्कफ़्लो, जहां परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स का विश्लेषण करने से पहले प्रोटीन एंजाइमेटिक रूप से पच जाते हैं, केवल एक प्रकार के संशोधन को समृद्ध करते हैं। हालांकि, यह पीटीएम का पूरा पूरक है, जो जैविक कार्यों की ओर जाता है, और एक प्रकार के पीटीएम का संवर्धन पीटीएम के इस तरह के क्रॉसस्टॉक को याद कर सकता है पीटीएम क्रॉसस्टॉक प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन के बीच देखा गया है, मानव प्रोटीन में दो सबसे आम पीटीएम और मास स्पेक्ट्रोमेट्री वर्कफ़्लो का उपयोग करके दो सबसे अधिक अध्ययन किए गए पीटीएम भी। यहां वर्णित एक साथ संवर्धन रणनीति का उपयोग करते हुए, दोनों पीटीएम पोस्टमार्टम मानव अग्नाशयी ऊतक, एक जटिल जैविक मैट्रिक्स से समृद्ध हैं। दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग एक सुविधाजनक स्पिन टिप-आधारित विधि में कई अंशों में एक साथ ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन के विभिन्न रूपों को अलग करने के लिए किया जाता है, जिससे संभावित पीटीएम क्रॉसस्टॉक इंटरैक्शन के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण की अनुमति मिलती है। ग्लाइको- और फॉस्फोपेप्टाइड्स के लिए यह संवर्धन वर्कफ़्लो कई पीटीएम की गहरी प्रोफाइलिंग प्राप्त करने और भविष्य के अध्ययनों के लिए संभावित लक्ष्य अणुओं की पहचान करने के लिए विभिन्न नमूना प्रकारों पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) प्रोटीन संरचनाओं और परिणामस्वरूप उनके कार्यों और डाउनस्ट्रीम जैविक प्रक्रियाओं को संशोधित करने में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं। विभिन्न पीटीएम द्वारा वहन की गई संयोजक परिवर्तनशीलता के कारण मानव प्रोटिओम की विविधता तेजी से बढ़ जाती है जीनोम द्वारा भविष्यवाणी की गई उनके विहित अनुक्रमों से प्रोटीन के विभिन्न रूपों को प्रोटियोफॉर्म के रूप में जाना जाता है, और कई प्रोटियोफॉर्म पीटीएम1 से उत्पन्न होते हैं। स्वास्थ्य और बीमारी में प्रोटियोफॉर्म विविधता का अध्ययन हाल के वर्षों में बहुत रुचि के अनुसंधान का एक क्षेत्र बन गया है 2,3.

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटिओमिक्स विधियों के विकास के माध्यम से प्रोटिओफॉर्म और अधिक विशेष रूप से बड़ी गहराई वाले पीटीएम का अध्ययन अधिक आसान हो गया है। एमएस का उपयोग करके, विश्लेषणों को आयनित, खंडित और टुकड़ों के एम / जेड के आधार पर पहचाना जाता है। प्रोटीन के गैर-संशोधित रूपों की तुलना में पीटीएम की कम सापेक्ष बहुतायत के कारण संवर्धन विधियां अक्सर आवश्यक होती हैं। हालांकि बरकरार प्रोटीन और उनके पीटीएम का विश्लेषण, जिसे टॉप-डाउन विश्लेषण कहा जाता है, अधिक नियमित हो गए हैं, प्रोटीन के एंजाइमी पाचन और बॉटम-अप विश्लेषण में उनके घटक पेप्टाइड्स का विश्लेषण अभी भी पीटीएम विश्लेषण के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाने वाला मार्ग है। दो सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किए गए पीटीएम, और विवो में दो सबसे आम पीटीएम, ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन4 हैं। ये दो पीटीएम सेल सिग्नलिंग और मान्यता में प्रमुख भूमिका निभाते हैं और इस प्रकार रोग अनुसंधान में विशेषता के लिए महत्वपूर्ण संशोधन हैं।

विभिन्न पीटीएम के रासायनिक गुण अक्सर विश्लेषण से पहले प्रोटीन और पेप्टाइड स्तरों पर इन पीटीएम के संवर्धन की दिशा में मार्ग प्रदान करते हैं। प्रत्येक मोनोसेकेराइड पर हाइड्रॉक्सिल समूहों की प्रचुरता के कारण ग्लाइकोसिलेशन एक हाइड्रोफिलिक पीटीएम है। इस संपत्ति का उपयोग हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी (एचआईएलआईसी) में ग्लाइकोपेप्टाइड्स को समृद्ध करने के लिए किया जा सकता है, जो हाइड्रोफोबिक गैर-संशोधित पेप्टाइड्स5 से अधिक हाइड्रोफिलिक ग्लाइकोपेप्टाइड्स को अलग कर सकता है। फॉस्फोराइलेशन फॉस्फेट मॉइटी को जोड़ता है, जिसे अम्लीय पीएच को छोड़कर नकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है। इस चार्ज के कारण, टाइटेनियम सहित विभिन्न धातु उद्धरणों का उपयोग फॉस्फोपेप्टाइड्स को आकर्षित करने और बांधने के लिए किया जा सकता है जबकि गैर-फॉस्फोराइलेटेड प्रजातियां धोई जाती हैं। यह स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी (आईएमएसी) का सिद्धांत है। ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन के लिए इन और अन्य संवर्धन रणनीतियों की आगे की चर्चा हाल की समीक्षा 6,7 में पाई जा सकती है।

पेप्टाइड्स पर पीटीएम की कम स्टोइकोमेट्री के कारण संवर्धन प्रोटोकॉल के लिए पेप्टाइड सामग्री (0.5 मिलीग्राम या उससे अधिक) की तुलनात्मक रूप से बड़ी मात्रा में अक्सर आवश्यकता होती है। उन परिदृश्यों में जहां नमूने की यह मात्रा आसानी से प्राप्त नहीं की जा सकती है, जैसे कि ट्यूमर कोर बायोप्सी या मस्तिष्कमेरु द्रव विश्लेषण, आसान वर्कफ़्लो का उपयोग करना फायदेमंद है जिसके परिणामस्वरूप अधिकतम जैव आणविक जानकारी होती है। हमारी प्रयोगशाला और अन्य लोगों द्वारा विकसित हालिया रणनीतियों ने एक ही पीटीएम संवर्धन वर्कफ़्लो 8,9,10,11,12 का उपयोग करके ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन के एक साथ और समानांतर विश्लेषण पर प्रकाश डाला है। यद्यपि इन दो पीटीएम के रासायनिक गुण भिन्न हो सकते हैं, लेकिन अभिनव पृथक्करण तकनीकों और उपयोग की जाने वाली सामग्रियों के कारण इन पीटीएम का विश्लेषण कई चरणों में किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण-हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी (ईआरएलआईसी) विश्लेषणों और स्थिर चरण सामग्री 13,14,15,16 के बीच चार्ज-चार्ज इंटरैक्शन के साथ विश्लेषण और मोबाइल चरण के बीच हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन के आधार पर पृथक्करण को ओवरले करता है। अम्लीय पीएच पर, स्थिर चरण में फॉस्फोराइलेटेड पेप्टाइड्स का आकर्षण गैर-संशोधित पेप्टाइड्स से उनके प्रतिधारण और पृथक्करण में सुधार कर सकता है। हाइड्रोफिलिक माइक्रोस्फीयर पर स्थिर टीआई (चतुर्थ) से युक्त सामग्री का उपयोग फॉस्फोपेप्टाइड्स और तटस्थ, अम्लीय और मैनोज -6-फॉस्फोराइलेटेड ग्लाइकोपेप्टाइड्स17,18 को अलग करने के लिए एचआईएलआईसी और आईएमएसी-आधारित क्षालन के लिए किया जा सकता है। इस रणनीति को दोहरे कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी के रूप में जाना जाता है। एक ही वर्कफ़्लो में कई पीटीएम को समृद्ध करने के लिए इन रणनीतियों का उपयोग संभावित पीटीएम क्रॉसस्टॉक इंटरैक्शन के विश्लेषण को अधिक सुलभ बना सकता है। इसके अतिरिक्त, कुल नमूना राशि और समय की आवश्यकताएं पारंपरिक संवर्धन विधियों से कम होती हैं जब समानांतर (यानी, अलग-अलग नमूना विभाज्य पर एचआईएलआईसी और आईएमएसी) में प्रदर्शन किया जाता है।

प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन के एक साथ विश्लेषण के लिए दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी रणनीति का प्रदर्शन करने के लिए, हमने इसे पोस्टमार्टम मानव अग्नाशयी ऊतकों का विश्लेषण करने के लिए लागू किया है। अग्न्याशय इंसुलिन और ग्लूकागन सहित पाचन एंजाइम और नियामक हार्मोन दोनों का उत्पादन करता है। अग्नाशयी रोग में अग्नाशयी कार्य बिगड़ा हुआ है। मधुमेह में, रक्त शर्करा का विनियमन प्रभावित होता है, जिससे रक्त में ग्लूकोज का स्तर अधिक होता है। अग्नाशयशोथ में, अंग के ऑटो-पाचन से सूजन होती है3. ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन सहित पीटीएम प्रोफाइल में परिवर्तन, अन्य बीमारियों में अक्सर होता है, जैसा कि अक्सर होता है।

यहां, हम अग्नाशयी ऊतक से निकाले गए प्रोटीन से प्राप्त एन-ग्लाइकोपेप्टाइड्स और फॉस्फोपेप्टाइड्स के लिए दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी रणनीति के आधार पर स्पिन-टिप आधारित एक साथ संवर्धन विधि के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल में प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन, संवर्धन, एमएस डेटा संग्रह और डेटा प्रोसेसिंग शामिल हैं, जैसा कि चित्रा 1 में देखा जा सकता है। इस अध्ययन से प्रतिनिधि डेटा पहचानकर्ता पीएक्सडी 033065 के साथ प्रोटिओमएक्सचेंज कंसोर्टियम के माध्यम से उपलब्ध हैं।

Figure 1
चित्रा 1: मानव अग्नाशयी ऊतकों से एन-ग्लाइकोपेप्टाइड्स और फॉस्फोपेप्टाइड्स के एक साथ विश्लेषण के लिए वर्कफ़्लो। डिटर्जेंट सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) का उपयोग करके प्रोटीन निष्कर्षण से पहले ऊतकों को पहले एक महीन पाउडर में क्रायो-चूर्णित किया जाता है। प्रोटीन तब एंजाइमी पाचन के अधीन होते हैं। परिणामी पेप्टाइड्स को दोहरे कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी का उपयोग करके संवर्धन से पहले विभाज्य किया जाता है। कच्चे डेटा को नैनोस्केल रिवर्स फेज लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एनआरपीएलसी-एमएस) का उपयोग करके एकत्र किया जाता है और डेटाबेस खोज सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य पीटीएम विश्लेषण को अधिक सुलभ बनाना और एक ही वर्कफ़्लो में कई पीटीएम के अधिक व्यापक विश्लेषण को सक्षम करना है। इस प्रोटोकॉल को कोशिकाओं और बायोफ्लुइड्स सहित अन्य जटिल जैविक मैट्रिक्स पर लागू किया जा सकता है।

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Protocol

मृतक के परिजनों से अनुसंधान के लिए अग्नाशय के ऊतकों के उपयोग के लिए सहमति प्राप्त की गई थी और विस्कॉन्सिन-मैडिसन स्वास्थ्य विज्ञान संस्थागत समीक्षा बोर्ड विश्वविद्यालय द्वारा एक प्राधिकरण प्राप्त किया गया था। आईआरबी निरीक्षण की आवश्यकता नहीं है क्योंकि इसमें 45 सीएफआर 46.102 (एफ) द्वारा मान्यता प्राप्त मानव विषयों को शामिल नहीं किया गया है।

सावधानी: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों को संभालते समय देखभाल की जानी चाहिए, जिसमें एसिड (फॉर्मिक, एसिटिक, ट्राइफ्लोरोएसेटिक), बेस (अमोनियम हाइड्रॉक्साइड), और क्रायोजेन (तरल नाइट्रोजन) शामिल हैं। संबंधित खतरों और आवश्यक सावधानियों से परिचित होने के लिए उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों के लिए सुरक्षा डेटा शीट पढ़ें। प्रतिशत का उपयोग करके निरूपित सांद्रता आयतन/कुल आयतन (v/v) है और पानी से पतला है।

1. ऊतक क्रायो-चूर्णीकरण, लिसिस, और प्रोटीन निष्कर्षण

  1. तरल नाइट्रोजन के साथ एक देवर भरें। ऊतक पल्वराइज़र के कुछ हिस्सों को पूर्व-ठंडा करें जो अग्नाशयी ऊतकों के संपर्क में आएंगे, अर्थात्, एक पॉलीस्टाइनिन कंटेनर में कक्ष, पल्वराइज़र और वसूली चम्मच।
  2. पूर्व ठंडा नमूना धारक में जमे हुए ऊतक के टुकड़े स्थानांतरण और ऊतक के लिए तरल नाइट्रोजन का एक चम्मच जोड़ें।
  3. पल्वराइज़र को कक्ष में रखें और नमूने को कुचलने के लिए पांच से दस बार मैलेट का उपयोग करके इसे हड़ताल करें। कक्ष से पल्वराइज़र निकालें और अनुयायी ऊतक पाउडर और टुकड़ों को खुरचें।
  4. यदि ऊतक पिघलने लगते हैं तो कक्ष में एक चम्मच तरल नाइट्रोजन जोड़ें। चूर्णीकरण प्रक्रिया को दोहराएं जब तक कि नमूना बड़े ऊतक टुकड़ों के बिना एक ठीक पाउडर न हो। पूर्व ठंडा ट्यूबों में लगभग 100 मिलीग्राम विभाज्य में नमूनों को भाग दें।
  5. 4% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 150 एमएम एनएसीएल और 25 एमएम ट्रिस (पीएच = 7.4) युक्त लाइसिस बफर तैयार करें। प्रत्येक के 20x स्टॉक के लिए 500 μL पानी में प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधक की एक गोली भंग करें। अंतिम 1x एकाग्रता के लिए लाइसिस बफर में प्रत्येक अवरोधक के 20x स्टॉक की आवश्यक मात्रा जोड़ें।
  6. ट्यूब के लिए 100 मिलीग्राम ऊतक प्रति लाइसिस बफर के 600 μL जोड़ें और 800 आरपीएम पर मिलाते हुए 10 मिनट के लिए एक हीटिंग ब्लॉक में 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। हीटिंग ब्लॉक से नमूने निकालें और उन्हें कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें।
  7. बीच में 30 एस आराम के साथ 15 एस दालों का उपयोग करके 45 एस के लिए 60 डब्ल्यू ऊर्जा (20 किलोहर्ट्ज) पर नमूनों को सोनीकेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3,000 एक्स जी पर नमूने गोली।
  8. सतह पर तैरनेवाला को 5x वर्षा विलायक में जोड़ें, 300 μL लाइसिस बफर को वर्षा विलायक के 1.5 मिलीलीटर में जोड़ें, जिसमें 50% एसीटोन, 49.9% इथेनॉल और 0.1% एसिटिक एसिड होता है। -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ठंडा करें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 3,000 एक्स जी पर फिर से नमूने गोली और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। एक स्पैटुला के साथ तोड़कर और वर्षा विलायक की एक ही मात्रा के साथ मिश्रण करके गोली धो लें। गोली फिर से, धोने के चरण 2x को दोहराते हुए।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 एक्स जी पर नमूना गोली। हवा 15 मिनट के लिए एक धूआं हुड में नमूना गोली सूखी और आगे बढ़ने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. प्रोटीन पाचन और डीसाल्टिंग

  1. 50 एमएम ट्राइथाइलमोनियम बाइकार्बोनेट (टीईएबी) और 8 एम यूरिया युक्त ताजा बनाए गए पाचन बफर के 300 μL में प्रोटीन गोली को फिर से निलंबित करें।
  2. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक प्रोटीन परख का उपयोग कर समाधान की प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाएं।
  3. समाधान में प्रोटीन के लिए, 5 एमएम की अंतिम एकाग्रता में डाइथियोथ्रिटोल (डीटीटी) जोड़ें, मिश्रण करें, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर कम करें। फिर, 15 एमएम की अंतिम एकाग्रता में आयोडोसेटामाइड (आईएए) जोड़ें, अंधेरे में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण और अल्काइलेट करें। डीटीटी के अलावा को पहले की तरह ही मात्रा में दोहराकर क्षारीकरण को बुझाएं और मिलाएं।
  4. ट्रिप्सिन को 1: 100 एंजाइम: प्रोटीन अनुपात में जोड़ें और 4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। फिर, 1 एम < के लिए उपयोग किए जाने वाले 8 एम यूरिया को पतला करने के लिए 50 एमएम टीईबी जोड़ें 1: 100 एंजाइम: प्रोटीन अनुपात पर ट्रिप्सिन जोड़ें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) को 0.3% वी / वी के अलावा के साथ पाचन को बुझाएं। प्रोटीन शुरू करने के प्रत्येक 1 मिलीग्राम के लिए, 1 मिलीलीटर एसिटोनिट्राइल (एसीएन) के साथ एक डीसाल्टिंग कारतूस (1 सीसी, 10 मिलीग्राम) और 0.1% टीएफए के 1 एमएल के साथ 3 एक्स की स्थिति।
  6. डिसाल्टिंग कारतूस पर पचे हुए मिश्रण को लोड करें। 0.1% टीएफए के 1 एमएल का उपयोग करके मिश्रण को 3x धो लें। यदि क्षालन धीमा है, तो सकारात्मक दबाव लागू करें लेकिन प्रति सेकंड एक बूंद > प्रवाह दर से बचें।
  7. 60% एसीएन और 0.1% फॉर्मिक एसिड (एफए) समाधान के 1 एमएल का उपयोग करके एल्यूट पेप्टाइड्स। एक केन्द्रापसारक वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके लगभग 35 डिग्री सेल्सियस पर सूखे पेप्टाइड्स जब तक विलायक पूरी तरह से वाष्पित नहीं हो जाता।
  8. पानी के 300 μL में पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित करें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पेप्टाइड परख का उपयोग करके पेप्टाइड सांद्रता का अनुमान लगाएं। पेप्टाइड्स को 500 μg विभाज्य में विभाजित करें और पूरी तरह से सूख जाएं।

3. ईआरएलआईसी एन-ग्लाइकोपेप्टाइड संवर्धन

नोट: सटीक अपकेंद्रित्र गति और समय नमूनों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और अनुकूलित किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, 2 मिनट के लिए 300 एक्स जी सामग्री की कंडीशनिंग और धोने के लिए उपयुक्त है और एल्यूटिंग के लिए 5 मिनट के लिए 100 एक्स जी है।

  1. कपास ऊन के लगभग 3 मिलीग्राम वजन और यह एक खाली 200 μL विंदुक टिप (स्पिन टिप; सामग्री की तालिका देखें) में पैक करें।
  2. एक ट्यूब में मजबूत आयनों विनिमय संवर्धन सामग्री हस्तांतरण और 10 मिलीग्राम सामग्री प्रति 0.1% टीएफए के 200 μL जोड़ें। पेप्टाइड्स के 500 μg के संवर्धन के लिए, सामग्री के 15 मिलीग्राम का उपयोग करें। 15 मिनट के लिए मिलाते हुए सामग्री को सक्रिय करें।
  3. ट्यूब एडाप्टर का उपयोग करके, स्पिन-टिप को 2 एमएल ट्यूब पर रखें और 15 मिलीग्राम सामग्री के लिए टिप में पर्याप्त घोल जोड़ें। बेंचटॉप अपकेंद्रित्र में कताई करके तरल निकालें।
  4. एसीएन के 200 μL के साथ 3x सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा सामग्री की स्थिति। 100 एमएम अमोनियम एसीटेट (एनएच4एसी), 1% टीएफए, और 80% एसीएन / 0.1% टीएफए (लोडिंग बफर) का उपयोग करके ट्रिप्लिकेट कंडीशनिंग दोहराएं।
  5. लोडिंग बफर के लगभग 200 μL में 500 μg पेप्टाइड नमूनों को फिर से निलंबित करें और स्पिन-टिप के माध्यम से प्रवाह करें। पूर्ण बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह-थ्रू 2x को पुनः लोड करें।
  6. 0.1% टीएफए के 200 μL का उपयोग करके 5x सेंट्रीफ्यूजिंग करके सामग्री को धो लें, और फिर 80% एसीएन / 0.1% एफए के 200 μL का उपयोग करके 2x।
  7. निम्नलिखित में से प्रत्येक के 200 μL के साथ सेंट्रीफ्यूजिंग करके पेप्टाइड्स को एल्यूट करें: 50% एसीएन / 0.1% एफए (ई 2); 0.1% टीएफए (ई 3); 300 एमएम केएच2पीओ4, 10% एसीएन (ई 4)।
  8. 5% एनएच4ओएच के 200 μL के साथ 2x सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा सामग्री को धो लें। 10% एनएच4ओएच (ई 5) के 200 μL के साथ शेष पेप्टाइड्स को एल्यूट करें।
  9. लगभग 35 डिग्री सेल्सियस पर केन्द्रापसारक वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके सभी क्षालन को पूरी तरह से सूखाएं।
  10. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक डीसाल्टिंग टिप का उपयोग करके मूल क्षालन (ई 5) का डीसाल्टिंग करें।
  11. पूर्णता के लिए लगभग 35 डिग्री सेल्सियस पर केन्द्रापसारक वैक्यूम कंसंट्रेटर का उपयोग करके डीसाल्टिंग टिप से क्षालन को सूखाएं।

4. टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन

नोट: सटीक अपकेंद्रित्र गति और समय नमूनों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और अनुकूलित किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, 2 मिनट के लिए 300 एक्स जी सामग्री की कंडीशनिंग और धोने के लिए उपयुक्त है और एल्यूटिंग के लिए 5 मिनट के लिए 100 एक्स जी है।

  1. कपास ऊन के लगभग 3 मिलीग्राम वजन और यह एक खाली 200 μL विंदुक टिप (स्पिन टिप) में पैक।
  2. एक ट्यूब में टीआई-आईएमएसी फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन सामग्री स्थानांतरित करें और प्रति 10 मिलीग्राम सामग्री में 0.1% टीएफए के 200 μL जोड़ें। 500 μg पेप्टाइड्स के संवर्धन के लिए, सामग्री के 10 मिलीग्राम का उपयोग करें।
  3. ट्यूब एडाप्टर का उपयोग करके, स्पिन-टिप को 2 एमएल ट्यूब पर रखें और 10 मिलीग्राम सामग्री के लिए टिप में पर्याप्त घोल जोड़ें। बेंचटॉप अपकेंद्रित्र में कताई करके तरल निकालें।
  4. ऊपर वर्णित के रूप में एक ही अपकेंद्रित्र सेटिंग्स का उपयोग कर 40% एसीएन/3% टीएफए के 200 μL के साथ सामग्री की स्थिति। 3% टीएफए के 200 μL में पेप्टाइड नमूनों को फिर से निलंबित करें और स्पिन-टिप के माध्यम से प्रवाहित करें। अधिक पूर्ण बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए दो बार प्रवाह-थ्रू को पुनः लोड करें।
  5. 50% एसीएन, 6% टीएफए, और 200 एमएम एनएसीएल समाधान के 200 μL के साथ सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा सामग्री को धो लें, इसके बाद 30% एसीएन और 0.1% टीएफए समाधान के 200 μL में 2x धोएं।
  6. 10% एनएच4ओएच के 200 μL के साथ एल्यूट पेप्टाइड्स। वैक्यूम के तहत क्षालन को पूरी तरह से सुखाएं। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एक डीसाल्टिंग टिप का उपयोग करके डीसाल्टिंग करें। वैक्यूम के तहत डिसाल्टिंग टिप से पूर्णता तक क्षालन को सूखा दें।

5. दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) एक साथ संवर्धन

नोट: सटीक अपकेंद्रित्र गति और समय नमूनों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और अनुकूलित किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, 2 मिनट के लिए 300 एक्स जी सामग्री की कंडीशनिंग और धोने के लिए उपयुक्त है और एल्यूटिंग के लिए 5 मिनट के लिए 100 एक्स जी है।

  1. लगभग 3 मिलीग्राम कपास ऊन का वजन करें और इसे एक खाली स्पिन-टिप में पैक करें।
  2. एक ट्यूब में टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी सामग्री के लगभग 1 ग्राम स्थानांतरित करें। सामग्री की ज्ञात एकाग्रता में 0.1% टीएफए जोड़ें, उदाहरण के लिए, 20 मिलीग्राम / 200 μL (सामग्री 4 डिग्री सेल्सियस पर इस निलंबन में संग्रहीत की जा सकती है)।
  3. 500 μg पेप्टाइड्स से संवर्धन के लिए, 20 मिलीग्राम सामग्री को स्थानांतरित करने के लिए स्पिन-टिप में पर्याप्त घोल जोड़ें। 0.1% टीएफए के 200 μL के साथ सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा स्पिन-टिप को धो लें।
  4. धोने विलायक (80% एसीएन और 3% टीएफए) के 200 μL में नमूनों को फिर से निलंबित करें और स्पिन-टिप के माध्यम से प्रवाह करें। प्रवाह के माध्यम से 2x पुनः लोड करें।
  5. लोडिंग/धोने विलायक के 200 μL के साथ सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा स्पिन टिप 6x धो लें। 80% एसीएन / 0.1% एफए समाधान के 200 μL के साथ स्पिन-टिप धो लें।
  6. निम्नलिखित में से प्रत्येक के 200 μL के साथ पेप्टाइड्स को एल्यूट करें: 60% एसीएन / 0.1% एफए (ई 1) और 40% एसीएन / 0.1% एफए (ई 2)। प्रत्येक क्षालन का अलग से विश्लेषण करें।
  7. निम्नलिखित में से प्रत्येक के 200 μL के साथ पेप्टाइड्स को एल्यूट करें: 20% एसीएन / 0.1% एफए और 0.1% एफए।
  8. निम्नलिखित में से प्रत्येक के 200 μL के साथ पेप्टाइड्स को एल्यूट करें: 40% एसीएन / 50% एसीएन /6% टीएफए, 200 एमएम एनएसीएल; और 30% एसीएन / 0.1% टीएफए। इन क्षालनों को मिलाएं और पैक किए गए टिप का उपयोग करके डीसाल्टिंग के बाद एक (ई 4) के रूप में विश्लेषण करें।
  9. 3x के लिए 90% एसीएन / 2.5% एनएच4ओएच के 200 μL का उपयोग करके बुनियादी पीएच के लिए सामग्री की स्थिति। इन वॉश को छोड़ दें।
  10. निम्नलिखित में से प्रत्येक के 200 μL के साथ पेप्टाइड्स को एल्यूट करें: 60% एसीएन / 10% एनएच4ओएच (ई 5) और 40% एसीएन / 10% एनएच4ओएच (ई 6)। पैक्ड टिप का उपयोग करके डीसाल्टिंग के बाद इन क्षालनों का अलग से विश्लेषण करें।
  11. निम्नलिखित में से प्रत्येक के 200 μL के साथ पेप्टाइड्स को एल्यूट करें: 20% एसीएन / 10% एनएच4ओएच; और 10% एनएच4ओएच। इन क्षालनों को मिलाएं और पैक किए गए टिप का उपयोग करके डीसाल्टिंग के बाद एक (ई 7) के रूप में विश्लेषण करें।
  12. वैक्यूम के तहत सभी क्षालन को पूरी तरह से सुखाएं।

6. नैनो-प्रवाह उलट चरण तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एनआरपीएलसी-एमएस)

नोट: एमएस डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण विधियां विविध हैं, और इस प्रकार केवल एक सुझाए गए एलसी-एमएस पाइपलाइन (और इसके संबंधित पैरामीटर) को निम्नलिखित चरणों में यहां वर्णित किया गया है। पहले उल्लिखित नमूना तैयारी और संवर्धन चरणों का उपयोग करके उत्पन्न नमूनों का विश्लेषण अन्य वाद्य सेट-अप का उपयोग करके किया जा सकता है, जिसमें व्यावसायिक रूप से उपलब्ध क्रोमैटोग्राफिक कॉलम का उपयोग करना शामिल है, पर्याप्त डेटा गुणवत्ता को देखते हुए।

  1. खींचें और19 में वर्णित के रूप में C18 सामग्री का उपयोग कर एक 15 सेमी लंबी केशिका (75 μm आंतरिक व्यास) पैक। मोबाइल चरण ए (पानी में 0.1% एफए) और मोबाइल चरण बी (एसीएन में 0.1% एफए) तैयार करें।
  2. 3% मोबाइल चरण बी लोड 2 μL नमूना (~ 13% नमूना मात्रा) के 15 μL में समृद्ध पेप्टाइड नमूने सीधे स्तंभ पर पुनर्गठन। तकनीकी डुप्लिकेट में प्रत्येक नमूने का विश्लेषण करें।
  3. मिनट की प्रवाह दर पर 90 मिनट से अधिक 3% से 30% मोबाइल चरण बी तक ढाल का उपयोग करके एल्यूट पेप्टाइड्स। 8 मिनट के लिए 75% बी का उपयोग करके कॉलम धो लें, इसके बाद 8 मिनट के लिए 95% बी, 12 मिनट के लिए 3% बी पर संतुलन के साथ विधि को खत्म करें।
  4. निम्नलिखित मापदंडों के साथ शीर्ष 20 चोटियों के डेटा-निर्भर अधिग्रहण का उपयोग करके सकारात्मक आयन मोड में मास स्पेक्ट्रोमीटर संचालित करें: स्प्रे वोल्टेज 2 केवी; जेड से एलसी / एमएस में एमएस1 का पता लगाना 120,000 रिज़ॉल्यूशन, 2 ई 5 स्वचालित लाभ नियंत्रण (एजीसी) लक्ष्य, 100 एमएस अधिकतम इंजेक्शन समय, 30% आरएफ लेंस, 1.6 मीटर / जेड विंडो के साथ चतुर्भुज अलगाव, चार्ज राज्यों 2-8 और अनिर्धारित, और 30 एस गतिशील बहिष्करण के लिए; एमएस में एमएस 2 का पता लगाने22%, 30%, और 38% पर कदम एचसीडी विखंडन का उपयोग करते हुए, 30,000 रिज़ॉल्यूशन, 5 ई 4 एजीसी लक्ष्य और 2.5 ई 4 न्यूनतम तीव्रता आवश्यकता पर पहला द्रव्यमान 120 मीटर /

7. एमएस डेटा विश्लेषण

नोट: एक ही डेटासेट का विश्लेषण करने के लिए दो अलग-अलग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक डेटा विश्लेषण पाइपलाइन यहां प्रस्तुत की गई है। फॉस्फोराइलेशन और ग्लाइकोसिलेशन को एक ही समय में दो अलग-अलग सॉफ़्टवेयर के बजाय एक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके खोजा जा सकता है, जैसा कि यहां वर्णित है, हालांकि सामान्य तौर पर, सॉफ़्टवेयर खोज समय खोज स्थान के आनुपातिक है, अर्थात, माना जाता है कि पीटीएम की संख्या। इस कारण से, ग्लाइकोपेप्टाइड्स और फॉस्फोपेप्टाइड्स की खोज के समानांतर दो अलग-अलग सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जाता है।

  1. उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके कच्चे डेटा फ़ाइलों को संसाधित करें (सामग्री की तालिका देखें)।
    1. यूनिप्रोट मानव (या उपयुक्त प्रजाति-विशिष्ट) डेटाबेस के खिलाफ स्पेक्ट्रा खोजें। एक निश्चित संशोधन के रूप में सिस के कार्बामिडोमिथाइलेशन को सेट करें। मिस्ड एंजाइमेटिक दरारों की अधिकतम संख्या को दो के रूप में सेट करें।
  2. कच्चे डेटा फ़ाइलों में, एक वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), विश्लेषण करने के लिए ग्लाइकोपेप्टाइड्स की खोजकरें 20. चार अवशेषों की न्यूनतम पेप्टाइड लंबाई के साथ 10 पीपीएम अग्रदूत द्रव्यमान सहिष्णुता और 0.01 दा टुकड़ा द्रव्यमान सहिष्णुता का उपयोग करें।
    1. हेक्सएनएसी (2) हेक्स (4-9) फॉस्फो (1-2), हेक्सएनएसी (3-4) हेक्स (4-9) फॉस्फो (1-2), हेक्सएनएसी (3-4) हेक्स (4-9) फॉस्फो (1-2), हेक्सएनएसी (2) हेक्स (3-4) फॉस्फो (1), और हेक्सएनएसी (3) सहित विशिष्ट मैनोज -6-फॉस्फेट (एम 6 पी) ग्लाइकन के साथ विस्तारित सॉफ्टवेयर-एम्बेडेड एन-ग्लाइकन डेटाबेस का उपयोग करके खोजें
    2. एक सामान्य संशोधन के रूप में एन-ग्लाइकोसिलेशन सेट करें। पेप्टाइड वर्णक्रमीय मैच (पीएसएम) प्रति अधिकतम कुल संशोधनों को एक आम और दो दुर्लभ के रूप में सेट करें।
    3. निम्नलिखित चर संशोधनों को सेट करें: मेट (दुर्लभ) का ऑक्सीकरण, एएसएन और जीएलएन (दुर्लभ) में डीमिडेशन, और सेर, थ्र और टायर (सामान्य) में फॉस्फोराइलेशन। निम्नलिखित पहचान फ़िल्टर सेट करें: स्कोर कट-ऑफ > 150, |लॉग प्रोब| > 1, और डेल्टा मॉड स्कोर 10 >।
    4. प्रोटीन और पेप्टाइड समूह टैब में खोज परिणामों का निर्यात और विश्लेषण करें।
    5. एमएस स्पेक्ट्रा में फॉस्फोहेक्स ऑक्सोनियम आयन (243 मीटर / जेड) की उपस्थिति के लिए एम 6 पी ग्लाइकन युक्त पहचान को मैन्युअल रूप से स्क्रीन करें और झूठी सकारात्मक पहचान को हटा दें, जिसमें यह नैदानिक आयन नहीं है।
  3. कच्चे डेटा फ़ाइलों में, एक ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके ( सामग्री की तालिका देखें), विश्लेषण किए जाने वाले फॉस्फोपेप्टाइड्स की खोजकरें 21. 20 पीपीएम पहले खोज पेप्टाइड सहिष्णुता और 4.5 पीपीएम मुख्य खोज पेप्टाइड सहिष्णुता का उपयोग करें।
    1. पेप्टाइड प्रति संशोधनों की अधिकतम संख्या 5 पर सेट करें। पीएसएम और प्रोटीन झूठी खोज दर (एफडीआर) को 1% और न्यूनतम पेप्टाइड लंबाई को 7 अवशेषों पर सेट करें।
    2. मेट, एन-टर्मिनल प्रोटीन एसिटिलेशन और सेर, थ्र और टायर में फॉस्फोराइलेशन में ऑक्सीकरण के रूप में चर संशोधनों को सेट करें। संशोधन का उपयोग करके खोज परिणामों का विश्लेषण करेंविशिष्ट पेप्टाइड्स फ़ाइलें।
  4. प्रोटीन, पेप्टाइड और संशोधन साइट के स्तर पर पीटीएम की पहचान की संख्या निर्धारित करें।

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Representative Results

प्रतिनिधि मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा, कच्ची फ़ाइलों और खोज परिणामों सहित, डेटासेट पहचानकर्ता पीएक्सडी 03306522 के साथ प्राइड पार्टनर रिपॉजिटरी के माध्यम से प्रोटीओमएक्सचेंज कंसोर्टियम में जमा किया गया है।

इस काम में, प्रत्येक संवर्धन क्षालन के लिए डुप्लिकेट इंजेक्शन प्रतिकृतियों का विश्लेषण किया गया था। दोनों तकनीकी प्रतिकृतियों से की गई पहचान को अंतिम विश्लेषण में संकलित किया गया था। एमएस विखंडन के लिए पेप्टाइड अग्रदूतों को चुनने में डेटा-निर्भर अधिग्रहण की अर्ध-स्टोकेस्टिक प्रकृति के कारण, तकनीकी डुप्लिकेट के बीच लगभग 70% -80% की पहचान ओवरलैप की उम्मीद है। इन विधियों का उपयोग करने वाले अनुप्रयोगों में, कम से कम दो तकनीकी प्रतिकृतियों को प्रोत्साहित किया जाता है। डाउनस्ट्रीम सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए जैविक प्रतिकृतियों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। डेटा रिपोर्टिंग के लिए वांछित स्ट्रिंगेंसी के आधार पर, पहचान के लिए फ़िल्टर सेट करना उपयोगी हो सकता है, उदाहरण के लिए, रिपोर्ट किए जाने वाले तकनीकी या जैविक प्रतिकृतियों की कम से कम एक्स संख्या में पहचान।

प्रत्येक संवर्धन से प्रत्येक क्षालन के लिए एक उदाहरण कुल आयन क्रोमैटोग्राम (टीआईसी) पूरक चित्रा एस 1, पूरक चित्रा एस 2, और पूरक चित्रा एस 3 में देखा जा सकता है। कच्चे एमएस फ़ाइलों के डेटाबेस खोज के दौरान कड़े फिल्टर का उपयोग पीटीएम के साथ पेप्टाइड अनुक्रमों के लिए एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा की अधिक सटीक और अधिक आत्मविश्वास पहचान सुनिश्चित कर सकता है। जैसा कि प्रत्येक क्षालन के लिए टीआईसी में स्पष्ट है, पेप्टाइड नमूने संवर्धन से विभाजन के बाद भी जटिल हैं। नैनोफ्लो क्रोमैटोग्राफी एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन, उच्च-द्रव्यमान सटीकता और तेजी से स्कैनिंग मास स्पेक्ट्रोमीटर के साथ मिलकर जटिल मिश्रण का विश्लेषण करने में मदद कर सकती है, जैसे कि ट्रिप्टिक डाइजेस्ट से पेप्टाइड्स, बड़ी संवेदनशीलता और गहराई के साथ। ग्लाइकोसिलेटेड और फॉस्फोराइलेटेड स्पेक्ट्रा के लिए उदाहरण एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा चित्रा 2 में देखा जा सकता है। अच्छी तरह से एनोटेट स्पेक्ट्रा जैसे कि अग्रदूतों के समृद्ध विखंडन के परिणामस्वरूप जो डेटाबेस खोज सॉफ़्टवेयर द्वारा सौंपी गई पहचान में आत्मविश्वास बढ़ाते हैं।

चित्रा 3 प्रत्येक क्षालन अंश पर दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी स्पिन टिप संवर्धन विधि का उपयोग करके किए गए पेप्टाइड पहचान को दर्शाता है। अधिकांश ग्लाइकोपेप्टाइड्स पहले चार अंशों में एल्यूट करते हैं, जबकि अधिकांश फॉस्फोपेप्टाइड्स अंतिम तीन अंशों में एल्यूट करते हैं। अंशों के बीच विभिन्न पीटीएम का यह पृथक्करण आयनीकरण में किसी भी हस्तक्षेप को रोकने में मदद करता है जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है यदि वे कल्पित बत्ता भर में पर्याप्त रूप से अलग नहीं थे।

चित्रा 4 एक ईआरएलआईसी ग्लाइकोपेप्टाइड-केवल संवर्धन की तुलना में दोहरी टीआई विधि से ग्लाइकोप्रोटिओमिक्स परिणामों की तुलना करता है। जैसा कि चित्रा 4 ए में देखा जा सकता है, प्रोटीन, ग्लाइकोफॉर्म, पीटीएम और संशोधन साइट के स्तर पर कई पहचान दोनों तरीकों के लिए आम हैं। हालांकि, दोहरी टीआई विधि की तुलना में ईआरएलआईसी की सभी स्तरों पर अधिक विशिष्ट पहचान है। इसमें एम 6 पी (कम से कम एक फॉस्फेट समूह के साथ उच्च मैनोज ग्लाइकन) ग्लाइकोफॉर्म शामिल हैं, जिन्हें झूठी सकारात्मक पहचान को हटाने के लिए डेटा के अतिरिक्त मैनुअल क्यूरेशन की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, किसी भी विधि का उपयोग करके पहचाने गए ग्लाइकन के प्रकार समान हैं। उनकी रचनाओं के आधार पर छह श्रेणियों में बिनिंग के बाद प्रत्येक प्रकार के ग्लाइकन का अनुपात दोनों विधियों के बीच समान है16.

दोहरी टीआई विधि से फॉस्फोप्रोटिओमिक्स परिणामों की तुलना चित्रा 5 में पारंपरिक आईएमएसी फॉस्फोपेप्टाइड-केवल संवर्धन से की जाती है। दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) संवर्धन पारंपरिक आईएमएसी के समान प्रदर्शन करता है जैसा कि प्रोटीन, पेप्टाइड और पीटीएम स्तरों पर पर्याप्त ओवरलैप द्वारा दिखाया गया है। किसी भी विधि का उपयोग करते हुए, अधिकांश फॉस्फोराइलेटेड अमीनो एसिड सेरीन और थ्रेओनिन होते हैं, जिसमें लगभग 1% फॉस्फोराइलेटेड टायरोसिन की पहचान की जाती है। दोनों विधियों का उपयोग बहु-फॉस्फोराइलेटेड पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए भी किया जा सकता है।

संशोधित प्रोटीन की सूचियों को जीन में मैप किया जाता है और जीन ऑन्टोलॉजी (जीओ) संवर्धन का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है जैसा कि चित्रा 6 और चित्रा 7 में दिखाया गया है। ईआरएलआईसी और आईएमएसी का उपयोग करके पहचाने गए संशोधित प्रोटीन के लिए जीओ विश्लेषण पूरक चित्रा एस 4 और पूरक चित्रा एस 5 में दिखाया गया है। नि: शुल्क, ऑनलाइन मेटास्केप टूल संवर्धन करता है और समृद्ध मार्गों और प्रक्रियाओं के आधार पर नेटवर्क बनाता है, उन्हें समानता23 से जोड़ता है। प्रत्येक जीओ विश्लेषण के लिए नोड शर्तें पूरक तालिका एस 1, पूरक तालिका एस 2, पूरक तालिका एस 3 और पूरक तालिका एस 4 में पाई जा सकती हैं। चूंकि ग्लाइकोसिलेशन बाह्य मैट्रिक्स में एक प्रमुख प्रोटीन पीटीएम है, इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि पहचाने गए एन-ग्लाइकोप्रोटीन की सूची का उपयोग करके समृद्ध कई शब्द बाह्य मैट्रिक्स से संबंधित हैं। फॉस्फोराइलेशन सेल सिग्नलिंग में शामिल है और इसे पहचाने गए फॉस्फोप्रोटीन की सूची का उपयोग करके पाए जाने वाले कई समृद्ध शब्दों में देखा जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: एन-ग्लाइकोसिलेटेड और फॉस्फोराइलेटेड पेप्टाइड्स से एनोटेट उच्च आत्मविश्वास एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा( ए) मैनोज़ -6-फॉस्फोराइलेटेड पेप्टाइड जीएसएलएसवाईएलएन (हेक्सएनएसी (2) हेक्स (7) फॉस्फो (1)) कैथेप्सिन डी (सीएटीडी) से वीटीआर प्रतिधारण समय से 53.08-53.33 मिनट सातवें संवर्धन क्षालन से पहचाना गया। जेड पर फॉस्फोहेक्स ऑक्सोनियम आयन की उपस्थिति इस पीटीएम असाइनमेंट में आत्मविश्वास में सुधार करती है। (बी) छठे संवर्धन क्षालन से प्रतिधारण समय 32.31-32.72 मिनट से थियोरेडॉक्सिन से संबंधित ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन 1 (टीएमएक्स 1) से फॉस्फोराइलेटेड पेप्टाइड वीईईक्यूईडीवीएस (फॉस्फो) ईईईएईएसके। पेप्टाइड टुकड़ा आयनों और उनके डी-फॉस्फोराइलेटेड वेरिएंट (टुकड़ा *द्वारा निरूपित) के बीच -98 (-एच3पीओ4) तटस्थ नुकसान की उपस्थिति इस पीटीएम असाइनमेंट में आत्मविश्वास में सुधार करती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सात क्षारों में दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी संवर्धन से पेप्टाइड पहचान की तुलना। पहचान की संख्या में दो तकनीकी (इंजेक्शन) प्रतिकृतियों में से कम से कम एक में पहचाने जाने वाले पेप्टाइड्स शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: पारंपरिक ईआरएलआईसी ग्लाइकोपेप्टाइड संवर्धन की तुलना में दोहरे कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी संवर्धन से ग्लाइकोप्रोटिओमिक्स परिणामों की तुलना। (ए) संवर्धन विधियों के बीच ग्लाइकोप्रोटीन, ग्लाइकोफॉर्म (प्रोटीन, साइट, ग्लाइकन), ग्लाइकन संरचना और ग्लाइकोसाइट पहचान के वेन आरेख। (बी) संवर्धन विधियों के बीच पेप्टाइड रीढ़ की हड्डी पर पहचाने जाने वाले ग्लाइकन के पाई चार्ट। ग्लाइकन को उनकी संरचना16 के आधार पर छह समूहों में बिन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: पारंपरिक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन की तुलना में दोहरे कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी संवर्धन से फॉस्फोप्रोटिओमिक्स परिणामों की तुलना। (ए) संवर्धन विधियों के बीच फॉस्फोप्रोटीन, फॉस्फोपेप्टाइड और फॉस्फोसाइट पहचान के वेन आरेख। (बी) अमीनो एसिड अवशेषों द्वारा टूटे आत्मविश्वास से स्थानीयकृत (75% या उच्च संभावना) फॉस्फोसाइट्स के पाई चार्ट। (सी) कई फॉस्फोराइलेटेड अवशेषों द्वारा पहचाने गए फॉस्फोपेप्टाइड्स के स्टैक्ड बार प्लॉट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी संवर्धन का उपयोग करके पहचाने गए एन-ग्लाइकोप्रोटीन के जीन ओन्टोलॉजी संवर्धन। एन-ग्लाइकोप्रोटीन को जीन में वापस मैप किया जाता है और पृष्ठभूमि के रूप में जीनोम की संपूर्णता का उपयोग करके काफी समृद्ध मार्गों और प्रक्रिया शर्तों की पहचान की जाती है। विभिन्न रंगों का उपयोग शब्दों के समूहों को लेबल करने के लिए किया जाता है जो शब्द समानता से जुड़े होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: दोहरे कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी संवर्धन का उपयोग करके पहचाने गए फॉस्फोप्रोटीन के जीन ओन्टोलॉजी संवर्धन। फॉस्फोप्रोटीन को जीन में वापस मैप किया जाता है और पृष्ठभूमि के रूप में जीनोम की संपूर्णता का उपयोग करके काफी समृद्ध मार्गों और प्रक्रिया शब्दों की पहचान की जाती है। विभिन्न रंगों का उपयोग शब्दों के समूहों को लेबल करने के लिए किया जाता है, जो शब्द समानता से जुड़े होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक चित्रा एस 1: दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी (ई 7 के माध्यम से ई 1, पैनल ए-जी) संवर्धन से प्रत्येक क्षालन से कुल आयन क्रोमैटोग्राम (टीआईसी) का उदाहरण। कुल संकेत (आयन वर्तमान) 117 मिनट डेटा संग्रह अवधि में प्लॉट किया गया है। आधार शिखर की तीव्रता मूल्य एनएल द्वारा दी जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा एस 2: ईआरएलआईसी (ई 1 के माध्यम से ई 5, पैनल ए-ई) संवर्धन से प्रत्येक क्षालन से कुल आयन क्रोमैटोग्राम (टीआईसी) का उदाहरण। कुल संकेत (आयन वर्तमान) 117 मिनट डेटा संग्रह अवधि में प्लॉट किया गया है। आधार शिखर की तीव्रता मूल्य एनएल द्वारा दी जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 3: टीआई-आईएमएसी संवर्धन से क्षालन से कुल आयन क्रोमैटोग्राम (टीआईसी) का उदाहरण। कुल संकेत (आयन वर्तमान) 117 मिनट डेटा संग्रह अवधि में प्लॉट किया गया है। आधार शिखर की तीव्रता मूल्य एनएल द्वारा दी जाती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 4: ईआरएलआईसी के साथ पारंपरिक ग्लाइकोपेप्टाइड संवर्धन का उपयोग करके पहचाने जाने वाले एन-ग्लाइकोप्रोटीन के जीन ओन्टोलॉजी संवर्धन। एन-ग्लाइकोप्रोटीन को जीन में वापस मैप किया जाता है और पृष्ठभूमि के रूप में जीनोम की संपूर्णता का उपयोग करके काफी समृद्ध मार्गों और प्रक्रिया शर्तों की पहचान की जाती है। विभिन्न रंगों का उपयोग शब्दों के समूहों को लेबल करने के लिए किया जाता है, जो शब्द समानता से जुड़े होते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक चित्रा एस 5: टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी के साथ पारंपरिक फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन का उपयोग करके पहचाने गए फॉस्फोप्रोटीन के जीन ओन्टोलॉजी संवर्धन। फॉस्फोप्रोटीन को जीन में वापस मैप किया जाता है और पृष्ठभूमि के रूप में जीनोम की संपूर्णता का उपयोग करके काफी समृद्ध मार्गों और प्रक्रिया शब्दों की पहचान की जाती है। विभिन्न रंगों का उपयोग शब्दों के समूहों को लेबल करने के लिए किया जाता है, जो शब्द समानता से जुड़े होते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिकाएँ एस 1-एस 4: जीन ओन्टोलॉजी संवर्धन विश्लेषण के लिए मेटास्केप नोड जानकारी। तालिकाओं में दोहरी टीआई (तालिका एस 1 और टेबल एस 2), ईआरएलआईसी (तालिका एस 3) का उपयोग करके एन-ग्लाइकोप्रोटीन और आईएमएसी (तालिका एस 4) का उपयोग करके फॉस्फोप्रोटीन का उपयोग करके पहचाने गए एन-ग्लाइकोप्रोटीन और फॉस्फोप्रोटीन की सूचियों के लिए नोड जानकारी होती है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी रणनीति एक एकल नमूना तैयारी वर्कफ़्लो में एक ही नमूने से एन-ग्लाइकोपेप्टाइड्स और फॉस्फोपेप्टाइड्स के एक साथ विश्लेषण के लिए उपयोगी है। पीटीएम के एक साथ संवर्धन करने के लिए ईआरएलआईसी-आधारित विधियों को भी दिखाया गया है। दोनों रणनीतियों का उपयोग पहले पीटीएम विश्लेषण14,18 में गहरे कवरेज के लिए किया गया है। स्पिन युक्तियों का उपयोग करके नमूना इनक्यूबेशन समय को कम करने के लिए दोहरी टीआई विधि को अनुकूलित करने में, हम आशा करते हैं कि यह प्रोटोकॉल कम संसाधन-गहन हो गया है और इस प्रकार, अधिक व्यापक रूप से सुलभ है।

संवर्धन सामग्री की सतह पर विश्लेषण और कार्यात्मक समूहों के बीच सहक्रियात्मक बातचीत के माध्यम से कई पीटीएम का एक साथ विश्लेषण प्राप्त किया जाता है। कपास के साथ पहली पैकिंग स्पिन-टिप्स में, सेल्यूलोज24 पर हाइड्रॉक्सिल समूहों के प्रसार के कारण एचआईएलआईसी मोड में ग्लाइकोपेप्टाइड्स का प्रतिधारण बढ़ जाता है। पानी और एसिटोनाइट्राइल (एक पानी-गलत विलायक) का उपयोग करके, ग्लाइकोपेप्टाइड्स को पानी और कार्बनिक परतों के गठन के कारण बनाए रखा जाता है और अलग किया जाता है। दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) संवर्धन के लिए सामग्री फॉस्फोपेप्टाइड्स के बंधन के लिए स्थिर टीआई (चतुर्थ) उद्धरणों पर निर्भर है। सामग्री की साइड चेन के हाइड्रोफिलिक गुणों का उपयोग एचआईएलआईसी मोड में ग्लाइकोपेप्टाइड्स को बनाए रखने के लिए किया जाता है, जिन्हें जलीय सामग्री में वृद्धि के साथ अम्लीय क्षालन का उपयोग करके पहले एल्यूट किया जाता है। सामग्री को पारंपरिक आईएमएसी फॉस्फोपेप्टाइड संवर्धन बफर के साथ धोया जाता है ताकि सियालिलेटेड ग्लाइकोपेप्टाइड्स को एल्यूट किया जा सके, जिसमें अन्य तटस्थ ग्लाइकोपेप्टाइड्स की तुलना में स्थिर चरण के लिए उच्च आत्मीयता होती है। सामग्री को बुनियादी पीएच में कंडीशनिंग करने के बाद, अमोनियम हाइड्रॉक्साइड और एसीएन समाधान का उपयोग इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन को तोड़ने के लिए किया जाता है जो फॉस्फोपेप्टाइड्स को सामग्री से बंधे रखते हैं। इस बीच, घटती कार्बनिक सामग्री मोनो- और मल्टी-फॉस्फोराइलेटेड पेप्टाइड्स और एम 6 पी ग्लाइकोपेप्टाइड्स को अलग करने की अनुमति देती है।

एक ही वर्कफ़्लो में कई क्षालन चरणों का उपयोग करके पीटीएम को अलग करते समय, सीमित नमूनों से बायोमोलेक्यूलर जानकारी को अधिकतम किया जा सकता है। इस तरह के दोहरे पीटीएम विश्लेषण वर्कफ़्लो के साथ एक चेतावनी प्रत्येक संवर्धन के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में नमूने (पेप्टाइड्स के 0.5 मिलीग्राम) की आवश्यकता है जब कम से कम पांच अंश एकत्र किए जाते हैं। बहरहाल, यहां प्रस्तुत एक साथ संवर्धन रणनीति अभी भी पारंपरिक रणनीतियों की तुलना में सामग्रियों की महत्वपूर्ण बचत प्रदान करती है। संवर्धन से पहले भी, पीटीएम अखंडता सुनिश्चित करने और पीटीएम जानकारी के कृत्रिम नुकसान से बचने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम आवश्यक हैं। इनमें उपयोग में नहीं होने पर कम तापमान पर नमूनों का उचित भंडारण (आदर्श रूप से -80 डिग्री सेल्सियस), प्रोटीन निष्कर्षण के दौरान प्रोटीज और फॉस्फेट अवरोधकों का उपयोग, और हाइड्रोफिलिक पेप्टाइड क्लीनअप विधि का उपयोग, जैसे कि यहां उपयोग किए जाने वाले एचएलबी कारतूस शामिल हैं।

यह देखा गया है कि ईआरएलआईसी (पारंपरिक ग्लाइकोपेप्टाइड संवर्धन) के परिणामस्वरूप बेहतर ग्लाइकोप्रोटिओम कवरेज हुआ, जबकि फॉस्फोप्रोटिओमिक्स परिणामों में पारंपरिक टीआई-आईएमएसी द्वारा अद्वितीय पहचान में दोहरे कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -आईएमएसी को बेहतर प्रदर्शन किया गया। दोहरी टीआई संवर्धन सामग्री की तुलना में ईआरएलआईसी सामग्री की भौतिक संरचना और बढ़ी हुई हाइड्रोफिलिसिटी ईआरएलआईसी में बेहतर ग्लाइकोप्रोटिओम कवरेज में एक प्रमुख कारक है। पारंपरिक आईएमएसी में फॉस्फोप्रोटिओम की बढ़ी हुई कवरेज पहले क्षालन चरणों और धोने के चरणों के दौरान ग्लाइकोपेप्टाइड्स को हटाने से आयन दमन में कमी का परिणाम हो सकती है। एक साथ दोहरी टीआई वर्कफ़्लो का उपयोग करके कवरेज में इन मामूली कमी के बावजूद, पारंपरिक एकल पीटीएम संवर्धन के साथ महत्वपूर्ण ओवरलैप अभी भी दो के बजाय केवल एक संवर्धन वर्कफ़्लो करने के अतिरिक्त लाभ के साथ प्राप्त किया जाता है।

समय की कमी के संबंध में, ईआरएलआईसी और पारंपरिक टीआई-आईएमएसी में दोहरी टीआई वर्कफ़्लो की तुलना में कम अंश हैं। आवश्यक संसाधनों के संबंध में, ईआरएलआईसी के लिए आवश्यक आयन-विनिमय सामग्री दोहरी टीआई और पारंपरिक आईएमएसी वर्कफ़्लो के लिए आवश्यक कार्यात्मक सामग्री से सस्ती है। इन प्रोटोकॉल में, केवल एन-लिंक्ड और ओ-लिंक्ड ग्लाइकोसिलेशन का विश्लेषण नहीं किया गया था। एंजाइम पीएनजीएसई एफ का उपयोग ओ-ग्लाइकोपेप्टाइड्स की खोज करते समय प्राप्त झूठी सकारात्मक की संख्या को सीमित करने के लिए एन-ग्लाइकन को क्लीव करने के लिए किया जा सकता है (और होना चाहिए)। हालांकि, यह दिखाया गया है कि यह रणनीति ग्लाइकोपेप्टाइड संवर्धन25 के लिए एचआईएलआईसी और ईआरएलआईसी की विशिष्टता को कम करती है। प्रोटोकॉल में, कच्चे डेटा फ़ाइलों का विश्लेषण करने के लिए दो अलग-अलग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके एक रणनीति का उपयोग किया जाता है। एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर ब्योनिक को ग्लाइकोप्रोटिओमिक्स डेटा का विश्लेषण करने में स्वर्ण मानक माना जाता है। एन-ग्लाइकन संरचनाओं की विविधता के कारण, पेप्टाइड खोज स्थान बढ़ जाता है, इस प्रकार खोज समय बढ़ जाता है। फॉस्फोराइलेशन को खोज के दौरान ग्लाइकोसिलेशन के अलावा एक सामान्य पीटीएम के रूप में भी जोड़ा जा सकता है, हालांकि पेप्टाइड मल्टी-फॉस्फोराइलेशन माना जाता है या नहीं, इसके आधार पर खोज का समय आसमान छू सकता है। मैक्सक्वांट, एक ओपन-सोर्स सॉफ़्टवेयर, फॉस्फोप्रोटिओमिक्स परिणामों में एफडीआर को कम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, हालांकि जटिल ग्लाइकोसिलेशन खोज के लिए आसान नहीं है। ग्लाइकोप्रोटिओमिक डेटा26,27,28 खोजने के लिए अन्य ओपन-सोर्स विकल्प भी हैं। उपलब्ध प्रयोगात्मक लक्ष्यों और संसाधनों के आधार पर, यहां वर्णित एलसी-एमएस और डेटा विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग प्रस्तुत या संशोधित के रूप में किया जा सकता है। विधियों के आगे अनुकूलन से पीटीएम के कवरेज में सुधार होने की उम्मीद है।

पीटीएम प्रोटीन संरचना में परिवर्तन के कारण जैव रासायनिक प्रक्रियाओं में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं। यह आदर्श है कि सभी प्रोटिओमिक विश्लेषण सभी प्रोटीन पीटीएम को एक साथ ध्यान में रखते हैं। उदाहरण के लिए, सभी प्रोटीन ग्लाइकोसिलेशन के योग के महत्व को मेटा-विषमता29 कहा गया है। हालांकि, वर्तमान एमएस-आधारित प्रौद्योगिकियों के साथ कुल पीटीएम विश्लेषण का लक्ष्य अभी तक संभव नहीं है। पीटीएम-विशिष्ट संवर्धन, यानी, एचआईएलआईसी और आईएमएसी के बाद बॉटम-अप प्रोटिओमिक्स, अभी भी पीटीएम विश्लेषण के लिए स्वर्ण मानक है, हालांकि यहां वर्णित लोगों जैसे एक साथ संवर्धन रणनीतियों का उपयोग करके, जैव आणविक जानकारी को बेहतर ढंग से स्पष्ट किया जा सकता है। क्रॉस-टॉक इंटरैक्शन विभिन्न पीटीएम30,31 के बीच पाए गए हैं, जिसमें ग्लाइकोसिलेशन और फॉस्फोराइलेशन32 शामिल हैं। रोग में इस तरह की बातचीत का मात्रात्मक विश्लेषण, उदाहरण के लिए, मधुमेह और कैंसर जैसे अग्नाशयी रोगों में, रोग तंत्र की हमारी समझ को बढ़ाने में उपयोगी साबित हो सकता है। विभिन्न नमूना प्रकारों के बीच निष्कर्षण विधियों के अनुकूलन के साथ, यहां वर्णित संवर्धन प्रोटोकॉल का उपयोग जटिल जैविक मैट्रिक्स में ग्लाइकोप्रोटिओम और फॉस्फोप्रोटिओम की गहराई से प्रोफाइलिंग के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस शोध को एनआईएच (आर 01 डीके 071801, आरएफ 1 एजी 052324, पी 01 सीए 250 9 72, और आर 21 एजी 065728), और किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन (1-पीएनएफ -2016-250-एस-बी और एसआरए -2016-168-एस-बी) से अनुदान वित्त पोषण द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। यहां प्रस्तुत डेटा विस्कॉन्सिन इंस्टीट्यूट फॉर क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल रिसर्च विश्वविद्यालय के माध्यम से एनआईएच / एनसीएटीएस यूएल 1 टीआर 002373 पुरस्कार से समर्थन के माध्यम से प्राप्त किया गया था। ऑर्बिट्रेप उपकरणों को एनआईएच साझा साधन अनुदान (एनआईएच-एनसीआरआर एस 10आरआर 029531) और विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय में अनुसंधान और स्नातक शिक्षा के लिए कुलपति के कार्यालय के समर्थन के माध्यम से खरीदा गया था। हम विस्कॉन्सिन अंग और ऊतक दान संगठन विश्वविद्यालय के उदार समर्थन को भी स्वीकार करना चाहते हैं जिन्होंने अनुसंधान के लिए मानव अग्न्याशय प्रदान किया और हमारी प्रयोगशाला में नमूने प्रदान करने के लिए डैन ट्रेमेल, डॉ सारा डी सैकेट और प्रोफेसर जॉन ओडोरिको की मदद की। हमारी शोध टीम उन परिवारों को विशेष धन्यवाद देना चाहती है जिन्होंने इस अध्ययन के लिए ऊतकों को दान किया। एलएल एनआईएच अनुदान एस 10 ओडी025084, विस्कॉन्सिन कार्बोन कैंसर सेंटर (233-एएआई 9 632) विश्वविद्यालय से एक अग्न्याशय कैंसर पायलट अनुदान, साथ ही एक विलास प्रतिष्ठित उपलब्धि प्रोफेसरशिप और चार्ल्स मेलबोर्न जॉनसन प्रतिष्ठित चेयर प्रोफेसरशिप को विस्कॉन्सिन पूर्व छात्र अनुसंधान फाउंडेशन और विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय-मैडिसन स्कूल ऑफ फार्मेसी द्वारा प्रदान किए गए धन के साथ स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) Fisher Scientific A38S-500
Acetone (Certified ACS) Fisher Scientific A18-1
Acetonitrile, Optima LC/MS Grade Fisher Scientific A955-4
Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) Fisher Scientific A637-500
Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) Fisher Scientific A669-212
Byonic software Protein Metrics n/a Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/)
C18 BEH material Waters 186002353 Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet)
CAE-Ti-IMAC, 100% J&K Scientific 2749380-1G Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment
Cellcrusher kit Cellcrusher n/a Used for grinding tissue samples into powder before extraction
Eppendorf 5424R Microcentrifuge Fisher Scientific 05-401-205 For temperature-controlled centrifugation
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Sigma 11697498001
DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) Promega V3151 Protein reducing agent
Ethanol, 200 proof (100%), USP Fisher 22-032-601
Fisherbrand Analog Vortex Mixer Fisher Scientific 02-215-414
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Fisher Scientific 02-681-320
Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) Fisher Scientific 02-681-321
Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB120110 For sample lysis using ultrasonication
Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade Fisher Scientific A117-50
Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) Polymicro Technologies LLC 100 m TSP075375 For in-house pulled and packed columns with integrated emitter
Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) Sigma-Aldrich 339261-100ML Used for opening emitter of pulled capillary column
Iodoacetamide, BioUltra Sigma I1149-5G Protein reducing reagent
MaxQuant software n/a n/a Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/)
Multi-therm Shaker with heating and cooling Benchmark Scientific H5000-HC Heating block
Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk Waters 186000383 Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each)
OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips Agilent A57003100 Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions
P-2000 Micropipette Puller Sutter Instrument Co. P-2000/F For pulling nano-capillary columns for LC-MS
PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets Sigma 4906845001
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher Scientific 23275
PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) PolyLC BMSX1203 Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment
Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) Fisher Scientific P285-500
Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate Next Advance PC77-MAG For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit
Proteome Discoverer software Thermo Fisher Scientific n/a Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html)
SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 Savant n/a Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat)
SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis Fisher Scientific BP2436200
Sequencing Grade Modified Trypsin Promega V5111
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Scientific S271-500
TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 Glygen Corporation TT2EMT.96 Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) Sigma 90360-100ML
Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% Fisher Scientific 60-017-61
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) Fisher Scientific BP152-500
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5071
Urea (Certified ACS) Fisher Scientific U15-500
Water, Optima LC/MS Grade Fisher Scientific W64

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References

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जैव रसायन अंक 183 एक साथ संवर्धन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन पीटीएम ग्लाइकोपेप्टाइड्स फॉस्फोपेप्टाइड्स दोहरी कार्यात्मक टीआई (चतुर्थ) -स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी आईएमएसी इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण हाइड्रोफिलिक इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी ईआरएलआईसी मास स्पेक्ट्रोमेट्री एमएस
मानव अग्नाशय के ऊतकों से एन-ग्लाइकोपेप्टाइड्स और फॉस्फोपेप्टाइड्स के एक साथ विश्लेषण के लिए एक स्पिन-टिप संवर्धन रणनीति
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Tabang, D. N., Wang, D., Li, L. A… More

Tabang, D. N., Wang, D., Li, L. A Spin-Tip Enrichment Strategy for Simultaneous Analysis of N-Glycopeptides and Phosphopeptides from Human Pancreatic Tissues. J. Vis. Exp. (183), e63735, doi:10.3791/63735 (2022).

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