Summary
التعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) تغير هياكل البروتين ووظائفه. يمكن لطرق الإثراء المتزامن لأنواع PTM متعددة أن تزيد من التغطية في التحليلات. نقدم بروتوكولا باستخدام كروماتوغرافيا تقارب المعادن المزدوجة الوظيفية Ti(IV) المجمدة متبوعة بقياس الطيف الكتلي للإثراء والتحليل المتزامن للبروتين N-glycosylation والفسفرة في أنسجة البنكرياس.
Abstract
يمكن أن يوفر قياس الطيف الكتلي تغطية عميقة للتعديلات اللاحقة للترجمة (PTMs) ، على الرغم من أن إثراء هذه التعديلات من المصفوفات البيولوجية المعقدة غالبا ما يكون ضروريا بسبب انخفاض قياس stoichiometry مقارنة بالتحليلات غير المعدلة. معظم سير عمل إثراء PTMs على الببتيدات في سير عمل البروتينات من أسفل إلى أعلى ، حيث يتم هضم البروتينات إنزيميا قبل تحليل الببتيدات الناتجة ، يثري نوعا واحدا فقط من التعديل. ومع ذلك ، فإن المكمل الكامل ل PTMs هو الذي يؤدي إلى وظائف بيولوجية ، وقد يؤدي إثراء نوع واحد من PTM إلى مثل هذا الحديث المتبادل ل PTMs. وقد لوحظ PTM crosstalk بين غليكوزيل البروتين والفسفرة ، وهما PTMs الأكثر شيوعا في البروتينات البشرية وأيضا PTMs الأكثر دراسة باستخدام سير عمل قياس الطيف الكتلي. باستخدام استراتيجية التخصيب المتزامنة الموصوفة هنا ، يتم إثراء كل من PTMs من أنسجة البنكرياس البشرية بعد الوفاة ، وهي مصفوفة بيولوجية معقدة. يتم استخدام كروماتوغرافيا التقارب المعدني المزدوج الوظيفية Ti(IV) المجمدة لفصل أشكال مختلفة من الجليكوزيل والفسفرة في وقت واحد في كسور متعددة بطريقة مريحة تعتمد على طرف الدوران ، مما يسمح بإجراء تحليلات نهائية لتفاعلات PTM المتقاطعة المحتملة. يمكن تطبيق سير عمل التخصيب هذا للجليكو والفوسفوببتيدات على أنواع مختلفة من العينات لتحقيق التنميط العميق لأجهزة PTMs المتعددة وتحديد الجزيئات المستهدفة المحتملة للدراسات المستقبلية.
Introduction
تلعب تعديلات البروتين بعد الترجمة (PTMs) دورا رئيسيا في تعديل هياكل البروتين وبالتالي وظائفها وعملياتها البيولوجية النهائية. يزداد تنوع البروتيوم البشري بشكل كبير بسبب التباين التوافقي الذي توفره PTMs المختلفة. أصبحت دراسة التنوع البروتيني في الصحة والمرض مجالا للبحث ذا أهمية كبيرة في السنوات الأخيرة 2,3.
أصبحت دراسة النماذج البروتينية وبشكل أكثر تحديدا PTMs ذات العمق الكبير أكثر سهولة من خلال تطوير طرق البروتينات القائمة على قياس الطيف الكتلي (MS). باستخدام MS ، يتم تأين التحليلات وتجزئتها وتحديدها بناء على m / z من الشظايا. غالبا ما تكون طرق التخصيب ضرورية بسبب انخفاض الوفرة النسبية ل PTMs مقارنة بأشكال البروتينات غير المعدلة. على الرغم من أن تحليل البروتينات السليمة و PTMs الخاصة بها ، والتي تسمى التحليلات من أعلى إلى أسفل ، أصبحت أكثر روتينية ، إلا أن الهضم الأنزيمي للبروتينات وتحليل الببتيدات المكونة لها في التحليلات من أسفل إلى أعلى لا يزال هو الطريق الأكثر استخداما على نطاق واسع لتحليل PTM. الاثنان الأكثر دراسة على نطاق واسع PTMs ، واثنين من PTMs الأكثر شيوعا في الجسم الحي ، هما glycosylation و phosphorylation4. يلعب هذان الجهازان أدوارا رئيسية في إشارات الخلايا والتعرف عليها ، وبالتالي فهي تعديلات مهمة للتوصيف في أبحاث الأمراض.
غالبا ما توفر الخواص الكيميائية لمختلف PTMs طرقا نحو إثراء هذه PTMs على مستويات البروتين والببتيد قبل التحليل. Glycosylation هو PTM محب للماء بسبب وفرة مجموعات الهيدروكسيل على كل السكريات الأحادية. يمكن استخدام هذه الخاصية لإثراء الجليكوببتيدات في كروماتوغرافيا التفاعل المحب للماء (HILIC) ، والتي يمكن أن تفصل المزيد من الببتيدات المحبة للماء عن الببتيدات غير المعدلة الكارهة للماء5. يضيف الفسفرة مويتي الفوسفات ، الذي يكون مشحونا سالبا إلا عند درجة الحموضة الحمضية. بسبب هذه الشحنة ، يمكن استخدام العديد من الكاتيونات المعدنية ، بما في ذلك التيتانيوم ، لجذب وربط الببتيدات الفوسفورية بينما يتم غسل الأنواع غير المفسفرة. هذا هو مبدأ كروماتوغرافيا تقارب المعادن المجمدة (IMAC). يمكن العثور على مزيد من المناقشات حول هذه الاستراتيجيات وغيرها من استراتيجيات التخصيب للغليكوزيل والفسفرة في المراجعات الأخيرة 6,7.
غالبا ما تكون هناك حاجة إلى كميات كبيرة نسبيا من مواد الببتيد الأولية (0.5 ملغ أو أكثر) لبروتوكولات التخصيب بسبب انخفاض قياس stoichiometry من PTMs على الببتيدات. في السيناريوهات التي قد لا يكون من السهل فيها الحصول على هذه الكمية من العينة، مثل خزعة الورم الأساسية أو تحليلات السائل الدماغي الشوكي، من المفيد استخدام سير العمل السهل الذي ينتج عنه أقصى قدر من المعلومات الجزيئية الحيوية. وقد أبرزت الاستراتيجيات الحديثة التي طورها مختبرنا وغيره التحليل المتزامن والمتوازي للغليكوزيل والفسفرة باستخدام نفس سير عمل إثراء PTM8،9،10،11،12. على الرغم من أن الخصائص الكيميائية لهذين ال PTMs قد تختلف ، إلا أنه يمكن تحليل هذه PTMs في خطوات متعددة بسبب تقنيات الفصل المبتكرة والمواد المستخدمة. على سبيل المثال، تتراكب كروماتوغرافيا التفاعل الكهروستاتيكي المحب للماء (ERLIC) على أساس التفاعلات المحبة للماء بين التحليلات والطور المتنقل مع تفاعلات الشحنة الشحنة بين التحليلات ومادة الطور الثابت13،14،15،16. في درجة الحموضة الحمضية ، يمكن أن يؤدي جذب الببتيدات المفسفرة إلى المرحلة الثابتة إلى تحسين الاحتفاظ بها وفصلها عن الببتيدات غير المعدلة. يمكن استخدام المواد التي تتكون من Ti (IV) المجمدة على المجهرية المحبة للماء للتخليق القائم على HILIC و IMAC لفصل الببتيدات الفوسفاتية والغليكوببتيدات المحايدة والحمضية و mannose-6-phosphorylated17,18. تعرف هذه الاستراتيجية باسم Ti(IV)-IMAC ثنائي الوظائف. يمكن أن يؤدي استخدام هذه الاستراتيجيات لإثراء PTMs متعددة في سير عمل واحد إلى جعل تحليلات تفاعلات PTM المحتملة أكثر سهولة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن إجمالي كمية العينة ومتطلبات الوقت أقل من طرق التخصيب التقليدية عند تنفيذها بالتوازي (أي HILIC و IMAC على حصص عينة منفصلة).
لإثبات استراتيجية Ti(IV)-IMAC ثنائية الوظيفة للتحليل المتزامن للغليكوزيل البروتيني والفسفرة ، قمنا بتطبيقها لتحليل أنسجة البنكرياس البشرية بعد الوفاة. ينتج البنكرياس كلا من الإنزيمات الهضمية والهرمونات التنظيمية، بما في ذلك الأنسولين والجلوكاجون. تضعف وظيفة البنكرياس في مرض البنكرياس. في مرض السكري ، يتأثر تنظيم نسبة السكر في الدم ، مما يؤدي إلى ارتفاع مستويات الجلوكوز في الدم. في التهاب البنكرياس ، ينتج الالتهاب عن الهضم التلقائي للعضو3. قد تؤدي التغييرات في ملامح PTM ، بما في ذلك الغليكوزيل والفسفرة ، كما هو الحال في كثير من الأحيان ، إلى أمراض أخرى.
هنا ، نصف بروتوكولا لطريقة التخصيب المتزامن القائمة على طرف الدوران ، استنادا إلى استراتيجية Ti(IV)-IMAC ثنائية الوظيفة ، ل N-glycopeptides و phosphopeptides المشتقة من البروتينات المستخرجة من أنسجة البنكرياس. ويشمل البروتوكول استخراج البروتين وهضمه، والتخصيب، وجمع بيانات التصلب المتعدد، ومعالجة البيانات، كما يتضح من الشكل 1. تتوفر البيانات التمثيلية من هذه الدراسة عبر اتحاد ProteomeXchange مع المعرف PXD033065.
الشكل 1: سير العمل للتحليل المتزامن ل N-glycopeptides و phosphopeptides من أنسجة البنكرياس البشرية. يتم أولا سحق الأنسجة بالتبريد إلى مسحوق ناعم قبل استخراج البروتين باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم المنظفة (SDS). ثم تخضع البروتينات للهضم الإنزيمي. يتم اقتباس الببتيدات الناتجة قبل التخصيب باستخدام Ti(IV)-IMAC ثنائي الوظائف. يتم جمع البيانات الخام باستخدام كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي النانوي - قياس الطيف الكتلي (nRPLC-MS) ويتم تحليلها باستخدام برنامج البحث في قواعد البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يهدف هذا البروتوكول إلى جعل تحليلات PTM أكثر سهولة وتمكين تحليل أكثر انتشارا ل PTMs متعددة في نفس سير العمل. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على المصفوفات البيولوجية المعقدة الأخرى ، بما في ذلك الخلايا والسوائل الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتم الحصول على الموافقة على استخدام أنسجة البنكرياس لأغراض البحث من أقرب أقرباء المتوفى، وتم الحصول على إذن من مجلس المراجعة المؤسسية للعلوم الصحية بجامعة ويسكونسن ماديسون. الرقابة على IRB ليست مطلوبة لأنها لا تشمل البشر على النحو المعترف به في 45 CFR 46.102 (و).
تحذير: يجب توخي الحذر عند التعامل مع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول ، والتي تشمل الأحماض (الفورميك ، الخليك ، ثلاثي فلورو أسيتيك) ، والقواعد (هيدروكسيد الأمونيوم) ، والمبردات (النيتروجين السائل). اقرأ أوراق بيانات السلامة الخاصة بالكواشف المستخدمة للتعرف على المخاطر المرتبطة بها والاحتياطات اللازمة. التركيزات التي يشار إليها باستخدام النسب المئوية هي الحجم / الحجم الكلي (v / v) ويتم تخفيفها بالماء.
1. سحق الأنسجة بالتبريد ، والتحلل ، واستخراج البروتين
- املأ ديوار بالنيتروجين السائل. قم بتبريد أجزاء مطحن الأنسجة التي ستلامس أنسجة البنكرياس مسبقا ، وهي الغرفة والطاحن وملعقة الاسترداد في حاوية البوليسترين.
- انقل قطع الأنسجة المجمدة إلى حامل العينة المبرد مسبقا وأضف ملعقة من النيتروجين السائل إلى الأنسجة.
- ضع الساحق في الغرفة واضربه باستخدام مطرقة خمس إلى عشر مرات لسحق العينة. قم بإزالة الطاحن من الغرفة وكشط مسحوق الأنسجة الملتصقة والقطع.
- أضف ملعقة من النيتروجين السائل إلى الغرفة إذا بدأت الأنسجة في الذوبان. كرر عملية السحق حتى تصبح العينة مسحوقا ناعما بدون قطع كبيرة من الأنسجة. قسم العينات إلى ما يقرب من 100 ملغ أليكوتس في أنابيب مبردة مسبقا.
- قم بإعداد مخزن مؤقت للتحلل يحتوي على 4٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، و 150 mM NaCl ، و 25 mM Tris (الرقم الهيدروجيني = 7.4). قم بإذابة قرص واحد لكل من مثبطات البروتياز والفوسفاتيز في 500 ميكرولتر من الماء للحصول على مخزون 20x من كل منهما. أضف الحجم المطلوب من مخزون 20x لكل مثبط إلى المخزن المؤقت للتحلل للحصول على تركيز نهائي 1x.
- أضف 600 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل لكل 100 ملغ من الأنسجة إلى الأنبوب واحتضنه عند 95 درجة مئوية في كتلة تسخين لمدة 10 دقائق مع الاهتزاز عند 800 دورة في الدقيقة. قم بإزالة العينات من كتلة التسخين واتركها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
- قم بضبط العينات بطاقة 60 واط (20 كيلو هرتز) لمدة 45 ثانية باستخدام نبضات 15 ثانية مع سكون 30 ثانية بينهما. حبيبات العينات عند 3000 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- أضف supernatant إلى مذيب هطول الأمطار 5x ، و 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل إلى 1.5 مل من مذيب هطول الأمطار ، الذي يحتوي على 50٪ من الأسيتون ، و 49.9٪ من الإيثانول ، و 0.1٪ من حمض الخليك. تبرد طوال الليل عند -20 درجة مئوية.
- قم بتكوير العينات مرة أخرى عند 3000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وإزالة supernatant. اغسل الكريات عن طريق التفتيت باستخدام ملعقة والخلط مع نفس الكمية من مذيب هطول الأمطار. بيليه مرة أخرى ، وتكرار خطوة الغسيل 2x.
- حبيبات العينة عند 16000 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. جفف حبيبات العينة بالهواء في غطاء دخان لمدة 15 دقيقة وخزنها عند -80 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للمتابعة.
2. هضم البروتين وتحلية المياه
- أعد تعليق بيليه البروتين في 300 ميكرولتر من مخزن الهضم الطازج الذي يحتوي على 50 ملليمتر من بيكربونات ثلاثي إيثيلامونيوم (TEAB) و 8 م يوريا.
- تقدير تركيز البروتين في المحلول باستخدام فحص البروتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- إلى البروتين الموجود في المحلول ، أضف ثنائي ثيوثريتول (DTT) إلى تركيز نهائي قدره 5 ملليمتر ، واخلطه ، وقلله في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. ثم ، أضف يودواسيتاميد (IAA) إلى تركيز نهائي قدره 15 مللي متر ، واخلطه ، وألكيل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام. قم بإخماد الألكلة عن طريق تكرار إضافة DTT في نفس الحجم كما كان من قبل واخلطها.
- أضف LysC / trypsin عند 1:100 إنزيم: نسبة البروتين واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. ثم ، أضف 50 mM TEAB لتخفيف اليوريا 8 M المستخدمة < 1 M. أضف التربسين عند 1:100 نسبة الإنزيم: البروتين واحتضنها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- إخماد عملية الهضم بإضافة حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) إلى 0.3٪ v / v. لكل 1 ملغ من بروتين البدء ، قم بتكييف خرطوشة تحلية المياه (1 سم مكعب ، 10 ملغ) مع 1 مل من الأسيتونيتريل (ACN) و 3x مع 1 مل من 0.1٪ TFA.
- قم بتحميل الخليط المهضوم على خرطوشة إزالة الملح. اغسل الخليط 3x باستخدام 1 مل من 0.1٪ TFA. إذا كان الاستخلاص بطيئا ، فقم بتطبيق ضغط إيجابي ولكن تجنب معدل التدفق > قطرة واحدة في الثانية.
- الببتيدات الحلوة باستخدام 1 مل من 60٪ ACN و 0.1٪ محلول حمض الفورميك (FA). جفف الببتيدات المطفأة عند حوالي 35 درجة مئوية باستخدام مكثف فراغ الطرد المركزي حتى يتبخر المذيب تماما.
- إعادة تعليق الببتيدات في 300 ميكرولتر من الماء وتقدير تركيزات الببتيد باستخدام فحص الببتيد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. قسم الببتيدات إلى 500 ميكروغرام من الأليكوت وجففها تماما.
3. ERLIC N-غليكوببتيد التخصيب
ملاحظة: قد تختلف سرعات أجهزة الطرد المركزي وأوقاتها بدقة بناء على العينات ويجب تحسينها. بشكل عام ، 300 × g لمدة 2 دقيقة مناسب لتكييف وغسل المواد و 100 × g لمدة 5 دقائق للتخلي.
- يزن حوالي 3 ملغ من الصوف القطني ويعبئه في طرف ماصة فارغ 200 ميكرولتر (طرف الدوران ؛ انظر جدول المواد).
- انقل مواد إثراء قوية لتبادل الأنيون إلى أنبوب وأضف 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA لكل مادة 10 ملغ. لتخصيب 500 ميكروغرام من الببتيدات ، استخدم 15 ملغ من المادة. قم بتنشيط المادة عن طريق الاهتزاز لمدة 15 دقيقة.
- باستخدام محول أنبوب ، ضع طرف الدوران فوق أنبوب 2 مل وأضف ما يكفي من الطين إلى الطرف للحصول على 15 ملغ من المادة. قم بإزالة السائل عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
- قم بتكييف المادة عن طريق الطرد المركزي 3x مع 200 ميكرولتر من ACN. كرر التكييف الثلاثي باستخدام أسيتات الأمونيوم 100 mM (NH4Ac) ، و 1٪ TFA ، و 80٪ ACN / 0.1٪ TFA (مخزن مؤقت للتحميل).
- أعد تعليق عينات الببتيد 500 ميكروغرام في حوالي 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحميل والتدفق عبر طرف الدوران. أعد تحميل التدفق من خلال 2x لضمان الربط الكامل.
- اغسل المادة عن طريق الطرد المركزي 5x باستخدام 200 ميكرولتر من 80٪ ACN / 0.1٪ TFA ، ثم 2x باستخدام 200 ميكرولتر من 80٪ ACN / 0.1٪ FA.
- قم بالتخلص من الببتيدات عن طريق الطرد المركزي باستخدام 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 50٪ ACN / 0.1٪ FA (E1) ؛ 0.1٪ FA (E2) ؛ 0.1٪ TFA (E3) ؛ 300 mM KH2PO4 ، 10٪ ACN (E4).
- اغسل المادة عن طريق الطرد المركزي 2x مع 200 ميكرولتر من 80٪ ACN / 5٪ NH4OH. قم بتمييع الببتيدات المتبقية مع 200 ميكرولتر من 10٪ NH4OH (E5).
- جفف جميع الفتحات تماما باستخدام مكثف فراغ الطرد المركزي عند حوالي 35 درجة مئوية.
- قم بإجراء تحلية المحلول الأساسي (E5) باستخدام طرف تحلية المياه وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- جفف الاستخلاص من طرف التحلية باستخدام مكثف فراغ الطرد المركزي عند حوالي 35 درجة مئوية حتى اكتماله.
4. Ti(IV)-IMAC إثراء الفوسفوببتيد
ملاحظة: قد تختلف سرعات أجهزة الطرد المركزي وأوقاتها بدقة بناء على العينات ويجب تحسينها. بشكل عام ، 300 × g لمدة 2 دقيقة مناسب لتكييف وغسل المواد و 100 × g لمدة 5 دقائق للتخلي.
- يزن حوالي 3 ملغ من الصوف القطني ويعبئه في طرف ماصة فارغ 200 ميكرولتر (طرف مغزل).
- نقل مواد إثراء الفوسفوببتيد Ti-IMAC إلى أنبوب وإضافة 200 ميكرولتر من 0.1٪ TFA لكل 10 ملغ من المواد. لتخصيب 500 ميكروغرام من الببتيدات ، استخدم 10 ملغ من المواد.
- باستخدام محول أنبوبي ، ضع طرف الدوران فوق أنبوب 2 مل وأضف ما يكفي من الطين إلى الطرف للحصول على مادة 10 ملغ. قم بإزالة السائل عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي على الطاولة.
- قم بتكييف المادة ب 200 ميكرولتر من 40٪ ACN / 3٪ TFA باستخدام نفس إعدادات أجهزة الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه. أعد تعليق عينات الببتيد في 200 ميكرولتر من 40٪ ACN / 3٪ TFA وتتدفق عبر طرف الدوران. أعد تحميل التدفق مرتين لضمان ربط أكثر اكتمالا.
- اغسل المادة عن طريق الطرد المركزي باستخدام محلول ACN بنسبة 200 ميكرولتر من 50٪ ACN و 6٪ TFA و 200 mM NaCl ، يليه غسل 2x في 200 ميكرولتر من 30٪ ACN و 0.1٪ من محلول TFA.
- الببتيدات الحلوة مع 200 ميكرولتر من 10 ٪ NH4OH. تجفيف الاستخلاص تماما تحت فراغ. قم بإجراء تحلية المياه باستخدام طرف تحلية المياه وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. جفف الاستخلاص من طرف التحلية تحت الفراغ حتى اكتماله.
5. التخصيب المزدوج الوظائف Ti (IV) في وقت واحد
ملاحظة: قد تختلف سرعات أجهزة الطرد المركزي وأوقاتها بدقة بناء على العينات ويجب تحسينها. بشكل عام ، 300 × g لمدة 2 دقيقة مناسب لتكييف وغسل المواد و 100 × g لمدة 5 دقائق للتخلي.
- يزن حوالي 3 ملغ من الصوف القطني ويعبئه في طرف دوار فارغ.
- نقل ما يقرب من 1 غرام من مادة Ti(IV)-IMAC إلى أنبوب. أضف 0.1٪ TFA إلى تركيز معروف من المواد ، على سبيل المثال ، 20 ملغ / 200 ميكرولتر (يمكن تخزين المواد في هذا التعليق عند 4 درجات مئوية).
- للتخصيب من الببتيدات 500 ميكروغرام ، أضف ما يكفي من الطين إلى طرف دوار لنقل 20 ملغ من المواد. اغسل طرف الدوران عن طريق الطرد المركزي باستخدام 200 ميكرولتر بنسبة 0.1٪ TFA.
- أعد تعليق العينات في 200 ميكرولتر من مذيب التحميل / الغسيل (80٪ ACN و 3٪ TFA) والتدفق عبر طرف الدوران. أعد تحميل التدفق من خلال 2x.
- اغسل طرف الدوران 6x عن طريق الطرد المركزي باستخدام 200 ميكرولتر من مذيب التحميل / الغسيل. اغسل طرف الدوران بمحلول FA بنسبة 200 ميكرولتر من 80٪ ACN / 0.1٪ FA.
- قم بتخلص الببتيدات ب 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 60٪ ACN / 0.1٪ FA (E1) و 40٪ ACN / 0.1٪ FA (E2). تحليل كل عملية إزالة على حدة.
- قم بالتخلص من الببتيدات مع 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 20٪ ACN / 0.1٪ FA و 0.1٪ FA. اجمع بين الخروجين وتحليلهما كعينة واحدة (E3).
- تخلص من الببتيدات مع 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 40 ٪ ACN / 3 ٪ TFA ؛ 50٪ ACN / 6٪ TFA ، 200 mM كلوريد الصوديوم ؛ و 30٪ ACN / 0.1٪ TFA. الجمع بين هذه الاستهلالات وتحليلها كواحد (E4) بعد تحلية المياه باستخدام طرف معبأ.
- قم بتكييف المادة إلى درجة الحموضة الأساسية باستخدام 200 ميكرولتر من 90٪ ACN / 2.5٪ NH4OH لمدة 3x. تخلص من هذه الغسيلات.
- قم بتمييع الببتيدات مع 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 60٪ ACN / 10٪ NH 4 OH (E5) و 40٪ ACN / 10٪ NH4OH (E6). قم بتحليل هذه التخفيضات بشكل منفصل بعد تحلية المياه باستخدام طرف معبأ.
- قم بتمييع الببتيدات مع 200 ميكرولتر من كل مما يلي: 20٪ ACN / 10٪ NH4OH. 10٪ ACN / 10٪ NH4OH; و 10٪ NH4OH. اجمع بين هذه التخدير وقم بتحليلها كواحدة (E7) بعد تحلية المياه باستخدام طرف معبأ.
- تجفيف جميع الاستخلاصات تماما تحت فراغ.
6. كروماتوغرافيا السائل ذات التدفق النانوي المعكوس - قياس الطيف الكتلي (nRPLC-MS)
ملاحظة: طرق الحصول على بيانات MS وتحليلها متنوعة، وبالتالي يتم وصف خط أنابيب LC-MS مقترح واحد فقط (والمعلمات المرتبطة به) هنا في الخطوات التالية. يمكن تحليل العينات التي تم إنشاؤها باستخدام خطوات إعداد العينات وإثرائها المحددة سابقا باستخدام إعدادات مفيدة أخرى ، بما في ذلك استخدام أعمدة كروماتوغرافية متاحة تجاريا ، مع توفير جودة بيانات كافية.
- اسحب وعبئ شعيرة شعرية بطول 15 سم (قطر داخلي 75 ميكرومتر) باستخدام مادة C18 كما هو موضح في19. إعداد المرحلة المتنقلة A (0.1٪ FA في الماء) والمرحلة المتنقلة B (0.1٪ FA في ACN).
- إعادة تشكيل عينات الببتيد المخصب في 15 ميكرولتر من المرحلة المتنقلة 3٪ B. تحميل 2 ميكرولتر من العينة (~ 13٪ حجم العينة) مباشرة على العمود. تحليل كل عينة في نسخة فنية مكررة.
- الببتيدات الملوية باستخدام تدرج من 3٪ إلى 30٪ المرحلة المتنقلة B على مدى 90 دقيقة بمعدل تدفق 0.3 ميكرولتر / دقيقة. اغسل العمود باستخدام 75٪ B لمدة 8 دقائق متبوعا بنسبة 95٪ B لمدة 8 دقائق ، وأنهى الطريقة بتوازن عند 3٪ B لمدة 12 دقيقة.
- تشغيل مطياف الكتلة في وضع الأيونات الموجبة باستخدام الحصول المعتمد على البيانات لأعلى 20 قمة مع المعلمات التالية: جهد الرش 2 كيلو فولت ؛ الكشف عن MS 1 في LC / MS من 400-2000 م / z بدقة 120000 ، هدف التحكم التلقائي في الكسب 2E5 (AGC) ، 100 مللي ثانية الحد الأقصى لوقت الحقن ، عدسة RF 30٪ ، عزل رباعي مع نافذة1.6 م / z ، لحالات الشحن 2-8 وغير محددة ، واستبعاد ديناميكي 30 ثانية ؛ اكتشاف MS 2 في LC / MS باستخدام تجزئة HCD المتدرجة بنسبة 22٪ و 30٪ و 38٪ ، والكتلة الأولى الثابتة 120 م / z بدقة 30000 ، وهدف 5E4 AGC ، ومتطلبات الحد الأدنى للكثافة 2.5E4.
7. تحليل بيانات التصلب المتعدد
ملاحظة: يتم عرض خط أنابيب واحد لتحليل البيانات باستخدام برنامجين مختلفين لتحليل نفس مجموعة البيانات هنا. يمكن البحث عن الفسفرة والغليكوزيل في نفس الوقت باستخدام برنامج واحد بدلا من برنامجين منفصلين كما هو موضح هنا ، على الرغم من أن وقت البحث عن البرامج يتناسب بشكل عام مع مساحة البحث ، أي عدد PTMs التي تم النظر فيها. لهذا السبب ، يتم استخدام برنامجين مختلفين بالتوازي مع البحث عن glycopeptides و phosphopeptides.
- معالجة ملفات البيانات الخام باستخدام البرنامج المناسب (انظر جدول المواد).
- ابحث في الأطياف مقابل قاعدة بيانات UniProt البشرية (أو الأنواع المناسبة الخاصة). تعيين كارباميدوميثيل من Cys كتعديل ثابت. اضبط الحد الأقصى لعدد الانقسامات الأنزيمية المفقودة على أنه اثنان.
- في ملفات البيانات الخام ، باستخدام برنامج تجاري (انظر جدول المواد) ، ابحث عن glycopeptides ليتم تحليلها20. استخدم تسامحا مع كتلة السلائف بمقدار 10 أجزاء في المليون وتسامحا مع كتلة شظايا 0.01 Da مع الحد الأدنى لطول الببتيد من أربعة بقايا.
- تم توسيع البحث باستخدام قاعدة بيانات N-glycan المضمنة في البرنامج باستخدام جليكان mannose-6-phosphate (M6P) النموذجي ، بما في ذلك HexNAc (2) Hex (4-9) Phospho (1-2) و HexNAc (3-4) Hex (4-9) Phospho (1-2) و HexNAc (2) Hex (3-4) Phospho (1) و HexNAc (3) Hex (3-4) Phospho (1).
- تعيين N-glycosylation كتعديل شائع. قم بتعيين الحد الأقصى للتعديلات الإجمالية لكل مطابقة طيفية للببتيد (PSM) كواحد شائع واثنين نادرين.
- قم بتعيين التعديلات المتغيرة التالية: أكسدة Met (نادرة) ، وإزالة الاستئصال في Asn و Gln (نادرة) ، والفسفرة في Ser و Thr و Tyr (شائعة). قم بتعيين عوامل تصفية التعريف التالية: قطع النتيجة > 150 ، |log prob| > 1 ، ودرجة دلتا وزارة الدفاع > 10.
- تصدير نتائج البحث وتحليلها في علامتي التبويب مجموعة البروتينات والببتيدات.
- فحص الهويات التي تحتوي على جليكان M6P يدويا لوجود أيون الأوكسونيوم PhosphoHex (243 m/z) في أطياف MS/MS وإزالة الهويات الإيجابية الخاطئة، التي لا تحتوي على هذا الأيون التشخيصي.
- في ملفات البيانات الخام ، باستخدام برنامج مفتوح المصدر (انظر جدول المواد) ، ابحث عن الببتيدات الفوسفاتية المراد تحليلها21. استخدم تسامحا مع ببتيد البحث الأول بمقدار 20 صفحة في الدقيقة وتسامحا مع ببتيد البحث الرئيسي بسرعة 4.5 جزء في المليون.
- اضبط الحد الأقصى لعدد التعديلات لكل ببتيد على 5. اضبط PSM ومعدل اكتشاف البروتين الخاطئ (FDR) على 1٪ والحد الأدنى لطول الببتيد إلى 7 بقايا.
- قم بتعيين تعديلات متغيرة مثل الأكسدة في Met ، و N-terminal protein acetylation ، والفسفرة في Ser و THR و Tyr. تحليل نتائج البحث باستخدام ملفات التعديلSpecificPeptides.
- تحديد عدد تحديدات PTMs على مستويات البروتين والببتيد وموقع التعديل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إيداع بيانات قياس الطيف الكتلي التمثيلية ، بما في ذلك الملفات الخام ونتائج البحث ، في اتحاد ProteomeXchange عبر مستودع شريك PRIDE مع معرف مجموعة البيانات PXD03306522.
في هذا العمل ، تم تحليل نسخ الحقن المكررة لكل عملية إثراء. وتم في التحليل النهائي تجميع الهويات التي تم إجراؤها من كلا النسختين التقنيتين. ونظرا للطبيعة شبه العشوائية للاقتناء المعتمد على البيانات في اختيار سلائف الببتيد لتجزئة التصلب المتعدد والتصلب المتعدد، يتوقع حدوث تداخل في تحديد الهوية يتراوح بين 70 في المائة و 80 في المائة بين التكرارات التقنية. في التطبيقات التي تستخدم هذه الأساليب ، يتم تشجيع نسختين متماثلتين تقنيتين على الأقل. وبالنسبة للتحليلات الإحصائية النهائية، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار التكرارات البيولوجية لمختلف الظروف التجريبية. واعتمادا على الصرامة المطلوبة للإبلاغ عن البيانات، قد يكون من المفيد تعيين مرشحات لتحديد الهوية، مثل تحديد الهوية في عدد × على الأقل من النسخ المتماثلة التقنية أو البيولوجية التي يتعين الإبلاغ عنها.
ويمكن رؤية مثال على مخطط كروماتوغرام الأيونات الكلي (TIC) لكل عملية إزالة من كل إثراء في الشكل التكميلي S1 والشكل التكميلي S2 والشكل التكميلي S3. يمكن أن يضمن استخدام مرشحات صارمة أثناء البحث في قاعدة البيانات لملفات MS الخام تحديد أطياف MS / MS بشكل أكثر دقة وثقة لتسلسل الببتيد باستخدام PTMs. وكما هو واضح في TICs لكل عملية استخفاف، لا تزال عينات الببتيد معقدة حتى بعد التجزئة من التخصيب. يمكن أن يساعد كروماتوغرافيا التدفق النانوي المقترنة بدقة عالية ودقة عالية الكتلة ومطياف الكتلة سريع المسح في تحليل المخاليط المعقدة ، مثل الببتيدات من هضم التربتيك ، بحساسية وعمق كبيرين. ويمكن رؤية مثال على أطياف MS/MS لأطياف الغليكوزيلات والمفسفرة في الشكل 2. وتنجم الأطياف المشروحة جيدا مثل هذه الأطياف عن تجزئة غنية للسلائف تزيد من الثقة في تحديد الهوية على النحو الذي حددته برامجيات البحث في قاعدة البيانات.
يوضح الشكل 3 تحديدات الببتيد التي تم إجراؤها باستخدام طريقة إثراء الطرف المغزلي Ti(IV)-IMAC ثنائية الوظيفة على كل جزء من أجزاء الاستخراج. غالبية الببتيدات السكرية تتلاشى في الكسور الأربعة الأولى، في حين أن غالبية الببتيدات الفوسفوببتيدات تعود في الكسور الثلاثة الأخيرة. يساعد هذا الفصل بين PTMs المختلفة بين الكسور على منع أي تدخل في التأين قد ينتج إذا لم يتم فصلها بشكل كاف عبر الاستواءات.
ويقارن الشكل 4 نتائج الغليكوبروتيوميكس من طريقة Ti المزدوجة مقارنة بتخصيب غليكوببتيد ERLIC فقط. كما يتضح من الشكل 4A ، فإن العديد من الهويات على مستويات البروتين و glycoform و PTM وموقع التعديل شائعة في كلتا الطريقتين. ومع ذلك ، فإن ERLIC لديها المزيد من الهويات الفريدة على جميع المستويات مقارنة بطريقة Ti المزدوجة. ويشمل ذلك M6P (جليكان مانوز مرتفع مع مجموعة فوسفات واحدة على الأقل) جليكوفورمات ، والتي تتطلب تنظيما يدويا إضافيا للبيانات لإزالة الهويات الإيجابية الخاطئة. علاوة على ذلك ، فإن أنواع الجليكان المحددة باستخدام أي من الطريقتين متشابهة. نسب كل نوع من أنواع الجليكان بعد الربط في ست فئات بناء على تركيباتها متشابهة بين كلتا الطريقتين16.
تتم مقارنة نتائج البروتيوميات الفوسفاتية الناتجة عن طريقة Ti المزدوجة بالتخصيب التقليدي للفوسفوببتيد IMAC فقط في الشكل 5. يعمل التخصيب المزدوج الوظائف Ti(IV) بشكل مشابه ل IMAC التقليدي كما يتضح من التداخل الكبير في مستويات البروتين والببتيد و PTM. باستخدام أي من الطريقتين ، فإن غالبية الأحماض الأمينية المفسفرة هي سيرين وثريونين ، مع تحديد حوالي 1٪ من التيروزين المفسفر. يمكن أيضا استخدام كلتا الطريقتين لتحديد الببتيدات متعددة الفوسفوريلات.
يتم تعيين قوائم البروتينات المعدلة إلى الجينات وتحليلها باستخدام إثراء أنطولوجيا الجينات (GO) كما هو موضح في الشكل 6 والشكل 7. وترد تحليلات GO للبروتينات المعدلة المحددة باستخدام ERLIC و IMAC في الشكل التكميلي S4 والشكل التكميلي S5. تقوم أداة Metascape المجانية عبر الإنترنت بإجراء الإثراء وإنشاء شبكات تستند إلى مسارات وعمليات غنية ، وربطها بالتشابه23. ويمكن الاطلاع على مصطلحات العقدة لكل تحليل من تحليلات GO في الجدول التكميلي S1 والجدول التكميلي S2 والجدول التكميلي S3 والجدول التكميلي S4. نظرا لأن الغليكوزيل هو بروتين رئيسي PTM في المصفوفة خارج الخلية ، فليس من المستغرب أن ترتبط عدة مصطلحات تم إثراؤها باستخدام قائمة البروتينات السكرية N المحددة بالمصفوفة خارج الخلية. تشارك الفسفرة في إشارات الخلايا ويمكن رؤية ذلك في العديد من المصطلحات المخصبة الموجودة باستخدام قائمة البروتينات الفوسفاتية المحددة.
الشكل 2: أطياف MS/MS المشروحة عالية الثقة من الببتيدات N-glycosylated والمفسفرة. (A) Mannose-6-phosphorylated peptide GSLSYLN(HexNAc(2)Hex(7)Phospho(1))VTR من الكاثيبسين D (CATD) المحددة من أوقات الاحتفاظ 53.08-53.33 دقيقة من الاستئصال السابع للتخصيب. إن وجود أيون أوكسونيوم PhosphoHex عند 243 m/z يحسن الثقة في مهمة PTM هذه. (ب) الببتيد المفسفرة VEEEQEADEEDVS(Phospho)EEEAESK من البروتين عبر الغشاء المرتبط بالثيوريدوكسين 1 (TMX1) من أوقات الاحتفاظ 32.31-32.72 دقيقة من الاستخلاص التخصيب السادس. إن وجود خسائر محايدة -98 (-H3PO4) بين أيونات شظايا الببتيد ومتغيرات إزالة الفوسفوريلات (المشار إليها بالشظية*) يحسن الثقة في مهمة PTM هذه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة بين تحديد الببتيد من التخصيب المزدوج الوظائف Ti(IV)-IMAC عبر سبعة استخراجات. ويشمل عدد عمليات تحديد الهوية الببتيدات المحددة في واحد على الأقل من اثنين من النسخ المتماثلة التقنية (الحقن). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مقارنة بين glycoproteomics تنتج عن إثراء Ti(IV)-IMAC ثنائي الوظيفة مقارنة بتخصيب جليكوببتيد ERLIC التقليدي . (A) مخططات Venn للبروتين السكري ، و glycoform (البروتين ، والموقع ، و glycan) ، وتكوين glycan ، وتحديد glycosite بين طرق التخصيب. (ب) مخططات دائرية للجليكان تم تحديدها على العمود الفقري للببتيد بين طرق التخصيب. يتم ربط الجليكان في ست مجموعات بناء على تكوينها16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقارنة بين البروتيوميات الفوسفاتية الناتجة عن التخصيب المزدوج الوظائف Ti(IV)-IMAC مقارنة بالتخصيب التقليدي للفوسفوببتيد Ti(IV)-IMAC. (أ) مخططات فين للفوسفوبروتين والفوسفوبتيد وتحديد الفوسفوزيت بين طرق التخصيب. (ب) مخططات دائرية لمواقع الفوسفات الموضعية بثقة (75٪ أو أعلى احتمالا) مقسمة بواسطة بقايا الأحماض الأمينية. (ج) مخطط شريط مكدس من الببتيدات الفوسفاتية المحددة المثبتة بعدد من المخلفات المفسفرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: إثراء أنطولوجيا الجينات للبروتينات السكرية N المحددة باستخدام إثراء Ti(IV)-IMAC ثنائي الوظائف. يتم تعيين البروتينات السكرية N مرة أخرى إلى الجينات ويتم تحديد المسارات المخصبة بشكل كبير ومصطلحات العملية باستخدام كامل الجينوم كخلفية. تستخدم ألوان مختلفة لتسمية مجموعات من المصطلحات المرتبطة بتشابه المصطلح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: إثراء أنطولوجيا الجينات للبروتينات الفوسفاتية المحددة باستخدام إثراء Ti(IV)-IMAC ثنائي الوظائف. يتم تعيين البروتينات الفوسفاتية مرة أخرى إلى الجينات ويتم تحديد المسارات المخصبة بشكل كبير ومصطلحات العملية باستخدام كامل الجينوم كخلفية. يتم استخدام ألوان مختلفة لتسمية مجموعات من المصطلحات ، والتي ترتبط بتشابه المصطلح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي S1: مثال على الكروماتوغرامات الأيونية الكلية (TICs) من كل عملية إزالة من إثراء Ti(IV)-IMAC ثنائي الوظائف (E1 إلى E7، الألواح من A-G). يتم رسم الإشارة الإجمالية (التيار الأيوني) خلال فترة جمع البيانات البالغة 117 دقيقة. يتم إعطاء شدة الذروة الأساسية بواسطة القيمة NL. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: مثال على كروماتوغرام الأيونات الكلية (TICs) من كل إزالة من إثراء ERLIC (E1 إلى E5 ، الألواح من A إلى E). يتم رسم الإشارة الإجمالية (التيار الأيوني) خلال فترة جمع البيانات البالغة 117 دقيقة. يتم إعطاء شدة الذروة الأساسية بواسطة القيمة NL. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: مثال على كروماتوغرام الأيونات الكلية (TIC) من الاستخلاص من إثراء Ti-IMAC. يتم رسم الإشارة الإجمالية (التيار الأيوني) خلال فترة جمع البيانات البالغة 117 دقيقة. يتم إعطاء شدة الذروة الأساسية بواسطة القيمة NL. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S4: إثراء أنطولوجيا الجينات للبروتينات السكرية N المحددة باستخدام إثراء جليكوببتيد التقليدي باستخدام ERLIC. يتم تعيين البروتينات السكرية N مرة أخرى إلى الجينات ويتم تحديد المسارات المخصبة بشكل كبير ومصطلحات العملية باستخدام كامل الجينوم كخلفية. يتم استخدام ألوان مختلفة لتسمية مجموعات من المصطلحات ، والتي ترتبط بتشابه المصطلح. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S5: إثراء أنطولوجيا الجينات للبروتينات الفوسفاتية المحددة باستخدام إثراء الفوسفوببتيد التقليدي باستخدام Ti(IV)-IMAC. يتم تعيين البروتينات الفوسفاتية مرة أخرى إلى الجينات ويتم تحديد المسارات المخصبة بشكل كبير ومصطلحات العملية باستخدام كامل الجينوم كخلفية. يتم استخدام ألوان مختلفة لتسمية مجموعات من المصطلحات ، والتي ترتبط بتشابه المصطلح. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الجداول التكميلية S1-S4: معلومات عقدة Metascape لتحليلات إثراء أنطولوجيا الجينات. تحتوي الجداول على معلومات العقدة لقوائم البروتينات السكرية N والبروتينات الفوسفاتية المحددة باستخدام Ti المزدوج (الجدول S1 والجدول S2) ، والبروتينات السكرية N باستخدام ERLIC (الجدول S3) ، والبروتينات الفوسفاتية باستخدام IMAC (الجدول S4). يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتعد استراتيجية Ti(IV)-IMAC ثنائية الوظيفة مفيدة للتحليل المتزامن للجليكوببتيدات N-glycopeptides والفوسفوببتيدات من نفس العينة في سير عمل إعداد عينة واحدة. كما ثبت أن الأساليب القائمة على ERLIC تؤدي التخصيب المتزامن ل PTMs. تم استخدام كلتا الاستراتيجيتين سابقا لتغطية عميقة في تحليلات PTM14,18. عند تكييف طريقة Ti المزدوجة لتقليل وقت حضانة العينات باستخدام أطراف الدوران ، نأمل أن يكون هذا البروتوكول قد أصبح أقل كثافة في استخدام الموارد ، وبالتالي يمكن الوصول إليه على نطاق أوسع.
يتم تحقيق التحليل المتزامن ل PTMs المتعددة من خلال التفاعلات التآزرية بين التحليلات والمجموعات الوظيفية على سطح مادة التخصيب. في أول تعبئة لأطراف الدوران بالقطن ، يزداد الاحتفاظ بالجليكوببتيدات في وضع HILIC بسبب انتشار مجموعات الهيدروكسيل على السليلوز24. باستخدام الماء والأسيتونيتريل (مذيب قابل للامتزاج بالماء) ، يتم الاحتفاظ بالجليكوببتيدات وفصلها بسبب تكوين طبقات مائية وعضوية. تعتمد مادة التخصيب المزدوج الوظيفة Ti(IV) على كاتيونات Ti(IV) المجمدة لربط الببتيدات الفوسفوببتيدية. تستخدم الخصائص المحبة للماء للسلاسل الجانبية للمادة للاحتفاظ بالجليكوببتيدات في وضع HILIC ، والتي يتم التخلص منها أولا باستخدام الاستخلاص الحمضي مع زيادة المحتوى المائي. يتم غسل المادة أيضا باستخدام مخازن تخصيب الفوسفوببتيد التقليدية IMAC لإلغاء جليكوببتيدات السياليل ، والتي لها تقارب أعلى مع المرحلة الثابتة من غيرها من الببتيدات المحايدة المحايدة. بعد تكييف المادة إلى درجة الحموضة الأساسية ، يتم استخدام هيدروكسيد الأمونيوم ومحلول ACN لكسر التفاعلات الكهروستاتيكية التي تحافظ على ارتباط الببتيدات الفوسفاتية بالمادة. في غضون ذلك ، يسمح المحتوى العضوي المتناقص بفصل الببتيدات أحادية ومتعددة الفوسفوريلات و M6P glycopeptides.
عند فصل PTMs باستخدام خطوات إزالة متعددة في نفس سير العمل ، يمكن تعظيم المعلومات الجزيئية الحيوية من عينات محدودة. التحذير مع سير عمل تحليل PTM المزدوج هذا هو الحاجة إلى كمية كبيرة نسبيا من العينة (0.5 ملغ من الببتيدات) كمادة أولية لكل إثراء عندما يتم جمع خمسة أجزاء على الأقل. ومع ذلك، فإن استراتيجية التخصيب المتزامنة المعروضة هنا لا تزال توفر توفيرا كبيرا للمواد مقارنة بالاستراتيجيات التقليدية. حتى قبل التخصيب ، هناك العديد من الخطوات المهمة اللازمة لضمان سلامة PTM وتجنب الفقدان الفعلي لمعلومات PTM. ويشمل ذلك التخزين السليم للعينات في درجات حرارة منخفضة عندما لا تكون قيد الاستخدام (من الناحية المثالية -80 درجة مئوية) ، واستخدام مثبطات البروتياز والفوسفاتيز أثناء استخراج البروتين ، واستخدام طريقة تنظيف الببتيد المحبة للماء ، مثل خراطيش HLB المستخدمة هنا.
وقد لوحظ أن ERLIC (إثراء غليكوببتيد التقليدي) أدى إلى تغطية أفضل للغليكوبروتيوم، في حين أن أداء Ti(IV)-IMAC ثنائي الوظائف قد تفوق في عمليات تحديد فريدة من نوعها بواسطة Ti-IMAC التقليدي في نتائج الفوسفوبروتيوميات. ومن المرجح أن يكون الهيكل المادي لمادة ERLIC وزيادة المحبة للماء مقارنة بمادة التخصيب المزدوجة Ti عاملا رئيسيا في تحسين تغطية glycoproteome في ERLIC. قد تكون التغطية المتزايدة للفوسفوبروتيوم في IMAC التقليدي نتيجة لانخفاض قمع الأيونات الناتجة عن إزالة الجليكوببتيدات خلال خطوات الاستخلاص الأولى وخطوات الغسيل. على الرغم من هذه الانخفاضات الطفيفة في التغطية باستخدام سير عمل Ti المزدوج المتزامن ، لا يزال هناك تداخل كبير مع إثراء PTM الفردي التقليدي مع ميزة إضافية تتمثل في أداء سير عمل إثراء واحد فقط بدلا من اثنين.
وفيما يتعلق بالقيود الزمنية، فإن ERLIC وTi-IMAC التقليديين لهما كسور أقل من سير عمل Ti المزدوج. وفيما يتعلق بالموارد اللازمة، فإن مواد تبادل الأنيون اللازمة ل ERLIC أرخص من المواد الوظيفية اللازمة لسير عمل Ti المزدوج و IMAC التقليدي. في هذه البروتوكولات ، تم تحليل الجليكوزيل المرتبط ب N فقط وليس المرتبط ب O. يمكن (وينبغي) استخدام إنزيم PNGase F لشق N-glycans للحد من عدد الإيجابيات الخاطئة التي تم الحصول عليها عند البحث عن O-glycopeptides. ومع ذلك ، فقد تبين أن هذه الاستراتيجية تقلل من خصوصية HILIC و ERLIC لتخصيب glycopeptide25. في البروتوكول ، يتم استخدام استراتيجية باستخدام برنامجين منفصلين لتحليل ملفات البيانات الخام. يعتبر Byonic ، وهو برنامج تجاري ، المعيار الذهبي في تحليل بيانات glycoproteomics. نظرا لتنوع هياكل N-glycan ، يتم زيادة مساحة البحث عن الببتيد ، وبالتالي زيادة أوقات البحث. يمكن أيضا إضافة الفسفرة كعلاج PTM شائع بالإضافة إلى الجليكوزيل أثناء البحث ، على الرغم من أن أوقات البحث قد ترتفع اعتمادا على ما إذا كان يتم النظر في الفسفرة المتعددة للببتيد. يمكن تحسين MaxQuant ، وهو برنامج مفتوح المصدر ، لتقليل FDR في نتائج الفوسفوبروتينات ، على الرغم من أن الجليكوزيل المعقد ليس سهلا للبحث. هناك أيضا خيارات أخرى مفتوحة المصدر للبحث في بيانات glycoproteomic26،27،28. اعتمادا على الأهداف التجريبية والموارد المتاحة ، يمكن استخدام LC-MS وخط أنابيب تحليل البيانات الموصوف هنا كما هو معروض أو تعديله. ومن المتوقع أن يؤدي المزيد من التحسين الأمثل للأساليب إلى تحسين تغطية تدابير منع انتشار الأسلحة النووية.
تلعب PTMs دورا رئيسيا في العمليات الكيميائية الحيوية بسبب التغييرات في بنية البروتين التي تنقلها. من المثالي أن تأخذ جميع التحليلات البروتينية جميع PTMs البروتين في الاعتبار في وقت واحد. على سبيل المثال ، تم تسمية أهمية مجموع جميع غليكوزيل البروتين ، على سبيل المثال ، بعدم التجانس الفوقي29. ومع ذلك ، فإن هدف تحليل PTM الكلي غير ممكن بعد مع التقنيات الحالية القائمة على MS. لا تزال البروتينات من أسفل إلى أعلى متبوعة بالتخصيب الخاص ب PTM ، أي HILIC و IMAC ، هي المعيار الذهبي لتحليلات PTM ، على الرغم من أنه باستخدام استراتيجيات التخصيب المتزامنة مثل تلك الموضحة هنا ، يمكن توضيح المعلومات الجزيئية الحيوية بشكل أفضل. تم العثور على تفاعلات عبر الحديث تحدث بين مختلف PTMs 30,31 ، بما في ذلك glycosylation والفسفرة32. قد يكون التحليل الكمي لمثل هذه التفاعلات في المرض ، على سبيل المثال ، في أمراض البنكرياس مثل السكري والسرطان ، مثمرا في زيادة فهمنا لآليات المرض. مع تحسين طرق الاستخراج بين أنواع العينات المختلفة ، يمكن استخدام بروتوكولات التخصيب الموصوفة هنا للتنميط المتعمق للجليكوبروتيوم والفوسفوبروتيوم في المصفوفات البيولوجية المعقدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود مصالح متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال تمويل منحة من المعاهد الوطنية للصحة (R01DK071801 و RF1AG052324 و P01CA250972 و R21AG065728) ومؤسسة أبحاث سكري الأحداث (1-PNF-2016-250-S-B و SRA-2016-168-S-B). كما تم الحصول على البيانات المقدمة هنا جزئيا من خلال دعم من جائزة NIH / NCATS UL1TR002373 من خلال معهد جامعة ويسكونسن للبحوث السريرية والانتقالية. تم شراء أدوات Orbitrap من خلال دعم منحة أدوات مشتركة من المعاهد الوطنية للصحة (NIH-NCRR S10RR029531) ومكتب نائب رئيس الجامعة للبحث والتعليم العالي في جامعة ويسكونسن ماديسون. ونود أيضا أن نشيد بالدعم السخي الذي قدمته منظمة التبرع بالأعضاء والأنسجة بجامعة ويسكونسن التي قدمت البنكرياس البشري للبحوث ومساعدة دان تريميل والدكتورة سارة دي ساكيت والبروفيسور جون أودوريكو لتوفير العينات لمختبرنا. يود فريق البحث لدينا تقديم شكر خاص للعائلات التي تبرعت بالأنسجة لهذه الدراسة. L.L. تعترف بمنحة المعاهد الوطنية للصحة S10OD025084 ، وهي منحة تجريبية لسرطان البنكرياس من مركز سرطان كاربون بجامعة ويسكونسن (233-AAI9632) ، بالإضافة إلى أستاذية Vilas للإنجاز المتميز وأستاذية كرسي تشارلز ملبورن جونسون المتميز بتمويل مقدم من مؤسسة أبحاث خريجي ويسكونسن وكلية الصيدلة بجامعة ويسكونسن ماديسون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic Acid, Glacial (Certified ACS) | Fisher Scientific | A38S-500 | |
| Acetone (Certified ACS) | Fisher Scientific | A18-1 | |
| Acetonitrile, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A955-4 | |
| Ammonium Acetate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Ammonium Hydroxide (Certified ACS Plus) | Fisher Scientific | A669-212 | |
| Byonic software | Protein Metrics | n/a | Commercial software used for glycoproteomic analysis (https://proteinmetrics.com/byos/) |
| C18 BEH material | Waters | 186002353 | Material removed from column and used to pack nano capillaries (pulledto integrate tip used directly in line with instrument inlet) |
| CAE-Ti-IMAC, 100% | J&K Scientific | 2749380-1G | Material used for dual-functional Ti(IV)-IMAC; can also be used for conventional IMAC/conventional phosphopeptide enrichment |
| Cellcrusher kit | Cellcrusher | n/a | Used for grinding tissue samples into powder before extraction |
| Eppendorf 5424R Microcentrifuge | Fisher Scientific | 05-401-205 | For temperature-controlled centrifugation |
| cOmplete protease inhibitor cocktail tablets | Sigma | 11697498001 | |
| DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol) | Promega | V3151 | Protein reducing agent |
| Ethanol, 200 proof (100%), USP | Fisher | 22-032-601 | |
| Fisherbrand Analog Vortex Mixer | Fisher Scientific | 02-215-414 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Fisherbrand Low-Retention Microcentrifuge Tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Fisherbrand Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB120110 | For sample lysis using ultrasonication |
| Formic Acid, 99.0+%, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | A117-50 | |
| Fused silica capillary (75 μm inner diameter, 360 μm outer diameter) | Polymicro Technologies LLC | 100 m TSP075375 | For in-house pulled and packed columns with integrated emitter |
| Hydrofluoric acid (48 wt. % in H2O) | Sigma-Aldrich | 339261-100ML | Used for opening emitter of pulled capillary column |
| Iodoacetamide, BioUltra | Sigma | I1149-5G | Protein reducing reagent |
| MaxQuant software | n/a | n/a | Free software used for phosphoproteomic analysis (https://www.maxquant.org/) |
| Multi-therm Shaker with heating and cooling | Benchmark Scientific | H5000-HC | Heating block |
| Oasis HLB 1 cc Vac Cartridge, 10 mg Sorbent per Cartridge, 30 µm, 100/pk | Waters | 186000383 | Larger-scale cartridge desalting for tryptic digests (loading capacity approximately up to 1 mg each) |
| OMIX C18 pipette tips, 100 µL tip, 10 - 100 μL elution volume, 1 x 96 tips | Agilent | A57003100 | Smaller-scale packed pipette tip for desalting for enrichment elutions |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000/F | For pulling nano-capillary columns for LC-MS |
| PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets | Sigma | 4906845001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher Scientific | 23275 | |
| PolySAX LP (12 μm, pore size 300 Å) | PolyLC | BMSX1203 | Material for strong anion-exchange chromatography used for ERLIC/conventional glycopeptide enrichment |
| Potassium Phosphate Monobasic (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pressure injection cell with integrated magnetic stirplate | Next Advance | PC77-MAG | For packing nano-capillary columns with stationary phase up to 2500 psi limit |
| Proteome Discoverer software | Thermo Fisher Scientific | n/a | Commercial software for proteomics anaysis (with integrated database searching software nodes) and data visualization (https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/mass-spectrometry/liquid-chromatography-mass-spectrometry-lc-ms/lc-ms-software/multi-omics-data-analysis/proteome-discoverer-software.html) |
| SpeedVac SC110 Vacuum Concentrator Model SC110-120 | Savant | n/a | Centrifugal vacuum concentrator for drying samples (under heat) |
| SDS Solution, 10% Sodium Dodecyl Sulfate Solution, Molecular Biology/Electrophoresis | Fisher Scientific | BP2436200 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| TopTip, Empty, 10-200 µL, Pack of 96 | Glygen Corporation | TT2EMT.96 | Empty pipette tip with micron-sized hole used that can be used to pack chromatographic materials for enrichments, bundled with tube adapters |
| Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB, 1 M, pH 8.5 (volatile)) | Sigma | 90360-100ML | |
| Trifluoroacetic acid, Reagent Grade, 99% | Fisher Scientific | 60-017-61 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5071 | |
| Urea (Certified ACS) | Fisher Scientific | U15-500 | |
| Water, Optima LC/MS Grade | Fisher Scientific | W64 |
References
- Smith, L. M., Kelleher, N. L. Proteoform: a single term describing protein complexity. Nature Methods. 10 (3), 186-187 (2013).
- Pan, S., Brentnall, T. A., Chen, R. Glycoproteins and glycoproteomics in pancreatic cancer. World Journal of Gastroenterology. 22 (42), 9288-9299 (2016).
- Tabang, D. N., Ford, M., Li, L. Recent advances in mass spectrometry-based glycomic and glycoproteomic studies of pancreatic diseases. Frontiers in Chemistry. 9, 707387 (2021).
- Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Scientific Reports. 1, 90 (2011).
- Alpert, A. J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography A. 499, 177-196 (1990).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100029 (2020).
- Low, T. Y., et al. Widening the bottleneck of phosphoproteomics: Evolving strategies for phosphopeptide enrichment. Mass Spectrometry Reviews. 40 (4), 309-333 (2021).
- Cho, K. C., Chen, L., Hu, Y., Schnaubelt, M., Zhang, H. Developing workflow for simultaneous analyses of phosphopeptides and glycopeptides. ACS Chemical Biology. 14 (1), 58-66 (2019).
- Zhou, Y., et al. An integrated workflow for global, glyco-, and phospho-proteomic analysis of tumor tissues. Analytical Chemistry. 92 (2), 1842-1849 (2020).
- Tang, R., et al. Facile preparation of bifunctional adsorbents for efficiently enriching N-glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1144, 111-120 (2021).
- Wang, Z., Wang, J., Sun, N., Deng, C. A promising nanoprobe based on hydrophilic interaction liquid chromatography and immobilized metal affinity chromatography for capture of glycopeptides and phosphopeptides. Analytica Chimica Acta. 1067, 1-10 (2019).
- Glover, M. S., et al. Characterization of intact sialylated glycopeptides and phosphorylated glycopeptides from IMAC enriched samples by EThcD fragmentation: Toward combining phosphoproteomics and glycoproteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 35-42 (2018).
- Alpert, A. J. Electrostatic repulsion hydrophilic interaction chromatography for isocratic separation of charged solutes and selective isolation of phosphopeptides. Analytical Chemistry. 80 (1), 62-76 (2008).
- Cui, Y., et al. Counterion optimization dramatically improves selectivity for phosphopeptides and glycopeptides in electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Analytical Chemistry. 93 (22), 7908-7916 (2021).
- Cui, Y., et al. Finding the sweet spot in ERLIC mobile phase for simultaneous enrichment of N-Glyco and phosphopeptides. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2491-2501 (2019).
- Tabang, D. N., et al. Analysis of pancreatic extracellular matrix protein post-translational modifications via electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography coupled with mass spectrometry. Molecular Omics. 17 (5), 652-664 (2021).
- Huang, J., et al. Dual-functional Titanium(IV) immobilized metal affinity chromatography approach for enabling large-scale profiling of protein Mannose-6-Phosphate glycosylation and revealing its predominant substrates. Analytical Chemistry. 91 (18), 11589-11597 (2019).
- Huang, J., et al. Dual-functional Ti(IV)-IMAC material enables simultaneous enrichment and separation of diverse glycopeptides and phosphopeptides. Analytical Chemistry. 93 (24), 8568-8576 (2021).
- Jami-Alahmadi, Y., Pandey, V., Mayank, A. K., Wohlschlegel, J. A. A robust method for packing high resolution C18 RP-nano-HPLC columns. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62380 (2021).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit13.20 (2012).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Perez-Riverol, Y., et al. The PRIDE database and related tools and resources in 2019: improving support for quantification data. Nucleic Acids Research. 47, 442-450 (2019).
- Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523 (2019).
- Zacharias, L. G., et al. HILIC and ERLIC enrichment of glycopeptides derived from breast and brain cancer cells. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3624-3634 (2016).
- Yang, W., et al. Comparison of enrichment methods for intact N- and O-linked glycopeptides using strong anion exchange and hydrophilic interaction liquid chromatography. Analytical Chemistry. 89 (21), 11193-11197 (2017).
- Toghi Eshghi, S., Shah, P., Yang, W., Li, X., Zhang, H. GPQuest: A spectral library matching algorithm for site-specific assignment of tandem mass spectra to intact N-glycopeptides. Analytical Chemistry. 87 (10), 5181-5188 (2015).
- Liu, M. -Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100010 (2021).
- Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A.
- Leutert, M., Entwisle, S. W., Villén, J. Decoding post-translational modification crosstalk with proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100129 (2021).
- Hart, G. W., Slawson, C., Ramirez-Correa, G., Lagerlof, O. Cross talk between O-GlcNAcylation and phosphorylation: Roles in signaling, transcription, and chronic disease. Annual Review of Biochemistry. 80 (1), 825-858 (2011).
